一、Wild type p53 increased chemosensitivity of drug-resistant human hepatocellular carcinoma Bel7402/5-FU cells（论文文献综述）
肖遵强[1]（2021）在《槲皮素通过靶向人抗原蛋白R抑制肝癌进展的机制研究》文中认为目的 研究槲皮素通过靶向作用于人抗原蛋白R（HuR）降低非编码RNA LINC01123的稳定性,并抑制肝癌细胞的增殖及转移的作用。进一步探索槲皮素抗肝癌的机制,为中药治疗肝癌提供新思路。方法1.使用不同浓度的槲皮素处理Hep3B,Huh7和MHCC97h细胞,通过CCK-8试验,EdU试验,克隆平板实验,流式实验,证明槲皮素可以抑制肝癌细胞的增殖,并诱导肝癌细胞凋亡。2.使用不同浓度的槲皮素处理Hep3B,Huh7和MHCC97h细胞,通过划痕实验,迁移实验,侵袭实验,证明槲皮素可以抑制肝癌细胞的迁移及侵袭性。3.建立裸鼠荷瘤模型,观察槲皮素是否可以在体内抑制肿瘤的生长。4.通过生信分析及临床资料分析,研究LINC01123在肝癌组织中的表达量与预后的关系。5.在Hep3B,HepG2和Huh7细胞中过表达或敲低LINC01123,通过CCK-8实验,EdU试验,transwell试验及建立裸鼠荷瘤模型,进一步证明LINC01123在体内及体外可促进肝癌的增殖转移。6.通过生信分析,RNA免疫共沉淀实验及双荧光素酶报告基因检测系统实验寻找LINC01123的靶点。7.通过生信分析及双荧光素酶报告基因检测系统实验寻找miR-34a-5p的靶点。8.通过TUFT1的挽救实验来证明LINC01123可通过miR-34a-5p/TUFT1轴促进肝癌的进展。9.通过生信分析,探究HuR与LINC01123表达量的相关性,通过RNA免疫共沉淀实验探究两者是否可以直接结合。10.在Hep3B,Huh7和MHCC97h细胞中过表达或敲低HuR,检测LINC01123的RNA稳定性及表达量,探索HuR能否通过增加LINC01123的稳定性,促进LINC01123 的表达。11.通过生信分析,探索HuR是否是槲皮素的作用靶点。12.通过在Hep3B,Huh7和MHCC97h细胞中过表达HuR,探索槲皮素是否通过靶向作用于HuR下调LINC01123的表达,从而发挥抗肝癌的作用。结果1.槲皮素可以通过剂量依赖的方式抑制Hep3B,Huh7和MHCC97h细胞的增殖。2.槲皮素可以通过剂量依赖的方式抑制Hep3B,Huh7和MHCC97h细胞的转移。3.槲皮素可以在体内实验中抑制肝癌的生长。4.LINC01123在肝癌组织中高表达,并与患者的不良预后相关。5.在Huh7细胞中敲低LINC01123的表达后,可以明显抑制Huh7细胞的增殖,侵袭及迁移,在HepG2及Hep3B细胞中过表达LINC01123可以促进HepG2,Hep3B细胞的增殖,侵袭及迁移。同时,LINC01123的沉默可以抑制体内实验中肝癌的生长。6.通过生信分析发现LINC01123与miR-34a-5p的表达量成反比,通过双荧光素酶报告基因检测系统和RNA免疫共沉淀实验可以证明LINC01123和miR-34-5p直接结合。7.通过生信分析发现miR-34-5与TUFT1的表达量成反比,通过双荧光素酶报告基因检测系统可以证明miR-34-5p和TUFT1直接结合。8.过表达miR-34-5p可以逆转LINC01123促进肝癌细胞增殖,迁移及侵袭的作用,过表达TUFT1可以逆转miR-34-5p抑制肝癌细胞增殖,迁移及侵袭的作用。9、HuR和LINC01123在肝癌组织中的表达量呈正相关关系,RNA免疫共沉淀实验证明HuR可以和LINC01123直接结合。10.在Hep3B,Huh7和MHCC97h细胞中过表达或敲低HuR的表达量,可以同向调控LINC01123的表达量,敲低HuR可以降低LINC01123的稳定性。11.通过生信分析及分子对接,可以证明HuR是槲皮素的潜在作用靶点。12.在Hep3B,Huh7,MHCC97h细胞中过表达HuR,可以逆转不同浓度的槲皮素对Hep3B,Huh7,MHCC97h细胞的增殖抑制和转移抑制的作用。结论 本研究发现LINC01123在肝癌中高表达,与患者预后不良相关,并可通过调节miR-34a-5p/TUFT1轴促进肝癌细胞的增殖及转移。HuR可与LINC01123结合,增加LINC01123的稳定,并促进其表达。HuR作为槲皮素的潜在靶点之一,槲皮素可通过靶向HuR,降低LINC01123的稳定性并抑制肝癌细胞的增殖与转移。本研究首次发现了中药单体槲皮素通过作用于LncRNA治疗肝癌的机制,为中药治疗肝癌提供了新的思路。
李彩琳[2]（2021）在《基于AMPK为靶点的美洲大蠊多肽PAE2逆转肝癌多药耐药作用及机制研究》文中研究说明目的:基于AMPK靶点在细胞水平及动物水平上探讨美洲大蠊多肽PAE2逆转肝癌多药耐药细胞BEL-7402/5-FU的作用及其机制研究。方法:（1）以人肝癌敏感BEL-7402细胞和人肝癌多药耐药细胞BEL-7402/5-FU为试验对象,ELISA法检测美洲大蠊多肽PAE2对细胞内AMPK含量的影响。RT-PCR法检测美洲大蠊多肽PAE2对细胞中AMPK m RNA含量的影响。（2）噻唑蓝法（MTT）测定AMPK激活剂AICAR作用时间及浓度。（3）划痕试验检测BEL-7402细胞、BEL-7402/5-FU细胞的侵袭转移能力以及美洲大蠊多肽PAE2对耐药细胞侵袭转移能力的影响。（4）RT-PCR法检测美洲大蠊多肽PAE2对细胞中侵袭转移相关因子MMP2,MMP9,m TOR,AKT,4EBP1 m RNA含量的影响。（5）激光共聚焦显微镜观察多肽PAE2对细胞自噬流LC3B的影响。（6）免疫细胞化学法（ICC）检测美洲大蠊多肽PAE2对细胞自噬相关蛋白P62的影响。（7）RT-PCR检测美洲大蠊多肽PAE2对自噬相关因子ATG5,ATG7,BECLIN,PIK3C3,LC3B,P62等m RNA的影响。（8）以Balb/c-nude为试验对象,裸鼠腋下接种人肝癌BEL-7402和BEL-7402/5-FU细胞,建立裸鼠皮下移植瘤模型。给予相应受试药物14天,观察裸鼠一般状态。裸鼠每天称重,隔天用游标卡尺记录肿瘤长径和短径,计算瘤体积。（9）裸鼠取材计算脏器指数及肿瘤重量。（10）裸鼠眼球取血,进行生化指标测定。（11）H&E染色观察多肽PAE2对裸鼠皮下移植瘤肿瘤组织及肝组织病理学的影响。（12）RT-PCR法检测美洲大蠊多肽PAE2对裸鼠肿瘤组织中侵袭转移相关因子MMP2,MMP9,m TOR,AKT,4EBP1 m RNA含量的影响。（13）实时荧光定量法（RT-PCR）检测美洲大蠊多肽PAE2对侵袭转移相关因子ATG5,ATG7,BECLIN,PIK3C3,LC3B,P62等m RNA的影响。结果:（1）ELISA结果显示,肝癌耐药细胞中耐药细胞中AMPK含量明显升高;美洲大蠊多肽PAE2可显着降低耐药细胞中AMPK的含量（P<0.05）。RT-PCR结果显示耐药细胞中AMPK m RNA表达量显着升高,美洲大蠊多肽PAE2可显着降低耐药细胞中AMPK m RNA的表达（P<0.05）。（2）经MTT法确定AMPK激活剂的IC20为0.006m M即1.55ug/m L（分子量258.23）。并以IC20作用48h作为后续细胞试验中与美洲大蠊多肽PAE2不同剂量组合用。（3）划痕试验结果显示,耐药细胞比敏感细胞具有更强的划痕愈合能力即侵袭转移能力,而美洲大蠊多肽PAE2可抑制细胞24h,48h划痕试验愈合率（P<0.05）。美洲大蠊多肽PAE2和AMPK激活剂联用后可减弱美洲大蠊多肽PAE2对划痕愈合率的影响（P<0.05）。（4）RT-PCR结果显示,相比于敏感细胞,耐药细胞中侵袭转移正相关因子MMP2m RNA、MMP9 m RNA、AKT m RNA表达量显着增高（P<0.05）,肝癌耐药组中m TOR m RNA则呈现增高趋势,而4EBP1 m RNA表达无显着变化。美洲大蠊多肽PAE2可降低耐药细胞中MMP2 m RNA、MMP9 m RNA、AKT m RNA、m TOR m RNA、4EBP1 m RNA、的表达且这种影响可通过与AICAR联用后抵消,但这种抵消效果并不呈现剂量依赖性。（5）激光共聚焦结果显示,与敏感细胞相比,耐药细胞可能具有更强的自噬能力,耐药细胞给予美洲大蠊多肽PAE2后可降低细胞中自噬流的产生,美洲大蠊多肽PAE2和AICAR合用后可加强细胞的自噬。（6）免疫细胞化学法检测自噬标志性蛋白P62在细胞中的表达,免疫细胞化学法结果显示,与敏感细胞相比,耐药细胞中P62表达量相对更少（P<0.05）,而给予美洲大蠊多肽PAE2后,细胞中P62呈现高表达状态;和单独给予美洲大蠊多肽PAE2相比,美洲大蠊多肽PAE2和AICAR联用后对细胞中P62蛋白的降低效果极为显着（P<0.05）。（7）RT-PCR试验结果显示,和敏感细胞相比,耐药细胞中ATG5,ATG7,BECLIN,PIK3C3,LC3B等m RNA呈现高表达状态（P<0.05）,而P62 m RNA则呈现极低表达状态（P<0.05）;单独给予美洲大蠊多肽PAE2后可降低细胞中ATG5,ATG7,BECLIN,PIK3C3,LC3B等m RNA的表达,同时升高P62 m RNA的表达;美洲大蠊多肽PAE2合用AICAR后,可升高ATG5,ATG7,LC3B m RNA的表达,降低P62 m RNA的表达,但联用后各组对PIK3C3 m RNA,BECLIN m RNA的表达并无显着影响或略成降低趋势。（8）裸鼠腋下接种敏感细胞BEL-7402和耐药细胞BEL-7402/5-FU后状态稳定,饮食饮水正常,给药后裸鼠出现体重下降,消瘦等情况。接种敏感细胞的裸鼠皮下移植瘤更容易成瘤,且更稳定,耐药细胞接种肿瘤成瘤率更低,且易发生肿瘤转移。瘤体积计算结果显示,接种肿瘤后5天左右瘤稳定生长,化疗药及美洲大蠊多肽PAE2对肿瘤均有一定的抑制效果。（9）裸鼠取材后称量瘤种后可见,敏感组瘤重远远超过耐药组,美洲大蠊多肽PAE2和索拉非尼能明显降低肿瘤的重量,联合用药组降低肿瘤重量效果更为显着。脏器计算结果显示,皮下接种肝癌敏感细胞和耐药细胞对裸鼠的心、脾、肺、肝、肾指数均无明显影响;给予相应受试药物后索拉非尼组裸鼠肝脏指数明显上升,表明阳性药索拉非尼对裸鼠肝脏具有一定的保护作用。美洲大蠊多肽PAE2低剂量以及美洲大蠊多肽PAE2联合AICAR后裸鼠肺脏指数、肾脏指数升高,可能是由于药物对裸鼠脏器具有一定的保护作用。（10）血清生化指标检测结果显示,敏感组及耐药组谷草转氨酶含量明显升高（P<0.05）,耐药组中谷丙转氨酶明显升高（P<0.05）;单独给予美洲大蠊多肽PAE2及联合给药后裸鼠血清中肌酐尿素氮均呈现上升趋势。（11）从肿瘤组织H&E染色结果可见,与正常组裸鼠肝脏比较,接种肿瘤后裸鼠肝脏细胞排列不规则,有皱缩现象,而给予化疗药物及美洲大蠊多肽PAE2后对耐药细胞的影响并不是很显着。肝癌皮下移植瘤不规则形态,给予相应药物后肿瘤细胞均出现形态变化,细胞核缩小或核碎裂的情况,多呈不规则状,也出现成片坏死的状态。（12）裸鼠皮下移植瘤RT-PCR结果显示,与敏感组比较,耐药组肿瘤组织中侵袭转移因子MMP2、MMP9、m TOR、AKT、4EBP1等m RNA表达量均显着升高（P<0.05）;给予化疗药物索拉非尼及单独给予美洲大蠊多肽PAE2后侵袭转移因子m RNA均显着降低;但PAE2联合用AICAR后仅仅可升高MMP2、MMP9、4EBP1等m RNA的表达量,对组织中m TOR、AKT等m RNA的表达无显着影响。（13）裸鼠RT-PCR结果显示,与敏感组比较,耐药组肿瘤组织中自噬相关因子ATG5、ATG7、BECLIN、PIK3C3、LC3B、P62等m RNA表达量均显着升高（P<0.05）,给予美洲大蠊后自噬相关因子m RNA表达量均降低,美洲大蠊多肽PAE2联合AICAR后可升高肿瘤组织中ATG5、BECLIN、LC3B、P62等m RNA的表达,而对ATG7、PIK3C3等m RNA无显着影响,可降低肿瘤组织中P62 m RNA的表达。结论:（1）耐药细胞BEL-7402/5-FU中AMPK含量及AMPK m RNA呈高表达,美洲大蠊多肽PAE2可降低细胞中AMPK的含量及AMPK m RNA的表达。（2）肝癌BEL-7402/5-FU细胞比BEL-7402细胞具有更强的侵袭转移及自噬能力。（3）美洲大蠊多肽PAE2可抑制耐药细胞的侵袭转移及自噬的发生,且这种抑制作用可通过联用AICAR后部分抵消。（4）美洲大蠊多肽PAE2体外对肝癌细胞侵袭转移、自噬的作用可能是通过AMPK来实现的。自噬是个极其复杂的过程,美洲大蠊多肽PAE2可能只影响其中部分过程。（5）美洲大蠊多肽PAE2对裸鼠肿瘤具有很好的抑制性;接种肿瘤对裸鼠肝脏组织影响极为严重,但短期给予美洲大蠊多肽PAE2对这种损伤无明显效果。（6）接种肝癌肿瘤细胞对裸鼠的肝脏损伤较为明显,化疗药物索拉非尼对肝脏具有一定的保护作用;而化疗药物和多肽PAE2均会增加裸鼠的肾脏负担。（7）裸鼠皮下接种肿瘤后对肝功能具有损伤作用,美洲大蠊多肽PAE2则会增加裸鼠的肾脏负担,（8）在裸鼠皮下移植瘤模型中,美洲大蠊多肽PAE2对侵袭转移及自噬相关因子的影响呈现一定趋势但并不如在细胞中明显。
李惠兰[3]（2021）在《新型NO供体聚合物紫杉醇胶束的制备及抗肿瘤作用和机制研究》文中研究表明目的:设计与合成NO供体（mPEG-PLA-NO）型可生物降解的聚合物胶束包载紫杉醇作为纳米药物输送系统（NO/PTX）,旨在增强紫杉醇的溶解度,降低毒性和增强抗肿瘤活性,并对其进行急性毒性研究,药物动力学研究,抗肿瘤的作用和机制研究以及药性评价,为新药开发提供依据。方法:第一部分一氧化氮供体型聚合物紫杉醇胶束的制备和表征选用呋咱型一氧化氮供体,采用活性酸酐法制备了m PEG-PLA-NO两亲性聚合物胶束,采用核磁共振谱（1H NMR）,凝胶渗透色谱仪对m PEG-PLA-NO进行分析。采用自乳化法制备包载紫杉醇于聚合物胶束内核的一氧化氮供体型聚合物紫杉醇纳米胶束（NO/PTX）,采用透射电镜,马尔文激光散射粒度仪对NO/PTX进行形态表征。采用高效液相法对药物载药量和包封率进行了检测和计算。采用Greiss法测定NO/PTX体外一氧化氮的释放。第二部分一氧化氮供体型聚合物紫杉醇胶束急性毒性研究SPF级昆明小鼠60只,适应喂养3 d后,分为m PEG-PLA组和m PEG-PLA-NO组。从800 mg/kg剂量开始,以20 m L/kg的给药体积进行尾静脉注射m PEG-PLA或m PEG-PLA-NO,每个剂量组最少6只小鼠。计算出LD50,进行载药材料安全性评价。另取SPF级昆明小鼠120只,适应喂养3 d后,分为PTX组,NO/PTX组,每组KM小鼠40只,禁食不禁水,称重标记。进行PTX组与NO/PTX组的急性毒性比较。按照15、30、45、60、75 mg/kg浓度梯度尾静脉注射的紫杉醇。在确定Dn和Dm后,根据给药间隔i,以i或i的倍数确定3-5个给药剂量。每个剂量至少5只小鼠,观察,记录状态和死亡情况。计算出LD50,进行药物安全性的比较。观察,记录状态和死亡情况。并且连续观察14 d内小鼠的体重变化,以及毛色、四肢活动、进食、饮水、排泄等情况,并记录各组有无中毒情况出现,以及是否有死亡情况。第三部分一氧化氮供体型聚合物紫杉醇胶束药物动力学研究采用H22细胞建立的雄性KM小鼠异种移植模型,研究了药代动力学和组织分布,以描述NO/PTX在体内的分布。通过尾静脉给小鼠注射盐水中的PTX（20 mg/kg,以紫杉醇计算）或NO/PTX（50 mg/kg,以紫杉醇计算）溶液。在0、0.05、0.5、1、2、3、4、8、12和24 h收集血浆和肿瘤。在每个采样时间点,用乙醚麻醉3至4只小鼠,并通过心脏穿刺从每只小鼠收集血液。然后,处死这些小鼠并收集所有肿瘤。离心后,从每只小鼠收集约100μL血浆并冷冻。通过HPLC测定血浆和肿瘤中PTX的浓度,并以多西紫杉醇为内标,通过HPLC-MS/MS测定心脏,肝脏,脾脏,肺和肾脏中PTX的浓度。使用DAS 2.0软件包（中国药理学会）通过房室分析处理药代动力学参数。第四部分一氧化氮供体型聚合物紫杉醇胶束体外抗肿瘤细胞及对P-gp蛋白的影响体外培养SMMC-7721,SCG-7901,SW480,Sk-ov-3,A549,Bel-7402,HCT-116,MCF-7,Hela,HEPG-2,HT29和NCI-H460共12株人源性肿瘤细胞,采用MTT法检测PTX和NO/PTX对肿瘤细胞的抑制率,并计算半效抑制浓度IC50,实验至少重复3次。体外培养SMMC-7721,SCG-7901,SW480,Sk-ov-3,A549,Bel-7402,HCT-116,MCF-7,Hela,HEPG-2,HT29和NCI-H460共12株人源性肿瘤细胞,采用Western blotting检测PTX和NO/PTX干预后,外排蛋白P-gp蛋白的表达。第五部分一氧化氮供体型聚合物紫杉醇胶束抗结肠癌和紫杉醇耐药性结肠癌作用机制研究通过体外培养人HCT116细胞,PTX,NO/PTX或不含一氧化氮供体的聚合物紫杉醇胶束（PTX Nano）干预24 h后,采用Hoechest/PI染色,倒置荧光显微镜观察细胞数量和形态;流式细胞术观察PTX,NO/PTX对HCT116细胞周期的影响;细胞划痕实验检测PTX,NO/PTX对细胞迁移的影响;Western Blot检测与细胞凋亡和增殖迁移相关蛋白的表达。通过体外培养人HCT116细胞和Taxol/HCT116细胞,倒置荧光显微镜观察两者细胞形态差异;CCK8实验检测PTX和NO/PTX对HCT116细胞和Taxol/HCT116细胞增殖的影响,并计算IC50值和Taxol/HCT116细胞的耐药指数;Western blotting检测HCT116与Taxol/HCT116细胞P-gp蛋白的表达差异以及PTX、NO/PTX对Taxol/HCT116细胞紫杉醇耐药关键蛋白P-gp蛋白和β3-Tublin蛋白的表达。第六部分一氧化氮供体型聚合物紫杉醇胶束抗肝癌作用机制研究通过体外培养人Bel-7402细胞,CCK8检测PTX和NO/PTX对Bel-7402细胞的抑制作用。采用Hoechst 33258染色观察细胞形态和数量。建立H22肝癌小鼠模型,分为空白组,m PEG-PLA组和m PEG-PLA-NO组,给药3次,每次间隔72 h,末次给药后72 h取瘤,称量瘤重计算抑瘤率（%）,观察m PEG-PLA和m PEG-PLA-NO干预后对各移植瘤的影响。通过建立H22肝癌小鼠模型,通过尾静脉注射PTX,Genexol?-PM和NO/PTX,并以生理盐水作为对照。同样给药3次,每次间隔72 h,末次给药后72 h取瘤,称量瘤重计算抑瘤率（%）,观察PTX和NO/PTX干预后对各移植瘤的影响。通过体外培养人Bel-7402细胞,给与PTX和NO/PTX 48 h后,提取Bel-7402细胞蛋白质,采用试剂盒检测细胞内SOD、MDA和GSH-PX水平。流式细胞术观察PTX和NO/PTX对细胞Bel-7402凋亡检测。Western Blot检测NO/PTX对于铁死亡,焦亡,内质网应激相关蛋白的作用。第七部分一氧化氮供体型聚合物紫杉醇胶束药性评价SD大鼠40只,分为空白组,PTX组,NO/PTX组,PTX Nano组。每组10只。每三天给药一次,共给药七次。检测大鼠体温和体重变化,安捷伦1290串联6460三重四级杆质谱仪检测大鼠尿液代谢组。正交偏最小二乘（OSC-PLS-DA）分析数据,进行药性判别。结果第一部分一氧化氮供体型聚合物紫杉醇胶束的制备和表征制备并合成了m PEG-PLA-NO,核磁共振谱（1H NMR）结构确证其分子结构,凝胶渗透色谱仪（GPC）分析m PEG-PLA的PDI为1.19,m PEG-PLA-NO的PDI为1.13。制备了聚合物胶束NO/PTX,粒径为30±0.58 nm,zeta电位为-2.76±0.25。透射电镜结果表明NO/PTX呈球形,分布均匀。NO/PTX的包封率为98.6%,NO/PTX的紫杉醇载药量4.69%。Greiss法测定一氧化氮释放率,结果表明,与硝酸甘油和PTX相比,NO/PTX在10 h内具有良好的释放性能,在6 h内释放率最高,达到66.8%。第二部分一氧化氮供体型聚合物紫杉醇胶束急性毒性研究通过CALC 2.0软件和BLISS方法确定半数致死量(LD50)和最大非致死剂量（MNLD）。m PEG-PLA和m PEG-PLA-NO的MNLD分别为2000 mg/kg和1500 mg/kg,表明m PEG-PLA和m PEG-PLA-NO均为无毒两亲性共聚物。PTX的最大耐受剂量LD0为36.3 mg/kg,绝对致死剂量LD100为45 mg/kg。NO/PTX的最大耐受剂量LD0为80 mg/kg,绝对致死剂量LD100为160 mg/kg。KM小鼠中PTX和NO/PTX的LD50分别为39.9 mg/kg和137.1 mg/kg。NO/PTX的急性毒性比PTX降低了3.43倍。第三部分一氧化氮供体型聚合物紫杉醇胶束药物动力学研究血清样品预处理后,其中的内源性物质不干扰紫杉醇和内标的测定。在此色谱条件下血浆中多西紫杉醇、紫杉醇的保留时间分别为19.43 min和22.08 min。按照加权最小二乘法计算线性关系式为:Y=0.0618X-0.0648（R2=0.9986）,（n=3）表明血浆紫杉醇的质量浓度在0.5～150μg/m L内线性关系好。按照加权最小二乘法计算线性关系式为:Y=0.0783X-0.2581（R2=0.9961）,（n=3）表明肿瘤组织紫杉醇的质量浓度在1～150μg/m L内线性关系好。紫杉醇浓度由高到低逐渐稀释,测定出最低检测限紫杉醇浓度为0.25μg/m L,最低定量限血浆紫杉醇浓度为0.5μM/m L,肿瘤组织为1μg/m L,准确度均在85%-115%之间,精密度RSD均小于15%。血浆提取回收率分别为103.2%,99.4%,95.7%,肿瘤提取去回收率分别为112.0%,95.2%,95.5%。内标提取回收率为92.55%。小鼠尾静脉注射PTX或NO/PTX后在体内的代谢与二室模型相符。小鼠尾静脉注射50 mg/kg剂量的NO/PTX后,获得的峰值血浆浓度(Cmax)为105.2μg/m L,尾静脉注射20 mg/kg剂量的PTX后,Cmax为71.7μg/m L。PTX的消除半衰期(t1/2β)1.5 h,NO/PTX的t1/2β为1.7 h。NO/PTX和PTX的血浆浓度-时间曲线下的面积(AUC（0-∞）)分别为128.1μg.h/m L和86.9μg.h/m L/kg。NO/PTX的AUC（0-∞）是PTX的1.35倍。在给药用后,紫杉醇广泛分布于大多数组织中。其中,在肿瘤中明显发现了最高的紫杉醇浓度。在所有时间点,肿瘤中NO/PTX组的紫杉醇浓度均高于PTX组,并在3 h左右达到最大紫杉醇浓度。除肿瘤外的各组织器官中紫杉醇的浓度较低,在KM小鼠组织器官中,紫杉醇最高浓度低于10μg/m L,大部分在24 h以后消除完全。给药后（3 min以后）,PTX在组织器官中分布顺序为:肿瘤>肾>肺>心>脾>肝,NO/PTX在各组织器官中分布顺序为:肿瘤>肺>肾>心>脾>肝。第四部分一氧化氮供体型聚合物紫杉醇胶束体外抗肿瘤细胞及对P-gp蛋白的影响本实验采MTT法对12种人源性肿瘤细胞进行药效学研究,实验均最少重复三次。结果显示NO/PTX在人乳腺癌细胞MCF-7,人胃腺癌细胞SCG-7901,人结肠癌细胞SW480,人结直肠腺癌细胞HCT-116,人肝癌细胞Bel-7402的IC50值较国产紫杉醇注射液低,表明其抗肿瘤效果优于国产紫杉醇注射液。电泳显色结果显示,在紫杉醇0.01μg/mL的浓度下,NO/PTX组Bel-7402细胞SW480细胞,Hela细胞,SMMC-7721细胞,HCT-116细胞,Hep G2细胞,MCF-7细胞,HT29细胞,SCG-7901细胞的P-gp蛋白表达量低于PTX组,表明NO/PTX增强紫杉醇抗肿瘤效果可能与抑制P-gp蛋白相关。第五部分一氧化氮供体型聚合物紫杉醇胶束抗结肠癌和紫杉醇耐药性结肠癌作用机制研究首先,通过Hoechst/PI染色,可以更直观的观察到NO/PTX较PTX具有更好的抗结肠癌HCT116作用。通过细胞周期实验,我们检测到NO/PTX在0.001μg/m L和PTX 0.01μg/m L两个浓度对细胞G2M期的抑制作用均大于PTX（NO/PTX抑制率为39.6%和50%,PTX为30.2%和36.3%）。Western Blot检测结果表明,NO/PTX较空白组,PTX组更能够降低HCT116细胞P-gp蛋白的表达。Western Blot检测同时表明,NO/PTX较空白组和PTX组,能够增加促凋亡蛋白BAX表达,降低抗凋亡蛋白Bcl-2表达,升高BAX/Bcl-2的比值,增加Cleaved Caspase 3的表达,显示出比市售紫杉醇注射液PTX更好的抗人结肠癌HCT116的结果。无一氧化氮供体的聚合物紫杉醇纳米胶束PTX Nano较空白组和PTX组,也能够降低HCT116细胞P-gp蛋白和增加Cleaved Caspase 3的表达,但降低P-gp蛋白和增加Cleaved Caspase 3的表达的作用比不上NO/PTX。PTX Nano证明m PEG-PLA聚合物胶束具有一定的抗肿瘤制剂优势,同时表明NO/PTX抗肿瘤作用不仅仅是因为制剂优势,还是紫杉醇与一氧化氮供体双重阻断的结果。其次,细胞划痕实验表明,NO/PTX较空白组和PTX组具有更好的抗HCT116细胞增殖迁移的能力。Western Blot检测结果表明,NO/PTX降低Vimentin蛋白表达,增加ZO-1蛋白表达,降低β3-Tublin和p-GSK-3β表达。PTX Nano较NO/PTX显示出更好的降低Vimentin蛋白表达,增加ZO-1蛋白表达能力,然而对于没有显示出降低β3-Tublin和p-GSK-3β表达作用。再者,NO/PTX抗结肠癌肿瘤优势还体现在对于结肠癌耐药细胞具有更好的抗肿瘤作用。我们首先对耐紫杉醇人结肠癌细胞Taxol/HCT116细胞的细胞形态,耐药稀释和P-gp蛋白表达进行了研究。确认Taxol/HCT116细胞较HCT116细胞具有强的紫杉醇耐药性。CCK8实验分析PTX和NO/PTX对taxol/HCT116细胞的增殖的影响,结果表明NO/PTX(IC50:1.2±0.4μg/m L)的IC50显着低于PTX(IC50:5.6±1.9μg/m L),NO/PTX具有比PTX低至4.66倍的IC50值,表明NO/PTX较PTX具有更加显着的抗结肠癌耐药性作用。Western Blot检测结果表明,NO/PTX较空白组和PTX组,显着降低了紫杉醇耐药性的关键蛋白P-gp蛋白和β3-tublin蛋白的表达。第六部分一氧化氮供体型聚合物紫杉醇胶束抗肝癌作用机制研究首先,我们用CCK8检查了NO/PTX和PTX对肝癌Bel-7402细胞的影响。PTX的IC50为7.8±0.4μg/m L,NO/PTX IC50为3.7±1.1μg/m L。这些结果表明,NO/PTX对Bel-7402细胞的毒性比PTX强。用Hoechst 33258染色法检测各组细胞凋亡情况有相同结论。其次,本部分首先制备了H22肝癌荷瘤小鼠模型,实验结果表明,聚合物m PEG-PLA没有显示任何抗肿瘤反应,在m PEG-PLA-NO组中观察到轻微的抗肿瘤作用。在PTX,Genexol?-PM和NO/PTX组中观察到了显着的抗肿瘤活性。PTX,Genexol?-PM和NO/PTX组在低剂量（10 mg/kg）下显示出可比的抗肿瘤活性（抑制率分别为39%,36%和41%）。此外,当剂量达到15 mg/kg时,NO/PTX的抗肿瘤作用明显强于PTX和Genexol?-PM组（PTX,Genexol?-PM和NO/PTX组分别为53%,41%和67%）,证明NO和紫杉醇的协同作用增强了抗肿瘤活性。此外,我们阐明了NO/PTX诱导肝癌细胞死亡是由铁死亡,焦亡,内质网应激（ERS）和凋亡相关网络介导的。NO/PTX通过增加活性氧（ROS）和丙二醛的水平,并降低谷胱甘肽过氧化物酶,超氧化物歧化酶和谷胱甘肽过氧化物酶4的水平引起铁死亡。使用铁死亡抑制剂Ferrostatin-1或ROS抑制剂N-乙酰半胱氨酸会降低NO/PTX的抗癌活性。此外,NO/PTX上调了caspase-1的表达,下调了炎性细胞因子IL-1β,这是细胞焦亡的关键蛋白。此外,NO/PTX上调了一系列调节剂的表达,例如钙结合蛋白,需肌醇酶1a（IRE1a）,葡萄糖调节蛋白78（GRP78）,cleaved-caspase-7,cleaved-caspase-3和降低的B-细胞淋巴瘤2（BCL-2）,核NF-κB,可诱导Bel-7402内质网介导的应激和凋亡。更重要的是,我们证明了NO/PTX增强的抗肿瘤作用可能与下调多药耐药转运蛋白P-gp蛋白,β3-微管蛋白,致敏紫杉醇化疗有关。最后,我们通过流式细胞仪,紫杉醇干预48 h后,检测了Bel-7402细胞凋亡率。NO/PTX在各浓度的凋亡率均高于PTX,表明NO/PTX较PTX具有更好的抗Bel-7402细胞作用。第七部分一氧化氮供体型聚合物紫杉醇胶束药性评价PTX组,NO/PTX组和PTX Nano组均位于寒性药区域,无明显的差异。表明PTX,NO/PTX和PTX Nano均属于寒性药,通过制剂手段制备成聚合物紫杉醇胶束或者连接供体的聚合物紫杉醇胶束,均没有改变药物的药性。结论1、NO/PTX是一种粒径为30 nm左右,呈球形,分布均匀的一氧化氮供体型聚合物紫杉醇胶束,NO/PTX的包封率为98.6%,NO/PTX的紫杉醇的载药量4.69%,具有良好的一氧化氮释放性能。载药材料m PEG-PLA和m PEG-PLA-NO均具有良好的安全性。NO/PTX耐受性好,最大耐受剂量是PTX的2.2倍。NO/PTX主要分布于肿瘤组织中,在组织器官中的浓度低。2、NO/PTX对MCF-7,SCG-7901,SW480,HCT-116,Bel-7402细胞中抗肿瘤效果优于国产紫杉醇注射液PTX,其增强紫杉醇的抗肿瘤效果与抑制P-gp蛋白表达相关。3、NO/PTX较PTX具有更好的抗结肠癌HCT116作用和抗HCT116细胞增殖迁移的能力,与紫杉醇和一氧化氮供体双重阻断相关。NO/PTX较PTX对于结肠癌耐药具有更好的抗紫杉醇耐药性,NO/PTX的抗紫杉醇耐药性作用与NO/PTX抑制P-gp和β3-tublin蛋白表达相关。4、NO/PTX诱导肝癌细胞死亡是由铁死亡,焦亡,内质网应激和凋亡相关网络介导的。抑制铁死亡降低了NO/PTX对Bel-7402细胞毒性。高浓度的NO/PTX引起Bel-7402细胞主要死亡方式为凋亡,而焦亡发生在NO/PTX中低浓度。5、PTX,NO/PTX和PTX Nano均属于寒性药,通过制剂手段制备成PTX Nano或者连接供体的NO/PTX,均没有改变药物的药性。
张俊林[4]（2021）在《FABP5调控人肝细胞癌细胞5-FU耐受机制的研究》文中研究表明目的:肝癌是一种恶性程度很高的癌症,其最主要的病因为乙肝病毒（HBV）感染,我国做为一个乙肝大国,每年有大量新增肝癌病例,这其中90%以上的病例病理类型为肝细胞癌（HCC）,目前对所有病人的治疗中,药物治疗仍占相当大的比例,而耐药性的出现,使整体生存率的改善并不明显。在HCC细胞Bel7402和Bel7402耐5-FU两种细胞株中,我们通过质谱蛋白组学分析,发现FABP5在耐药株Bel/5-FU中比Bel7402中表达量明显升高。鉴于在各种癌症中,FABP5的升高预示着不良的后果,我们探索了FABP5在HCC对5-FU耐药中的作用,并初步探索了影响的机制。方法:1.我们通过GEPIA数据库检索了在肝细胞癌中FABP5的表达量与正常肝组织的差异,并且检测了FABP5表达量的高低对对病人总体生存曲线的影响。2.通过平板克隆形成实验和CCK-8测定IC50曲线,验证Bel/5-FU细胞株的耐药性,而Bel7402细胞株对5-FU敏感。3.验证蛋白组学结果,分别从q PCR和Western Blot两种方法检测FABP5在m RNA和蛋白水平,在两种细胞株中的表达量;我们又检查了在其他肝细胞癌细胞株Huh7中,FABP5的表达量与与前两种细胞的对比:又检测了Bel/5-FU细胞株在不同5-FU药物浓度条件下培养,FABP5表达量的变化。4.通过q PCR和Western Blot实验检测敲降和过表达FABP5细胞株的构建。5.平板克隆形成实验和CCK-8检测敲降和过表达FABP5之后细胞的克隆形成能力和细胞增殖能力的影响。6.检测耐药相关蛋白P-gp在两种细胞株中的表达情况,同时检测敲降和过表达FABP5之后,对P-gp表达的影响。7.通过数据库检索和查阅文献,寻找FABP5影响的下游分子PPARγ,并用Western Blot检测敲降和过表达FABP5之后,PPARγ表达水平的变化。结果:1.GEPIA数据库结果显示,肝细胞癌组织比正常肝组织中,FABP5的表达量明显升高,并且临床中FABP5表达量高的病人比表达量低的病人总体生存率明显降低,差异具有统计学意义（P<0.05）。2.平板克隆形成实验和CCK-8测定药物作用曲线IC-50,均显示Bel/5-FU对5-FU耐药,而Bel7402对5-FU敏感。3.q PCR和Western Blot分别显示,FABP5在m RNA和蛋白水平在Bel/5-FU比Bel7402明显升高,差异具有统计学意义（P<0.05）;FABP5在HCC细胞株Huh7中蛋白表达量处于较高水平;Bel/5-FU细胞株在不同5-FU药物浓度条件下培养,对FABP5蛋白表达水平无影响。4.q PCR和Western Blot都显示,Bel/5-FU瞬转敲降、Bel7402稳转过表达和Bel/5-FU稳转敲降细胞株构建成功,且敲降序列中,si486的敲降效率最高。5.在Bel7402中过表达FABP5,使细胞对5-FU的耐受性增强,在Bel/5-FU中敲降FABP5,使细胞对5-FU的耐受性降低。6.分子水平Western Blot显示,耐药相关蛋白P-gp在Bel/5-FU中表达量高于Bel7402,且P-gp的表达量随着FABP5的表达量升高而升高,降低而降低。7.FABP5可正向调节下游核转录因子PPARγ的表达。结论:FABP5升高与HCC患者预后不良有关,提示FABP5可能成为临床诊断和治疗中有意义的指标和潜在的药物靶点;Bel/5-FU耐药细胞中FABP5的表达量升高,并且敲降FABP5可使耐药性降低,在Bel7402中过表达FABP5,可增加对5-FU的耐药性;在HCC中,FABP5可调节下游核转录因子PPARγ的表达。
马雨水[5]（2020）在《肝癌中lncRNA OIP5-AS1和miR-302调控机制及洛那法尼联合Degrasyn疗效研究》文中指出作为目前最常见的致死性肿瘤疾病之一,肝癌的五年生存率仅7%。肝癌发生隐袭,其早期诊断十分困难,大约90%的肝癌患者被诊断时已是中晚期而丧失外科手术切除机会,导致肝癌的预后非常差。常规化疗药物治疗不仅毒副作用大,而且不能明显缓解疾病进展或延长患者生命。因此需要对于肝癌的发病机制和其中的关键调控因子进行深入的研究,提高肝癌的早期诊断、开发新型肝癌治疗药物,提高肝癌治疗疗效,延缓肿瘤复发与转移,改善患者预后。据报道,lnc RNA OIP5-AS1在几种癌症中表达增加。然而,lnc RNA OIP5-AS1在肝癌中的作用仍有待研究。在本文第一部分中,我们通过实时定量PCR实验,证实lnc RNA OIP5-AS1在肝癌组织标本中上调,其过表达与肝癌患者的低生存率有关。细胞和裸鼠的体内外功能实验也表明,lnc RNA OIP5-AS1可以促进肝癌细胞增殖,抑制细胞凋亡。此外,荧光素酶分析证实lnc RNA OIP5-AS1与hsa-mi R-26a-3p,EPHA2之间的结合位点。回复实验进一步证实lnc RNA OIP5-AS1对肝癌细胞生物学行为的影响。基于以上实验探讨,我们的研究结果提示lnc RNA OIP5-AS1可能通过调节hsa-mi R-26a-3p/EPHA2信号轴来促进肝癌细胞的增殖和侵袭。实验证据表明,肝细胞癌的发生和发展过程中,肝癌干细胞（LCSCs）可能起重要的作用。其中,微小RNA（mi RNA）在LCSCs诱发的肝癌中起着重要的作用,但mi RNA-302家族在LCSCs中的作用和相关分子机制却鲜为人知。本文第二部分中,我们应用Mi RNAs微阵列技术,检测参与LCSCs维持和分化的mi RNAs;进而我们探讨mi R-302a/d及其靶基因E2F7在肝癌中的生物学作用及其分子机制。同时,我们采用定量PCR和Kaplan-Meier生存分析法检测mi R-302a/d和E2F7在HCC患者中的表达及相关性。我们的结果显示:mi RNA-302家族成员在HCC细胞球形形成过程中下调,mi R-302a/d表达低的肝癌患者的生存期（OS）和无进展生存期（PFS）相对较短。此外,荧光素酶分析证实mi R-302a/d直接靶向抑制E2F7。过表达mi R-302a/d抑制E2F7 m RNA和蛋白表达。而且mi R-302a/d的低表达和E2F7的高表达与肝癌患者OS和PFS较短显着相关。进一步的细胞功能分析也表明mi R-302a/d可能通过直接抑制靶基因E2F7及其下游AKT/β-catenin/CCND1信号通路,负调控肝癌干细胞的自我更新能力和细胞周期转换。因此,我们的结果提示:E2F7是mi R-302a/d的直接靶点,mi R-302a/d通过靶向E2F7/AKT/β-catenin/CCND1信号通路抑制LCSCs的干细胞和肝癌细胞的增殖。在论文第三部分中,我们通过条件性c Myc转基因小鼠与Alb-Cre工具小鼠杂交,在肝脏内形成自发肝癌,用于肝癌模型的建立与后续的机制研究,以及洛那法尼联合Degrasyn对Alb-c Myc自发成瘤肝癌小鼠治疗作用及其机制的初步探讨。我们的结果发现洛那法尼联合Degrasyn治疗组的小鼠肝表面癌结节明显减少、体重恢复,中位生存期延长,提示洛那法尼联合Degrasyn没有明显的毒副作用,并且对Alb-c Myc自发成瘤小鼠有一定的治疗效果。机制上,我们通过全转录组测序发现,与对照组相比,Alb-c Myc组样本中发现2655个dif-m RNAs、96个dif-mi RNAs以及158个dif-lnc RNAs。对与m RNA相关的差异表达基因的富集分析证实参与染色体稳定性和蛋白质降解过程的基因可能在肝癌的发病机制中起重要作用。进一步的实验验证,与对照组相比,lnc RNA OIP5-AS1和E2F7在Alb-c Myc自发成瘤小鼠的肝癌组织中显着上调,而洛那法尼联合Degrasyn治疗后显着降低;相关mi R-26a-3p,mi R-302a/d和EPHA2在Alb-c Myc自发成瘤小鼠的肝癌组织中显着下调,而洛那法尼联合Degrasyn治疗后显着升高。这些结果暗示:洛那法尼联合Degrasyn具有Alb-c Myc自发性肝癌小鼠模型治疗作用,其机制涉及对lnc RNA OIP5-AS1,mi R-26a-3p,EPHA2,mi R-302a/d和E2F7表达的调控效应。总之,本论文揭示肝癌中lnc RNA OIP5-AS1通过hsa-mi R-26a-3p/EPHA2轴和mi R-302a/d通过靶向E2F7/AKT/β-catenin/CCND1信号通路调控肝癌细胞恶性生物学行为的分子机制;洛那法尼联合Degrasyn具有Alb-c Myc自发性肝癌小鼠模型治疗作用。以上两部分机制研究加深我们对第三部分洛那法尼联合Degrasyn对肝癌治疗效果作用的理解,为肝癌的诊断和治疗提供理论和实践基础。
刘熙[6]（2020）在《冬凌草甲素衍生物GYD0618对乳腺癌和卵巢癌耐药细胞的抑制作用及机制研究》文中提出[目 的]恶性肿瘤严重威胁着人类的健康,目前化疗仍是恶性肿瘤临床治疗的主要方法之一。肿瘤多药耐药（Multidrug resistance,MDR）的产生是导致化疗失败,影响肿瘤患者临床预后的主要因素。因此,探寻新型作用机制、作用靶点的抗MDR药物是改变肿瘤治疗现状的重要途径,具有重要的临床意义。本课题组基于冬凌草甲素的抗肿瘤活性及其构效关系,构建了一系列以构象限制、取代基变换以及环特性变换等为特点的新型冬凌草甲素衍生物,并在前期研究中证实了其抗肿瘤作用,但该系列化合物是否具有抗肿瘤多药耐药的作用尚不清楚。本研究以耐阿霉素人乳腺癌MCF-7/ADR细胞和耐顺铂人卵巢癌A2780/CP细胞为模型,体内、外实验考察抗肿瘤活性较高的冬凌草甲素衍生物CYD0618对乳腺癌和卵巢癌细胞耐药细胞的抑制作用,并探讨其作用机制。[方 法]1.采用MTT实验、克隆形成实验检测冬凌草甲素衍生物YD0514,CYD0618和CYD0686对MCF-7/ADR和A2780/CP耐药细胞的增殖抑制作用。2.采用细胞划痕实验、Transwell实验考察CYD0618对MCF-7/ADR和A2780/CP耐药细胞迁移及侵袭能力的影响。3.采用流式细胞技术检测CYD0618对MCF-7/ADR和A2780/CP耐药细胞凋亡的影响。4.构建MCF-7/ADR和A2780/CP耐药细胞裸鼠移植瘤模型,考察CYD0618在体内对移植瘤的生长抑制作用。5.采用siRNA干扰技术敲低MCF-7/ADR和A2780/CP耐药细胞STAT3的表达,检测干扰STAT3对细胞耐药性的影响。6.转染 STAT3 过表达载体（pcDNA-STAT3）或 IL-6 刺激 MCF-7 和 A2780细胞高表达STAT3,检测过表达STAT3对细胞耐药性的影响。7.采用Western Blot及免疫组织化学方法检测CYD0618对MCF-7/ADR和A2780/CP耐药细胞STAT3及其下游信号分子表达的影响。8.采用免疫荧光技术检测CYD0618对STAT3表达及核定位的影响。9.采用分子对接法模拟分析CYD0618和STAT3相互作用的结构域。10.采用免疫共沉淀法和细胞热转变实验（Cellular Thermal Shift Assay,CETSA）检测 CYD0618 和 STAT3 的结合。[结 果]1.MCF-7/ADR及A2780/CP耐药细胞呈现多药耐药特性,且具有更强的迁移及侵袭能力。2.冬凌草甲素衍生物 YD0514、CYD0686、CYD0618 对 MCF-7/ADR 及A2780/CP耐药细胞均有抑制作用,且呈时间和剂量依赖性,其中CYD0618的抑制作用最强。3.划痕实验,Transwell实验结果发现CYD0618能够抑制MCF-7/ADR及A2780/CP耐药细胞的迁移及侵袭。4.流式细胞分析结果示CYD0618能够显着促进MCF-7/ADR及A2780/CP耐药细胞的凋亡。5.体内实验结果显示CYD0618显着抑制MCF-7/ADR和A2780/CP耐药细胞裸鼠移植瘤的生长,且无明显的毒副作用。6.分别在MCF-7/ADR及A2780/CP耐药细胞中干扰STAT3,在MCF-7、A2780细胞中过表达STAT3,药物敏感实验结果显示STAT3与乳腺癌及卵巢癌细胞的耐药性密切相关。7.Western Blot结果显示CYD0618能显着抑制STAT3的表达及磷酸化,以及STAT3下游增殖、凋亡及侵袭转移相关分子的表达。免疫组化分析证实CYD0618 能抑制移植瘤 STAT3、p-STAT3、Cyclin D1 的表达,并促进 Cleaved Caspase-3的表达。免疫荧光结果示CYD0618能够抑制STAT3入核。8.分子对接结果示CYD0618能够靶向结合STAT3的SH2结构域,引起构象变化,从而抑制Tyr705残基处STAT3的磷酸化。免疫共沉淀及CETSA结果显示CYD0618能够直接结合STAT3。[结 论]STAT3的激活与乳腺癌和卵巢癌细胞的耐药性密切相关,提示药物靶向调控STAT3的活性与功能可能是一种合理、有效的抗肿瘤多药耐药的策略。冬凌草甲素衍生物CYD0618对乳腺癌及卵巢癌耐药细胞均具有显着的体内、体外抑制作用。CYD0618通过直接靶向结合并抑制STAT3,进而抑制MCF-7/ADR及A2780/CP耐药细胞的增殖、侵袭和转移,促进耐药细胞的凋亡。本研究结果表明冬凌草甲素衍生物CYD0618是一种有效的STAT3抑制剂,具备开发为抗肿瘤新药的潜力。
章立华[7]（2020）在《胃癌体细胞突变图谱的构建及特征性点突变的功能挖掘与验证》文中研究说明胃癌是中国发病率排名第二、死亡率排名第三的恶性肿瘤。晚期胃癌患者治疗效果较差,其中主要原因是胃癌组织基因突变的多样性与多克隆性,及其与微环境（包括机体免疫系统）长期互动演变赋予复杂的生物学特性。近年来,随着高通量测序技术的不断发展,癌症突变图谱和癌症基因组学研究已取得快速的突破,然而胃癌的全外显子组突变图谱特征和分子功能机制尚不完全清楚,迫切需要对胃癌基因突变特征及其生物学功能深入研究,从而为胃癌精准医学提供理论基础和转化医学依据,具有重要的临床意义和社会价值。本论文对46例胃癌患者的癌组织和癌旁组织进行了全外显子测序（Whole Exome Sequencing,WES）和生物信息学分析,构建了胃癌全外显子组突变图谱,分析了胃癌分子突变特征,并进一步在国际癌症基因组联盟（International Cancer Genome Consortium,ICGC）数据库中的胃癌WES数据集中进行分析与验证,再结合患者的病例信息和预后随访数据,挖掘与临床治疗相关的候选突变基因和突变位点,并运用体内外实验验证特征性基因突变的生物学功能和临床意义。本论文的主要内容和结果如下:1.通过WES和生信分析,提示了胃癌体细胞突变图谱及突变特征。从江南大学附属医院随机抽取1200份胃癌的电子病历,筛选出111份具有完整的诊断、随访信息且完好足量的癌和癌旁正常组织样本,通过基因组DNA抽提、文库构建、外显子捕获、测序得到Fastq格式的测序原始数据,然后使用FastQC进行数据质控,GATK4 Mutect2检测体细胞突变,Funcotator对体细胞突变进行功能注释,Maftools包对体细胞突变进行数据统计分析和可视化展示,最终得到46例胃癌突变图谱特征。主要结果包括:（1）前10位高频突变的基因为TP53（51%）、TTN（49%）、FLG（30%）、SYNE1（30%）、HMCN1（26%）、ASPM（26%）、DNAH5（23%）、FSIP2（23%）、XIRP2（21%）、MUC16（21%）;突变负荷为6.494±1.067 bp/Mbp。（2）在突变分类上,错义突变占比85.51%,移码缺失突变占比6.56%,无义突变占比4.22%,移码插入突变占比1.79%,框内缺失突变占比1.48%,框内插入突变占比0.33%,无终止密码突变占比0.09%;在变异类型上,单核苷酸变异占比89.83%,缺失突变占比8.07%,插入突变占比2.12%;在单核苷酸突变类型上,C>T突变占比62.30%,C>A突变占比15.86%,T>C突变占比13.62%,T>G突变占比5.32%,C>G突变占比6.84%,T>A突变占比4.07%;转换突变占比82.82%,颠换突变占比17.17%。（3）药物基因组显着富集突变的基因为TP53、APOB、FAT3、HMCN1、MUC16和OBSCN;（4）显着性富集的突变通路为RTK-RAS、PI3K、TGF-Beta、WNT和TP53（P<0.01）;（5）TP53被显着富集为驱动基因（MutSigCV算法和oncodriveCLUST算法）。这些结果从基因组分子水平提示了胃癌体细胞突变特征,提示胃癌体细胞突变方式存在着多样性;TP53、MUC16和HMCN1突变可能影响药物治疗效果;RTK-RAS、PI3K、TGF-Beta、WNT、TP53通路突变可能和胃癌的发生发展有关。2.通过对不同数据集胃癌基因突变图谱的交叉验证和进一步筛选,发现TP53R337C突变是潜在不良预后标志物及潜在有害性突变位点。为了进一步探讨胃癌基因突变图谱特征,本文在ICGC癌症测序数据库中,对美国（443例）、日本（585例）和中国（北京大学肿瘤医院,123例）的胃癌外显子测序数据集进行分析并绘制突变图谱。在TCGA胃癌数据集中,根据临床病理信息和随访信息,进行了Kaplan-Meier生存分析,COX与LASSO回归分析,筛选出与预后相关的位点,并在江南大学附属医院数据集中进行验证。结果显示TP53突变频率在日本数据集中为56%（高频排名第一）,在美国数据集中为39%（高频排名第二）,在中国（北京大学肿瘤医院）中为39%（高频排名第一）。单因素和多因素COX回归分析均显示与预后相关的10个TP53突变位点为:SNP7675101、SNP7675209、SNP7674202、SNP7675178、SNP7674954、SNP7670700、SNP7673772、SNP7675161、SNP7675203、SNP7675229。在江南大学附属医院数据集中发现TP53突变与化疗耐药相关,携带TP53的SNP7670700（R337C）位点突变的胃癌患者不仅总生存期显着短,而且无进展生存期也显着缩短。上述结果提示TP53 R337C突变是潜在不良预后标志物及潜在有害性突变位点,值得进一步研究其生物学功能。3.通过实验验证发现TP53 R337C突变可促进胃癌的5-FU耐药。本文对AGS和SGC7901胃癌细胞系,分别转染TP53 R337C突变型质粒和TP53野生型质粒,采用细胞毒性实验测定胃癌细胞的5-氟尿嘧啶（5-FU）半抑制浓度(IC50),评估其对5-FU的敏感性。结果显示,与过表达野生型TP53相比,过表达R337C突变型TP53显着提高AGS和SGC7901细胞的IC50,提示TP53 R337C突变可能促进胃癌细胞的5-FU耐药。进一步运用稳定过表达R337C突变型和野生型TP53胃癌AGS细胞进行裸鼠皮下成瘤实验和5-FU治疗,结果显示TP53 R337C突变组裸鼠移植瘤体积显着大于野生型组,这进一步证实TP53 R337C突变可能促进5-FU耐药。同时在过表达TP53 R337C的AGS和SGC7901细胞中,沉默R337C突变TP53的表达,可显着增强胃癌细胞对5-FU的敏感性,提示干扰TP53 R337C的表达可能逆转5-FU耐药。以上结果提示TP53 R337C可能是潜在的胃癌化疗耐药标志物,靶向TP53 R337C突变为逆转耐药提供了新的思路,具有潜在的临床应用价值。本研究运用WES技术绘制了无锡地区胃癌基因突变图谱,并分析了其突变特征,且对比了中国（北京大学肿瘤医院）、日本、美国的胃癌突变图谱,在这1197例胃癌样本中发现TP53处于高频突变,结合临床分析发现了TP53基因10个潜在的危害性突变位点,并通过体内外实验证实了TP53 R337C突变可促进胃癌细胞对5-FU的耐药,首次提示TP53 R337C突变是胃癌潜在的耐药标志物和治疗靶点,为胃癌精准用药和新药靶点的发现提供了理论依据。
吕鸿[8]（2020）在《美洲大蠊多肽PAE2逆转HepG2/ADM多药耐药性的作用及机制研究》文中研究说明目的:探讨美洲大蠊多肽PAE2逆转人肝细胞癌耐药细胞HepG2/ADM多药耐药（MDR）的作用及其机制。方法:通过以下方法从体内外用药确定美洲大蠊多肽PAE2单体逆转肝癌MDR的作用及机制。（1）以人肝细胞癌敏感细胞株HepG2,耐ADM的耐药细胞株HepG2/ADM和Balb/c-nude小鼠为研究对象;（2）MTT法检测HepG2/ADM细胞的多药耐药性;确定美洲大蠊提取物多肽PAE2、CⅡ-3、脱脂膏的逆转剂量;（3）通过激光共聚焦显微镜观察HepG2/ADM细胞内ADM的累积情况;（4）采用免疫印迹法检测多肽PAE2对HepG2/ADM细胞中相关凋亡蛋白Bax、Bcl-2、Caspase-9、PARP的影响;（5）采用免疫细胞化学染色法和RT-qPCR法检测HepG2/ADM细胞中P-gp、MRP、LRP、BCRP、PKC、GST-π、Topo II的蛋白和m RNA的相对表达量,探究PAE2逆转MDR的机制;（6）采用免疫细胞化学染色法检测HepG2/ADM细胞中VEGF蛋白的相对表达量,探究PAE2对HCC血管生成能力的影响;（7）采用Balb/c-nude小鼠建立HepG2和HepG2/ADM细胞的腋下移植瘤模型;（8）观察移植瘤裸鼠的一般状态、免疫器官、肝肾功能的改变;（9）采用与细胞实验相同的方法检测多肽PAE2对肿瘤生长抑制、诱导肿瘤细胞调亡、调节肿瘤组织多药耐药相关蛋白和相关酶及血管生成的影响;（10）HE染色法检测肿瘤组织病理学改变。结果:（1）MTT结果显示,HepG2/ADM细胞对临床常用的五种化疗药物5-FU、ADM、CTX、VCR、OXP均出现了不同程度的耐药,耐药倍数在2～5之间,表现出交叉耐药性。（2）MTT法确定PAE2的逆转剂量,经SPSS计算得PAE2对HepG2/ADM细胞作用48 h的IC5（3.21±1.09μg/m L）、IC10（22.19±7.10μg/m L）、IC20（183.19±64.38μg/m L）,分别作为实验中美洲大蠊多肽PAE2的低、中、高剂量。（3）高剂量的PAE2与5-FU、AMD、VCR、CTX和OXP合用后,可不同程度的逆转多药耐药HepG2/ADM细胞对不同化疗药物的耐药性。逆转指数分别为1.15、1.16、1.25、1.94、1.39,表明PAE2具有逆转MDR作用。（4）激光共聚焦实验结果显示PAE2能促进HepG2/ADM细胞株对ADM的摄取,减少耐药细胞对药物的外排,改善HepG2/ADM细胞株的交叉耐药性。（5）免疫印迹实验表明,PAE2主要通过HepG2/ADM异源二聚体参与的信号通路,激活凋亡蛋白的表达来诱导HepG2/ADM细胞株的凋亡;PAE2对于Caspase-9和PARP蛋白介导的凋亡通路也有一定影响。（6）免疫细胞化学染色结果显示,与HepG2细胞相比,HepG2/ADM细胞株中的P-gp、LRP、BCRP、VEGF、PCK、GST-π、Topo II表达量显着上调,存在统计学差异,与HepG2/ADM细胞株产生MDR作用相关,PAE2对P-gp、LRP、BCRP、VEGF、PCK、GST-π、Topo II蛋白的表达有明显的抑制作用。（7）RT-qPCR结果显示HepG2/ADM细胞株产生MDR的作用是与MDR1、LRP、BCRP、GST-π、Topo II高表达,造成药物外排,摄取不足,细胞内的药物代谢异常相关,PAE2对MDR相关蛋白和相关酶m RNA的表达有明显的抑制作用,具有统计学意义。（8）在Balb/c-nude小鼠成瘤的实验中,经过对脏器指数、BUN、Cr、AST、ALT的检测,显示美洲大蠊提取物相对安全,对裸小鼠主要脏器无毒副作用,而且可降低移植瘤小鼠的肾损伤,有保护心肝细胞的作用,静脉给药方式在此方面的作用可能由于口服给药组方式。（9）PAE2的所有剂量的两种给药途径均能有效抑制体内HCC肿瘤的生长,其中中剂量静脉给药组抑瘤作用最好;（10）免疫印迹法实验中可以观察到PAE2对Balb/c-nude小鼠体内肿瘤凋亡能力影响主要是由Bax/Bcl-2和PARP分子相关的信号通路来介导。（11）免疫组织化学染色法结果显示P-gp、LRP、BCRP、GST-π、Topo II、VEGF在耐药株的组别中的表达量是高于敏感株的组别的,说明了体内HCC产生MDR作用与上述因子的高表达相关;PAE2两种给药方式可抑制体内HCC肿瘤中LRP、BCRP、PKC、GST-π、Topo II、VEGF的表达。（12）RT-qPCR结果显示MRP、BCRP在耐药株中的表达量高于敏感株,PAE2能抑制体内HCC肿瘤内MDR1、MRP、LRP、BCRP、PKC、GST-π、Topo II、VEGF m RNA的表达;（13）在病理学HE染色观察中,Balb/c-nude小鼠经PAE2给药后的肿瘤组织,肿瘤细胞的体积减小,排列稀疏,出现了大面积的凝固性坏死和核碎裂,肿瘤的恶性程度降低,提示PAE2在体内仍能发挥良好的抗肿瘤作用;结论:（1）HepG2/ADM细胞具有多药耐药特征,与HepG2相比,HepG2/ADM细胞在Balb/c-nude小鼠皮下移植成瘤后同样体现出MDR特征;（2）美洲大蠊脱脂膏、CⅡ-3、多肽PAE2体内外均能够逆转人肝癌耐药细胞HepG2/ADM的多药耐药性;（3）美洲大蠊多肽PAE2逆转HepG2/ADM细胞MDR的作用优于CⅡ-3和脱脂膏;（4）美洲大蠊多肽PAE2可能通过影响细胞相关凋亡蛋白和介导多药耐药的相关蛋白和酶的表达,减少药物外排,促进细胞内药物累积、细胞凋亡,从而逆转人肝癌多药耐药细胞HepG2/ADM的耐药性。
单巧南[9]（2020）在《USP22促进缺氧诱导的肝细胞癌干性的研究》文中提出研究背景:肝细胞癌（以下简称肝癌）,是我国目前普遍的恶性肿瘤之一。其中90%以上患者的肝癌与乙型肝炎相关。以手术切除为主,经动脉化疗栓塞,射频消融等为辅的治疗方法虽然对患者的预后有所帮助,但对晚期肝癌并无显着疗效。因此,探索肝癌的发生发展机制,寻找肝癌治疗的新靶点,对于提高肝癌患者生存率至关重要。由于无限制增殖以及血管生成异常,包括肝癌在内的实体肿瘤内部普遍缺氧。HIF1α是缺氧诱导因子HIF1的关键亚基,在缺氧时稳定,参与调控肿瘤干性相关基因的表达。泛素特异性肽酶USP22在前期研究中被认为是肿瘤干性标志物,本研究团队前期已发现USP22可通过促进MRP1表达调控肝癌细胞对化疗药物耐药。TP53作为最重要的抑癌基因之一,在乙肝相关肝癌患者中突变频率高。本研究发现USP22在缺氧条件下促进HIF1α的表达;而HIF-1α在TP53基因突变时可反向促进USP22的转录表达水平。因此,本项目研究在缺氧条件下USP22/HIF1α对肝癌耐药、转移、成瘤等干性表型的影响,阐明在分子层面USP22与HIF1α的相互调节机制,评估在肝癌组织标本中USP22/HIF1α的表达状态及关联性,验证USP22/HIF1α可作为靶向肝癌干性治疗的关键靶点。研究目的1.明确USP22在缺氧条件下促进肝癌细胞干性表型。2.探究USP22在缺氧条件下通过HIF1α促进肝癌细胞干性表型的具体机制。3.探索USP22/HIF1α在肝癌中的临床意义以及作为治疗靶点的有效性。研究方法1.通过慢病毒构建降低USP22表达或过表达USP22的肝癌细胞系;通过对肝癌细胞样本的测序分析,证明USP22在缺氧情况下对干性相关基因的表达有促进作用;通过对细胞增殖、细胞成球,迁移,对索拉菲尼耐药能力,干性相关表面标志物,体内极限稀释成瘤等实验探究USP22变化后肝癌细胞干性的变化。2.通过western blot和双荧光素报告酶系统测定肝癌细胞降低USP22表达后或过表达USP22后,HIF1α蛋白水平及转录活性的变化;通过构建USP22和HIF1α突变质粒,应用western blot、免疫共沉淀技术及免疫荧光共聚焦扫描等技术,明确USP22和HIF1α的结合位点,结合位置及调控方式。3.通过免疫组化测定并分析262例肝癌临床样本中的USP22及HIF1α的表达相关性;通过TCGA等数据库分析325例肝癌患者中,USP22、HIF1α的表达高低及TP53突变情况对患者生存预后影响;利用纳米材料靶向USP22,联合小分子抑制剂索拉菲尼在荷瘤裸鼠中分组治疗,观察各组的治疗效果及体重变化并利用免疫组化技术分析瘤中USP22,HIF1α蛋白表达变化。结果1.在缺氧条件下,体外实验中,USP22可促进干性相关基因的表达同时促进肝癌细胞增殖,成球,迁移,对索拉菲尼的耐药以及干性相关表面标志物的表达;体内实验中,USP22促进肝癌细胞的成瘤能力。2.下调肝癌细胞中的USP22基因表达,HIF1α蛋白的表达及转录活性随之降低,过表达USP22则促进HIF1α的蛋白表达及转录活性。USP22通过C19肽酶结构域和HIF1α结合,免疫荧光测定两者的共定位信号位于细胞核。在TP53突变的肝癌细胞中,HIF1α促进USP22的m RNA水平和蛋白水平。在TP53野生型的细胞中敲除TP53,HIF1α对USP22转录调控功能恢复。3.USP22在肝癌中的表达和HIF1α正相关;USP22和HIF1α高表达且TP53突变的患者临床预后极差;针对USP22为靶点的纳米药物FLPP-sh USP22在TP53野生型肝癌荷瘤小鼠中体现良好的抑瘤效果,联合小分子抑制剂索拉菲尼的治疗方案在TP53突变型肝癌荷瘤小鼠中同样体现良好的抑瘤效果。结论1.USP22在缺氧条件下促进肝癌细胞干性。2.USP22抑制HIF1α蛋白的泛素化,稳定HIF1α的蛋白以及促进其转录活性;USP22通过C19肽酶结构域和HIF1α结合于细胞核;基于TP53失活,HIF1α正反馈促进USP22的转录。3.USP22及HIF1α高表达结合TP53突变与肝癌患者的不良预后密切相关;针对USP22为靶点的纳米治疗展现良好的抑瘤作用。
黄震琪[10]（2020）在《核转录因子Snail1沉默改善硼替佐米耐药多发性骨髓瘤细胞化疗敏感性的作用机制研究》文中研究说明研究背景多发性骨髓瘤（multiple myeloma,MM）是一种起源于淋巴浆细胞系的血液系统恶性肿瘤。其典型特征是浆细胞异常增殖,造成血钙增高、肾功能损害、贫血、骨病等临床表现。MM诊断的中位年龄为69岁、平均总生存期为6-7年。化学治疗是该病的主要治疗手段。近年来,随着对MM发病机制的深入探索,研究者们从分子水平筛选出蛋白酶体抑制剂、免疫调节剂等靶向治疗药物,新药的出现使MM的治疗取得了突破。蛋白酶体抑制剂硼替佐米（bortemozib,Bor）的临床使用是MM化疗进程中的重大事件。硼替佐米不但可以直接抑制骨髓瘤细胞的增殖并诱导凋亡,同时还可以改善地塞米松等其他药物的化疗敏感性。以硼替佐米为基础的化疗方案短期内虽然明显改善了MM患者的相关症状并延迟了肿瘤进展,但是几乎所有使用硼替佐米的MM患者在用药一段时间后都会出现耐药特征,这极大限制了该药对于MM的长期疗效。截至目前,关于MM对硼替佐米的耐药机制研究尚少,其耐药机制尚不明确,临床也未出现有效的解决方案。Snail1是锌指转录因子Snail超家族成员,通常作为转录阻遏物。转录因子Snail1在控制上皮细胞向间质细胞转化和成纤维细胞活化中起着关键作用,其的表达和功能受到从基因转录到蛋白质修饰的多个水平的调节。Snail1在各种癌症中广泛表达,它的表达升高与癌症的发生、转移以及抗癌治疗中耐药的发生等密切相关。目前关于Snail1的研究主要集中在肝细胞癌、胃癌、膀胱癌等疾病,多发性骨髓瘤中尚未见报道。第一部分多发性骨髓瘤硼替佐米耐药机制产生过程中存在Snail1基因表达上调目的:明确MM硼替佐米耐药机制产生过程中存在Snail1基因表达的异常。方法:收集临床硼替佐米耐药MM患者耐药机制产生前后的多发性骨髓瘤细胞（multiple myeloma cells,MMCs）样本,分别提取总RNA和细胞总蛋白,荧光定量PCR（realtime-PCR）方法检测Snail1基因mRNA含量,免疫印迹方法（western blotting）检测Snail1蛋白表达,并分析其在两组样本中转录及蛋白表达差异。同时,采用Western blotting方法检测多药耐药基因1（multi-drug resistance gene 1,MDR1）以及抑癌基因P53（tumor protein p53,P53）mRNA含量及蛋白表达,分析两个功能基因在MMCs的硼替佐米耐药机制进展中的表达状况。结果:与硼替佐米化疗前的MMCs比较,发生硼替佐米耐药MMCs细胞中Snail1基因mRNA及蛋白表达均明显增强（P<0.01,vs化疗前MMCs）;MDR1基因mRNA及蛋白表达均明显增强（P<0.01,vs化疗前MMCs）;P53蛋白表达明显降低（P<0.01,vs化疗前MMCs）,而mRNA含量无显着差异（P>0.05,vs化疗前MMCs）;hsa-mi R-22-3p相对含量则明显增强（P<0.01,vs化疗前MMCs）。结论:Snail1基因在MMCs对硼替佐米耐药机制产生的过程中mRNA及蛋白表达均明显增强,其与MDR1基因mRNA及蛋白表达变化趋势一致,与P53蛋白的表达变化趋势相反,与hsa-mi R-22-3p相对含量变化趋势一致。第二部分Snail1沉默改善MMCs对硼替佐米耐药的作用机制分析目的:明确Snail1基因沉默改善硼替佐米耐药MMCs的化疗敏感性并阐明作用机制。方法:通过慢病毒途径在硼替佐米耐药MMCs细胞株XG-7/Bor和RPMI-8226/Bor中沉默Snail1和P53,同时过表达MDR1,后分别提取总RNA和细胞总蛋白,Realtime-PCR、Western blotting方法分别检测三组mRNA、蛋白变化。生物信息学预测hsa-mi R-22-3p与P53基因3’非编码区（UTR）结合位点并通过荧光素酶报告基因实验证实。生物信息学预测核转录因子Snail1与hsa-mi R-22-3p和MDR1启动子的转录因子结合位点（transcription factor binding site,TFBS）并进行证实。通过慢病毒途径在XG-7/Bor和RPMI-8226/Bor细胞中沉默Snail1,后观察细胞耐药性、凋亡变化。基因干预后收集细胞总蛋白,Western blotting方法检测各组细胞MDR1和P53蛋白表达变化。实验中设置MDR1和P53回复对照组,对Snail1/MDR1和Snail1/hsa-mi R-22-3p/P53作用途径的主导性做出评价。结果:通过慢病毒途径可以在XG-7/Bor和RPMI-8226/Bor细胞中有效沉默Snail1和P53,有效过表达MDR1基因（P<0.01,vs细胞对照组或者NC对照组）。Hsa-mi R-22-3p通过与P53基因3’UTR区种子区“5’-GGCAGCU-3’”的结合抑制P53蛋白表达。Snail1在MDR1和hsa-mi R-22-3p启动子区域均存在TFBS结合位点,并对二者转录进行正向调控。Snail1沉默可以有效降低耐药细胞株XG-7/Bor和RPMI-8226/Bor对硼替佐米的IC50值（P<0.01,vs细胞对照组或者NC对照组）。在XG-7/Bor细胞中,Snail1基因沉默可以有效上调细胞凋亡率（P<0.01,vs细胞对照组或者NC对照组）,抑制MDR1蛋白表达并上调P53蛋白表达（P<0.01,vs细胞对照组或者NC对照组）,外源MDR1基因过表达或者P53基因沉默能够明显抑制Snail1基因沉默对其表达影响（P<0.01,vs Snail1基因沉默组）。结论:慢病毒途径是解决和提高MMCs基因转导效率的有效方法。Snail1基因沉默通过Snail1/MDR1作用途径有效改善XG-7/Bor和RPMI-8226/Bor细胞对硼替佐米的耐药,并通过Snail1/hsa-mi R-22-3p/P53作用途径诱导细胞凋亡。
二、Wild type p53 increased chemosensitivity of drug-resistant human hepatocellular carcinoma Bel7402/5-FU cells（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、Wild type p53 increased chemosensitivity of drug-resistant human hepatocellular carcinoma Bel7402/5-FU cells（论文提纲范文）
（1）槲皮素通过靶向人抗原蛋白R抑制肝癌进展的机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 中英文缩略词表 |
| 前言 |
| 第一部分 中药单体槲皮素抑制肝癌细胞增殖转移的机制研究 |
| 一、材料与方法 |
| (一) 实验材料 |
| 1. 实验细胞系 |
| 2. 实验动物 |
| 3. 实验试剂及实验仪器 |
| (二) 实验方法 |
| 1. 细胞培养 |
| 2. 细胞药物处理 |
| 3. 细胞增殖实验 |
| 4. 细胞迁移和侵袭实验 |
| 5. 细胞凋亡实验 |
| 6. 裸鼠荷瘤及给药模型的构建 |
| 7. 统计分析 |
| 二、结果 |
| 1. 槲皮素可以抑制HCC细胞的增殖 |
| 2. 槲皮素可以诱导HCC细胞的凋亡 |
| 3. 槲皮素可以抑制HCC细胞的侵袭及转移 |
| 4. 槲皮素可以抑制体内HCC的生长 |
| 三、分析与讨论 |
| (一)中药治疗HCC的认识及发展 |
| 1. 中医对肝癌的认识 |
| 2. 肝癌的中医病因学研究 |
| 3. 肝癌的中医治疗思想 |
| 4. 肝癌常用的治疗方剂与中药 |
| 5. 中药可改善HCC患者症状及预后 |
| 6. 中药可改善化疗药物的副反应 |
| 7. 中药治疗HCC的分子机制 |
| 8. 中医治疗HCC的挑战 |
| (二) 槲皮素的肝脏保护作用和抗肿瘤机制研究 |
| 1. 槲皮素广泛存在于抗肿瘤中药且安全低毒 |
| 2. 槲皮素对肝脏具有多重保护作用 |
| 3. 槲皮素治疗HCC的机制 |
| 四、小结 |
| 第二部分 槲皮素靶向人抗原蛋白HuR调控LINC01123治疗肝癌的机制研究 |
| 第一章 长链非编码RNA LINC01123通过调节miR-34a-5p/TUFT1轴促进肝癌细胞的增殖和侵袭 |
| 一、材料与方法 |
| (一)实验材料 |
| (二)实验方法 |
| 1. 临床样本的收集分析 |
| 2. 细胞转染 |
| 3. 组织或细胞的RNA提取 |
| 4. 荧光定量PCR |
| 5. 细胞增殖实验 |
| 6. 细胞迁移和侵袭实验 |
| 7. 蛋白样品制备及免疫印迹实验 |
| 8. 双荧光素酶报告基因检测系统实验 |
| 9. RNA免疫共沉淀分析 |
| 10. 裸鼠荷瘤模型的构建 |
| 11. 生物信息学分析 |
| 12. 统计分析 |
| 二、结果 |
| 1. LINC01123在HCC组织中表达上调,与患者的预后不良相关 |
| 2. LINC01123促进HCC细胞增殖和侵袭 |
| 3. LINC01123沉默抑制了体内HCC的生长 |
| 4. LINC01123通过海绵吸附作用,靶向结合miR-34a-5p |
| 5. LINC01123可通过miR-34a-5p/TUFT1轴促进HCC进展 |
| 三、分析与讨论 |
| 四、小结 |
| 第二章 HuR可增加LINC01123的稳定性并促进其表达 |
| 一、材料与方法 |
| (一) 实验材料 |
| (二) 实验方法 |
| 1. 生物信息学分析 |
| 2. 细胞转染 |
| 3. HuR敲低的细胞系中LINC01123半衰期的测定 |
| 4. RNA免疫共沉淀分析 |
| 5. 细胞RNA的提取 |
| 6. 荧光定量PCR |
| 7. 蛋白样品制备及免疫印迹实验 |
| 8. 统计分析 |
| 二、结果 |
| 1. HuR在HCC组织中高表达,与LINC01123的表达量呈正相关关系 |
| 2. LINC01123与HuR存在潜在的结合可能 |
| 3. HuR能增加LINC01123的稳定性,并单向促进LINC01123的表达 |
| 三、分析与讨论 |
| 四、小结 |
| 第三章 槲皮素靶向HuR作用于LINC01123抑制HCC的增殖与转移 |
| 一、材料与方法 |
| (一) 实验材料 |
| (二) 实验方法 |
| 1. 生物信息学分析 |
| 2. 细胞药物处理 |
| 3. 细胞RNA的提取 |
| 4. 荧光定量PCR |
| 5. 细胞增殖实验 |
| 6. 细胞迁移及侵袭实验 |
| 7. 细胞凋亡实验 |
| 8. 蛋白样品制备及免疫印迹实验 |
| 9. 统计分析 |
| 二、结果 |
| 1. HuR是槲皮素的潜在作用靶点 |
| 2. 槲皮素通过靶向HuR下调LINC01123的表达并抑制HCC的进展 |
| 三、分析与讨论 |
| 四、小结 |
| 结论 |
| 附图 |
| 参考文献 |
| 学术成果 |
| 致谢 |
| 文献综述 人抗原蛋白R与肿瘤耐药机制的研究进展 |
| 参考文献 |
（2）基于AMPK为靶点的美洲大蠊多肽PAE2逆转肝癌多药耐药作用及机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 中英文缩略词表 |
| 前言 |
| 第一章 美洲大蠊多肽PAE_2对细胞侵袭转移及自噬影响体外研究 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 细胞株及实验动物 |
| 1.2 实验药品、样品来源及其制备 |
| 1.3 试剂和溶液 |
| 1.4 主要仪器与设备 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 肿瘤细胞培养 |
| 2.2 试验试剂配制 |
| 2.3 试验分组 |
| 2.4 AMPK生物信息学分析 |
| 2.5 美洲大蠊多肽PAE_2对细胞中AMPK的影响 |
| 2.6 AMPK激活剂AICAR作用时间及浓度测定 |
| 2.7 划痕试验检测美洲大蠊多肽PAE_2对细胞侵袭转移的影响7 |
| 2.8 RT-qPCR法检测美洲大蠊多肽PAE_2对侵袭转移相关mRNA的影响 |
| 2.8.1 美洲大蠊多肽PAE_2对侵袭转移相关mRNA的影响 |
| 2.8.2 侵袭转移相关因子引物验证 |
| 2.9 激光共聚焦显微镜观察美洲大蠊多肽PAE_2对细胞中LC3蛋白的影响9 |
| 2.10 免疫细胞化学法检测美洲大蠊多肽PAE_2对细胞中P62蛋白的影响10 |
| 2.11 美洲大蠊多肽PAE_2对自噬相关mRNA的影响 |
| 2.11.1 美洲大蠊多肽PAE_2对自噬相关mRNA的影响 |
| 2.11.2 自噬相关因子引物验证 |
| 2.12 统计学处理 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 肝癌细胞中AMPK的表达 |
| 3.2 美洲大蠊多肽PAE_2对细胞内AMPK含量的影响 |
| 3.3 AMPK激活剂AICAR作用时间及作用浓度测定 |
| 3.4 划痕试验检测美洲大蠊多肽PAE_2对细胞划痕愈合率的影响 |
| 3.5 美洲大蠊多肽PAE_2对细胞侵袭转移相关因子的影响 |
| 3.5.1 RT-PCR检测美洲大蠊多肽PAE_2对细胞侵袭转移相关因子的影响 |
| 3.5.2 RT-PCR检测侵袭转移相关因子引物特异性验证 |
| 3.6 .激光共聚焦观察美洲大蠊多肽PAE_2对细胞自噬的影响(LC3 蛋白的形成).. |
| 3.7 免疫细胞化学法化观察美洲大蠊多肽PAE_2对细胞自噬的影响(P62 蛋白) |
| 3.8 美洲大蠊多肽PAE_2对细胞自噬相关因子mRNA表达的影响 |
| 3.8.1 美洲大蠊多肽PAE_2对细胞自噬相关因子mRNA表达的影响 |
| 3.8.2 自噬相关因子mRNA引物验证 |
| 第二章 美洲大蠊多肽PAE_2对裸鼠皮下移植瘤侵袭转移及自噬影响体内研究 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 实验药品、实验试剂 |
| 1.3 主要仪器与设备 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 肿瘤细胞培养 |
| 2.2 试验试剂配制 |
| 2.3 试验分组 |
| 2.4 Balb/c-nude裸鼠皮下移植瘤模型建立 |
| 2.5 美洲大蠊多肽PAE_2对裸鼠的影响 |
| 2.6 美洲大蠊多肽PAE_2对裸鼠生化指标的影响 |
| 2.7 HE染色法检测美洲大蠊多肽PAE_2对移植瘤裸鼠肿瘤组织、肝脏组织病理影响 |
| 2.8 美洲大蠊多肽PAE_2对移植瘤裸裸鼠侵袭转移相关因子mRNA的影响 |
| 2.8.1 美洲大蠊多肽PAE_2对移植瘤裸裸鼠侵袭转移相关因子mRNA的影响 |
| 2.8.2 移植瘤裸裸鼠肿瘤组织中侵袭转移相关因子引物验证 |
| 2.9 美洲大蠊多肽PAE_2对移植瘤裸裸鼠侵袭自噬 |
| 2.9.1 美洲大蠊多肽PAE_2对移植瘤裸裸鼠自噬相关因子mRNA的影响 |
| 2.9.2 移植瘤裸裸鼠肿瘤组织侵袭转移相关因子引物验证 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 裸鼠一般状态观察 |
| 3.2 美洲大蠊多肽PAE_2对移植瘤裸鼠相关脏器的影响 |
| 3.3 美洲大蠊多肽PAE_2对移植瘤裸鼠血清生化指标的影响 |
| 3.4 美洲大蠊多肽PAE_2对移植瘤裸鼠肿瘤及肝脏组织病理学的影响 |
| 3.5 美洲大蠊多肽PAE_2对裸鼠皮下移植瘤侵袭转移相关因子mRNA的影响 |
| 3.5.1 美洲大蠊多肽PAE_2对裸鼠皮下移植瘤侵袭转移相关因子mRNA的影响 |
| 3.5.2 侵袭转移相关因子引物验证 |
| 3.6 美洲大蠊多肽PAE_2对裸鼠皮下移植瘤自噬相关因子mRNA的影响 |
| 3.6.1 美洲大蠊多肽PAE_2对裸鼠皮下移植瘤自噬相关因子mRNA的影响 |
| 3.6.2 裸鼠皮下移植瘤自噬相关因子验证 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 6 参考文献 |
| 7 致谢 |
| 8 攻读学位期间发表的学术论文与研究成果 |
| 9 附录 |
（3）新型NO供体聚合物紫杉醇胶束的制备及抗肿瘤作用和机制研究（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 中文摘要 |
| abstract |
| 缩略词表 |
| 引言 |
| 第一部分 一氧化氮供体型聚合物紫杉醇胶束的制备和表征 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果与分析 |
| 4 讨论与小结 |
| 第二部分 一氧化氮供体型聚合物紫杉醇胶束急性毒性研究 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果与分析 |
| 4 讨论与小结 |
| 第三部分 一氧化氮供体型聚合物紫杉醇胶束药物动力学研究 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果与分析 |
| 4 讨论与小结 |
| 第四部分 一氧化氮供体型聚合物紫杉醇胶束体外抗肿瘤细胞及对P-糖蛋白的影响 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果与分析 |
| 4 讨论与小结 |
| 第五部分 一氧化氮供体型聚合物紫杉醇胶束抗结肠癌和紫杉醇耐药性结肠癌作用机制研究 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果与分析 |
| 4 讨论与小结 |
| 第六部分 一氧化氮供体型聚合物紫杉醇胶束抗肝癌作用机制研究 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果与分析 |
| 4 讨论与小结 |
| 第七部分 一氧化氮供体型聚合物紫杉醇胶束药性评价 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 结果和讨论 |
| 4 讨论与小结 |
| 全文总结 |
| 创新点 |
| 参考文献 |
| 综述 一氧化氮对肿瘤作用的浓度依赖作用和化疗增敏机制 |
| References |
| 个人简介 |
（4）FABP5调控人肝细胞癌细胞5-FU耐受机制的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 1.实验材料 |
| 2.实验方法 |
| 结果 |
| 1.FABP5 在肝细胞癌中的表达及与患者生存率的关系 |
| 2.验证Bel7402和Bel/5-FU对5-FU药物的耐药性 |
| 3.FABP5 在不同细胞株及不同培养条件下的表达量差异 |
| 4.构建瞬时转染和稳定转染细胞株 |
| 5.敲降和过表达FABP5 对细胞5-FU耐受性的影响 |
| 6.P-gp在Bel/5-FU和Bel7402中的表达差异 |
| 7.FABP5 影响下游核蛋白PPARγ的表达 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 FABP5在肿瘤发生发展中的作用及研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间发表文章情况 |
| 致谢 |
（5）肝癌中lncRNA OIP5-AS1和miR-302调控机制及洛那法尼联合Degrasyn疗效研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 肝癌的现状 |
| 1.2 非编码RNA概述 |
| 1.2.1 lncRNA及其在肿瘤发生发展中的作用 |
| 1.2.2 MicroRNA及其在肿瘤发生发展中的作用 |
| 1.3 小分子靶向药物在肝癌中的研究进展 |
| 1.4 洛那法尼与Degrasyn在肿瘤研究中的应用 |
| 第二章 lncRNA OIP5-AS1 在肝癌中的作用与机制 |
| 2.1 引言 |
| 2.1.1 lncRNA OIP5-AS1与肝癌 |
| 2.1.2 研究目标 |
| 2.2 研究内容 |
| 2.2.1 肝癌中明显表达失调的lncRNAs鉴定 |
| 2.2.2 lncRNA OIP5-AS1敲低细胞系 |
| 2.2.3 lncRNA OIP5-AS1作用体外实验检测 |
| 2.2.4 探讨lncRNA OIP5-AS1对hsa-miR-26a-3p的调控 |
| 2.2.5 lncRNA OIP5-AS1参与hsa-miR-26a-3p对EPHA2调控机制 |
| 2.2.6 明确lncRNA OIP5-AS1、hsa-miR-26a-3p和EPHA2相互关系 |
| 2.2.7 lncRNA OIP5-AS1和hsa-miR-26a-3p体内成瘤实验 |
| 2.2.8 验证肝癌中三者的表达相关性及其临床意义 |
| 2.3 材料与方法 |
| 2.3.1 试剂与耗材 |
| 2.3.2 主要实验设备 |
| 2.3.3 组织样本和细胞系与动物 |
| 2.3.4 实验方法 |
| 2.3.5 统计分析 |
| 2.4 实验结果 |
| 2.4.1 肝癌中失调lncRNA的鉴定 |
| 2.4.2 肝癌中lncRNA明显失调的验证 |
| 2.4.3 肝癌组织和细胞系lncRNA OIP5-AS1 的表达 |
| 2.4.4 干扰lncRNA OIP5-AS1抑制细胞增殖和体外侵袭能力 |
| 2.4.5 lncRNA OIP5-AS1 是调节hsa-miR-26a-3p的分子海绵 |
| 2.4.6 hsa-miR-26a-3p在肝癌患者中的表达及其预后价值评估 |
| 2.4.7 lncRNA OIP5-AS1 负调控hsa-miR-26a-3p促进细胞增殖和侵袭 |
| 2.4.8 lncRNA OIP5-AS1 充当hsa-miR-26a-3p ce RNA调控EPHA2 |
| 2.4.9 敲低lncRNA OIP5-AS1 抑制体内肿瘤发生 |
| 2.5 讨论 |
| 第三章 miR-302a/d在肝癌干细胞中的作用机制 |
| 3.1 引言 |
| 3.1.1 miR-302家族与肝癌 |
| 3.1.2 研究目标 |
| 3.2 研究内容 |
| 3.2.1 HCC细胞系的肿瘤球体外形成和鉴定 |
| 3.2.2 miR-302a/d,RNAi和E2F7过表达细胞系构建与鉴定 |
| 3.2.3 miR-302a/d作用体外实验检测作用体外实验检测 |
| 3.2.4 miR-302a/d和E2F7相互关系裸鼠体内成瘤实验 |
| 3.2.5 验证肝癌中miR-302a/d和E2F7表达相关性及其临床意义 |
| 3.3 材料与方法 |
| 3.3.1 试剂与耗材 |
| 3.3.2 主要实验设备 |
| 3.3.3 组织样本和细胞系与动物 |
| 3.3.4 实验方法 |
| 3.4 实验结果 |
| 3.4.1 HCC细胞系的肿瘤球的体外形成和鉴定 |
| 3.4.2 miRNA芯片分析表明,miR-302 家族参与LCSC干性维持 |
| 3.4.3 LCSC的分化和CSC标志物表达 |
| 3.4.4 miR-302a/d抑制HCC细胞的增殖和球体形成并促进细胞凋亡 |
| 3.4.5 miR-302a/d直接靶向HCC细胞E2F7 |
| 3.4.6 E2F7在LCSC形成和分化中的表达 |
| 3.4.7 miR-302a/d通过抑制细胞周期进入来抑制LCSC干性 |
| 3.4.8 E2F7激活AKT1细胞周期蛋白D1信号和下游细胞周期 |
| 3.4.9 miR-302a/d协同E2F7 调控β-catenin/CCND1 信号转导 |
| 3.4.10 miR-302a/d和E2F7 在肝癌中的表达及相关性 |
| 3.4.11 miR-302a/d和E2F7在LCSC中的表达及相关性 |
| 3.4.12 miR-302a/d和E2F7在肝癌中的临床意义 |
| 3.5 讨论 |
| 第四章 洛那法尼联合Degrasyn治疗作用初探 |
| 4.1 引言 |
| 4.1.1 肝癌治疗 |
| 4.1.2 研究目标 |
| 4.2 研究内容 |
| 4.2.1 繁殖和鉴定自发成瘤肝癌小鼠 |
| 4.2.2 洛那法尼联合Degrasyn对HCC自发成瘤小鼠疗效的观察 |
| 4.2.3 洛那法尼联合Degrasyn作用于HCC自发成瘤小鼠机制探 |
| 4.3 材料与方法 |
| 4.3.1 试剂与耗材 |
| 4.3.2 主要实验设备 |
| 4.3.3 实验动物 |
| 4.3.4 实验方法 |
| 4.4 实验结果 |
| 4.4.1 Alb-c Myc小鼠基因型鉴定 |
| 4.4.2 Alb-c Myc小鼠表型及洛那法尼联合Degrasyn治疗效果探讨 |
| 4.4.3 洛那法尼联合Degrasyn对小鼠器官组织的影响 |
| 4.4.4 Alb-c Myc自发成瘤肝癌小鼠分子检测 |
| 4.4.5 洛那法尼联合Degrasyn治疗对相关分子的影响 |
| 4.5 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 文献综述 肝癌非编码 RNA 调控机制及相关药物研发进展 |
| 主要参考文献 |
| 缩略词 |
| 致谢 |
| 作者简历及在读期间取得的科研成果 |
| 附件 |
（6）冬凌草甲素衍生物GYD0618对乳腺癌和卵巢癌耐药细胞的抑制作用及机制研究（论文提纲范文）
| 缩略词表 |
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 第一部分 冬凌草甲素衍生物对乳腺癌和卵巢癌耐药细胞的抑制作用 |
| 引言 |
| 1 材料与方法 |
| 2 实验结果 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 第二部分 冬凌草甲素衍生物CYD0618对乳腺癌及卵巢癌耐药细胞的抑制作用 |
| 引言 |
| 1 材料与方法 |
| 2 实验结果 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 第三部分 冬凌草甲素衍生物CYD0618抑制STAT3信号克服乳腺癌及卵巢癌细胞耐药 |
| 引言 |
| 1 材料与方法 |
| 2 实验结果 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 第四部分 冬凌草甲素衍生物CYD0618靶向结合STAT3 |
| 引言 |
| 1 材料与方法 |
| 2 实验结果 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 冬凌草甲素及其衍生物的抗肿瘤作用及机制 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间获得的学术成果 |
| 致谢 |
（7）胃癌体细胞突变图谱的构建及特征性点突变的功能挖掘与验证（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略词 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 胃癌 |
| 1.1.1 胃癌流行病学与病理学 |
| 1.1.2 胃癌体细胞突变图谱研究进展 |
| 1.2 体细胞突变在癌症中的研究进展 |
| 1.2.1 体细胞突变的定义与突变类型 |
| 1.2.2 体细胞突变在癌症中的研究进展 |
| 1.2.3 TP53体细胞突变在癌症中的生物学意义 |
| 1.2.4 TP53体细胞突变在胃癌中的研究进展 |
| 1.2.5 TP53体细胞突变与耐药的研究进展 |
| 1.3 全外显子组生物信息学分析与数据库挖掘 |
| 1.3.1 全外显子的生物信息学分析 |
| 1.3.2 数据分析的语言及命令 |
| 1.3.3 ICGC数据库中胃癌全外显子测序数据集 |
| 1.3.4 TCGA、COSMIC和 c Bio Portal数据库网站 |
| 1.4 本论文研究的意义和内容 |
| 1.4.1 研究意义 |
| 1.4.2 研究内容 |
| 第二章 基于WES分析胃癌体细胞突变图谱与突变特征 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 实验材料及仪器 |
| 2.2.1 临床样本与资料信息 |
| 2.2.2 实验试剂 |
| 2.2.3 实验仪器 |
| 2.2.4 生物信息分析软件 |
| 2.2.5 基因组变异数据注释数据库 |
| 2.3 实验方法与生信分析 |
| 2.3.1 实验入组与样本收集 |
| 2.3.2 DNA文库构建与测序 |
| 2.3.3 测序数据质量控制的分析 |
| 2.3.4 GATK4 Mutect2体细胞突变(SNV/INDEL)生物信息学分析 |
| 2.3.5 体细胞突变(SNV/INDEL)的统计与数据可视化的展示 |
| 2.3.6 Sanger测序 |
| 2.4 结果 |
| 2.4.1 DNA抽提质检结果 |
| 2.4.2 测序原始数据的质量报告 |
| 2.4.3 Sanger测序结果 |
| 2.4.4 体细胞突变图谱的统计结果 |
| 2.4.5 体细胞突变特征图谱的展示 |
| 2.4.6 体细胞突变特征的概要分析 |
| 2.4.7 碱基突变类型的统计分析 |
| 2.4.8 突变负荷的队列分析 |
| 2.4.9 全基因组间突变关系的统计分析 |
| 2.4.10 基于位置聚类算法驱动基因的分析 |
| 2.4.11 药物-基因相互作用的富集分析 |
| 2.4.12 致癌信号通路的富集分析 |
| 2.4.13 基于Mut Sig CV法分析驱动基因 |
| 2.5 讨论 |
| 2.6 本章小结 |
| 第三章 ICGC库中胃癌体细胞突变数据分析 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 实验材料及软件 |
| 3.2.1 实验数据集 |
| 3.2.2 GenVisR包 |
| 3.2.3 karyoplote R包 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 瀑布图的代码绘制 |
| 3.3.2 热点突变染色体位置图的代码绘制 |
| 3.3.3 统计学方法 |
| 3.4 结果 |
| 3.4.1 体细胞突变特征图谱 |
| 10%)的比较分析'>3.4.2 胃癌体细胞高频突变基因(>10%)的比较分析 |
| 3.4.3 体细胞突变染色体位置分布的比较分析 |
| 3.4.4 体细胞突变负荷的比较分析 |
| 3.4.5 TP53突变与突变负荷的相关性分析 |
| 3.5 讨论 |
| 3.6 本章小结 |
| 第四章 TP53突变位点的筛选 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 研究资料 |
| 4.2.1 TCGA数据资料的下载 |
| 4.2.2 TCGA数据的前处理 |
| 4.3 统计分析方法 |
| 4.3.1 Kaplan-Meier生存分析法 |
| 4.3.2 COX与 LASSO回归分析法 |
| 4.3.3 列线图的构建与内部验证 |
| 4.3.4 统计分析与软件 |
| 4.3.5 统计分析与绘图的代码 |
| 4.4 结果 |
| 4.4.1 患者基线资料 |
| 4.4.2 TCGA中 TP53 突变型组中筛选预后相关的突变位点 |
| 4.4.3 TCGA数据集中筛选预后相关的突变位点 |
| 4.4.4 TCGA数据集中TP53的10 个突变位点作为预后的临床应用 |
| 4.4.5 在江南大学附属医院数据集中筛选TP53预后相关的突变位点 |
| 4.4.6 江南大学附属医院数据集中TP53突变与临床信息特征的相关性分析 |
| 4.5 讨论 |
| 4.6 本章小结 |
| 第五章 TP53 R337C突变介导胃癌细胞对5-FU的耐药 |
| 5.1 前言 |
| 5.2 实验材料及仪器 |
| 5.2.1 实验材料 |
| 5.2.2 实验仪器 |
| 5.2.3 引物 |
| 5.3 实验方法 |
| 5.3.1 细胞培养 |
| 5.3.2 TP53野生型和突变型过表达细胞株的构建 |
| 5.3.3 q RT-PCR(逆转录-聚合酶链反应)实验 |
| 5.3.4 蛋白免疫印迹(Western Blot,WB)实验 |
| 5.3.5 siRNA基因干扰实验 |
| 5.3.6 CTB(Cell Viability Assay)细胞毒性实验 |
| 5.3.7 细胞荧光免疫法与激光共聚焦实验 |
| 5.3.8 体内裸鼠实验 |
| 5.3.9 统计方法 |
| 5.4 结果 |
| 5.4.1 TP53在胃癌细胞株中的表达分析 |
| 5.4.2 TP53野生型和R337C突变型转染株的构建与筛选 |
| 5.4.3 过表达TP53 R337C突变对胃癌细胞株5-FU耐药的影响 |
| 5.4.4 TP53干扰序列的筛选 |
| 5.4.5 沉默TP53 R337C的表达对胃癌细胞5-FU耐药的影响 |
| 5.4.6 体内实验中TP53 R337C突变对5-FU耐药的影响 |
| 5.5 讨论 |
| 5.6 本章小结 |
| 主要结论与展望 |
| 主要结论 |
| 展望 |
| 论文创新点 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录 :作者在攻读博士学位期间发表的论文 |
（8）美洲大蠊多肽PAE2逆转HepG2/ADM多药耐药性的作用及机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 中英文缩略词表 |
| 前言 |
| 第1章 美洲大蠊多肽PAE_2体外逆转HepG2/ADM多药耐药性的作用研究 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.1.1 细胞株 |
| 1.1.2 实验药品 |
| 1.1.3 主要试剂与耗材 |
| 1.1.4 主要仪器和设备 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.2.1 细胞培养 |
| 1.2.2 细胞复苏 |
| 1.2.3 细胞换液 |
| 1.2.4 细胞传代 |
| 1.2.5 细胞冻存 |
| 1.2.6 溶液的配制 |
| 1.2.7 MTT法测定多肽PAE_2对细胞增殖抑制作用的时效与量效关系 |
| 1.2.8 MTT法检测HepG2和HepG2/ADM细胞的多药耐药性及多肽PAE_2对HepG2/ADM细胞的逆转作用 |
| 1.2.9 MTT法测定美洲大蠊提取物CⅡ-3、脱脂膏和索拉非尼的细胞毒性,确定逆转耐药剂量 |
| 1.2.10 分组与给药 |
| 1.2.11 激光共聚焦显微镜观察多肽PAE_2对药物累积的影响 |
| 1.2.12 Western blot法检测多肽PAE_2对HepG2/ADM细胞相关凋亡蛋白的影响 |
| 1.2.13 免疫细胞化学法和RT-qPCR法检测多肽PAE_2对HepG2/ADM细胞多药耐药相关蛋白的影响 |
| 1.2.14 免疫细胞化学法和RT-qPCR法检测多肽PAE_2对HepG2/ADM细胞中介导MDR相关酶的影响 |
| 1.2.15 免疫细胞化学法检测多肽PAE_2对HepG2/ADM细胞中VEGF的影响 |
| 1.2.16 统计学处理 |
| 1.3 实验结果 |
| 1.3.1 多肽PAE_2对细胞增殖抑制作用的时效与量效关系 |
| 1.3.2 MTT法检测HepG2和HepG2/ADM细胞的多药耐药性及多肽PAE_2对HepG2/ADM细胞的逆转作用 |
| 1.3.3 MTT法测定美洲大蠊提取物CⅡ-3、脱脂膏、索拉非尼的细胞毒性,确定逆转耐药剂量 |
| 1.3.4 激光共聚焦显微镜观察多肽PAE_2对药物累积的影响 |
| 1.3.5 Western blot法检测多肽PAE_2对HepG2/ADM细胞相关凋亡因子的影响 |
| 1.3.6 免疫细胞化学法和RT-qPCR法检测多肽PAE_2对HepG2/ADM细胞多药耐药相关蛋白的影响 |
| 1.3.7 免疫细胞化学法和RT-qPCR法检测多肽PAE_2对HepG2/ADM细胞中酶介导的MDR的影响 |
| 1.3.8 免疫细胞化学法检测多肽PAE_2对HepG2/ADM细胞中VEGF的影响 |
| 1.4 讨论 |
| 1.5 结论 |
| 第2章 美洲大蠊多肽PAE_2逆转HepG2/ADM裸鼠移植瘤多药耐药性的作用研究 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 实验动物 |
| 2.1.2 实验药品 |
| 2.1.3 主要试剂 |
| 2.1.4 主要仪器和设备 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 药品及试剂的配制 |
| 2.2.2 建立肝癌细胞移植瘤裸鼠模型 |
| 2.2.3 分组与给药 |
| 2.2.4 多肽PAE_2对移植瘤裸鼠肿瘤生长及脏器指数的影响 |
| 2.2.5 多肽PAE_2对移植瘤裸小鼠肝肾功能的影响 |
| 2.2.6 多肽PAE_2对移植瘤裸小鼠肿瘤组织凋亡蛋白的影响 |
| 2.2.7 免疫组织化学法和RT-qPCR法检测多肽PAE_2对移植瘤裸小鼠肿瘤组织中多药耐药相关蛋白的影响 |
| 2.2.8 免疫组织化学法和RT-qPCR法检测多肽PAE_2对移植瘤裸小鼠肿瘤组织中介导多药耐药相关酶的影响 |
| 2.2.9 免疫组织化学法检测多肽PAE_2对移植瘤裸小鼠肿瘤组织中VEGF的影响 |
| 2.2.10 HE染色法检测多肽PAE_2对移植瘤裸小鼠肿瘤组织的病理改变 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 移植瘤裸鼠的一般状态观察 |
| 2.3.2 多肽PAE_2对移植瘤裸鼠相关脏器的影响 |
| 2.3.3 多肽PAE_2对移植瘤裸鼠肝肾功能的影响 |
| 2.3.4 多肽PAE_2对移植瘤裸鼠的抑瘤作用 |
| 2.3.5 多肽PAE_2对移植瘤裸鼠相关凋亡蛋白的影响 |
| 2.3.6 多肽PAE_2对移植瘤裸鼠肿瘤组织中多药耐药蛋白的影响 |
| 2.3.7 多肽PAE_2对移植瘤裸鼠肿瘤组织中介导多药耐药酶的影响 |
| 2.3.8 多肽PAE_2 对移植瘤裸鼠肿瘤组织VEGF的影响 |
| 2.3.9 多肽PAE_2对移植瘤裸鼠肿瘤组织的影响 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文与研究成果 |
| 附件 |
（9）USP22促进缺氧诱导的肝细胞癌干性的研究（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 中英文缩略词 |
| 绪论 |
| 参考文献 |
| 第一部分 USP22在缺氧条件下调控肝癌细胞干性 |
| 1 介绍 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 实验步骤与方法 |
| 2.3 统计学分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 USP22在缺氧条件下促进肿瘤干性相关基因表达 |
| 3.2 USP22在缺氧条件下促进肝癌细胞增殖 |
| 3.3 USP22在缺氧条件下促进肝癌细胞克隆形成 |
| 3.4 USP22在缺氧条件下促进肝癌细胞迁移 |
| 3.5 USP22在缺氧条件下促进肝癌细胞对索拉菲尼的耐药 |
| 3.6 USP22缺氧条件下促进肝癌细胞表面标志物(CD24)表达 |
| 3.7 USP22促进肝癌在体内的发生发展 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 6 参考文献 |
| 第二部分 USP22和HIF1α存在正反馈调控机制 |
| 1 介绍 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 实验步骤与方法 |
| 2.3 统计学分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 USP22 促进HIF1α蛋白的表达 |
| 3.2 USP22 促进HIF1α转录活性 |
| 3.3 USP22和HIF1α在肝癌细胞系中相互作用 |
| 3.4 USP22 主要在细胞核通过C19 肽酶结构域和HIF1α结合 |
| 3.5 USP22 抑制HIF1α通过蛋白酶体途径降解 |
| 3.6 USP22 抑制HIF1α的泛素化修饰 |
| 3.7 HIF1α正反馈促进USP22 转录基于TP53 失功能 |
| 3.8 沉默TP53 基因后HIF1α对 USP22 的转录促进作用恢复 |
| 3.9 USP22和TP53是HIF1α转录调控的靶点 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 6 参考文献 |
| 第三部分 USP22/HIF1α的临床意义及作为肝癌治疗靶点的有效性研究 |
| 1 介绍 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 实验步骤与方法 |
| 2.3 统计学分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 USP22和HIF1α在肝癌患者中表达正相关 |
| 3.2 USP22,HIF1α表达情况及TP53 突变状态与预后相关 |
| 3.3 USP22 纳米脂质体的粒径分布和Zeta电势测定 |
| 3.4 FLPP-sh USP22 单药治疗在BEL-7402 细胞荷瘤裸鼠中获得良好抑瘤效果. |
| 3.5 FLPP-sh USP22 联合索拉菲尼在Huh7 荷瘤裸鼠中获得良好抑瘤效果 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 6 参考文献 |
| 全文总结 |
| 综述 肝癌干细胞在肝癌发生发展及治疗中的作用 |
| 参考文献 |
| 作者简历及在学期间所取得的科研成果 |
（10）核转录因子Snail1沉默改善硼替佐米耐药多发性骨髓瘤细胞化疗敏感性的作用机制研究（论文提纲范文）
| 中英文缩略词对照表 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 第一部分 多发性骨髓瘤硼替佐米耐药机制产生过程中存在Snail1基因表达上调 |
| 前言 |
| 实验材料 |
| 实验方法 |
| 实验结果 |
| 结论 |
| 讨论 |
| 第二部分 Snail1基因沉默改善硼替佐米耐药MMCs药物敏感性的作用机制分析 |
| 前言 |
| 实验材料 |
| 实验方法 |
| 实验结果 |
| 实验结论 |
| 讨论 |
| 结论与展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 综述 微小RNA与多发性骨髓瘤的耐药机制研究进展 |
| 参考文献 |
四、Wild type p53 increased chemosensitivity of drug-resistant human hepatocellular carcinoma Bel7402/5-FU cells（论文参考文献）
- [1]槲皮素通过靶向人抗原蛋白R抑制肝癌进展的机制研究[D]. 肖遵强. 浙江中医药大学, 2021(02)
- [2]基于AMPK为靶点的美洲大蠊多肽PAE2逆转肝癌多药耐药作用及机制研究[D]. 李彩琳. 大理大学, 2021(09)
- [3]新型NO供体聚合物紫杉醇胶束的制备及抗肿瘤作用和机制研究[D]. 李惠兰. 江西中医药大学, 2021(01)
- [4]FABP5调控人肝细胞癌细胞5-FU耐受机制的研究[D]. 张俊林. 大连医科大学, 2021(01)
- [5]肝癌中lncRNA OIP5-AS1和miR-302调控机制及洛那法尼联合Degrasyn疗效研究[D]. 马雨水. 华东师范大学, 2020(02)
- [6]冬凌草甲素衍生物GYD0618对乳腺癌和卵巢癌耐药细胞的抑制作用及机制研究[D]. 刘熙. 昆明医科大学, 2020(02)
- [7]胃癌体细胞突变图谱的构建及特征性点突变的功能挖掘与验证[D]. 章立华. 江南大学, 2020(01)
- [8]美洲大蠊多肽PAE2逆转HepG2/ADM多药耐药性的作用及机制研究[D]. 吕鸿. 大理大学, 2020(05)
- [9]USP22促进缺氧诱导的肝细胞癌干性的研究[D]. 单巧南. 浙江大学, 2020(01)
- [10]核转录因子Snail1沉默改善硼替佐米耐药多发性骨髓瘤细胞化疗敏感性的作用机制研究[D]. 黄震琪. 安徽医科大学, 2020(01)