一、Cre重组酶表达载体的构建及其在转基因小鼠胰腺中的表达（论文文献综述）
邢胜[1]（2021）在《由SETD4调控的静息c-Kit+细胞在激活后对心脏微血管生成作用的研究》文中认为血管在成年哺乳动物心脏中以高度成型和组织化的血管网的形态存在,生血管的过程往往只在血管组织缺氧等生理因素刺激的条件下才会发生。在缺血性损伤的心脏中,由于心肌层中血管网有限的增殖能力无法满足心肌细胞对氧气的需求,最终导致心肌组织经历不可逆转的损伤。近些年的研究表明,心脏内源性cKit阳性细胞已被证实能够产生大量心脏内皮细胞但极少向心肌细胞方向分化,而内皮细胞的产生对生血管过程至关重要,因此,c-Kit阳性细胞在心脏缺血性损伤治疗方面的潜力备受关注。成体心脏中,部分c-Kit阳性细胞以静息状态存在,而细胞静息作为体内一种保守机制也存在于一些其他组织的干细胞中,在应对组织损伤和维持稳态过程中发挥重要的作用。然而,心脏内调控c-Kit阳性细胞静息的关键因子以及静息的c-Kit阳性细胞的功能仍然还不清楚。本研究通过分析细胞增殖指标Ki67和H3p S10,以及利用Ed U掺入实验和Brd U滞留实验成功确认了心脏内一部分c-Kit阳性细胞处于长期静息状态。本课题组的前期研究发现了一个由SETD4蛋白表观遗传调控的细胞静息的进化保守机制。通过对静息的c-Kit阳性细胞的分子特征分析,明确了该类群静息的细胞是通过SETD4蛋白催化形成H4K20me3促进异染色质的形成,从而调控细胞静息的分子机制,并通过腺病毒过表达SETD4的体外实验进一步印证了其对c-Kit阳性细胞的静息调控机制。在此基础上,为了研究SETD4调控的静息的c-Kit细胞在小鼠心脏中的功能,我们构建了SETD4条件性敲除小鼠,并实现了在成年及新生小鼠心脏内c-Kit细胞中SETD4基因的条件性敲除。研究结果表明成年及新生小鼠中敲除SETD4基因均会导致心脏内皮细胞的大量产生并促进微血管的生成。而大口径的冠状血管中的内皮细胞则极少来源于c-Kit阳性细胞。同时,我们发现敲除SETD4基因从而激活静息的c-Kit阳性细胞是通过激活PI3K-Akt-m TOR信号通路实现的。此外,我们在心肌梗死模型小鼠上进行了SETD4基因的条件性的敲除,结果表明敲除了SETD4基因的c-Kit阳性细胞能够在心肌梗死的受损心脏中产生更多的微血管细胞,进而供给额外的氧气减缓心肌细胞的凋亡,改善由缺血性损伤引发的心功能受损。为了研究SETD4阳性细胞在心脏发育过程中的细胞生物学功能,我们构建了基于SETD4驱动的Cre组成型表达的SETD4谱系示踪小鼠。研究发现SETD4细胞在心脏发育的胚胎早期（E6.5）就已出现,并且在胚胎发育阶段能够产生包括c-Kit细胞在内的多种类型的细胞后代,其中一部分c-Kit细胞可能仍保留着SETD4蛋白到成年阶段保持长期静息的状态。综上所述,我们的研究发现了由SETD4调控的一类静息的c-Kit阳性细胞类群,揭示了SETD4蛋白在调控c-Kit阳性细胞静息以及静息激活后促进微血管的产生,缓解心肌梗死造成的损伤方面起着重要的作用。
陈佳贤[2]（2021）在《小鼠Kiss1基因启动子的鉴定、功能分析及应用探索》文中研究指明Kiss1基因所编码的神经肽Kisspeptin是下丘脑-垂体-性腺（HPG）轴上的关键调节因子,调控促性腺激素释放激素（Gn RH）的释放,在个体性发育的过程中发挥着重要作用。Kiss1表达调控机制一直是神经内分泌学研究的热点。启动子从转录水平上调控基因的表达,直接决定着下游基因表达的时空特异性,因此Kiss1启动子的解析对于研究Kiss1表达调控机制具有重要意义。基因特异性启动子的开发在转基因动物的构建以及基因工程工具（CRISPR-Cas9系统和Cre-lox P系统）的优化中也扮演着非常重要的角色。本研究旨在对Kiss1启动子的序列及调控模式进行解析,并探索其在基因工程工具中的应用潜力。方法:构建一系列Kiss1启动子5’端片段缺失的荧光素酶报告基因重组载体,利用双荧光素酶法在不同细胞系中鉴定Kiss1启动子的转录活性区域,并从中筛选出具有最高转录活性的启动子p2（-1089～+18）,用于进一步的研究及应用。对p2（-1089～+18）的序列进行转录因子结合分析,构建p2（-1089～+18）驱动的绿色荧光（EGFP）报告载体,转染GT1-7细胞后用雌二醇（E2）处理,利用流式细胞术和实时荧光定量PCR（q RT-PCR）检测报告基因表达量的变化以验证启动子对雌激素信号的响应情况。随后,分别探索该启动子在以下三个基因工程工具中的应用潜力:其一,将p2（-1089～+18）-EGFP报告载体进一步包装成慢病毒感染体外培养的下丘脑原代神经元细胞,以实现Kiss1神经元的荧光标记。其二,构建p2（-1089～+18）驱动的Cas9表达载体,与sg RNA表达载体共转染,利用T7E1 assay验证CRISPR-Cas9系统的剪切效率。其三,构建p2（-1089～+18）驱动的Cre表达载体,与Ai9载体共转染,通过观察、q RT-PCR检测红色荧光表达情况以及PCR法验证Cre-lox P系统的重组效率。结果:本研究成功构建了六个Kiss1启动子5’端缺失片段荧光素酶报告基因重组载体用于Kiss1启动子转录活性区域的鉴定。不同细胞系中的启动子活性分析结果显示,三个在GT1-7细胞中具有较高活性的Kiss1启动子在N6细胞中无活性或活性极低,说明Kiss1启动子具有一定的细胞特异性。其中p2（-1089～+18）具有远高于其它启动子片段的转录活性,因此将其作为之后的主要研究对象。对p2（-1089～+18）序列进行转录因子结合分析发现,该启动子上存在两个雌激素受体响应元件（ERE）（-421处和-502处）。对该分析结果进行流式细胞术和q RT-PCR验证,结果显示,p2（-1089～+18）下游报告基因的表达水平在雌二醇（E2）刺激后出现了显着增加（P<0.05）,说明该启动子能够响应外源雌激素信号且表现为正向调控。关于启动子应用部分:首先,本研究成功在体外分离培养了下丘脑原代神经元细胞,并将pLL3.7-p2（-1089～+18）-EGFP载体成功包装成慢病毒感染下丘脑原代神经元细胞,q RT-PCR结果显示,细胞中EGFP有明显的过表达,与对照组相比,高出了约2100倍（P<0.01）,但显微镜下未能观察到Kiss1神经元的荧光标记。此外,本研究成功构建了p2（-1089～+18）驱动的Cas9表达载体并证实其能在sg RNA的引导下实现对靶位点一定程度的有效剪切。成功构建了p2（-1089～+18）驱动的Cre表达载体,利用q RT-PCR在细胞中检测到了由Cre重组酶介导lox P位点重组而导致的下游红色荧光蛋白报告基因超8倍于阴性对照的表达（P<0.01）。结论:本研究鉴定了小鼠Kiss1启动子的转录活性区域,筛选出了具有高活性的Kiss1启动子,并对该启动子在基因工程工具中的应用潜力进行了探索,为后续研究提供了思路和改进的方向。此外,启动子的序列分析和激素响应分析不仅为揭示Kiss1基因转录调控的规律作出了贡献,也为后续启动子活性和特异性方面的优化方案提供了重要参考。
于海滨[3]（2020）在《线粒体甘油-3-磷酸乙酰转移酶（GPAM）基因沉默对牛乳脂代谢的影响》文中研究表明随着畜牧业的快速发展和人类生活水平的提高,消费者对牛乳品质的需求也逐渐增加,对乳品质的要求也越来越高。牛乳品质性状是复杂经济性状,多基因共同调控其表型变化。随着后基因组学时代的到来,筛查与挖掘奶牛乳脂性状相关且具有重大遗传效应的候选功能基因,成为当前奶牛遗传育种科研工作者的主要挑战。甘油-3-磷酸酰基转移酶线粒体（GPAM）基因,属于GPAT基因家族,该基因定位在牛第26q22号染色体上。有研究表明,GPAM基因催化磷脂和甘油三酯（TG）生物合成的第一步反应。基于课题组前期组学分析结果,GPAM基因可能对牛乳脂代谢具有重要影响。本研究以GPAM为候选基因,在敲除细胞水平验证目的基因与牛脂质代谢的功能,同时在模式动物的基础上,解析GPAM基因对乳脂代谢的调控作用机制。利用CRISPR-Cas9技术,以牛乳腺上皮细胞为研究对象,构建GPAM基因敲除细胞系,同时利用本课题组前期构建的GPAM基因过表达和干扰载体,分别检测目的基因过表达、干扰和敲除后,基因m RNA和蛋白水平的表达情况,检测细胞内甘油三酯、胆固醇和脂肪酸含量,并利用RT-q PCR和Western-blot技术,在m RNA和蛋白水平上验证GPAM基因对牛乳脂代谢相关基因的调控作用。研究结果表明:目的基因敲除后,细胞内GPAM在m RNA和蛋白水平的表达均降低;GPAM基因敲除细胞系内的甘油三酯和胆固醇的含量相对于野生型细胞均显着降低;细胞内脂肪酸含量检测结果显示:GPAM基因过表达能够降低细胞内丁酸的含量,沉默GPAM基因能够促进细胞内丁酸和辛酸含量显着升高;GPAM基因敲除能够促进辛酸的含量增加;乳脂代谢相关基因表达量的检测结果显示:敲除GPAM基因能够降低细胞内脂代谢相关基因ACSL5、FABP3、HSL、PRSS2、AGPAT4的表达,进而调控乳脂代谢通路。GPAM基因转录组测序共获得360个上调基因和570个下调基因;差异基因中的352个基因共富集在3196个GO terms,其中613个GO terms显着富集,包括402个生物过程的GO terms,72个细胞成分GO terms和139个分子功能GO terms;差异表达基因中共富集237个Pathway,其中139个Pathway显着富集（P<0.05）,下调基因富集在78个通路中,上调基因富集在61个通路中。GPAM敲除后信号通路互作关系预测分析结果表明,GPAM敲除后在对糖代谢信号通路的作用,主要是通过影响丙酸（PATH:00640）和丙酮酸（PATH:00620）代谢通路,使其表达水平上调,提示GPAM基因可能对丙酸和丙酮酸起调控作用,从而对细胞内糖酵解产生一定的影响。同时在转录组测序结果中也发现GPAM基因与细胞ATP应答和质子转运ATP酶活性的调节有关,提示该基因可能参与细胞线粒体能量代谢和ATP供能。根据转录组的数据分析结果表明;GPAM基因与细胞ATP应答和质子转运ATP酶活性的调节有关,提示该基因可能参与细胞线粒体能量代谢和ATP供能。转录组数据分析发现,GPAM基因参与丙酸、丙酮酸代谢进程,该基因敲除后细胞内丙酸、丙酮酸代谢发生了变化,预测可能对线粒体能量代谢和糖酵解产生影响。同时,GPAM基因作为一种线粒体基因,研究其表达对细胞线粒体功能的影响具有重要意义,根据以上推断我们展开了敲除细胞内线粒体能量代谢的研究。以牛GPAM基因敲除乳腺上皮细胞系为研究对象,研究GPAM基因敲除后细胞中线粒体数量、线粒体呼吸能力、线粒体糖酵解速率、细胞对ATP需求的变化。线粒体能量代谢实验结果表明:在GPAM基因敲除细胞系中,细胞内线粒体呼吸能力降低。同时,GPAM敲除后导致线粒体糖酵解所需的重要调节酶活性降低,从而最终导致细胞线粒体糖酵解过程受到显着抑制。同时影响了细胞内Na+/K+的转运;敲除GPAM基因后细胞内线粒体含量减少。实验表明,敲除细胞中GPAM含量的降低导致了细胞线粒体氧化磷酸化和三羧酸循环过程受到显着抑制。以上这些结果都说明,GPAM的敲除能够影响乳腺上皮细胞的线粒体能量代谢。利用CRISPR-Cas9基因编辑技术,建立GPAM基因敲除小鼠模型,在模式动物水平上验证基因表达调控作用。结果表明:GPAM基因敲除小鼠的生长、发育和繁殖无明显的变化。血清学检测结果发现:GPAM基因敲除小鼠的血清中甘油三酯含量显着低于对照组野生型小鼠（p<0.05）,而血清中胆固醇的含量变化并不显着;组织中甘油三酯和胆固醇的检测结果发现:敲除小鼠乳腺组织和脂肪组织中甘油三酯、胆固醇的含量均显着低于对照组野生型小鼠（p<0.05）;小鼠乳汁甘油三酯酶联免疫吸附实验结果显示:与野生鼠相比,GPAM基因敲除小鼠乳汁中的甘油三酯含量明显降低（p<0.05）;组织形态学观察表明,敲除小鼠脂肪组织中脂肪细胞的胞体直径略小于野生型小鼠,肌间脂肪含量明显少于与野生型小鼠,乳腺组织中野生型小鼠的脂肪细胞的直径略大于敲除型小鼠,其他组织无明显形态学变化;乳腺组织的脂肪酸含量检测结果显示:敲除小鼠乳腺组织中肉豆蔻酸、棕榈硬脂酸、花生四烯酸盐和亚麻酸盐上显着高于野生型小鼠。本研究在前期转录组学分析的基础上,以GPAM为候选基因,在敲除细胞系水平上验证GPAM基因对细胞内脂肪酸、甘油三酯、胆固醇含量的影响,并对GPAM基因敲除细胞系进行转录组分析,解析该基因敲除后对乳脂代谢相关基因的分子机制;同时检测了敲除GPAM基因乳腺上皮细胞内线粒体活性及能量代谢改变情况,阐明GPAM基因是参与线粒体能量代谢的重要基因,并对糖酵解产生影响;构建了GPAM基因敲除小鼠模型,在模式动物水平上进一步验证GPAM基因对乳脂代谢的调控作用。为奶牛乳脂性状的改良和新品种的培育提供优质的基因资源和理论基础。
李慧莹[4]（2020）在《光激活Dre重组酶系统的构建及其应用研究》文中研究表明在动物体内特定的细胞群体中进行时空特异性的遗传学研究是生物学一直以来的难题。位点特异性重组酶,尤其是酪氨酸重组酶家族的Cre重组酶,因其重组效率高且特异性强,被广泛应用于细胞标记和基因功能研究。然而单个重组酶系统具有一定的局限性很难用于研究复杂的生物学问题。而Dre重组酶与Cre重组酶具有高度同源性且不会与其发生交叉反应,因此常与Cre重组酶联合使用。目前已有的多种诱导型Dre重组酶,均为化学诱导系统。虽然它们能够严谨地调控基因表达,但缺乏空间特异性、诱导周期长、效率低且会扰乱内源信号通路而光诱导系统是一种时空特异性高且安全高效易调节的基因表达调控工具。因此本论文旨在构建光激活的Dre重组酶（photoactivatable Dre,PA-Dre）系统及Cre激活的光诱导Dre（Cre-Activated Light Inducible Dre,CALID）系统并在体内特定的细胞群体中实现时空特异性的基因调控。首先,借助分子动力学模拟,我们获得了多个Dre重组酶的分段位点。经过一系列筛选发现Dre N60/Dre C61,Dre N150/Dre C151和Dre N246/Dre C247在Magnets系统调控下具有较好的光依赖性,其中Dre N246/Dre C247效果最佳。然后通过一系列的分子优化,我们最终获得了诱导倍数高达约100倍的PA-Dre系统。该系统不仅能在细胞上高效严谨地调控基因表达,还可在小鼠的肝脏和脑部灵活地调控内源基因表达。接着,为了实现更高分辨率的基因操作并扩大PA-Dre重组酶系统的适用范围,我们基于双重倒置开放阅读框（double-floxed inverted open reading frame,DIO）策略构建了Cre激活的光诱导Dre（CALID）系统并将其用于特定类型神经元细胞标记。我们利用腺相关病毒表达的Ca MKIIα-EGFP-2A-Cre病毒和PV-Cre转基因小鼠激活光诱导的Dre重组酶,通过调节光照参数和光纤直径大小,分别实现了对Ca MKIIα兴奋性神经元和Parvalbumin抑制性神经元的大面积标记和稀疏标记,由此证明该系统介导的细胞标记不仅精度高还具有良好的可调性。综上所述,我们开发了蓝光激活的Dre重组酶系统并在此基础上构建了Cre激活的光诱导Dre重组酶系统,为基因编辑领域增加了一对新工具,从而进一步提高了细胞标记的精准度。此外我们相信已有的Cre转基因小鼠与光诱导Dre重组酶系统结合将有助于阐明各研究领域中复杂的生物学问题,如细胞起源和组织再生等,为其后续研究开辟新途径。
苏鹏[5]（2020）在《顺向示踪工具病毒HSV1 H129的特性研究与系统改进》文中指出大脑是人类已知的最复杂的器官。要想理解大脑的工作原理工,首先必须了解其结构基础,尤其是大脑的神经元连接组。因此,能够在神经环路中定向传播的示踪工具显得尤为重要。基于嗜神经工具病毒的跨突触示踪逐渐成为解析神经环路的重要技术手段。其中,单纯疱疹病毒（HSV）1型毒株H129具有顺向跨突触的能力而作为顺向示踪剂被广泛应用于神经科学研究中。然而,基于H129的示踪剂还有一些缺点需要克服,包括非特异感染和较低的灵敏度等。本论文通过对H129病毒进行遗传学改造,致力于解决H129病毒的这两个重要缺陷。首先,H129是否能作为严格的顺向跨突触示踪剂使用。本论文构建了TK和ICP34.5双基因缺失的H129突变株H306。由于H306在不分裂的细胞中不能增殖,本文以此毒株分别在体内外实验中评估了H129的侵染特性及其逆向标记效率。实验结果表明,无论标记时间长短（3天或10天）,H306均可以高效的标记脑内神经元,且其能够通过轴突末梢吸收的方式大量标记上游脑区投射神经元,显示出明显的逆向标记表型。类推野生型H129也会逆向吸收并且病毒会复制跨突触传播,因此,具有跨多突触标记能力的H129的示踪结果可能是一个混合网络。在解释来自于目前H129工具病毒的顺向示踪结果时需要谨慎。其次,实现开发严谨的顺向H129示踪剂需要有效地消除H129病毒感染轴突末梢的能力,本文的研究思路来源于溶瘤病毒构建策略。这些溶瘤病毒的研究主要聚焦于开发具有靶向感染能力的HSV以溶杀肿瘤。基于此,本文构建了一株重组H129病毒Hs06以重靶向特定类型神经元。Hs06的糖蛋白g D基因重组插入了抗人表皮生长因子受体2型（Her2）的单链抗体序列,利用腺相关病毒（AAV）在特定脑区或者特定类型神经元中表达Her2受体和野生型g D,便可以实现Hs06的特异性感染和单级输出网络的示踪。本文在初级视皮层（V1）环路的实验验证了Hs06的顺向特性,同时解析了外侧下丘脑（LH）和腹侧被盖区（VTA）的GABA能神经元的输出网络,实验结果均与文献中利用电生理与行为学等手段得到的结论一致。因此,结合广泛应用的重组酶转基因小鼠（如cre-品系）,Hs06可以标记特定脑区特定类型神经元的直接投射网络。最后,为提高标记灵敏度,本论文选择了增强H129病毒携带的外源基因表达量的思路。使用类似于特洛伊木马的策略,本文章中构建了一株H129/AAV嵌合病毒H8,以增加外源基因表达框的拷贝数的方式实现荧光基因表达增强。体内外实验均证实H8基因组引入的AAV复制系统可以有效复制H8中外源基因表达框,使得H8的荧光强度显着高于目前的H129示踪工具。荧光增强使得H8可以更快速的进行顺向示踪,而且无需进行免疫组化增强信号。上述结果表明,将AAV复制系统整合到HSV基因组中可以增强外源基因的表达水平。另外该方法也可能作为一个通用策略用于增强基于HSV的基因载体的外源基因表达能力。总的来说,本论文工作系统地研究了现有H129示踪剂的缺陷,并对其进行了改进。本文构建的新型顺向示踪病毒系统可以实现对神经元输出网络的严谨解析,有望在神经环路的研究中发挥重要作用。本文还建立了一种适用于现有H129示踪剂的荧光增强策略,将在缩短实验时间等方面发挥重要作用。
刘淼[6]（2020）在《利用类器官研究肝胆胰导管上皮祖细胞特性》文中研究说明肝脏和胰腺是人体两大重要外分泌腺,分泌食物消化所必需的消化液,这些消化液由充当管道系统的导管网络收集,分配到胆囊进行储存或消化道对食物进行消化加工。在胚胎发育过程中,肝脏、胆管及胰腺谱系的细胞均来源于共同的内胚层祖细胞。近年研究表明,在人的胆周腺中存在多能干细胞群,具有多向分化潜能,能分化为肝实质细胞、胆管细胞以及胰腺内分泌细胞;另有研究发现,在胰管腺中也存在功能类似的祖细胞。成体组织中的干/祖细胞制备的类器官是一种三维上皮结构培养物,已有研究证明,肝脏类器官具有向功能肝细胞分化的能力;小鼠胰腺类器官在移植到体内后可以分化为肝细胞和胰腺内分泌细胞。结合以上研究结果,我们推测肝胆胰导管上皮祖细胞具有相似的功能,都能向肝脏细胞、胆管细胞及胰腺内分泌细胞分化。因此本研究利用3D培养技术,分别建立小鼠的肝内胆管类器官（mouse hepatic duct organoid,mHDO）、胆总管类器官（mouse bile tree organoid,mBTO）和胰腺主导管类器官（mouse pancreatic duct organoid,mPDO）培养物,通过检测细胞分化能力、细胞谱系追踪和高通量转录组测序等方法验证肝胆胰上皮祖细胞的基因表达及功能的相似性;并成功建立了人胆管上皮类器官（human bile tree organoid,hBTO）,在体外利用3D培养,发现其可以向肝细胞,胆管细胞及胰腺β细胞分化,证明了 hBTO向肝胆胰多谱系方向的分化潜能,为疾病治疗及药物筛选开辟了新途径,为器官损伤后的再生与与修复,特别是肝脏/胰岛移植发掘更广泛的细胞资源。本研究的主要研究方法及结果:1.利用机械法在解剖镜下直接分离获得肝内胆管（肝管）、胆总管及胰腺主导管（胰管）,通过胶原酶消化法获得肝胆胰导管上皮细胞,利用Matrigel作为基质,成功建立小鼠肝胆胰导管上皮祖细胞类器官细胞系mPDO、mBTO和mHDO,三种类器官具有连续的自我更新能力,经历冻存复苏后仍可连续传代至6个月以上。利用反转录PCR及免疫染色初步证明,三种类器官具有向多谱系分化的潜能。2.分别制备三组肝胆胰导管类器官mPDO、mBTO和mHDO,利用转录组测序分析,比较三种类器官与组织中肝胆胰导管上皮细胞,及三种类器官之间的基因表达差异变化,结果证明与不同组织来源的导管细胞相比,培养后的三种类器官基因表达的差异变化及程度都显着降低,具有相似的基因表达水平。3.利用Matrigel基质胶,结合特定的细胞培养条件,成功建立mPDO、mBTO和mHDO向肝实质样细胞（ALB表达细胞）、胆管细胞、胰腺β样细胞（Insulin分泌细胞）分化方法,利用体内移植及体外分化方法,证明三种类器官分化功能具有相似性。4.利用细胞遗传谱系追踪方法,通过对转基因小鼠组织的连续切片观察,以及利用转基因小鼠制备mPDO、mBTO和mHDO,证明了肝胆胰导管上皮祖细胞均来源于PDX1表达细胞,尽管制备的三种类器官都广泛表达Lgr5,正常小鼠体内肝胆胰上皮细胞在胚胎发育、新生阶段及发育成熟后均无Lgr5的表达。5.在证明了肝胆胰上皮祖细胞相似性的基础上,我们选取了最易获得的人胆管上皮组织建立人胆管类器官hBTO,并且建立了 hBTO向肝实质样细胞（ALB表达细胞）、胆管细胞、胰腺β样细胞（Insulin分泌细胞）分化方法,为研究器官损伤后的再生与修复奠定基础。结论:小鼠肝胆胰导管上皮细胞制备的类器官mPDO、mBTO和mHDO具有较高的相似性,包括具有相似的基因表达模式;具有向肝胆胰多谱系方向分化的潜能;具有相似的细胞谱系特征。进一步的,建立了人胆管类器官hBTO向肝胆胰分化的方法,为建立药物筛选模型、研究组织再生与修复以及器官移植开辟了新的途径。
张小灵[7]（2019）在《D6-Cre、Emx1-Cre、hGFAP-Cre三种大脑皮层发育相关工具鼠表达特征的比较研究》文中认为大脑皮层内部区域组织高度专业化,是哺乳动物中枢神经系统的重要组成部分。大脑皮层的生成过程具有时序性和时空特异性。大脑皮层中各层神经元可以投射到不同的区域,发挥不同的功能,以维持神经系统正常的功能。如果产生的神经元类型及其分布发生异常,则会导致众多临床上的疾病,如自闭症,精神分裂症,癫痫等。所以研究大脑皮层发育过程中神经元精确有序的生成和定位具有重要意义。在实验室前期工作中,通过原位杂交技术发现D6-Cre和hGFAP-Cre介导的Dicer条件性敲除小鼠端脑中均出现了由Dicer敲除导致的microRNA缺失,但是不同Cre介导的条件性敲除小鼠也出现了不同的表型。为了探索其表型差异的原因,我们进行了在研究大脑皮层方面应用较多的三种Cre工具鼠D6-Cre、Emx1-Cre、hGFAP-Cre表达特征的比较。在本研究中发现,Emx1-Cre、D6-Cre、hGFAP-Cre工具鼠Cre重组酶在大脑皮层中的起始表达时间分别为胚胎期第9.5天（即E9.5）、E10.5以后（约为E11）和E12.5。随着发育的进行,D6-Cre重组酶的表达始终局限于端脑,而Emx1-Cre和hGFAP-Cre的表达范围在不断扩大。同时,在利用不同Cre工具鼠条件性敲除Dicer时均出现了神经元放射状迁移异常的现象。前期工作提示miR-129可能与大脑皮层神经元迁移有关。因此我们通过鼠胚电转将miR-129过表达后,发现大脑皮层中神经元迁移过程受到抑制。而过表达Fmr1后,可以促进大脑皮层中神经元的迁移,且不影响神经元命运决定。在鼠脑中同时过表达miR-129和Fmr1能够部分缓解由过表达miR-129引起的神经元迁移抑制现象。综上所述,我们发现D6-Cre、Emx1-Cre、hGFAP-Cre三种工具鼠具有不同的表达模式,且与文献报道略有不同;在microRNA调控大脑皮层神经元迁移方面,发现miR-129可以靶向Fmr1基因,进而调控大脑皮层神经元迁移过程。
孙乐强[8]（2018）在《嗜神经病毒神经嗜性和毒性比较》文中提出嗜神经病毒是一类对神经系统高度敏感的病毒,多种嗜神经病毒具有严格的神经嗜性,并且在感染后能够沿特定方向跨突触传播。随着基因工程和反向遗传学技术的迅速发展,嗜神经病毒被改造为多种形式的环路标记工具,用以解析中枢神经系统的神经环路连接网络。而且可结合钙离子指示蛋白、光遗传和化学遗传工具特异性地监测和操纵神经环路的活性,对神经环路的功能进行研究。嗜神经病毒在神经元内的转运方向具有一定的偏好性。单纯疱疹病毒（HSV）的HSV129毒株和水泡性口炎病毒（VSV）主要以顺行方向转运,被作为神经环路顺向标记工具。狂犬病毒（RABV）,犬腺病毒2型（CAV）,伪狂犬病毒（PRV）的bartha株和逆行标记的腺相关病毒rAAV2-retro沿轴突逆行转运,被改造用于神经环路的逆向标记。根据病毒的复制能力分为不跨突触的标记病毒和跨多级突触的标记病毒。不跨突触的标记病毒为复制缺陷型病毒,如G蛋白缺失的狂犬病毒（RABV-SAD-?G）,E1蛋白缺失的犬腺病毒（CAV2）和rAAV2-retro,用以标记注射位点的一级环路连接。跨多级突触的标记病毒为复制完整型病毒,包括PRV的bartha株、RABV的固定毒株、HSV的H129毒株,随着病毒的复制,可跨突触标记核团的多级环路。如此繁多的病毒标记工具,使科研工作者能够更全面的解析大脑的神经连接以及信号传递模式。在不同的研究中该如何准确的选择有效的病毒工具,依赖于我们对不同病毒特性的了解。不同来源的标记病毒具有不同特性,包括病毒结构、基因组、受体蛋白、复制包装等过程,病毒只能够入侵表达对应受体蛋白的神经元,进入神经元后通过与宿主蛋白的相互作用,完成病毒的复制、包装等过程。神经网络由种类繁多的神经元构成,不同类型的神经元的基因表达各不相同。以上病毒与宿主之间的差异可能会导致嗜神经病毒对不同类群的神经元具有不同的神经嗜性,造成神经环路标记的不一致。然而,目前对不同示踪病毒的神经嗜性比较,及其在环路标记的影响并没有系统的研究报道。本课题对目前常用的跨多级示踪病毒和不跨突触的示踪的病毒的神经嗜性和毒性进行系统的分析比较,为神经环路标记工具的合理应用提供参考。1.多级逆行示踪病毒神经嗜性比较将表达绿色荧光蛋白的RABV的固定毒来源的CVS-B2c-EGFP和PRV Bartha株来源的PRV-152（EGFP）分别注射在小鼠的腘淋巴结。病毒粒子被支配淋巴结的神经末吸收后沿神经纤维逆行标记支配淋巴结的神经元,随着病毒的复制和跨突触感染,大脑内的高级神经连接网络被标记。通过全脑切片成像,对两种病毒标记的神经元的核团位置和数量进行分析比较,结果显示通过以上两种逆向标记病毒绘制的神经环路存在差异。2.单级逆行示踪病毒神经嗜性比较将几种常用的复制缺陷型病毒SAD-?G、rAAV2-retro、CAV2-Cre以及一种化学示踪剂green retrobeads分别注射在鼠脑的相同核团,标记注射位点的一级输入环路。通过全脑切片、成像,对不同病毒标记的神经元的核团和数量进行统计分析。结果发现不同病毒标记的神经环路并不完全一致。进一步通过Cre/Lox重组酶系统放大荧光蛋白信号排除不同病毒荧光蛋白表达差异;通过混合注射,排除注射误差后,依然能够观察到标记差异。这说明不同的标记病毒对大脑内的神经元类群存在嗜性偏好。在对下丘脑的环路进行标记时,rAAV2-retro更倾向于标记皮层,而SAD-?G倾向于标记下丘脑和基底神经节。3.病毒神经嗜性差异机制的初步探索病毒利用细胞膜上的受体感染进入神经元,不同类型的病毒只识别并结合其对应的特异受体蛋白。而且大脑内的神经元种类繁多、功能各异,基因表达必定存在差异。因此,我们推测病毒具有神经嗜性差异的重要因素是神经元轴突末梢的病毒受体表达不均一,从而造成病毒对不同类群的神经元具有选择性。我们在RABV不敏感的神经元过表达禽白血病病毒受体（TVA）后,能够明显提高对应配体EnvA（禽白血病病毒囊膜蛋白）假包装的狂犬病毒的感染性。这说明神经元表达对应病毒受体后,能够提高该病毒的神经嗜性。为了进一步探索决定神经嗜性的分子机制,我们建立了鼠脑神经元的单细胞分离方法,分离SAD-?G和rAAV2-retro标记的神经元,并进行单细胞测序。对22群SAD-?G标记的神经元和21群rAAV2-retro标记的神经元的转录组进行分析,推测造成两种病毒神经嗜性差异的分子机制。4.示踪病毒的毒性比较示踪病毒注射后由于病毒的感染和基因的表达势必会对脑组织产生一定的毒性。我们首先通过组织RNA-seq对注射位点和逆标记位点组织的转录组进行测序,分析病毒标记对脑组织基因表达的影响。结果显示病毒标记诱导大量免疫相关基因的表达,SAD-?G对注射位点和逆标记位点的基因表达的改变比rAAV2-retro更显着。进而通过免疫组织化学染色观察到SAD-?G标记后在注射位点和逆标记位点出现小胶质细胞的大量激活,rAAV2-retro仅在注射位点引起小胶质细胞的激活,而在逆标记位点并未出现明显的激活现象。同时我们还发现SAD-?G逆标记会引起催产素基因的高表达。5.多种示踪病毒联合应用标记高级神经环路通过以上研究我们发现,不同来源的示踪病毒的神经嗜性存在差异。我们利用病毒的神经嗜性差异,对多种单级示踪病毒联合应用,提出解析特定核团的二级输入环路策略。本研究通过比较不同嗜神经病毒对大脑内神经元的感染特性,确定嗜神经病毒对大脑内的神经元存在嗜性差异,并且通过单细胞测序分析造成病毒神经嗜性差异的分子机制。同时比较了不同嗜神经病毒改造的神经环路标记工具在脑组织内产生的毒性反应。以上研究为嗜神经病毒感染机制研究提供新的思路,同时也为嗜神经病毒在神经环路中的正确应用提供参考。
谭禄彬[9]（2018）在《内侧缰核到脚间核通路乙酰胆碱及其alpha5亚型受体功能》文中认为内侧缰核（MHb）到脚间核（IPN）通路是背侧间脑传导系统（DDC）的重要组成部分,是连接前脑和后脑的重要信息中继站之一。已有研究表明MHb-IPN影响运动感觉传输、社交行为、药物滥用以及一些情绪性行为,但是其亚核团功能区分和神经元类型并不清楚。本研究利用转基因技术、细胞遗传学、化学遗传学等方法敲除、标记、损毁、激活和抑制特定类型神经元,以观察其行为学效应。我们首先运用CRISPR-Cas9转基因技术构建了6个MHb高表达基因的敲除小鼠品系,行为实验表明分布在ventral MHb的CNNM2和TSPAN18小鼠恐惧记忆不能消退,而分布于superior MHb的SYT6不影响恐惧记忆的消退,只影响恐惧记忆的整体水平或者可能影响小鼠对电击的感受和恐惧记忆的学习,分布于整个MHb的TMEM176A/B和HCN3行为表现介于二者之间,它们的恐惧水平增加,但恐惧记忆消退速度未被显着影响。细胞遗传学方法特异性损毁Ventral MHb减缓小鼠恐惧记忆消退,dorsal MHb损毁不但减缓小鼠恐惧记忆消退,且dorsal MHb还参与了恐惧记忆的形成,而模拟MHb递质释放激活IPN可以加快小鼠恐惧记忆消退。环路示踪分析也表明了BAC-dorsal MHb和LPO-Ventral MHb两条特异性通路,说明了MHb参与了小鼠恐惧记忆的形成与消退去具有亚核团特异性。Ventral MHb损毁降低小鼠的焦虑水平、减弱小鼠社交动机、对环境的适应能力下降、认知能力和气味分辨能力受损,但不影响小鼠的奖赏感受能力。我们通过检测个体IPN CHRNA5基因表达水平,发现大鼠群体中CHRNA5基因表达水平可以显着分为两个群体,CHRNA5基因表达水平与大鼠尼古丁摄入量成正相关关系,且CHRNA5基因的本底表达并不受尼古丁摄入的影响。CRE重组酶特异性敲入的转基因大鼠可以实现特异性标记IPN CHRNA5神经元,不同浓度的尼古丁可以激活MHb和IPN神经元,化学遗传学方法激活IPN CHRNA5神经元可以增加大鼠尼古丁摄入,抑制IPN CHRNA5神经元可以减少大鼠尼古丁摄入。本文的研究表明MHb影响小鼠恐惧记忆形成和消退,以及与这些行为相关的情绪性行为表达,并且具有亚核团特异性;本文还发现IPN CHRNA5神经元控制大鼠尼古丁摄入,本研究为相关精神紊乱和尼古丁成瘾研究提供新的视角。
王明[10]（2018）在《牛安全位点Rosa26的鉴定与定点修饰》文中研究指明外源基因在受体细胞或个体中持续稳定表达对于基础研究和转基因应用具有重要意义。传统转基因技术一般通过随机插入的方式将外源基因整合到基因组中,这种方法虽然简单直接,却存在着固有的缺陷。其整合位点和拷贝数的不确定性,往往使外源基因在动物个体中表达不稳定或表达差异过人,严重限制了转基因动物的应用与发展。近年来,基于同源重组的定点整合技术的发展,使外源基因可以以单拷贝形式整合至预定的基因组位点上，有效克服了传统转基因技术随机整合的缺陷。可是这个位点我们如何选择,才能保证外源基因良性插入并高效表达,并没有得到解决。在此基础上,科研人员提出“安全位点”定点转基因技术,该技术是指外源基因以单拷贝的形式定点插入到动物受体基因组中的“安全位点”,此位点既可以保证外源基因持续稳定表达,同时对动物自身基因组没有影响,保证受体动物的安全。Rosa26位点是动物基因组中应用最为广泛的“安全位点”,最早由 Friedrich和Soriano在小鼠中发现。对Rosa26的研究发现,该位点可以支持外源基因在胚胎发育各时期及个体所有组织中广谱性表达,且对胚胎发育、动物个体没有不良影响。目前,利用Rosa26位点建立的定点修饰小鼠模型已有几百种,在基因功能研究、疾病模型研究、药物开发等领域发挥着重要作用。继小鼠Rosa26发现后,人、大鼠、猪、家兔、羊的Rosa26位点先后被确定,通过研究发现,该位点在各物种中具有高度的同源性、保守性,均支持外源基因持续稳定高表达。牛,作为一种重要的农业经济动物,对其进行遗传改造,培育更加安全、具有更高牛乳品质、具有抗逆抗病等优良性状的品系是当前研究的热点。鉴定和定点修饰牛的安全位点Rosa26,不仅可以有效解决常规转基因修饰带来的诸多问题,更可以为制备外源基因稳定高表达的转基因大动物品系提供有效途径。本研究通过多重序列比对的方式,利用小鼠、大鼠、猪和人的Rosa26跨物种保守序列搜索牛的基因组数据库,在牛22号染色体上定位到一段同源性高达75%的序列,该序列区段上下游基因与已报道物种Rosa26 上下游基因一致。我们初步认为牛22号染色体上定位的序列为牛的Rosa26（bovine Rosa26,bRosa26）。3’RACE、5’RACE实验检测到该位点由两个外显子组成,编码一个转录本。RT-PCR、Q-PCR实验证实bRosa26在牛的各组织中广泛表达。将bRosa26启动子序列克隆至至绿色荧光蛋白表达载体上,瞬时转染多个组织来源的细胞系,均检测到绿色荧光蛋白的表达,在细胞水平上证实bRosa26启动子具有启动外源基因表达的活性。结合TALENs技术,本研究高效的将Cre重组酶介导的报告基因重组系统定点整合在bRosa26位点上,并利用TAT-Cre蛋白在细胞中实现了高效的Cre-loxP介导的重组反应。利用体细胞核移植技术,本研究成功制备bRosa26基因打靶胎儿和牛。RT-PCR、Q-PCR、Western Blot等实验证实,外源基因EGFP在胚胎发育各时期、个体各组织中稳定广泛表达,且其表达对bRosa26上下游600 Kb表达框内所有基因的表达未造成显着干扰,在个体水平上证实bRosa26位点是一个支持外源丛因广谱性表达的安全位点。本研究利用bRosa26基因打靶胎儿成功建立了成纤维细胞系,一对异源loxP位点的引入,可以基于重组酶介导的盒式交换（Recombination-mediated cassette exchange,RMCE）实现基因替换。利用此成纤维细胞系,我们高效地将绿色荧光蛋白EGFP替换为红色荧光蛋白tdDIMER,证实bRosa26位点可以介导高效的RMCE实现基因替换。本研究将三种广谱型启动子启动EGFP表达的打靶载体高效地定点整合在bRosa26位点上，在细胞水平上检测到EGFP均能持续稳定表达,且其表达对bRosa26上下游邻近基因的表达未造成显着干扰。其中CAG启动子启动EGFP的表达活性高于EF1a、PGK以及bRosa26内源启动子,证实bRosa26位点支持外源启动子启动外源基因的友好表达。本研究首次在牛的基因组中寻找并鉴定了安全位点Rosa26,结合TALENs技术成功对该位点实现了高效地定点修饰。结合穿膜肽TAT-Cre蛋白成功在牛细胞中实现了高效地Cre-loxP介导的重组反应。结合体细胞核移植技术成功制备了稳定表达EGFP胎儿成纤维细胞系及动物个体。同时,在建立的基于RMCE的基因替换成纤维细胞系中,实现了红色荧光蛋白的替换,这为后期任意基因通过RMCE技术定点整合至bRosa26,实现任意基因在牛中持续稳定高表达奠定了良好的基础。本研究克服了传统转基因技术的诸多弊端,极大地提高了外源基因在牛基因组中的整合效率,为在牛基因组中实现安全、精确的基因修饰建立了良好的工具,对基因定点修饰牛在产业化、商业化中的应用具有重要的推动意义。
二、Cre重组酶表达载体的构建及其在转基因小鼠胰腺中的表达（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、Cre重组酶表达载体的构建及其在转基因小鼠胰腺中的表达（论文提纲范文）
（1）由SETD4调控的静息c-Kit+细胞在激活后对心脏微血管生成作用的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词和术语表 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 研究背景 |
| 1.1.1 c-Kit受体蛋白的研究概况 |
| 1.1.2 心脏中血管生成的研究概况 |
| 1.1.3 SET结构域蛋白研究概况 |
| 1.1.4 细胞静息的研究概况 |
| 1.2 研究目的与意义 |
| 第二章 SETD4 蛋白在静息的c-Kit阳性细胞中的表达特征分析 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料 |
| 2.2.1 实验动物 |
| 2.2.2 实验试剂 |
| 2.2.3 实验仪器 |
| 2.3 方法 |
| 2.3.1 小鼠取材 |
| 2.3.2 细胞的流式分选 |
| 2.3.3 细胞的流式周期分析 |
| 2.3.4 细胞的滴片与免疫荧光 |
| 2.3.5 细胞的BrdU掺入及检测 |
| 2.3.6 细胞的腺病毒感染 |
| 2.3.7 细胞的EdU标记与检测 |
| 2.3.8 图像处理和数据分析 |
| 2.4 结果 |
| 2.4.1 心脏内c-Kit阳性细胞的流式周期分析 |
| 2.4.2 心脏内c-Kit阳性细胞的静息状态分析 |
| 2.4.3 心脏内静息的c-Kit阳性细胞中SETD4 蛋白的表达特征分析 |
| 2.4.4 体外激活静息的c-Kit阳性细胞后SETD4 蛋白的表达特征分析 |
| 2.4.5 c-Kit阳性细胞中过表达SETD4 蛋白的腺病毒体系的构建 |
| 2.4.6 体外过表达SETD4 蛋白促进c-Kit阳性细胞静息的功能分析 |
| 2.5 小结与讨论 |
| 第三章 SETD4 蛋白促进c-Kit阳性细胞中异染色质生成的功能分析 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料 |
| 3.2.1 实验动物 |
| 3.2.2 实验试剂 |
| 3.2.3 实验仪器 |
| 3.3 方法 |
| 3.3.1 细胞培养 |
| 3.3.2 细胞的腺病毒感染 |
| 3.3.3 细胞的EdU标记与检测 |
| 3.3.4 细胞的滴片与免疫荧光 |
| 3.3.5 细胞样品的蛋白抽提 |
| 3.3.6 Western blot |
| 3.3.7 图像处理和数据分析 |
| 3.4 结果 |
| 3.4.1 SETD4 阳性细胞中染色质分子特征分析 |
| 3.4.2 体外激活的c-Kit阳性细胞中染色质分子的特征分析 |
| 3.4.3 体外过表达SETD4 蛋白促进异染色质生成中H4K20 的三甲基化 |
| 3.5 小结与讨论 |
| 第四章 SETD4 阳性细胞在小鼠心脏胚胎发育阶段的功能分析 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料 |
| 4.2.1 实验动物 |
| 4.2.2 实验试剂 |
| 4.2.3 实验仪器 |
| 4.3 方法 |
| 4.3.1 谱系示踪转基因小鼠的构建 |
| 4.3.2 转基因小鼠的杂交及基因型鉴定 |
| 4.3.3 小鼠心脏组织的冷冻包埋 |
| 4.3.4 冷冻切片与免疫荧光 |
| 4.3.5 细胞的滴片与免疫荧光 |
| 4.3.6 图像处理与数据统计分析 |
| 4.4 结果 |
| 4.4.1 SETD4-Cre转基因小鼠的构建与鉴定 |
| 4.4.2 SETD4 蛋白在心脏胚胎发育早期出现 |
| 4.4.3 心脏中内源性c-Kit阳性细胞来源于胚胎期SETD4 阳性细胞 |
| 4.4.4 心脏胚胎期SETD4 阳性细胞产生心血管各类型细胞的谱系后代 |
| 4.5 小结与讨论 |
| 第五章 SETD4 敲除对于小鼠心脏中内皮细胞的产生及血管生成的功能分析 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 材料 |
| 5.2.1 实验动物 |
| 5.2.2 实验试剂 |
| 5.2.3 实验仪器 |
| 5.3 方法 |
| 5.3.1 条件性敲除转基因小鼠的构建 |
| 5.3.2 转基因小鼠的杂交及基因型鉴定 |
| 5.3.3 他莫昔芬药物的诱导 |
| 5.3.4 小鼠心脏组织冷冻包埋 |
| 5.3.5 冷冻切片与免疫荧光 |
| 5.3.6 细胞样品的蛋白抽提 |
| 5.3.7 Western blot |
| 5.3.8 图像处理和数据分析 |
| 5.4 结果 |
| 5.4.1 SETD4 基因敲除小鼠的构建与鉴定 |
| 5.4.2 SETD4 基因敲除效率的鉴定 |
| 5.4.3 基于c-Kit驱动的 SETD4 基因敲除后激活静息的 c-Kit阳性细胞 |
| 5.4.4 基于c-Kit驱动的SETD4 基因敲除后促进内皮细胞的产生 |
| 5.4.5 基于c-Kit驱动的SETD4 基因敲除后促进微血管的产生 |
| 5.4.6 基于c-Kit驱动的SETD4 基因敲除后激活PI3K-m TOR信号通路 |
| 5.5 小结与讨论 |
| 第六章 SETD4 敲除在心肌梗死引发的心脏缺血损伤中的作用和功能 |
| 6.1 引言 |
| 6.2 材料 |
| 6.2.1 实验动物 |
| 6.2.2 实验试剂 |
| 6.2.3 实验仪器 |
| 6.3 方法 |
| 6.3.1 心肌梗死小鼠模型的构建 |
| 6.3.2 心肌梗死面积的马松三色检测法 |
| 6.3.3 小鼠心功能的超声检测 |
| 6.3.4 冰冻切片与免疫荧光 |
| 6.3.5 心肌细胞凋亡的TUNEL检测法 |
| 6.3.6 图像处理和数据分析 |
| 6.4 结果 |
| 6.4.1 SETD4 基因的敲除缓解心肌梗死引发的心功能受损 |
| 6.4.2 SETD4 基因敲除的c-Kit细胞响应心肌梗死损伤 |
| 6.4.3 心肌梗死小鼠中SETD4 基因敲除的c-Kit细胞产生更多的微血管细胞 |
| 6.4.4 心肌梗死小鼠中SETD4 基因敲除的c-Kit细胞极少贡献心肌细胞及冠状血管内皮细胞 |
| 6.4.5 SETD4 基因的敲除抑制心肌梗死引发的心肌细胞的凋亡 |
| 6.5 小结与讨论 |
| 第七章 结论与展望 |
| 7.1 结论 |
| 7.2 展望 |
| 参考文献 |
| 附录一 论文所用引物 |
| 附录二 常用试剂Ⅰ |
| 附录三 常用试剂Ⅱ |
| 作者简历 |
| 致谢 |
（2）小鼠Kiss1基因启动子的鉴定、功能分析及应用探索（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第一章 引言 |
| 1.1 性发育 |
| 1.2 Kiss1 基因 |
| 1.2.1 Kiss1 概述 |
| 1.2.2 Kiss1 基因与性发育 |
| 1.2.3 Kiss1 基因转录调控的研究进展 |
| 1.2.4 雌激素对Kiss1 基因的调控 |
| 1.3 Kiss1 神经元分布的可视化 |
| 1.4 CRISPR-Cas9 系统和Cre-lox P系统 |
| 1.4.1 CRISPR-Cas9 系统 |
| 1.4.2 Cre-lox P系统 |
| 1.4.3 启动子在两组系统中的重要性 |
| 1.5 小鼠Kiss1 基因 |
| 1.6 GT1-7 细胞系和N6 细胞系 |
| 1.7 研究内容 |
| 1.8 研究意义 |
| 第二章 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 实验材料 |
| 2.1.2 生物信息学网站 |
| 2.1.3 实验仪器 |
| 2.1.4 实验试剂 |
| 2.1.5 常用试剂的配制 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 Kiss1 启动子5’端缺失片段荧光素酶报告基因重组载体的构建 |
| 2.2.2 细胞培养的基本操作 |
| 2.2.3 双荧光素酶报告基因检测方法 |
| 2.2.4 pLL3.7-p2(-1089~+18)-EGFP载体的构建 |
| 2.2.5 实时荧光定量PCR(q RT-PCR)检测基因表达水平 |
| 2.2.6 流式细胞术检测细胞荧光强度 |
| 2.2.7 下丘脑原代神经元体外分离和培养 |
| 2.2.8 慢病毒的包装及感染 |
| 2.2.9 pLL3.7-p2(-1089~+18)-Cas9/Cre载体的构建 |
| 2.2.10 T7E1 assay |
| 2.2.11 红色荧光观察及PCR法验证Cre介导Ai9 质粒的重组 |
| 2.2.12 数据分析及作图 |
| 第三章 结果与分析 |
| 3.1 Kiss1 启动子5’端缺失片段的设计 |
| 3.2 Kiss1 启动子5’端缺失片段荧光素酶报告基因重组载体的构建及验证 |
| 3.2.1 Kiss1 启动子5’端缺失片段的克隆 |
| 3.2.2 pGL3-Basic载体线性化 |
| 3.2.3 pGL3-Kiss1 promoter重组载体的鉴定 |
| 3.3 Kiss1 启动子转录调控区域鉴定 |
| 3.3.1 在GT1-7 细胞中测定启动子片段活性 |
| 3.3.2 Kiss1 启动子在不同细胞系中的活性检测 |
| 3.4 Kiss1 启动子p2(-1089~+18)片段的转录因子结合分析 |
| 3.5 p GL3-p2(-1089~+18)-EGFP载体的构建及验证 |
| 3.5.1 pLL3.7-CMV-EGFP载体线性化 |
| 3.5.2 p2(-1089~+18)启动子片段的克隆 |
| 3.5.3 pLL3.7-p2(-1089~+18)-EGFP重组载体的鉴定 |
| 3.6 验证Kiss1 启动子对雌激素的响应 |
| 3.6.1 细胞转染与荧光表达情况观察 |
| 3.6.2 流式细胞术、q RT-PCR、双荧光素酶法验证启动子对雌激素的响应 |
| 3.7 Kiss1 神经元的荧光标记 |
| 3.7.1 下丘脑原代神经元细胞体外分离培养 |
| 3.7.2 慢病毒包装及滴度测定 |
| 3.7.3 慢病毒感染下丘脑原代神经元细胞 |
| 3.8 pLL3.7-p2(-1089~+18)-Cas9/Cre载体的构建及验证 |
| 3.8.1 pLL3.7-p2(-1089~+18)-EGFP载体线性化 |
| 3.8.2 Cas9 编码基因和Cre编码基因片段的克隆 |
| 3.8.3 pLL3.7-p2(-1089~+18)-Cas9/Cre重组载体的鉴定 |
| 3.9 T7E1 assay验证pLL3.7-p2(-1089~+18)-Cas9 载体功能 |
| 3.9.1 pLL3.7-p2(-1089~+18)-Cas9和42230-EGFP-mi R-29a的有效性验证 |
| 3.9.2 T7E1 assay检测剪切效率 |
| 3.10 利用Ai9 质粒验证pLL3.7-p2(-1089~+18)-Cre载体功能 |
| 3.10.1 pLL3.7-p2(-1089~+18)-Cre载体的有效性验证 |
| 3.10.2 验证Cre重组酶介导Ai9 质粒的重组 |
| 第四章 讨论 |
| 4.1 Kiss1 启动子转录活性区域的鉴定及激素响应评估 |
| 4.2 Kiss1 启动子的转录因子结合分析 |
| 4.3 Kiss1 神经元的荧光标记 |
| 4.4 Kiss1 启动子p2(-1089~+18)在CRISPR-Cas9和Cre-lox P系统中的应用 |
| 第五章 结论与展望 |
| 5.1 结论 |
| 5.2 展望 |
| 参考文献 |
| 攻读硕士学位期间发表学术论文目录 |
| 课题来源 |
| 致谢 |
（3）线粒体甘油-3-磷酸乙酰转移酶（GPAM）基因沉默对牛乳脂代谢的影响（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 英文缩写词表 |
| 引言 |
| 第一篇 文献综述 |
| 第一章 GPAM基因的研究进展 |
| 1.1 GPAM基因家族基因 |
| 1.2 GPAM基因的生物学作用 |
| 1.3 线粒体GPAM的功能 |
| 1.4 酵母中的GPAT表达 |
| 1.5 GPAM在甘油三酯合成中的调控作用 |
| 1.6 结语 |
| 第二章 影响乳品质的重要因素及乳脂代谢通路的研究进展 |
| 2.1 甘油三酯的在乳品质评价中意义 |
| 2.2 哺乳动物乳腺中的甘油三酯合成 |
| 2.3 乳脂代谢相关基因的简介 |
| 2.4 多不饱和脂肪酸在乳脂中的调控作用 |
| 2.5 乳汁中的甘油三酯表达 |
| 2.6 结语 |
| 第三章 线粒体基因及线粒体能量代谢的研究进展 |
| 3.1 线粒体的主要功能 |
| 3.2 线粒体在生命活动中的重要意义 |
| 3.3 线粒体在细胞死亡过程中的作用 |
| 3.4 线粒体能量代谢 |
| 3.5 结语 |
| 第四章 基因编辑技术的研究进展 |
| 4.1 转基因技术概况 |
| 4.2 精原干细胞技术 |
| 4.3 原始生殖细胞技术 |
| 4.4 胚胎干细胞基因打靶技术 |
| 4.5 条件基因靶向技术 |
| 4.6 诱导多能干细胞技术 |
| 4.7 CRISPR-CAS9 技术 |
| 4.8 结语 |
| 第二篇 研究内容 |
| 第一章 牛GPAM基因敲除乳腺上皮细胞系的建立及其对细胞内乳脂代谢的影响 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 实验细胞 |
| 1.1.2 主要仪器 |
| 1.1.3 实验用酶 |
| 1.1.4 其他药品及试剂 |
| 1.1.5 试剂的配置 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 奶牛乳腺上皮细胞系的支原体检测 |
| 1.2.2 GPAM基因第一和第二外显子的克隆及鉴定 |
| 1.2.3 GPAM基因敲除靶位点的设定以及sg RNA的设计 |
| 1.2.4 gRNA的体外筛选 |
| 1.2.5 GPAM基因g RNA表达载体的构建 |
| 1.2.6 细胞培养及传代 |
| 1.2.7 敲除载体的的转染 |
| 1.2.8 细胞内编辑效率验证 |
| 1.2.9 敲除细胞的筛选、培养及鉴定 |
| 1.2.10 实时荧光定量PCR和 Western Blot检测候选基因的表达 |
| 1.2.11 GPAM基因表达载体与干扰载体鉴定 |
| 1.2.12 细胞内甘油三酯和胆固醇含量检测 |
| 1.2.13 细胞内脂肪酸含量的测定 |
| 1.3 结果 |
| 1.3.1 乳腺上皮细胞系的支原体检测 |
| 1.3.2 GPAM基因第一和第二外显子的克隆和鉴定 |
| 1.3.3 gRNA浓度的测定 |
| 1.3.4 gRNA的体外筛选结果 |
| 1.3.5 敲除载体的构建及细胞转染 |
| 1.3.6 细胞内敲除效率验证 |
| 1.3.7 阳性细胞测序验证 |
| 1.3.8 GPAM过表达和干扰载体鉴定与检测结果 |
| 1.3.9 牛GPAM基因敲除后细胞内m RNA和蛋白表达的检测 |
| 1.3.10 GPAM基因表达对细胞内甘油三酯含量的影响 |
| 1.3.11 GPAM基因表达对细胞内胆固醇含量的影响 |
| 1.3.12 GPAM基因表达对细胞内脂肪酸含量的影响 |
| 1.3.13 GPAM敲除对脂代谢相关基因的影响 |
| 1.4 讨论 |
| 1.5 小结 |
| 第二章 牛GPAM基因敲除乳腺上皮细胞系转录组测序分析 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 实验样品 |
| 2.1.2 主要仪器 |
| 2.1.3 其他药品及试剂 |
| 2.1.4 试剂的配置 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 总RNA提取及质量检测 |
| 2.2.2 文库建立及测序 |
| 2.2.3 原始数据质量控制 |
| 2.2.4 Mapping结果统计及基因结构分析 |
| 2.2.5 差异基因表达分析 |
| 2.2.6 差异基因GO富集和KEGG分析 |
| 2.2.7 差异基因表达水平验证 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 细胞总RNA提取及检测 |
| 2.3.2 GPAM基因敲除乳腺上皮细胞系转录组测序数据筛选及分析 |
| 2.3.3 差异表达基因分析 |
| 2.3.4 GO和 KEGG富集分析 |
| 2.3.5 差异基因蛋白互作预测分析 |
| 2.3.6 GPAM敲除后信号通路互作关系预测分析 |
| 2.3.7 基因共表达网络关系预测分析 |
| 2.3.8 差异基因的表达水平验证 |
| 2.3.9 GPAM基因对甘油三酯合成相关基因的调控作用 |
| 2.3.10 GPAM基因对脂肪酸合成相关基因的调控作用 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 牛GPAM基因对乳腺上皮细胞线粒体能量代谢的影响 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 实验样品 |
| 3.1.2 主要仪器设备 |
| 3.1.3 其他药品及试剂 |
| 3.1.4 溶液配制 |
| 3.1.5 分析软件 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 细胞线粒体的提取 |
| 3.2.2 GPAM基因敲除乳腺上皮细胞系线粒体呼吸的检测 |
| 3.2.3 GPAM基因敲除乳腺上皮细胞系线粒体线粒体糖酵解速率测定 |
| 3.2.4 敲除细胞对ATP需求的影响 |
| 3.2.5 敲除细胞对ATP 需求的影响 |
| 3.2.6 细胞线粒体数量的测定 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 敲除细胞中线粒体呼吸的检测 |
| 3.3.2 敲除细胞中线粒体糖酵解速率测定 |
| 3.3.3 敲除细胞对ATP需求的影响 |
| 3.3.4 GPAM基因敲除后细胞内线粒体数量的改变 |
| 3.3.5 GPAM基因敲除后细胞内线粒体中三羧酸循环检测分析 |
| 3.3.6 GPAM基因敲除后细胞内线粒体中氧化磷酸化检测分析 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 基于敲除小鼠模型验证GPAM基因对脂肪代谢的调控作用 |
| 4.1 材料 |
| 4.1.1 实验动物 |
| 4.1.2 主要仪器设备 |
| 4.1.3 其他药品及试剂 |
| 4.1.4 溶液配制 |
| 4.1.5 分析软件 |
| 4.2 方法 |
| 4.2.1 GPAM基因敲除小鼠模型的制备 |
| 4.2.2 GPAM基因敲除小鼠的扩繁 |
| 4.2.3 GPAM基因敲除小鼠的鉴定 |
| 4.2.4 目的基因敲除小鼠在mRNA和蛋白水平上的检测 |
| 4.2.5 目的基因敲除小鼠相关生长性状的测定 |
| 4.2.6 组织形态学的检测 |
| 4.2.7 敲除小鼠血清学相关指标的检测 |
| 4.2.8 敲除小鼠组织中甘油三酯和胆固醇含量的检测 |
| 4.2.9 敲除小鼠乳汁中甘油三酯含量的检测 |
| 4.2.10 敲除小鼠组织中脂肪酸成分及含量的检测 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 敲除小鼠的阳性鉴定 |
| 4.3.2 目的基因敲除小鼠在mRNA和蛋白水平上的检测 |
| 4.3.3 目的基因敲除小鼠相关生长性状测定 |
| 4.3.4 目的基因敲除小鼠各组织形态学分析 |
| 4.3.5 敲除小鼠血清中甘油三酯含量的测定 |
| 4.3.6 敲除小鼠血清中胆固醇含量的测定 |
| 4.3.7 敲除小鼠乳腺组织和脂肪组织甘油三酯和胆固醇含量的测定 |
| 4.3.8 敲除小鼠乳汁中甘油三酯含量的测定 |
| 4.3.9 敲除小鼠乳腺脂肪酸含量的测定 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 导师简介 |
| 作者简介 |
| 在读期间发表的文章及专利 |
| 致谢 |
（4）光激活Dre重组酶系统的构建及其应用研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第一章 前言 |
| 1.1 位点特异性重组酶的研究进展 |
| 1.1.1 酪氨酸重组酶的发展史 |
| 1.1.2 诱导型酪氨酸重组酶 |
| 1.1.3 酪氨酸重组酶的应用 |
| 1.2 光遗传学概述 |
| 1.2.1 光遗传学的发展历程 |
| 1.2.2 光遗传学工具 |
| 1.2.3 光遗传学工具的应用 |
| 1.3 本课题的选题依据及意义 |
| 第二章 PA-Dre系统的构建、优化及其特点表征 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验材料与方法 |
| 2.2.1 实验材料 |
| 2.2.2 试剂配方 |
| 2.2.3 实验方法 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 PA-Dre系统的设计与构建 |
| 2.3.2 PA-Dre系统的优化 |
| 2.3.3 PA-Dre系统的特点 |
| 2.4 小结 |
| 第三章 利用PA-Dre系统在小鼠体内时空特异性地激活基因表达 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验材料与方法 |
| 3.2.1 实验材料 |
| 3.2.2 试剂配方 |
| 3.2.3 实验方法 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 利用PA-Dre系统在小鼠体内激活外源基因表达 |
| 3.3.2 利用PA-Dre系统在小鼠体内激活内源基因表达 |
| 3.4 小结 |
| 第四章 利用CALID系统在小鼠脑部实现细胞类型特异性的标记 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验材料与方法 |
| 4.2.1 实验材料 |
| 4.2.2 试剂配方 |
| 4.2.3 实验方法 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.3.1 CALID系统的设计与构建 |
| 4.3.2 利用CALID系统标记兴奋性神经元 |
| 4.3.3 利用CALID系统标记抑制性神经元 |
| 4.4 小结 |
| 第五章 总结与讨论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 研究成果 |
| 致谢 |
（5）顺向示踪工具病毒HSV1 H129的特性研究与系统改进（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 绪论 |
| 1.1 大脑神经网络研究 |
| 1.2 目前研究神经环路结构的主要示踪技术 |
| 1.3 嗜神经工具病毒的分类 |
| 1.4 顺向示踪工具病毒HSV1 H129 简介及其发展状况 |
| 1.5 本文的主要工作 |
| 2 单纯疱疹病毒H129 株在中枢神经系统的感染特性 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 实验材料与方法 |
| 2.3 利用H306 毒株研究H129 的逆向感染特性 |
| 2.4 本章工作小结 |
| 3 基于H129 的严谨型顺向跨单级突触系统开发 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.3 基于重靶向H129 病毒Hs06 的顺向示踪系统 |
| 3.4 本章工作小结 |
| 4 荧光蛋白高表达的H129 毒株的开发与应用 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.3 高亮H129 毒株H8 的开发与应用 |
| 4.4 本章工作小结 |
| 5 全文总结与展望 |
| 5.1 本文工作总结 |
| 5.2 本文工作创新点 |
| 5.3 展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录1 攻读博士学位期间发表的主要论文及研究成果 |
| 附录2 部分缩写中英文对照 |
（6）利用类器官研究肝胆胰导管上皮祖细胞特性（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 绪论 |
| 1.1 肝胆胰的器官发生 |
| 1.2 肝脏、胆管及胰腺干/祖细胞 |
| 1.2.1 肝脏干/祖细胞 |
| 1.2.2 胆道系统的干/祖细胞 |
| 1.2.3 胰腺干/祖细胞 |
| 1.3 类器官培养技术 |
| 1.3.1 类器官培养体系的建立 |
| 1.3.2 利用ESC和iPSC制备类器官 |
| 1.3.3 利用基本组织制备类器官 |
| 1.4 细胞谱系追踪 |
| 1.4.1 Cre-loxP系统原理 |
| 1.4.2 诱导型Cre-loxP系统 |
| 1.4.3 Rosa26-mTmG转基因小鼠应用 |
| 1.5 本研究的目的与意义 |
| 2 小鼠肝、胆、胰导管类器官制备及鉴定 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 实验动物 |
| 2.1.2 主要仪器 |
| 2.1.3 实验试剂 |
| 2.1.4 溶液及培养基的配制与保存 |
| 2.1.5 总RNA的提取及cDNA的合成 |
| 2.1.6 PCR鉴定 |
| 2.1.7 冰冻切片及免疫荧光染色 |
| 2.1.8 小鼠肝管、胆总管和胰腺导管类器官的制备 |
| 2.1.9 类器官的传代、冻存与复苏 |
| 2.2 实验结果 |
| 2.2.1 mPDO、mBTO和mHDO的制备 |
| 2.2.2 三种类器官维持导管细胞特异性基因的表达 |
| 2.2.3 三种类器官均表达肝、胆,胰谱系基因 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 本章小结 |
| 3 转录组测序分析三种类器官相似性 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 实验用组织与细胞 |
| 3.1.2 主要仪器 |
| 3.1.3 实验试剂 |
| 3.1.4 培养基的配制与保存 |
| 3.1.5 总mRNA的提取 |
| 3.1.6 总RNA质量评估 |
| 3.1.7 转录组实验流程 |
| 3.1.8 基因表达量分析 |
| 3.1.9 差异基因表达分析 |
| 3.1.10 基因表达量验证 |
| 3.2 实验结果 |
| 3.2.1 RNA质量评估结果 |
| 3.2.2 差异表达分析统计结果 |
| 3.2.3 差异表达聚类分析结果 |
| 3.2.4 肝胆胰谱系基因聚类分析结果图 |
| 3.2.5 基因表达验证结果 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 本章小结 |
| 4 mPDO、mBTO和mHDO分化潜能鉴定 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 实验动物和细胞系 |
| 4.1.2 主要仪器 |
| 4.1.3 实验试剂 |
| 4.1.4 培养基的配制与保存 |
| 4.1.5 总mRNA的提取及cDNA的合成 |
| 4.1.6 real-time PCR |
| 4.1.7 冰冻切片及免疫荧光染色 |
| 4.1.8 流式细胞术 |
| 4.1.9 Wnt-3A条件培养基的制备 |
| 4.1.10 Rosa26-mTmG小鼠三种类器官的制备 |
| 4.1.11 胆上皮细胞分化方法 |
| 4.1.12 肝实质细胞分化方法 |
| 4.1.13 胰腺β细胞体外分化方法 |
| 4.1.14 胰腺β细胞体内分化方法(肾包囊下移植) |
| 4.2 实验结果 |
| 4.2.1 mPDO、mBTO和mHDO向胆管细胞分化能力分析 |
| 4.2.2 mPDO、mBTO和mHDO向肝细胞分化能力分析 |
| 4.2.3 mPDO、mBTO和mHDO在体外向胰腺β细胞分化能力分析 |
| 4.2.4 mPDO、mBTO和mHDO在体内向胰腺β细胞分化能力分析 |
| 4.3 讨论 |
| 4.4 本章小结 |
| 5 利用细胞谱系追踪分析三种类器官相似性 |
| 5.1 |
| 5.1.1 实验动物 |
| 5.1.2 主要仪器 |
| 5.1.3 实验试剂 |
| 5.1.4 培养基的配制与保存 |
| 5.1.5 冰冻切片及免疫荧光染色 |
| 5.1.6 转基因鼠肝胆胰导管上皮细胞类器官的制备 |
| 5.1.7 转基因鼠类器官的传代、冻存与复苏 |
| 5.2 实验结果 |
| 5.2.1 mPDO、mBTO和mHDO来源于PDX1表达的细胞 |
| 5.2.2 成体小鼠肝胆胰导管无显着Lgr5表达 |
| 5.2.3 新生小鼠肝胆胰导管无显着Lgr5表达 |
| 5.2.4 E15.5胎鼠肝胆胰无显着Lgr5表达 |
| 5.2.5 E17.5胎鼠肝胆胰无显着Lgr5表达 |
| 5.3 讨论 |
| 5.4 本章小结 |
| 6 人胆总管类器官制备及分化 |
| 6.1 材料与方法 |
| 6.1.1 实验材料 |
| 6.1.2 主要仪器 |
| 6.1.3 实验试剂 |
| 6.1.4 培养基的配制与保存 |
| 6.1.5 总mRNA的提取及cDNA的合成 |
| 6.1.6 real-time PCR |
| 6.1.7 冰冻切片及免疫荧光染色 |
| 6.1.8 流式细胞术 |
| 6.1.9 人胆总管类器官的制备 |
| 6.1.10 hBTO的传代、冻存与复苏 |
| 6.1.11 hBTO向胆上皮细胞分化方法 |
| 6.1.12 hBTO向肝实质细胞分化方法 |
| 6.1.13 hBTO向胰腺β细胞体外分化方法 |
| 6.1.14 hBTO向胰腺β细胞体内分化方法(肾包囊移植) |
| 6.2 实验结果 |
| 6.2.1 hBTO的制备及鉴定 |
| 6.2.2 hBTO向胆管细胞分化能力分析 |
| 6.2.3 hBTO向肝细胞分化能力分析 |
| 6.2.4 hBTO体外向胰腺β细胞分化能力分析 |
| 6.2.5 hBTO体内向胰腺β细胞分化能力分析(肾包囊移植) |
| 6.3 讨论 |
| 6.4 本章小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
| 致谢 |
（7）D6-Cre、Emx1-Cre、hGFAP-Cre三种大脑皮层发育相关工具鼠表达特征的比较研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 1.Cre/loxP系统在转基因小鼠中的应用 |
| 2.大脑皮层发育相关Cre工具鼠的种类和表达情况 |
| 3.Cre工具鼠重组酶的表达检测方法 |
| 4.MicroRNA在大脑皮层发育过程中的作用 |
| 5.不同Cre工具鼠介导的Dicer条件性敲除小鼠表型不同 |
| 6.本研究的目的、方法及意义 |
| 实验材料 |
| 实验方法 |
| 实验结果 |
| 1.D6-Cre工具鼠Cre重组酶的时空表达情况 |
| 2.D6-Cre工具鼠Cre重组酶表达存在个体差异 |
| 3.Emx1-Cre工具鼠Cre重组酶的时空表达情况 |
| 4.hGFAP-Cre工具鼠Cre重组酶的时空表达况 |
| 5.不同Cre工具鼠条敲Dicer出现表型存在差异 |
| 6.过表达miR-129抑制神经元迁移 |
| 7.miR-129靶基因鉴定 |
| 8.Fmr1调控大脑皮层神经元迁移 |
| 9.miR-129靶向Fmr1调控大脑皮层神经元迁移 |
| 讨论 |
| 1.三种Cre工具鼠Cre重组酶表达模式不同 |
| 2.构建的Cre工具鼠本身可能会存在效率问题 |
| 3.MiR-129靶向Fmr1调控大脑皮层神经元迁移过程 |
| 总结 |
| 不足与展望 |
| 文献综述 大脑皮层发育常用Cre工具鼠研究进展 |
| 参考文献 |
| 个人简历 |
| 致谢 |
（8）嗜神经病毒神经嗜性和毒性比较（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略语表 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 神经环路解析的重要示踪工具 |
| 1.1.1 疱疹病毒 |
| 1.1.2 狂犬病毒 |
| 1.1.3 水泡性口炎病毒 |
| 1.1.4 逆转录病毒 |
| 1.1.5 腺相关病毒 |
| 1.1.6 腺病毒 |
| 1.1.7 森林脑炎病毒和辛德毕斯病毒 |
| 1.2 嗜神经病毒在神经环路研究中的优势及应用 |
| 1.3 嗜神经病毒在环路研究中的弊端 |
| 第二章 本研究的目的与意义 |
| 第三章 材料和方法 |
| 3.1 试验材料 |
| 3.1.1 病毒、菌株、细胞和实验动物 |
| 3.1.2 载体与质粒 |
| 3.1.3 工具酶及主要试剂 |
| 3.1.4 细胞培养产品 |
| 3.1.5 实验设备 |
| 3.1.6 相关软件 |
| 3.1.7 培养基及缓冲液的配制 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 质粒的构建 |
| 3.2.2 细胞系传代 |
| 3.2.3 病毒制备方法 |
| 3.2.4 免疫组织化学实验 |
| 3.2.5 小鼠脑部神经环路标记及鉴定 |
| 3.2.6 鼠脑脑区的图像配准、计数和统计分析 |
| 3.2.7 小鼠神经元的单细胞分离 |
| 3.2.8 单细胞转录组建库测序 |
| 3.2.9 鼠脑组织测序 |
| 第四章 示踪病毒神经嗜性比较 |
| 4.1 逆向跨多级示踪病毒神经嗜性比较 |
| 4.1.1 CVS-B2c-EGFP病毒的扩增 |
| 4.1.2 PRV-152 病毒的扩增浓缩 |
| 4.1.3 CVS-B2c-EGFP和 PRV-152 多级环路标记比较 |
| 4.2 单级逆向示踪病毒神经嗜性比较 |
| 4.2.1 逆向单级示踪病毒PRV-?TK-NLS-EGFP构建 |
| 4.2.2 RABV逆向单级标记病毒的扩增和浓缩 |
| 4.2.3 rAAV2-retro-YFP、SAD-?G-GFP脑内环路标记差异 |
| 4.2.4 表达Cre重组酶的示踪病毒神经嗜性比较 |
| 4.2.5 rAAV2-retro-Cre和 SAD-?G-EGFP混合注射进行环路标记 |
| 4.3 本章小结 |
| 第五章 病毒神经嗜性差异的机制探索 |
| 5.1 TVA的表达能够增强EnvA假包装RAVB神经嗜性 |
| 5.2 单细胞测序分析造成病毒神经嗜性差异的分子机制 |
| 5.2.1 神经元单细胞分离方法的建立 |
| 5.2.2 病毒标记神经元的转录组测序 |
| 5.2.3 病毒标记神经元类型分析 |
| 5.2.4 已报道的RABV潜在受体在两种病毒标记神经元的表达分析 |
| 5.2.5 造成病毒嗜性差异的膜蛋白的初步筛选 |
| 5.3 本章小结 |
| 第六章 嗜神经病毒对脑组织的毒性比较 |
| 6.1 rAAV2-retro和 SAD-?G对标记组织基因表达谱的影响 |
| 6.2 rAAV2-retro和 SAD-?G标记组织内小胶质细胞的激活 |
| 6.3 SAD-?G影响下丘脑催产素的表达 |
| 6.4 本章小结 |
| 第七章 嗜神经病毒在神经环路标记中的应用 |
| 7.1 绘制LHA的神经环路输入网络 |
| 7.2 二级输入环路示踪 |
| 7.3 本章小结 |
| 第八章 讨论 |
| 8.1 嗜神经病毒神经嗜性差异 |
| 8.2 嗜神经病毒神经嗜性差异分子机制探索 |
| 8.3 嗜神经病毒标记工具毒性 |
| 8.4 嗜神经病毒在环路标记中的综合应用 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附录 |
（9）内侧缰核到脚间核通路乙酰胆碱及其alpha5亚型受体功能（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 主要英文缩略词对照表 |
| 第1章 前言 |
| 1.1 缰核到脚间核神经环路 |
| 1.1.1 缰核到脚间核神经环路的连接 |
| 1.1.2 MHb-IPN的行为功能 |
| 1.1.3 MHb-IPN通路与精神疾病 |
| 1.2 MHb-IPN与恐惧反应相关行为 |
| 1.3 尼古丁成瘾与胆碱能神经元及其受体 |
| 1.3.1 尼古丁的广泛影响 |
| 1.3.2 胆碱能神经系统 |
| 1.3.3 尼古丁受体 |
| 1.3.4 尼古丁成瘾神经环路 |
| 1.3.5 尼古丁受体α5亚基与尼古丁成瘾 |
| 1.4 尚未解决的问题 |
| 1.4.1 MHb亚核团特异性控制恐惧记忆行为 |
| 1.4.2 尼古丁摄入量与IPN CHRNA5 基因表达水平的关系 |
| 1.4.3 IPN CHRNA5 神经元在大鼠尼古丁成瘾行为中发挥的作用 |
| 第2章 实验材料与方法 |
| 2.1 转基因动物构建及验证 |
| 2.1.1 实验试剂 |
| 2.1.2 转基因载体制备引物 |
| 2.1.3 胚胎培养注射及移植 |
| 2.1.4 转基因动物基因型鉴定 |
| 2.1.5 转基因动物表达分析(RNA荧光原位杂交,RNA-FISH) |
| 2.2 大鼠IPN基因表达水平检测 |
| 2.3 MHb损毁及行为实验 |
| 2.3.1 神经元损毁 |
| 2.3.2 条件恐惧实验 |
| 2.3.3 高架十字迷宫实验 |
| 2.3.4 社交实验 |
| 2.3.5 气味辨别实验 |
| 2.3.6 T-迷宫 |
| 2.3.7 糖水偏好实验 |
| 2.3.9 长时程旷场实验 |
| 2.4 大鼠尼古丁自给药实验 |
| 2.4.1 实验动物 |
| 2.4.2 药品 |
| 2.4.3 实验设备 |
| 2.4.4 手术及护理 |
| 2.4.5 大鼠尼古丁成瘾行为训练和测试 |
| 第3章 MHb调控小鼠的恐惧记忆消退及其他情绪性行为 |
| 3.1 敲除MHb高表达基因影响小鼠的恐惧记忆消退 |
| 3.2 MHb神经元控制小鼠恐惧记忆消退 |
| 3.2.1 细胞遗传学方法损毁腹侧MHb ChAT神经元 |
| 3.2.2 腹侧MHb ChAT神经元损毁减缓小鼠恐惧记忆消退 |
| 3.2.3 背侧MHb神经元损毁加快小鼠的恐惧记忆形成 |
| 3.2.4 直接激活IPN加快小鼠恐惧记忆消退 |
| 3.2.5 dorsal MHb与 Ventral MHb有不同的神经输入 |
| 3.3 MHb神经元参与小鼠其他情绪性行为 |
| 3.3.1 Ventral MHb ChAT神经元损毁影响小鼠对新环境的适应能力 |
| 3.3.2 Ventral MHb ChAT神经元损毁降低小鼠焦虑水平 |
| 3.3.3 Ventral MHb ChAT神经元损毁影响小鼠的气味分辨 |
| 3.3.4 Ventral MHb ChAT神经元损毁影响社交行为 |
| 3.3.5 Ventral MHb ChAT神经元损毁影响认知行为 |
| 3.3.6 Ventral MHb ChAT神经元损毁不影响小鼠奖赏行为 |
| 3.4 本章小结 |
| 第4章 IPNα5尼古丁受体亚型与尼古丁成瘾 |
| 4.1 CHRNA5-CRE敲入转基因小鼠构建 |
| 4.1.1 CHRNA5-CRE敲入转基因小鼠构建策略 |
| 4.1.2 CHRNA5-CRE敲入转基因小鼠表达验证 |
| 4.2 CHRNA5-CRE基因表达水平与尼古丁成瘾的关系 |
| 4.2.1 CHRNA5 基因表达水平与大鼠尼古丁成瘾成正相关 |
| 4.2.2 长时程尼古丁给药不会改变CHRNA5 及其他尼古丁受体基因表达水平 |
| 4.3 尼古丁可以激活IPN CHRNA5 神经元 |
| 4.3.1 尼古丁可以强烈激活IPN c-fos表达 |
| 4.4 CHRNA5 神经元活动控制大鼠尼古丁摄入量 |
| 4.4.1 化学遗传学激活CHRNA5 神经元增加尼古丁摄入量 |
| 4.4.2 化学遗传学抑制CHRNA5 神经元减少尼古丁摄入量 |
| 4.4.3 CNO不影响对照组大鼠尼古丁摄入 |
| 4.5 本章小结 |
| 第5章 总结与展望 |
| 5.1 MHb在恐惧行为中的作用 |
| 5.2 IPN在尼古丁成瘾中的作用 |
| 5.2.1 大鼠CHRNA5 基因敲除策略 |
| 5.2.2 大鼠α5 nAChRs电生理特性 |
| 5.2.3 IPNα5 nAChRs行为学效应 |
| 5.3 MHb-IPN参与调控的其他行为 |
| 5.4 研究总结和展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历、在学期间发表的学术论文与研究成果 |
（10）牛安全位点Rosa26的鉴定与定点修饰（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 中英文缩略词表 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 转基因大动物研究概况 |
| 1.1.1 转基因大动物的研究历史 |
| 1.1.2 转基因大动物的应用 |
| 1.1.3 大动物传统转基因技术 |
| 1.1.4 大动物转基因定点修饰技术 |
| 1.2 安全位点研究现状 |
| 1.2.1 安全位点Rosa26的发现及研究现状 |
| 1.2.2 安全位点Rosa26的定点修饰 |
| 1.2.3 安全位点Rosa26的应用 |
| 1.3 本研究的目的与意义 |
| 第二章 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 菌株与质粒 |
| 2.1.2 细胞系和实验动物 |
| 2.1.3 实验仪器 |
| 2.1.4 常用试剂及试剂盒 |
| 2.1.5 培养基及常用试剂配制 |
| 2.1.6 常用分析软件及网站 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 PCR反应体系与程序 |
| 2.2.2 酶切、连接与转化 |
| 2.2.3 DNA纯化回收 |
| 2.2.4 质粒提取 |
| 2.2.5 基因组提取 |
| 2.2.6 RNA提取 |
| 2.2.7 蛋白提取 |
| 2.2.8 蛋白浓度测定 |
| 2.2.9 荧光定量PCR |
| 2.2.10 3'RACE/5'RACE |
| 2.2.11 SSA实验 |
| 2.2.12 TALENs质粒构建 |
| 2.2.13 T7E1检测TALENs效率 |
| 2.2.14 TAT-Cre的纯化 |
| 2.2.15 Western Blotting |
| 2.2.16 Southern Blotting |
| 2.2.17 细胞培养与筛选 |
| 第三章 实验结果与分析 |
| 3.1 牛Rosa26 (bovine Rosa26,bRosa26)位点的定位与表达分析_Toc510886805 |
| 3.1.1 bRosa26位点在基因组中的定位 |
| 3.1.2 3'RACE、5'RACE确定bRosa26转录本 |
| 3.1.3 RT-PCR、Q-PCR检测bRosa26 noncoding RNA在牛各组织中的表达 |
| 3.1.4 bRosa26-EGFP瞬时表达载体构建 |
| 3.1.5 bRosa26启动子体外启动EGFP表达分析 |
| 3.1.6 分析与讨论 |
| 3.2 TALENs真核表达载体的构建及活性分析 |
| 3.2.1 bRosa26位点TALENs设计与构建 |
| 3.2.2 SSA实验 |
| 3.2.3 T7E1实验 |
| 3.2.4 分析与讨论 |
| 3.3 TALENs介导bRosa26位点基因打靶 |
| 3.3.1 bRosa26位点基因打靶载体构建 |
| 3.3.2 TALENs介导bRosa26位点基因打靶细胞筛选与鉴定 |
| 3.3.3 TAT-Cre重组蛋白报告模型验证 |
| 3.3.4 细胞水平EGFP表达情况分析 |
| 3.3.5 胚胎发育、个体水平EGFP表达情况分析 |
| 3.3.6 分析与讨论 |
| 3.4 RMCE介导bRosa26-EGFP基因替换 |
| 3.4.1 bRosa26-EGFP胎儿成纤维细胞系的建立 |
| 3.4.2 RMCE替换载体的构建 |
| 3.4.3 RMCE替换克隆点的筛选 |
| 3.4.4 分析与讨论 |
| 3.5 bRosa26位点支持广谱型启动子启动外源基因表达研究 |
| 3.5.1 广谱型启动子启动EGFP打靶载体构建 |
| 3.5.2 细胞克隆点的筛选与鉴定 |
| 3.5.3 外源启动子启动EGFP表达情况分析 |
| 3.5.4 分析与讨论 |
| 第四章 结论与展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附录 |
| 作者简历 |
四、Cre重组酶表达载体的构建及其在转基因小鼠胰腺中的表达（论文参考文献）
- [1]由SETD4调控的静息c-Kit+细胞在激活后对心脏微血管生成作用的研究[D]. 邢胜. 浙江大学, 2021(01)
- [2]小鼠Kiss1基因启动子的鉴定、功能分析及应用探索[D]. 陈佳贤. 东华大学, 2021(01)
- [3]线粒体甘油-3-磷酸乙酰转移酶（GPAM）基因沉默对牛乳脂代谢的影响[D]. 于海滨. 吉林大学, 2020
- [4]光激活Dre重组酶系统的构建及其应用研究[D]. 李慧莹. 华东师范大学, 2020(02)
- [5]顺向示踪工具病毒HSV1 H129的特性研究与系统改进[D]. 苏鹏. 华中科技大学, 2020(01)
- [6]利用类器官研究肝胆胰导管上皮祖细胞特性[D]. 刘淼. 东北林业大学, 2020(01)
- [7]D6-Cre、Emx1-Cre、hGFAP-Cre三种大脑皮层发育相关工具鼠表达特征的比较研究[D]. 张小灵. 北京协和医学院, 2019(02)
- [8]嗜神经病毒神经嗜性和毒性比较[D]. 孙乐强. 华中农业大学, 2018(01)
- [9]内侧缰核到脚间核通路乙酰胆碱及其alpha5亚型受体功能[D]. 谭禄彬. 清华大学, 2018(04)
- [10]牛安全位点Rosa26的鉴定与定点修饰[D]. 王明. 中国农业大学, 2018(02)