一、基因枪介导转化的外源基因表达框和质粒在水稻中遗传和表达行为的比较研究（论文文献综述）
张素芳[1]（2020）在《杂种落叶松遗传转化及Lol-miR11467功能的初步研究》文中研究指明落叶松是我国北方重要的用材、生态树种之一,利用选择育种、杂交育种等已获得一批生长材质优良的种质资源。由于极端气候条件频发,东北地区春季干旱严重,严重影响落叶松成活及生长,选育抗旱品种十分必要。常规育种改良周期较长,从分子方面开展遗传改良可缩短育种周期,但落叶松干旱响应等分子机理的研究远远落后于其他树种。miRNA是植物中参与转录后基因表达调控的一类非编码单链小RNA分子,主要通过降解靶mRNA或者抑制靶mRNA的翻译调控基因的表达,从而改变植株生长性状或抗逆性等。为定向改良落叶松的优良性状并大量快速繁殖优良种质资源,以杂种落叶松日3×兴9未成熟合子胚为外植体诱导胚性愈伤组织,构建并优化落叶松胚性愈伤的遗传转化体系,同时对干旱胁迫条件下落叶松sRNA进行初步功能分析挖掘miRNA,获得Lol-miR11467并进行遗传转化,分析转基因细胞系在干旱、盐碱胁迫条件下的生理变化并筛选其调控的下游靶基因,主要研究结果如下:（1）杂种落叶松遗传转化体系的构建与优化。胚性愈伤组织的诱导率与球果采集时间有关,7月1日采集的材料诱导率最高,是未成熟合子胚的最佳采集时期。使用75%酒精消毒1 min后使用3%NaClO消毒10 min,接种在含有1.0 mg/L 2,4-D+0.2 mg/L KT的BM培养基中,胚性愈伤组织诱导率最大,为10.33%。在含有0.5 mg/L 2,4-D+0.2 mg/L KT的BM增殖培养基上培养12 d时为最佳继代周期。预培养在含有10 g/L肌醇、60 g/L蔗糖的1/4 BM培养基上获的体胚发生数最多。45 mg/L的ABA和75 g/L的PEG4000共同作用能够促进体胚的发生数,体胚发生数量达到最大,为210个/g。采用农杆菌介导法对落叶松进行遗传转化时,发现使用OD600值为0.5的侵染液侵染20 min,共培养2 d,利用4 mg/L Hyg的筛选培养基进行抗性愈伤的筛选,pCAMBIA1301遗传转化效率最高,为45.56%。（2）干旱胁迫下落叶松小RNA挖掘。使用miRDeep2软件共预测到190个miRNAs,其靶基因总数为6284个,共4964个获得注释信息。获得差异表达的miRNAs共59个,约占所有预测的miRNAs（190个）的31.05%,其中有33个是上调表达,26个下调表达。对其差异表达miRNA的靶基因进行富集分析,发现富集较多的是代谢途径,显着富集的是代谢途径中的ABC转运、类胡萝卜素的生物合成、植物激素信号转导、N-聚糖生物合成等,表明miRNAs的调控由多种代谢途径共同参与,miRNAs可能在落叶松的生长发育、胁迫响应等不同生命过程中发挥着重要的作用。（3）落叶松miRNAs的表达分析。在不同的胁迫处理下,大多数miRNAs都能够响应干旱、盐碱胁迫。其中novelmiR63在PEG6000和NaCl胁迫时快速响应,利用不同激素处理后,发现novelmiR63（Lol-miR11467）均能够响应激素应答,novelmiR63与miRBase数据库比对发现,与云杉的miR11467相似度较高,其靶基因注释为生物保护性大分子蛋白之一的热激蛋白,在干旱胁迫中具有一定的调控作用。将其作为候选基因进行遗传转化,并命名为Lol-miR11467。（4）Lol-miR11467在落叶松中的遗传转化。利用农杆菌介导法将Lol-miR11467转入杂种落叶松的胚性愈伤组织中,获得抗性愈伤细胞系27个。将转基因细胞系与野生型细胞系分别放于含有20%PEG6000、50 mM NaHCO3和250 mM NaCl的培养基中,在不同的胁迫处理下,转基因细胞系的POD活性均低于野生型,MDA含量均高于野生型,可溶性蛋白含量均低于野生型,推测Lol-miR11467在落叶松中具有一定的负调控干旱、盐碱胁迫的能力。（5）Lol-miR11467靶基因筛选。3个转基因细胞系的差异基因GO和KEGG富集分析表明,由Lol-miR11467转入后引起的差异基因显着富集在次生代谢的生物合成、激素响应、类黄酮生物合成以及苯丙烷生物合成,表明Lol-miR11467可能在落叶松中响应胁迫、激素等外界刺激以及次生代谢和苯丙烷生物合成的代谢途径中发挥着很重要的作用。对3个转基因细胞系共有的差异基因进行深入挖掘,发现MYB、bHLH、NAC、WRKY等转录因子类,LEA、热激蛋白等生物保护性大分子类以及糖基转移酶、半乳糖苷酶等糖代谢相关的酶类以及与miRNA自身相关的AGO蛋白等和抗旱相关基因的下调表达,推测过表达Lol-miR11467可以通过负调控这些基因的表达而使落叶松抵抗干旱胁迫的能力降低。以抗性愈伤组织转录组的差异基因序列作为参考序列,对Lol-miR11467进行靶基因预测,预测到4条与干旱胁迫相关且下调表达的靶基因。综上所述,本研究通过杂种落叶松遗传转化体系的构建及干旱胁迫下的差异miRNAs分析,获得转Lol-miR11467基因的抗性细胞系,其生理指标检测表明转基因细胞系的抗旱能力减弱,最终找到了可能与落叶松抗旱性减弱相关的4条Lol-miR11467的靶基因。本研究为落叶松或针叶树的遗传转化及miRNAs的分子机理研究奠定基础。
周静[2]（2020）在《抗虫彩叶基因聚合表达载体构建及在毛白杨中的转化研究》文中认为毛白杨生长迅速,树干通直挺拔,是我国重要的速生用材树种和园林绿化树种,在我国林业经济、生态建设和城乡绿化中发挥着重要的作用。但病虫危害严重影响毛白杨的正常生长,而叶色单一在一定程度上影响了毛白杨的观赏度。随着生物技术的发展,利用多基因聚合转化技术创制同时具有抗虫和彩叶特性的毛白杨新材料,对于毛白杨种质创新具有重要意义。Btcry Ⅱ基因编码的毒蛋白和丝氨酸蛋白酶抑制剂Bbi基因对鳞翅目害虫具有高毒力,CmOr基因可调控类胡萝卜素含量以改变叶色,本实验采用IRES元件构建了多基因聚合表达载体p CAMBIA1304-Btcry Ⅱ-IRES-CmOrIRES-Luc;利用农杆菌介导法将其和抗虫基因表达载体p CAMBIA1304-Bbi分别转入毛白杨TC1521无性系中,通过抗性筛选、PCR鉴定获得一批转基因阳性植株;进一步通过RT-PCR、qRT-PCR对外源基因的表达情况进行了分析,为后续进行抗虫试验、叶片色素测试等生理生化指标分析奠定了工作基础。本研究主要结果如下:1.以pCAMBIA1304质粒为骨架,构建了基于IRES元件的多基因聚合表达载体p CAMBIA1304-Btcry Ⅱ-IRES-CmOr-IRES-Luc,通过PCR检测,证明外源基因Btcry Ⅱ和CmOr已经成功整合到表达载体上。2.利用冻融法将多基因表达载体p CAMBIA1304-Btcry Ⅱ-IRES-CmOr-IRES-Luc和抗虫基因表达载体p CAMBIA1304-Bbi导入农杆菌GV3101中,通过农杆菌介导法将其分别转入毛白杨TC1521,经过植物组织培养和潮霉素（Hyg）筛选,得到40株转抗虫、彩叶双价基因的生根抗性苗和18株转Bbi基因的生根抗性苗。经PCR鉴定,获得双价基因阳性植株8株和抗虫基因Bbi阳性植株7株。3.采用RT-PCR和qRT-PCR技术,对8个转双价基因的阳性植株进行外源基因的表达分析,检测结果表明,在其中7个转基因株系中都能够检测到Btcry Ⅱ和CmOr基因,且相对表达量明显高于野生型植株（WT）;对7个转Bbi基因阳性植株进行RT-PCR检测,在2个转基因株系中检测到该基因的转录本,说明Bbi基因不仅已经整合到毛白杨TC1521的基因组中,而且能够正常转录。4.对上述7个转Btcry Ⅱ、CmOr双价基因株系和2个转Bbi抗虫基因株系进行扩繁,共获得转双价基因植株24株,转Bbi抗虫基因植株16株,并移栽到温室进行培养。这些工作为后续抗虫测试和叶片色素分析奠定了工作基础。
赵强[3]（2020）在《外源基因DNA甲基化对农杆菌介导的大豆子叶节遗传转化的影响研究》文中研究指明转基因技术具有推动农业生产发生革命性变化的潜力。农杆菌介导的遗传转化法是目前应用最为广泛的大豆遗传转化方法。但是,与其他的物种相比较,低转化效率一直是大豆基因功能研究中的一个瓶颈,制约了转基因大豆的商业化发展。并且,大豆的遗传转化效率具有很强的基因型依赖性,这限制了遗传转化技术在具有良好性状的商业化大豆品种中的应用。本研究采用不同大豆品种进行农杆菌介导的大豆子叶节遗传转化和大豆原生质体细胞转化试验,分析了不同大豆品种转化早期阶段外源基因表达差异及其调控机制对大豆抗性丛生芽诱导效率的影响,以期提高大豆的抗性丛生芽再生效率,得到以下主要结果:（1）筛选得到高/低遗传转化效率大豆品种。利用农杆菌介导的大豆子叶节遗传转化体系对17个大豆品种进行遗传转化试验,共获得168株转基因大豆植株。根据不同大豆品种的遗传转化效率,筛选得到大豆品种东农50（DN50）,Williams 82（Wm82）,Bert（Br）和沈农9（SN9）为高遗传转化效率大豆品种（转化效率高于5.5%）,而Kottman（Kt）,General（Gr）,中黄35（ZH35）和辽豆16（LD16）为低遗传转化效率大豆品种（转化效率低于1%）。在农杆菌介导的大豆子叶节遗传转化试验中,当培养基中含有筛选剂(5mg·L-1草铵膦)时,高遗传转化效率大豆品种的抗性丛生芽诱导效率达到75%以上,而低遗传效率大豆品种的抗性丛生芽诱导效率低于20%。并且,不同大豆品种的芽伸长效率（约80%）和生根效率（约85%）没有显着的差异。（2）建立并优化大豆原生质体细胞分离、纯化和转化表达体系。以28℃黑暗环境下培养至真叶完全展开后4天的大豆叶片为材料;使用含有0.4M甘露醇的CPW溶液对组织材料进行预处理30min;使用含有1.6%纤维素酶,0.8%离析酶和1.5%的果胶酶的酶解液于黑暗条件下130r/min×28℃振荡酶解10小时;采用300目细胞筛与100g离心的方法纯化大豆原生质体细胞,得到的大豆原生质体细胞的产量约为1.12×107个·g·FW-1,原生质体细胞活力均达到92%以上;使用20%PEG4000介导法将植物表达载体pEarleyGate 104和pER8-GFP分别转化进入大豆原生质体细胞,以EYFP/GFP作为荧光报告蛋白,在转化后第2天（2DAT）观察到不同大豆品种转化效率（荧光细胞占比）均达到75%以上。（3）高/低遗传转化效率大豆品种原生质体细胞的外源基因表达存在显着差异。在大豆原生质体细胞中,外源基因的转化效率随着培养时间内的延长呈现先上升后下降的趋势,在2DAT时达到最大值,且在1-2DAT时,不同大豆品种原生质中外源基因的转化效率之间没有显着的差异;而在3DAT时,低遗传转化效率大豆品种的外源基因转化效率和基因表达水平显着的低于高遗传转化大豆品种。（4）内源蛋白酶水解途径不是造成大豆原生质体中外源基因表达水平降低的主要原因。与对照相比较,向原生质体细胞培养液中分别添加外源蛋白酶抑制剂MG132（20μM）、AEBSF（50μM）和MG115（200μM）对于3DAT时外源基因的转化效率和基因表达水平没有显着的影响。（5）甲基化抑制剂5-Azac显着的影响外源基因的表达水平。与2DAT相比较,3DAT时,低遗传转化效率大豆品种甲基化酶编码基因MET1的表达水平显着上升,且显着高于高遗传转化效率大豆品种。同时,低遗传转化效率大豆品种外源基因EYFP的启动子区和编码区的甲基化水平显着的显着高于高遗传转化效率大豆品种。10μM的甲基化抑制剂5-Azac处理能够显着的降低低遗传转化效率大豆品种中外源基因的启动子及编码区的DNA甲基化程度,并提高外源基因的表达水平。（6）甲基化抑制剂显着的增加了低遗传转化效率大豆品种的抗性丛生芽诱导效率。在农杆菌介导的大豆遗传转化体系中,在抗性丛生芽诱导1周后,向培养基中加入10μM的甲基化抑制剂5-Azac能够显着的提高大部分大豆品种（19/22）的抗性丛生芽的筛选效率,特别是对于低遗传转化效率大豆品种的促进效果更为显着。综上所述,在本研究中低遗传效率大豆品种中外源基因启动子及编码区较高程度的DNA甲基化水平,抑制了外源基因的表达,并导致了抗性丛生芽诱导效率的低下。甲基化抑制剂5-Azac能够有效的降低外源基因的DNA甲基化程度,并提高低遗传转化效率抗性丛生芽的诱导效率。由于抗性丛生芽的再生是农杆菌介导的大豆遗传转化中的关键步骤,这些结果为提高低遗传转化效率大豆基因型的遗传转化效率提供了新的途径,有利于克服大豆遗传转化困难的问题。
王灿[4]（2020）在《CRISPR/Cas9介导的无外源基因插入的马铃薯基因编辑体系》文中研究说明近年来,基因编辑技术CRISPR/Cas9在动植物中都得到了广泛应用。在本研究中,利用CRISPR/Cas9基因组编辑技术,将与直链淀粉合成有关的颗粒结合型淀粉合成酶基因（Granule-Bound Starch SynthaseⅠ,GBSS I）作为基因组编辑的靶基因,以大西洋、陇薯三号和费乌瑞它作为试验材料,通过基因枪转化将体外合成的核糖核蛋白RNP和mRNA传递到外植体中,实现对靶基因的敲除,以获得无外源DNA插入的马铃薯新品系。本研究以RNP为转化试剂共获得168株再生植株,其中有13株再生植株在靶位点处成功实现基因编辑,而以mRNA为转化试剂的结果还未送测序。本实验得到以下结论:1)以陇薯三号茎段作为外植体分化的愈伤组织,结构过于紧密,用基因枪轰击的方式,未能将反应试剂传递到愈伤组织中;2)以费乌瑞它的茎段作为外植体分化形成的愈伤组织,由于结构松散,导致后期不能分化成苗;3)以大西洋叶片和叶片愈伤组织作为基因枪实验的外植体,最终获得GBSS I基因敲除的转化株,基因编辑效率为0.039-0.36%。本研究说明基于CRISPR/Cas9的基因枪技术通过转化RNP的方法可对马铃薯进行无外源DNA插入且无转基因过程的基因编辑。
苏佩佩[5]（2019）在《小麦组织特异性启动子的筛选、功能分析及应用研究》文中认为小麦（Triticum aestivum L.）是世界第二大粮食作物,小麦籽粒作为人类重要的主食之一,是全球超过35%的人类每日所需蛋白质和热量的主要来源。植物组织特异性表达基因和启动子研究一方面有助于预测基因的功能,深入了解植物生长发育过程中基因的表达调控规律,另一方面启动子更是植物基因工程研究的重要工具。但单子叶植物特别是小麦中组织特异性基因和启动子的研究远远落后于其他禾本科作物,比如水稻。本文对小麦组织特异性基因及启动子进行了筛选和分析,利用组织特异性启动子构建了雄性不育系,并尝试利用小麦组织特异性启动子创建小麦无损伤可视化筛选方法;另外还在水稻中分离鉴定了小麦花粉特异性表达基因Ta PSG076的同源基因Os PSG076的启动子,构建了用于Os PSG076基因功能验证的植物表达载体并得到了转基因水稻株系。主要研究结果如下:（1）分析了NCBI公共数据库中小麦胚芽鞘、根、叶、雌蕊、雄蕊、胚、和胚乳七个组织中基因表达的芯片数据,共发现了604个探针代表的基因表现出组织特异性特征。进一步将其中的330个基因进行了小麦染色体定位,发现具有相同组织特异性的基因往往成簇分布在染色体上,并且有些基因的序列被定位在不同的染色体上呈现多拷贝现象。（2）为了验证芯片数据分析结果的可靠性,利用RT-sq PCR和RT-q PCR方法证实了其中36个候选基因表达的组织特异性,实验结果与芯片数据表现出高度一致性。在此基础上,构建了p Col1::GUS,p Root2::GUS和p Leaf1::GUS的植物表达载体,通过农杆菌介导的转化技术,瞬时侵染小麦胚芽鞘,证明Ta Col1启动子可以驱动gus基因在小麦胚芽鞘中瞬时表达。同样采用农杆菌转化技术,获得了p Root2::GUS和p Leaf1::GUS的转基因拟南芥植株。经GUS组织化学检测,证明Ta Root2启动子在拟南芥中表现为根特异性调控模式,而Ta Leaf1启动子在拟南芥叶片中优势表达。（3）利用候选的小麦根特异性启动子Ta Root7和已报道的1Dx5胚乳特异性启动子,分别构建p Root7::Ds Red和1Dx5::Ds Red表达载体,利用基因枪转化,获得了转基因小麦株系,并建立了小麦无损伤可视化筛选方法。（4）利用本实验室克隆鉴定的小麦花粉特异性启动子Ta PSG076构建了Ta PSG076::Barnase（p14B）表达载体,利用基因枪转化,获得了转基因小麦株系,用以创制小麦雄性不育系。（5）基于本实验室分离鉴定的小麦花粉特异性启动子Ta PSG076,分离鉴定了水稻中的同源基因Os PSG076的上游启动子,构建了987 bp该启动子序列的表达载体Os PSG076::GUSplus,利用农杆菌介导的转化技术进行水稻的遗传转化,获得了转基因水稻株系。经过GUS组织化学染色发现,Os PSG076启动子在水稻的花粉中特异表达,且表达强度很高,证实Os PSG076启动子是水稻花粉特异性启动子。（6）构建了Os PSG076基因的过表达（OE）、RNA干扰（RNAi）、基因编辑（CRISPR/Cas9）植物表达载体并获得了水稻转基因株系。综上所述,本文通过高通量分析鉴定了小麦中七个组织的特异性基因,这些结果有助于了解相关未知基因的功能,为小麦组织特异性启动子的挖掘提供了新的资源。对其中三个启动子进行了功能验证,并进行了小麦组织特异性启动子的应用研究。此外,还分离鉴定了一个水稻花粉特异性基因启动子Os PSG076,并获得了可对Os PSG076基因进行功能验证的水稻转基因材料。这些结果证实了本文中组织特异性启动子筛选方法的可行性,及组织特异性启动子的潜在应用价值。
周忠良[6]（2016）在《小麦抗赤霉病基因的遗传转化和转乙醇酸基因材料的鉴定》文中进行了进一步梳理小麦是重要粮食作物,在世界范围内广泛种植。赤霉病（Fusarium head blight,FHB）是主要由禾谷镰刀菌引起的一种小麦全球性真菌病害,多发生在温暖潮湿地区。小麦赤霉病不仅使小麦严重减产,而且致病菌分泌多种毒素,这些毒素能长期留存在食物链中,严重威胁人畜健康。培育抗病品种是解决小麦赤霉病的最好途径。但在小麦及其近缘作物中缺乏优良抗病种质资源,导致抗赤霉病常规育种进展缓慢。随着基因工程技术和生物信息学的快速发展,人们开始从更广泛的领域寻找赤霉病抗性基因。本研究主要把抗赤霉病病相关基因和靶标RNAi片段构建最小表达框,分别通过基因枪多基因共转化法和农杆菌介导的双元表达载体导入襄麦76和扬麦158中,旨在获得抗赤霉病株系,为抗赤霉病转基因育种提供新材料。主要获得以下结果:1.转靶标RNAi基因片段小麦的筛选与赤霉病抗性鉴定。1)利用基因枪介导的遗传转化方法,将赤霉菌几丁质合酶（chitinsynthase,chs）基因的RNAi片段chs3bAS2-chs3bAS2和chs3bAS5-chs3bAS1,以及标记基因PMI（Phosphomannoseisomerase,PMI）,共转化小麦品种襄麦76,筛选获得2个转基因株系ZC1和ZC2。T1～T3代PCR鉴定表明,转入的基因能稳定遗传,但出现2个目的基因分离现象。T2、T3代进行单花接种鉴定结果表明:ZC1和ZC2株系较未转化襄麦76赤霉病抗性有显着提高,含目的基因chs3bAS5-chs3bAS1和chs3bAS2-chs3bAS2的植株比仅有目的基因chs3bAS5-chs3bAS1植株的抗性较好,T3代时达到显着性差异。因此,以Chs3b基因不同RNAi片段为靶标的寄主诱导的基因沉默（Host-induced gene silencing,HIGS）技术,能有效提高小麦的赤霉病抗性,RNAi-chs3b基因抗性具有累加效应。2)将赤霉菌几丁质合酶和葡聚糖合酶（Glucansynthare,Gls）基因的RNAi片段glsAS3-glsAS6、chs3bAS2-chs3bAS 和chs3bAS5-chs3bAS1,以及筛选标记基因PMI,同上方法转入襄麦76,筛选获得1个转基因株系A3-3。T1、T2代PCR鉴定表明,转入的基因能稳定、连锁遗传;将A3-3株系与未转化襄麦76杂交,对其杂交后代的PCR鉴定表明,转入基因已通过有性杂交转移到未转化小麦基因组中,不同基因呈连锁遗传。3)将除草剂抗性基因Bar（bialaphos resistance,Bar）与赤霉菌基因RNAi片段CYP51、chs3bAS2-chs3bAS2和chs3bAS5-chs3bAS1一起,经基因枪法转化襄麦76,通过对转基因材料T1、T2的分析与鉴定,发现6个转基因株系可分为三种不同基因型:①BC1株系同时含有标记基因Bar和3个目的基因CYP51、chs3bAS2-chs3bAS2和chs3bAS5-chs3bAS1,②BC4株系仅含标记基因Bar和目的基因chs3bAS2-chs3bAS2,③BA1、BA2、BC2和BC3 4个株系均只含目的基因chs3bAS2-chs3bAS2 不含 Bar 基因。4)将含有不同调控元件的赤霉菌RNAi片段glsAS3-glsAS6（tRNA）和6×chs3bAS5-2以及PMI基因,以基因枪转化襄麦76,筛选获得1个转基因株系DC。TO代PCR鉴定表明,DC株系同时含有标记基因PMI和目的基因glsAS3-glsAS6（tRNA）和 6×chs3bAS5-2。5)通过农杆菌介导法,将赤霉菌TamiR（4）转入小麦品种扬麦158,筛选获得1个转基因株系Y4-2,TO代PCR鉴定表明,Y4-2株系同时含有标记基因PMI和目的基因TamiR（4）。2.转抗病相关基因小麦的筛选与分析。将拮抗细菌丰原素基因fenB和筛选标记PMI基因,通过基因枪法导入小麦品种襄麦76,筛选获得2个转基因株系FB1和FB2,分别含有目的基因fenB和标记基因PMI。FB1和FB2株系目前处于T4代,不同时代PCR鉴定结果显示:目的基因与标记基因趋于纯合且连锁遗传。3.转乙醇酸途径基因小麦的鉴定与农艺性状分析。1)鉴定转乙醇酸途径3个关键酶基因AtGDH、GcL、TsR的2个小麦（受体品种为襄麦76）转基因株系ZQ1和ZQ2,T5、T6代PCR及RT-PCR鉴定结果显示,2个转基因株系的转基因均已完全纯合,转基因在RNA水平高效表达。ZQ株系T6代农艺性状分析:ZQ1和ZQ2株系株型紧凑,一些农艺性状与野生型不同。2)鉴定转乙醇酸脱氢酶融合基因DEF的3个转基因株系UD、CD和ZX,其中UD和ZX株系转基因的启动子为Ubi,CD株系转基因的启动子是CMPS。UD株系T5、T6代PCR鉴定表明,转基因分离较大;而CD和ZX株系的T3、T4代的PCR鉴定显示,转入的基因能稳定遗传且逐渐趋于纯合。
周定港[7]（2016）在《转cry1Ac基因甘蔗的分子特征及生物学研究》文中进行了进一步梳理甘蔗（Saccharum spp.）是最重要的糖料作物,虫害是影响甘蔗产量、品质和宿根年限的主要限制因素之一,其中螟虫危害最为严重,并具有全生长季危害的特点,对产业造成严重损失。与大多数作物一样,甘蔗基因池中缺乏抗虫基因,加上甘蔗遗传背景复杂,因此,传统杂交育种培育抗虫品种难度大,导致甘蔗栽培品种抗虫性差。转cey1Ac基因在玉米、棉花等作物抗虫性改良上效果显着并已大面积商业化应用,且其安全性已经得到证实,因此,通过转基因技术改造甘蔗抗虫性,培育抗虫品种并创制可用于杂交利用的抗虫种质是目前最为有效的途径。甘蔗又是工业原料作物和营养繁殖作物,转基因安全风险等级为最低（I级）,而蔗糖结晶经过107℃高温过程,并未在转基因甘蔗加工而成的蔗糖中检出外源基因成分或蛋白成分,因此,转基因甘蔗的商业化应用值得期待。本研究以基因枪轰击获得的转cry1Ac基因甘蔗群体为实验材料,开展了外源基因成分特异、高效、灵敏的检测技术研究以及对抗性拟转基因甘蔗株系进行了真实性鉴定,奠定了转基因甘蔗深入研究的重要基础性工作;而外源基因的相对低拷贝是外源基因稳定整合和适度表达的前提,甘蔗上是否也有类似情况尚未可知。考虑到甘蔗基因组高达10Gb且倍性复杂,生物素标记的Southern杂交信号弱、效果差,我们建立了高效、安全稳定的外源基因拷贝数鉴定技术,实现了对转基因群体外源基因的拷贝数的高效低成本鉴定;继而探究了转基因甘蔗株系的遗传稳定性及外源基因的插入位点或旁侧序列,探究了转基因群体cry1Ac蛋白的时空表达特性等,对后续系统生物学研究具有重要意义。在此基础上,对外源基因拷贝数、转基因甘蔗产量、品质性状和抗虫性进行了关联分析,以期探索转cry1Ac基因甘蔗的分子特征与生物学特性之间的关系,并对外源目的蛋白表达对甘蔗根际土壤微生态中微生物的影响进行了评价。进一步,通过典型转基因株系与非转基因对照的RNA-seq转录组学分析转基因的非预期效应,试图从分子和基因整体水平上,揭示抗虫转基因甘蔗及其受体FN15非转基因甘蔗相关代谢和信号通路应答机制的差异,从而解析生物学特性差异的分子基础。该研究具有重要的科学意义和实际应用价值。本研究得到国家自然科学基金项目（No.31271782）和福建农林大学优秀博士学位论文基金（No.1122YB015）的资助。相关研究的主要结果与结论如下:1.基于环介导等温扩增（Loop-mediated isothermal amplification,LAMP）技术原理,针对转基因甘蔗外源目的基因cry1Ac序列（GenBank:KF630361.1）和bar基因序列（GenBank:EU048867.1）设计特异性的LAMP扩增引物,优化了 cry1Ac-LAMP的主要体系成分,25.0μL反应体系含有:5.25mMMg2+、4:1的内外引物比、2.0U的M大片段DNA聚合酶,其敏感性较常规PCR灵敏10倍,检测限为43.1 copies的质粒1Ac0229和1.0 ng·μL/-1的转基因甘蔗（cry1Ac拷贝数为21.89 copies·cell-1）基因组DNA。bar-LAMP优化后的25.0μL反应体系含有:5.25 mMMg2+、6:1的内外引物比、6.0 U的Bst大片段DNA聚合酶;其敏感性较常规PCR灵敏10倍,检测限是10 copies的质粒1Ac0229;特异性探究实验发现cry1Ac-LAMP和bar-LAMP只能检测到含有特异cry1Ac基因或bar基因的甘蔗样品,拟转基因系的应用检测试验发现所建立的方法cry1Ac-LAMP和bar-LAMP技术是可靠的。结果表明,建立的cry1Ac-LAMP和bar-LAMP检测技术方法特异性强、灵敏度高、快速省时、结果可靠,可视化检测尤其适用于转基因甘蔗的田间现场筛查检测与监管,具有很好的应用价值和推广前景。2.基于前人报道腺苷 5-磷酰硫酸还原酶（Adenosine 5’-phosphosulfatereductase,APRT）、细胞周期素（Cyclin,CYC）和脯氨酰-4-羟化酶（Prolyl4-hydroxylase,P4H）三个基因是甘蔗潜在的具有高特异性和低拷贝数内标准基因。我们克隆了APRT、CYC和P4H基因并构建了多元内标准基因靶标标准质粒（p1AcAPC）,建立了基于这个标准质粒的TaqMan实时荧光定量PCR技术,对转cry1Ac基因的抗性再生甘蔗植株群体的拷贝数进行了鉴定。该方法具有高特异性和高敏感性,检测操作简便,效率高等特点,其定量结果不仅可作为转cry1Ac基因甘蔗真实性鉴定的佐证,更主要的是可以实现快速鉴定转基因甘蔗的拷贝数,相关研究也是转cry1Ac基因甘蔗遗传稳定分析及后续系统生物学研究的基础。3.外源基因拷贝数、转基因甘蔗产量、品质和抗虫性进行关联分析的研究结果与结论如下:（1）外源目的基因cry1Ac以中等拷贝数导入和整合,有利于抗虫目标性状改良,并增加获得对非目标性状影响不大的转化事件的几率,可能是由于现代甘蔗栽培种至少为八倍体,且染色体数目约为120条,基因组达10 Gb,因此,低拷贝数外源目的基因的导入和整合,其所表达的蛋白对抗虫目标性状的改良效果不明显,这与二倍体物种如水稻等有较大的不同,但高拷贝的导入和整合又导致非目标性状如甘蔗产量和品质性状变劣。此外,我们还观察到蛋白表达与外源基因拷贝数之间没有确定的线性关系或剂量效应;（2）在FN15为受体的转基因系群体中,中拷贝型的转基因株系表现出更好的产量与品质性状表型,并从中筛选到1个（a1株系）单位面积产糖量优于非转基因对照、2个（a5和a6株系）与对照相当但螟害率显着低于对照的株系,待完成安全性评价后,有望直接作为甘蔗生产性品种利用或作为杂交亲本用于甘蔗抗螟虫育种。4.转基因甘蔗的蛋白时空表达情况,其研究结果如下:（1）FN15受体转基因群体和ROC22受体转基因群体,cry1Ac蛋白在甘蔗不同的组织部位的表达均呈现出蔗叶中表达量最高、根次之、茎中最低的趋势;（2）FN15受体转基因群体和ROC22受体转基因群体,cry1Ac蛋白在不同生长阶段的表达呈现出分蘖期最高、成熟期次之、拔节期最低的趋势;（3）根中的cry1Ac蛋白表达情况最为复杂:FN15受体转基因系中,蔗根中cry1Ac蛋白表达呈现出成熟期最高、拔节期次之、分蘖期最低的趋势;而ROC22受体转基因系中,蔗根中cry1Ac蛋白表达呈现出分蘖期最高、拔节期次之、成熟期最低的趋势;（4）对于FN15受体的转基因株系,中拷贝型的al和a5株系在各生育期其cry1Ac表达量均高于低拷贝型的19b-2和19b-4株系;而ROC22为受体的转基因株系,则没有这个趋势。发现转cry1Ac基因甘蔗外源cry1Ac蛋白存在一定的动态时空表达特性,并具有受体基因型的差异。5.通过单引物PCR、Genome walking试剂盒（TaKaRa）和hi-Tail PCR等三种方法,对转cry1Ac基因甘蔗外源基因插入位点进行了研究。研究发现,单引物PCR法特异性较低;Genome walking试剂盒（TaKaRa）获得克隆条带过大（约5 Kb）、加上随机引物（AP）为混合物且为专利产品,给TA克隆测序带来了挑战、实验成本和周期长,不利于序列分析;hi-Tail PCR法中加入了 AC1及其LAD引物的巧妙设计,极大地提高了获得旁侧序列的能力。采用hi-Tail PCR法,成功鉴定了 a1株系左右边界和a5株系右边界的旁侧序列,发现基因枪法轰击转化的转基因甘蔗外源基因趋向于整合到线粒体等环状DNA中。6.通过PCR-DGGE法,对6个转cry1Ac基因甘蔗株系根际土壤微生态的微生物物群落和进化关系进行了研究,发现土壤微生物群落的变化是动态的,可能与生长时期、季节和环境等因素有关,但从整体和长期趋势来看,转基因系和非转基因系对土壤微生态的作用是一致的。7.转cry1Ac基因甘蔗及非转基因对照的RNA-seq转录组表达谱分析转基因甘蔗的非预期效应,其研究结果如下:（1）本研究RNA-seq测序与组装的质量高。12个甘蔗样品共获得了 83.50 Gb的数据量和668,017,350条的总reads数。组装得到的甘蔗Unigene库总共含有65,995条Unigenes,N50长度达到了 1,049 bp,平均组装长度为715.14 bp。（2）差异基因表达统计发现,上/下调表达情况较丰富,转基因系和非转基因系差异表达的基因总共有1,067个,共同上调表达的基因总共有199个,共同下调表达的基因总共有473个。（3）转基因系和非转基因系相比,上调表达基因的代谢途径主要涉及与植物次生代谢途径相关,有苯丙氨酸代谢途径、甘油酯代谢途径、亚油酸代谢途径、类黄酮生物合成和二萜生物合成途径等,其次是植物激素转导途径。下调表达基因的代谢途径主要涉及异羟肟酸生物合成等化学防御代谢途径,脂肪酸代谢等基础代谢途径以及植物激素信号转导、植物-病原互作等代谢通路。这些有关转基因甘蔗转录本潜在功能的分析,初步揭示了转基因甘蔗典型株系的抗虫性和其他表型性状形成的分子基础,而这些途径中与植物抗逆和防御相关的基因以及中、低拷贝型株系间的差异基因是后续深入研究的重点,不仅有助于揭示上述基因在甘蔗抗逆、防御和产量形成中的作用,还有助于指导培育抗虫性、产量和品质兼优符合育种目标的转基因新品系。
张卓[8]（2014）在《抗病RNAi与抗虫除草剂四价植物表达载体构建与转化甘蔗研究》文中研究说明甘蔗是重要的糖料和能源作物,甘蔗花叶病、黄叶病和螟虫是危害着甘蔗生产的主要病虫害。传统的病虫害防治方法难以彻底解决这些问题,并且危害生态环境。甘蔗管理成本高,减少田间管理成本的抗除草剂甘蔗品种有利于机械化生产。由于甘蔗遗传背景非常复杂,且抗病虫、除草剂的种质资源匮乏,因此,很难通过杂交育种等传统方式获得高抗植株。近年来随着转基因技术的发展和RNAi技术的提出,使培育抗病虫害的多性状聚合的甘蔗品种成为可能。根据本实验室分离合成的甘蔗花叶病Pro和CP基因的保守序列,以及甘蔗黄叶病CP基因的保守序列,通过酶切连接,获得甘蔗花叶病、甘蔗黄叶病保守序列融合片段,通过正向和反向插入干扰中间载体pHANNIBAL形成双价病毒苷扰结构。同时将Cry1AC基因表达框插入到中间载体pHANNIBAL-Z,将干扰表达载体pART27中的Npt Ⅱ基因表达框由Bar基因表达框替换,最后将干扰结构插入重组质粒pHANNIBAL-Cry1Ac中,利用NotⅠ酶切,回收双价病毒干扰结构和Cry1AC基因表达框片段,连接到添加Bar基因表达框的干扰表达载体pART27-Z上,构建了抗病虫和除草剂四价植物表达载体。采用基因枪轰击和农杆菌浸染将构建的四价植物表达载体转入甘蔗品种FN39、ROC22和FN15的胚性愈伤组织中,通过PPT筛选获得抗性再生甘蔗植株,经过PCR、实时荧光定量PCR以及Bt蛋白试纸检测,获得同时整合四种目的基因结构并表达的四价转基因甘蔗植株。本论文的主要研究成果:（1）采用酶切、连接技术,成功改造干扰中间载体pHANNIBAL（在Spe Ⅰ和Sph Ⅰ位点之间引入Sma Ⅰ位点）和干扰表达载体pART27-Z（用Bar置换NPT Ⅱ）;（2）成功构建双价RNAi抗甘蔗花叶病和黄叶病与抗虫及除草剂四价植物表达载体,即 pART27-MC1YCP-Cry1AC、pART27-MC2YCP-Cry1AC 和 pART27-MYCP-Cry1AC,并转化获得工程农杆菌株;（3）建立PPT（草丁膦）筛选梯度,确定了甘蔗品种ROC22、FN39和FN15分别在愈伤组织分化时期和再生苗时期的PPT筛选浓度,在甘蔗愈伤组织分化期为0.8 g/L,在再生苗生长期,FN39筛选浓度为0.8 mg/L,ROC22和FN15筛选浓度为0.9 mg/L;（4）通过基因枪法和农杆菌介导法,经PPT筛选获得三种抗病虫除草剂转基因甘蔗植株群体;（5）通过PCR、实时荧光定量RT-PCR以及Bt蛋白试纸检测,获得33株四价转化甘蔗植株,其中通过农杆菌介导转化获得5株,通过基因枪介导转化获得28株。
赵艳,邓春泉,邓丽蝶[9]（2014）在《洁净DNA转化获得2mG2-epsps基因单拷贝整合的抗草甘膦水稻》文中研究指明洁净DNA转化是基因枪介导外源基因表达框导入植物的转化技术,能从根本上消除载体框架序列对转基因植株的不利影响。2mG2-epsps基因是具有重要育种价值的草甘膦除草剂抗性基因。以日本晴为材料,研究了草甘膦对水稻愈伤组织生长及分化的影响,采用洁净DNA转化技术将2mG2-epsps基因表达框导入水稻。结果表明:1)草甘膦对水稻愈伤组织的生长及分化有明显的抑制作用,当草甘膦浓度为2mmol/L时,愈伤组织绿苗分化率为18.97%,较对照71.67%显着降低。2)基因枪介导2mG2-epsps基因表达框转化水稻时,经草甘膦筛选获得抗性愈伤后,在植株再生培养基中去除筛选剂利于抗性愈伤的分化,转化率为17.20%。经Southern杂交分析,2mG2-epsps基因表达框均以单拷贝整合到受体基因组。52.17%（12/23）转基因株系可耐受1250mmol/L的草甘膦。
王勇[10]（2013）在《无选择标记1Dx5基因的小麦遗传转化》文中提出长期以来，受粮食总量不足的制约，我国对小麦育种和品质改良方面重视程度不够，品质性状遗传改良研究相对滞后。通过现代生物技术获得稳定表达的具有优良遗传性状的转基因小麦植株，并消除其生物安全性的潜在危险是近年来分子育种研究的热点。本研究通过基因枪法直接将无选择标记的线性表达框导入小麦，以获得无载体框架序列及无选择标记基因的1Dx5基因的小麦新材料，创制面包烘烤小麦新种质。同时为了扩大基因型范围和改善目前小麦遗传转化率偏低的现状，建立了高效稳定的小麦幼胚盾片的再生体系，并优化了基因枪转化参数。为进一步开展重要农艺性状转基因小麦新品种培育将具有重要意义。本研究取得的主要研究结果如下：（1）建立了高效、稳定的小麦幼胚盾片再生体系通过对新冬26小麦品种幼胚盾片的愈伤组织诱导和分化率的研究比较发现，激素对小麦幼胚盾片胚性愈伤组织诱导率差异不显着，均在94%以上，但不同的激素在愈伤组织的再生苗率之间存在着很大差异。2,4-D与Dicamba组合的诱导激素在再生分化上显着优于2,4-D和Dicamba。以添加1.5mg·L-12,4-D和0.5mg·L-1Dicamba为诱导培养基，分化培养基添加1mg·L-1ZT和0.01mg·L-12,4-D对愈伤组织分化效果为最佳，绿苗分化率最高可达90%。分化培养基中1mg·L-1ZT有利于根的分化。（2）优化了基因枪转化体系通过对gus报告基因的瞬时表达检测，研究了影响基因枪转化频率的轰击距离、氦气压力、质粒浓度，旨在获得更为合理有效的小麦基因枪基因转化体系。明确了以轰击压强为1100psi、轰击距离为9cm和质粒用量为0.5μg/枪时为最佳基因枪介导转化新冬26小麦的技术参数。（3）获得了转基因植株，并対种子蛋白进行了SDS-PAGE分析利用基因枪将无选择标记线性1Dx5基因转入不含5亚基的小麦品种新冬26幼胚盾片中，经PCR二分法筛选，得到转1Dx5基因小麦T0代植株2株，转化率为0.18%，得到转35S p-1Dx5基因小麦T0代植株3株，转化率为0.26%。利用SDS-PAGE分析目的基因在转基因后代籽粒中的表达。转基因植株后代种子分析表明，1Dx5在转基因后代部分种子中表达。成功地将无选择标记的线性1Dx5片段导入普通小麦新冬26中，并在后代部分种子中得到了表达。为利用优质基因改良小麦加工品质奠定基础。
二、基因枪介导转化的外源基因表达框和质粒在水稻中遗传和表达行为的比较研究（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、基因枪介导转化的外源基因表达框和质粒在水稻中遗传和表达行为的比较研究（论文提纲范文）
（1）杂种落叶松遗传转化及Lol-miR11467功能的初步研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 绪论 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 针叶树体胚发生研究进展 |
| 1.2.1 胚性愈伤组织的诱导 |
| 1.2.2 胚性愈伤组织的增殖及继代 |
| 1.2.3 体胚成熟 |
| 1.3 落叶松体胚发生研究进展 |
| 1.4 针叶树的遗传转化研究 |
| 1.4.1 针叶树的遗传转化 |
| 1.4.2 落叶松的遗传转化 |
| 1.5 miRNA的研究进展 |
| 1.5.1 miRNA的发现 |
| 1.5.2 miRNA的作用机理 |
| 1.5.3 植物miRNA的功能研究 |
| 1.5.4 miRNA在针叶树及落叶松中的研究 |
| 1.6 本研究的目的意义 |
| 1.7 本研究的技术路线 |
| 2 杂种落叶松遗传转化体系的建立与优化研究 |
| 2.1 试验材料 |
| 2.1.1 植物材料 |
| 2.1.2 试验菌株、药品与试剂 |
| 2.2 试验方法 |
| 2.2.1 药品及培养基的制备 |
| 2.2.2 外植体的消毒及接种 |
| 2.2.3 胚性愈伤组织的诱导 |
| 2.2.4 胚性愈伤组织的增殖及继代周期的确定 |
| 2.2.5 体细胞胚胎成熟及萌发 |
| 2.2.6 抗生素敏感性试验 |
| 2.2.7 胚性愈伤组织的遗传转化 |
| 2.2.8 统计及分析 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 再生体系的优化 |
| 2.3.2 遗传转化体系的建立及优化 |
| 2.3.3 转pCAMBIA1301空载体株系的分子验证 |
| 2.4 讨论 |
| 2.4.1 外植体选择对诱导率的影响 |
| 2.4.2 植物生长调节剂对诱导的影响 |
| 2.4.3 胚性愈伤组织的增殖培养 |
| 2.4.4 农杆菌介导的遗传转化的影响因素 |
| 2.5 本章小结 |
| 3 干旱胁迫下的落叶松小RNA挖掘与分析 |
| 3.1 试验材料 |
| 3.2 试验方法 |
| 3.2.1 小RNA文库的构建及质量控制 |
| 3.2.2 miRNA预测及鉴定分析 |
| 3.2.3 miRNA差异基因聚类及表达分析 |
| 3.2.4 miRNA靶基因预测及功能注释分析 |
| 3.2.5 sRNA测序数据的验证 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 小RNA文库的构建及质量分析 |
| 3.3.2 小RNA序列分析 |
| 3.3.3 miRNA预测及筛选 |
| 3.3.4 sRNA测序的数据验证 |
| 3.3.5 miRNA靶基因预测及其功能注释 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 本章小结 |
| 4 miRNA响应不同处理的表达模式分析 |
| 4.1 试验材料 |
| 4.1.1 植物材料 |
| 4.1.2 试剂及药品 |
| 4.2 试验方法 |
| 4.2.1 miRNA提取及反转录 |
| 4.2.2 miRNA的qRT-PCR |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 miRNA在不同胁迫处理下的表达分析 |
| 4.3.2 miRNA在不同激素处理下的表达分析 |
| 4.4 讨论 |
| 4.4.1 miRNAs在不同胁迫处理下的表达分析 |
| 4.4.2 miRNA在不同激素处理下的表达分析 |
| 4.5 本章小结 |
| 5 Lol-miR11467在落叶松中的遗传转化研究 |
| 5.1 试验材料 |
| 5.1.1 植物材料 |
| 5.1.2 菌株、试剂及药品 |
| 5.2 试验方法 |
| 5.2.1 pCAMBIA1301-Lol-miR11467的过表达载体构建 |
| 5.2.2 转pCAMBIA1301-Lol-miR11467基因株系的分子检测 |
| 5.2.3 不同胁迫处理的转基因愈伤组织的形态变化 |
| 5.2.4 不同胁迫处理的转基因愈伤组织生理生化指标的测定 |
| 5.3 结果与分析 |
| 5.3.0 转基因细胞系的检测 |
| 5.3.1 不同胁迫处理下转基因愈伤组织的变化 |
| 5.3.2 不同胁迫处理的转基因愈伤组织生理生化指标的测定 |
| 5.4 讨论 |
| 5.5 本章小结 |
| 6 Lol-miR11467的靶基因筛选与分析 |
| 6.1 试验材料 |
| 6.2 试验方法 |
| 6.2.1 转录组测序及生物信息学分析 |
| 6.2.2 qRT-PCR验证 |
| 6.3 结果与分析 |
| 6.3.1 测序数据质量评估及组装 |
| 6.3.2 差异表达基因筛选 |
| 6.3.3 转录组数据验证 |
| 6.3.4 Unigene功能注释 |
| 6.3.5 差异表达关键基因的挖掘及归纳 |
| 6.3.6 Lol-miR11467靶基因筛选 |
| 6.4 讨论 |
| 6.5 本章小结 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 工作展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
| 致谢 |
| 东北林业大学博士学位论文修改情况确认表 |
（2）抗虫彩叶基因聚合表达载体构建及在毛白杨中的转化研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 1 引言 |
| 1.1 研究背景 |
| 1.2 抗虫转基因研究进展 |
| 1.2.1 Bt毒蛋白分类和杀虫机理 |
| 1.2.2 国内外Bt毒蛋白抗虫转基因研究进展 |
| 1.2.3 蛋白酶抑制剂基因杀虫机理 |
| 1.2.4 国内外蛋白酶抑制剂抗虫转基因研究进展 |
| 1.3 彩叶转基因研究进展 |
| 1.3.1 橙基因CmOr变色机理 |
| 1.3.2 国内外彩叶转基因研究进展 |
| 1.4 多基因聚合的研究进展 |
| 1.4.1 杂交聚合转化法 |
| 1.4.2 多次转化法 |
| 1.4.3 多载体共转化 |
| 1.4.4 多基因单载体共转化 |
| 1.5 基因工程在杨树上的研究进展 |
| 1.5.1 抗虫转基因 |
| 1.5.2 抗病转基因 |
| 1.5.3 抗除草剂转基因 |
| 1.5.4 抗逆转基因 |
| 1.6 常用转基因方法 |
| 1.6.1 农杆菌介导法 |
| 1.6.2 花粉管通道法 |
| 1.6.3 基因枪法 |
| 1.6.4 低能离子束介导法 |
| 1.6.5 超声波诱导植物组织基因转移法 |
| 1.7 转基因筛选和检测方法 |
| 1.7.1 标记基因 |
| 1.7.2 DNA水平分析 |
| 1.7.3 RNA水平分析 |
| 1.7.4 蛋白表达水平分析 |
| 1.8 研究目的与内容 |
| 1.8.1 研究目的 |
| 1.8.2 研究内容 |
| 2 多基因聚合表达载体设计与构建 |
| 2.1 试验材料 |
| 2.1.1 菌株与载体 |
| 2.1.2 酶与试剂盒 |
| 2.1.3 主要仪器设备 |
| 2.1.4 培养基配制 |
| 2.1.5 抗生素配制 |
| 2.1.6 引物序列 |
| 2.2 试验方法 |
| 2.2.1 载体构建 |
| 2.2.2 载体鉴定 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 植物表达载体结构图 |
| 2.3.2 载体的PCR鉴定 |
| 2.4 讨论 |
| 3 根癌农杆菌介导的植物表达载体在毛白杨中的遗传转化 |
| 3.1 试验材料 |
| 3.1.1 遗传转化材料 |
| 3.1.2 载体 |
| 3.1.3 培养基配制 |
| 3.1.4 主要溶液配制 |
| 3.1.5 主要仪器设备 |
| 3.2 试验方法 |
| 3.2.1 工程菌的制备与检测 |
| 3.2.2 毛白杨的遗传转化 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 表达载体转化农杆菌的PCR检测 |
| 3.3.2 毛白杨遗传转化 |
| 3.4 讨论 |
| 4 转基因植株的分子检测 |
| 4.1 试验材料 |
| 4.1.1 检测材料 |
| 4.1.2 试验所需试剂耗材 |
| 4.1.3 主要仪器设备 |
| 4.2 试验方法 |
| 4.2.1 转化植株的PCR检测 |
| 4.2.2 转基因植株的RT-PCR检测 |
| 4.2.3 转基因植株的q RT-PCR检测 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 转化植株的PCR检测 |
| 4.3.2 转基因植株的RT-PCR检测 |
| 4.3.3 转基因植株的q RT-PCR检测 |
| 4.3.4 转基因植株的扩繁与移栽 |
| 4.4 讨论 |
| 5 结论与展望 |
| 5.1 结论 |
| 5.2 创新点 |
| 5.3 展望 |
| 参考文献 |
| 个人简介 |
| 导师简介 |
| 获得成果目录 |
| 致谢 |
（3）外源基因DNA甲基化对农杆菌介导的大豆子叶节遗传转化的影响研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 大豆的遗传转化方法 |
| 1.2.1 农杆菌介导法 |
| 1.2.2 基因枪转化法 |
| 1.2.3 聚乙二醇转化法 |
| 1.2.4 花粉管通道法 |
| 1.2 外源基因表达的影响因素 |
| 1.2.1 外源基因插入特性对基因表达的影响 |
| 1.2.2 宿主调控对外源基因表达的影响 |
| 1.2.3 外界环境条件对外源基因表达的影响 |
| 1.3 植物中DNA甲基化 |
| 1.3.1 DNA甲基化的产生机制 |
| 1.3.2 DNA甲基化的功能 |
| 1.3.3 DNA甲基化的研究方法 |
| 1.4 原生质体转化与外源基因表达 |
| 1.4.1 原生质体转化方法在基因功能研究中的优势 |
| 1.4.2 原生质转化方法在基因功能研究中的应用 |
| 1.4.3 原生质转化方法的影响因素 |
| 1.5 研究的目的与意义 |
| 1.6 技术路线 |
| 第二章 农杆菌介导的大豆子叶节遗传转化 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 试验材料 |
| 2.1.2 试验方法 |
| 2.1.3 数据处理与计算 |
| 2.2 结果与分析 |
| 2.2.1 农杆菌介导的大豆遗传转化 |
| 2.2.2 不同大豆品种丛生芽诱导效率 |
| 2.2.3 不同大豆品种丛生芽伸长效率 |
| 2.2.4 不同大豆品种生根效率 |
| 2.2.5 不同大豆品种遗传转化效率 |
| 2.3 本章小结 |
| 2.3.1 结论 |
| 2.3.2 讨论 |
| 第三章 大豆原生质体细胞分离和瞬时转化体系 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 试验材料 |
| 3.1.2 试验方法 |
| 3.1.4 数据处理与计算 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.2.1 大豆原生质体制备和活力检测 |
| 3.2.2 组织材料培养时间对原生质体产量及活力的影响 |
| 3.2.3 预处理液中甘露醇含量对原生质体产量和活力的影响 |
| 3.2.4 酶解液成份对原生质体产量和活力的影响 |
| 3.2.5 酶解时间对原生质体产量和活力的影响 |
| 3.2.6 不同组织材料类型对原生质体产量和活力的影响 |
| 3.2.7 大豆原生质体中外源基因的瞬时表达 |
| 3.3 本章小结 |
| 3.3.1 结论 |
| 3.3.2 讨论 |
| 第四章 不同遗传转化效率大豆品种外源基因表达的影响因素研究 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 试验材料 |
| 4.1.2 试验方法 |
| 4.1.3 数据处理与计算 |
| 4.2 结果与分析 |
| 4.2.1 不同遗传转化效率大豆品种原生质体的制备 |
| 4.2.2 不同遗传转化效率大豆品种原生质体的转化效率 |
| 4.2.3 雌二醇诱导时间对大豆原生质体转化效率的影响 |
| 4.2.4 雌二醇浓度对大豆原生质体转化效率的影响 |
| 4.2.5 培养时间对不同遗传转化效率大豆品种原生质体细胞外源荧光蛋白表达的影响 |
| 4.2.6 不同遗传转化效率大豆品种原生质体细胞内外源基因的表达差异 |
| 4.2.7 蛋白酶抑制剂对外源基因表达的影响 |
| 4.2.8 不同转化效率的大豆品种原生质体中甲基化酶相关编码基因表达水平 |
| 4.2.9 不同转化效率的大豆品种原生质体中甲基化水平差异 |
| 4.2.10 甲基化抑制剂5-Azac对外源基因表达水平的影响 |
| 4.2.11 甲基化抑制剂5-Azac对外源基因甲基化水平的影响 |
| 4.3 本章小结 |
| 4.3.1 结论 |
| 4.3.2 讨论 |
| 第五章 5-AZAC对农杆菌介导的大豆遗传转化的影响 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.1 试验材料 |
| 5.1.2 试验方法 |
| 5.1.3 数据处理与计算 |
| 5.2 结果与分析 |
| 5.2.1 不同5-Azac处理浓度对大豆遗传转化的影响 |
| 5.2.2 不同5-Azac使用方式对大豆抗性丛生芽诱导效率的影响 |
| 5.2.3 5-Azac对不同大豆品种抗性丛生芽诱导效率的影响 |
| 5.3 本章小结 |
| 5.3.1 结论 |
| 5.3.2 讨论 |
| 第六章 全文总结 |
| 6.1 大豆的遗传转化效率具有显着的基因型差异 |
| 6.2 建立高效的大豆原生质体细胞分离和瞬时转化表达体系 |
| 6.3 DNA甲基化能够造成大豆品种间外源基因表达水平差异 |
| 6.4 甲基化抑制剂5-AZAC能够显着的提高大豆遗传转化过程中抗性丛生芽的诱导效率 |
| 6.5 创新点 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文目录 |
（4）CRISPR/Cas9介导的无外源基因插入的马铃薯基因编辑体系（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略词表 |
| 一 前言 |
| 1.1 基因组编辑的现状与发展 |
| 1.1.1 CRISPR/Cas9 系统 |
| 1.1.2 CRISPR/Cpf1 系统 |
| 1.1.3 CRISPR/Cas13 系统 |
| 1.2 基因组编辑技术在植物中的研究进展 |
| 1.2.1 基因敲除或插入 |
| 1.2.2 单碱基诱变 |
| 1.2.3 核酸内切酶介导的活细胞成像技术 |
| 1.3 基因编辑技术在农业育种上的应用与发展 |
| 1.3.1 增加农作物产量 |
| 1.3.2 提升农作物品质 |
| 1.3.3 提高植物抗逆性 |
| 1.3.4 加速杂交育种 |
| 1.4 基因编辑在马铃薯上的研究进展 |
| 1.4.1 降低马铃薯龙葵素含量 |
| 1.4.2 改善低温糖化现象 |
| 1.4.3 马铃薯抗除草剂 |
| 1.4.4 提高马铃薯支链淀粉含量 |
| 1.4.5 马铃薯抗多酚氧化酶(PPO) |
| 1.4.6 马铃薯抗病毒 |
| 1.4.7 马铃薯克服自交不亲和 |
| 1.5 无转基因成分且无转基因过程的基因组编辑 |
| 1.5.1 无转基因成分的基因组编辑 |
| 1.5.2 无转基因过程的基因组编辑 |
| 1.6 研究目的和意义 |
| 1.7 实验创新性 |
| 1.7.1 技术创新 |
| 1.7.2 材料创新 |
| 二 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 菌株和质粒 |
| 2.1.2 试剂与工具酶 |
| 2.1.3 实验仪器和设备 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 载体构建 |
| 2.2.2 阳性菌株检测 |
| 2.2.3 sgRNA体外转录及纯化 |
| 2.2.4 Cas9 mRNA体外转录及纯化 |
| 2.2.5 金粉悬浊液的配置 |
| 2.2.6 RNP的金粉包裹 |
| 2.2.7 RNA的金粉包裹 |
| 2.2.8 基因枪轰击 |
| 2.2.9 马铃薯叶片基因枪转化 |
| 2.2.10 马铃薯叶片愈伤的基因枪转化 |
| 2.2.11 马铃薯叶片DNA的提取 |
| 2.2.12 建立PCR产物混合池 |
| 2.2.13 马铃薯试管苗的培养 |
| 三 结果 |
| 3.1 CRISPR敲除载体构建 |
| 3.1.1 载体构建 |
| 3.1.2 RNA体外转录结果 |
| 3.2 愈伤组织的培养 |
| 3.3 基因枪预实验 |
| 3.3.1 马铃薯茎段愈伤组织基因枪轰击预实验结果 |
| 3.3.2 马铃薯叶片愈伤组织基因枪预实验结果 |
| 3.3.3 马铃薯叶片组织的基因枪预实验结果 |
| 3.4 基因枪实验 |
| 3.4.1 马铃薯叶片愈伤组织基因枪实验结果 |
| 3.4.2 马铃薯叶片基因枪实验结果 |
| 3.5 PCR产物测序结果 |
| 四 讨论 |
| 4.1 CRISPR/Cas9 系统的改进与优化 |
| 4.2 基因枪轰击技术的改进与优化 |
| 五 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 附录1 实验方法 |
| 附录2 Barcode引物 |
| 附录3 培养基配制方法 |
| 附录4 公司合成序列 |
| 附录5 DNA提取及PCR产物结果图 |
| 附录6 深度测序结果 |
| 致谢 |
（5）小麦组织特异性启动子的筛选、功能分析及应用研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 绪论 |
| 1.1 启动子概述 |
| 1.2 植物启动子的研究现状 |
| 1.3 小麦遗传转化 |
| 1.4 杂种优势与雄性不育 |
| 1.5 本课题研究目的和研究内容 |
| 2 小麦组织特异性基因的全基因组分析与鉴定 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.3 实验结果与分析 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 本章小结 |
| 3 小麦组织特异性启动子的分离及在植物体中的遗传转化研究 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.3 实验结果与分析 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 本章小结 |
| 4 利用组织特异性启动子构建的应用表达载体转化小麦的研究 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.3 实验结果与分析 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 本章小结 |
| 5 OsPSG076启动子在水稻中的转化研究 |
| 5.1 实验材料 |
| 5.2 实验方法 |
| 5.3 实验结果与分析 |
| 5.4 讨论 |
| 5.5 本章小结 |
| 6 水稻OsPSG076基因分析及其表达载体的遗传转化 |
| 6.1 实验材料 |
| 6.2 实验方法 |
| 6.3 实验结果与分析 |
| 6.4 讨论 |
| 6.5 本章小结 |
| 7 全文总结与展望 |
| 7.1 主要研究结果 |
| 7.2 本文的特色与创新点 |
| 7.3 课题展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录1 攻读学位期间发表的论文 |
| 附录2 主要符号与缩略词(按字母顺序) |
（6）小麦抗赤霉病基因的遗传转化和转乙醇酸基因材料的鉴定（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 1 前言 |
| 1.1 研究背景 |
| 1.1.1 小麦赤霉病危害 |
| 1.1.2 小麦赤霉病的防治 |
| 1.2 小麦转基因技术的国内外研究进展 |
| 1.2.1 基因枪转化法 |
| 1.2.2 农杆菌转化法 |
| 1.2.3 花粉管通道法 |
| 1.2.4 其它转化方法 |
| 1.3 筛选标记基因及筛选体系 |
| 1.3.1 PMI/甘露糖筛选体系 |
| 1.3.2 Bar/Bialaphos筛选体系 |
| 1.4 小麦抗赤霉病相关基因 |
| 1.5 RNAi作用机理及其应用 |
| 1.6 乙醇酸途径相关基因 |
| 1.7 最小表达框及多基因共转化 |
| 1.7.1 最小表达框 |
| 1.7.2 多基因共转化 |
| 1.8 研究的目的及意义 |
| 2 实验材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 实验主要仪器设备 |
| 2.1.2 材料及菌株 |
| 2.1.3 相关试剂及配制 |
| 2.1.4 菌株培养所用培养基 |
| 2.1.5 小麦遗传转化所用培养基 |
| 2.1.6 PCR及RT-PCR试剂 |
| 2.1.7 试剂盒和限制性内切酶 |
| 2.1.8 赤霉病菌接种和鉴定相关培养基配制 |
| 2.1.9 PCR及RT-PCR引物 |
| 2.2 基因枪轰击法流程 |
| 2.2.1 转化最小表达框的制备 |
| 2.2.2 襄麦76转化受体的制备 |
| 2.2.3 DNA“微弹”的制备 |
| 2.2.4 基因枪轰击、愈伤组织的再生及筛选 |
| 2.3 农杆菌介导法实验流程 |
| 2.3.1 转化子的制备及菌体DNA提取 |
| 2.3.2 菌体PCR鉴定 |
| 2.3.3 农杆菌浸染及愈伤组织的再生及筛选 |
| 2.4 转基因材料的分子鉴定及表型鉴定方法 |
| 2.4.1 转基因小麦叶片DNA的提取 |
| 2.4.2 转基因小麦的PCR鉴定 |
| 2.4.3 转基因小麦的RT-PCR鉴定 |
| 2.4.4 田间赤霉病抗性鉴定 |
| 2.4.5 幼胚一步成苗快速加代法 |
| 2.4.6 小麦杂交技术 |
| 2.5 统计分析 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 最小表达框DNA的制备 |
| 3.2 基因枪介导法Bar标记阳性植株的筛选 |
| 3.2.1 转AFP2及Hvchi基因株系PCR鉴定 |
| 3.2.2 襄麦76转RNAi-gls及RNAi-chs3b基因植株的分子鉴定 |
| 3.3 基因枪介导法PMI标记阳性植株的筛选 |
| 3.3.1 襄麦76转FENB基因植株的分子鉴定 |
| 3.3.2 转chs3bAS5-chs3bAS1、chs3bAS2-chs3bAS3基因植株的鉴定 |
| 3.3.3 转glsAS3-glsAS6,chs3bAS5-chs3bAS1和chs3bAS2-chs3bAS3基因植株的分子鉴定 |
| 3.3.4 转GlsAS3-GlsAS6 (tRNA)和6×Chs3bAS5-2基因植株的鉴定 |
| 3.4 农杆菌介导法获得转基因植株的PCR鉴定 |
| 3.4.1 农杆菌转化子菌体PCR鉴定 |
| 3.4.2 农杆菌介导法PMI标记阳性植株的筛选 |
| 3.4.3 扬麦158转TamiR(4)基因植株T0代PCR鉴定 |
| 3.5 襄麦76转乙醇酸途径基因植株的分子鉴定 |
| 3.5.1 转AtGDH, GcL及TsR基因高世代材料的分子鉴定 |
| 3.5.2 襄麦76转DEF及UEch42基因高世代材料的分子鉴定 |
| 3.5.3 转DEF及UEch42基因低世代材料的鉴定 |
| 4 讨论 |
| 4.1 多基因共转化小麦后代遗传分析 |
| 4.2 PMI与Bar筛选标记的区别 |
| 4.3 Ti质粒重组片段大小的分析 |
| 4.4 赤霉病抗性接种鉴定分析 |
| 4.5 转乙醇酸途径基因材料的分析 |
| 5 展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（7）转cry1Ac基因甘蔗的分子特征及生物学研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 前言 |
| 1.1 甘蔗螟虫是甘蔗生产上最重要的害虫 |
| 1.1.1 甘蔗螟虫的发生及危害 |
| 1.1.2 甘蔗螟虫的防治 |
| 1.2 转基因育种是改良甘蔗的一条有效途径 |
| 1.2.1 甘蔗转基因研究远滞后于其他作物且未商业化种植 |
| 1.2.2 甘蔗转基因研究历程及主要进展 |
| 1.3 甘蔗抗虫转基因育种 |
| 1.3.1 Bt/cry等抗虫基因及利用情况 |
| 1.3.2 cry1Ac基因及转cry1Ac基因作物 |
| 1.3.3 转cry1Ac基因甘蔗研究现状 |
| 1.4 基因工程甘蔗的系统生物学研究 |
| 1.4.1 基因工程甘蔗的分子特征研究 |
| 1.4.2 组学技术研究基因工程甘蔗 |
| 1.5 立题依据与研究意义 |
| 1.6 主要研究内容与技术路线 |
| 1.6.1 主要研究内容 |
| 1.6.2 技术路线 |
| 第二章 基于环介导等温扩增技术(LAMP)鉴定转cry1Ac基因甘蔗研究 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 植物材料与基因组DNA |
| 2.1.2 阳性质粒1Ac0229制备与检测 |
| 2.1.3 cry1Ac基因和bar基因LAMP引物、PCR引物设计与合成 |
| 2.1.4 LAMP反应混合物 |
| 2.1.5 LAMP体系优化 |
| 2.1.6 LAMP产物检测 |
| 2.1.7 PCR反应 |
| 2.1.8 LAMP和常规PCR敏感性比较 |
| 2.1.9 LAMP特异性检测 |
| 2.1.10 拟转cry1Ac基因甘蔗和拟转bar基因甘蔗无性系的鉴定 |
| 2.1.11 拟转cry1Ac基因甘蔗和拟转bar基因甘蔗无性系的拷贝数鉴定和蛋白表达鉴定 |
| 2.2 结果与分析 |
| 2.2.1 基于cry1Ac基因的LAMP方法的建立和应用 |
| 2.2.2 基于bar基因的LAMP方法的建立和应用 |
| 2.3 讨论 |
| 第三章 利用实时荧光定量PCR鉴定转基因甘蔗cry1Ac的拷贝数 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 植物材料与基因组DNA |
| 3.1.2 内标准基因APRT、CYC和P4H的克隆 |
| 3.1.3 多元靶标重组质粒的构建与检测 |
| 3.1.4 TaqMan实时荧光定量PCR |
| 3.1.5 Southern blot法鉴定转cry1Ac基因甘蔗拷贝数 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.2.1 内标准基因CYC、APRT和P4H的PCR克隆 |
| 3.2.2 多元靶标重组质粒的构建与检测 |
| 3.2.3 标准曲线的绘制 |
| 3.2.4 转基因甘蔗外源目的基因cry1Ac的拷贝数鉴定 |
| 3.2.5 Southern blot法鉴定转cry1Ac基因甘蔗拷贝数 |
| 3.3 讨论 |
| 第四章 转cry1Ac基因甘蔗的蛋白表达与表型性状 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 植物材料 |
| 4.1.2 工农艺性状和螟害情况调查 |
| 4.1.3 转cry1Ac基因甘蔗的拷贝数 |
| 4.1.4 转cry1Ac基因甘蔗的蛋白表达 |
| 4.1.5 外源基因拷贝数和主要工农艺性状关联分析 |
| 4.2 结果与分析 |
| 4.2.1 转cry1Ac基因甘蔗及对照的螟害情况 |
| 4.2.2 转cry1Ac基因甘蔗及对照的主要工农艺性状表现 |
| 4.2.3 转基因甘蔗及对照叶片中cry1Ac蛋白表达情况 |
| 4.2.4 灰色关联分析 |
| 4.3 讨论 |
| 第五章 转cry1Ac基因甘蔗的分子特征及根系土壤微生物群落研究 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.1 转cry1Ac基因甘蔗外源蛋白的时空表达 |
| 5.1.2 转cry1Ac基因甘蔗部分株系的旁侧序列研究 |
| 5.1.3 根际土壤细菌16S rDNA和18S rDNA的DGGE分析 |
| 5.2 结果与分析 |
| 5.2.1 转cry1Ac基因甘蔗外源蛋白的时空表达特性 |
| 5.2.2 旁侧序列和插入位点分析 |
| 5.2.3 根际土壤的PCR-DGGE及序列分析 |
| 5.3 讨论 |
| 第六章 转录组学分析转cry1Ac基因甘蔗典型株系的非预期效应 |
| 6.1 材料与方法 |
| 6.1.1 植物材料及总RNA提取 |
| 6.1.2 mRNA的富集、cDNA文库构建和Illumina测序 |
| 6.1.3 甘蔗样品的de novo组装及其注释 |
| 6.1.4 甘蔗样品的RNA-seq表达谱分析 |
| 6.1.5 外源cry1Ac基因和bar基因的表达分析 |
| 6.1.6 与抗虫性相关防御基因的差异表达分析 |
| 6.1.7 与产量性状相关基因的差异表达分析 |
| 6.1.8 与蔗糖分积累相关基因的差异表达分析 |
| 6.1.9 实时荧光定量PCR验征 |
| 6.2 结果与分析 |
| 6.2.1 甘蔗总RNA的检测 |
| 6.2.2 测序数据评估 |
| 6.2.3 甘蔗样品的de novo组装及其注释结果 |
| 6.2.4 甘蔗样品的RNA-seq表达谱分析结果 |
| 6.2.5 实时荧光定量PCR验证 |
| 6.3 讨论 |
| 第七章 主要结论、创新点及后续工作 |
| 7.1 主要结论 |
| 7.2 主要创新点 |
| 7.3 后续研究计划 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 附录Ⅰ: 缩略词表 |
| 附录Ⅱ: RNA-seq表达谱差异表达基因筛选 |
| 附录Ⅲ: Trizol法提取总RNA |
| 附录Ⅳ:个人简介 |
| 致谢 |
（8）抗病RNAi与抗虫除草剂四价植物表达载体构建与转化甘蔗研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 引言 |
| 1.1 甘蔗产业概述 |
| 1.1.1 甘蔗的生物学性状及重要性 |
| 1.1.2 甘蔗的用途 |
| 1.1.3 甘蔗作物的分布 |
| 1.2 甘蔗花叶病概况 |
| 1.2.1 甘蔗花叶病发生与分布 |
| 1.2.2 甘蔗花叶病病症及危害 |
| 1.2.3 甘蔗花叶病毒结构、功能与分类 |
| 1.3 甘蔗黄叶病概况 |
| 1.3.1 甘蔗花叶病发生与分布 |
| 1.3.2 甘蔗花叶病病症及危害 |
| 1.3.3 甘蔗黄叶病传播途径 |
| 1.3.4 甘蔗黄叶病毒结构与分类 |
| 1.4 甘蔗螟虫概况 |
| 1.4.1 甘蔗螟虫发生 |
| 1.4.2 甘蔗螟虫病症及危害 |
| 1.4.3 甘蔗螟虫的防治 |
| 1.5 甘蔗生长期田间管理及人工投入 |
| 1.6 我国蔗价现状 |
| 1.7 提高甘蔗品种抗病虫的方法 |
| 1.7.1 杂交育种 |
| 1.7.2 组织培养 |
| 1.7.3 分子育种 |
| 1.7.3.1 功能基因表达蛋白产生的抗性 |
| 1.7.3.2 RNA介导的抗性 |
| 1.8 甘蔗遗传转化方法 |
| 1.8.1 农杆菌介导法 |
| 1.8.2 基因枪转化法 |
| 1.8.3 电击法 |
| 1.8.4 聚乙二醇(PEG)介导法 |
| 1.9 目的和意义 |
| 1.9.1 研究目的 |
| 1.9.2 研究意义 |
| 1.10 本研究研究的技术路线 |
| 2 实验材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 植物受体材料 |
| 2.1.2 质粒与菌株 |
| 2.1.3 主要试剂及耗材 |
| 2.1.4 主要仪器设备 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 PCR检测引物及程序 |
| 2.2.2 抗病虫害及除草剂四价表达载体的构建路线 |
| 2.2.3 三价中间载体的构建 |
| 2.2.3.1 中间载体pHANNIBAL的改造 |
| 2.2.3.1.1 目的片段的酶切 |
| 2.2.3.1.2 目的片段回收 |
| 2.2.3.1.3 目的片段的连接 |
| 2.2.3.1.4 重组质粒的转化 |
| 2.2.3.1.5 重组质粒的提取 |
| 2.2.3.1.6 重组质粒酶切验证 |
| 2.2.3.2 本实验保存的RNAi中间载体验证 |
| 2.2.3.2.1 质粒大小验证 |
| 2.2.3.2.2 PCR验证 |
| 2.2.3.2.3 酶切验证 |
| 2.2.3.3 本实验保存的质粒pUBCG0229-Cry1AC验证 |
| 2.2.3.3.1 质粒大小验证 |
| 2.2.3.3.2 PCR验证 |
| 2.2.3.3.3 酶切验证 |
| 2.2.3.4 抗虫中间载体pHANNIBAL-Cry1AC的构建 |
| 2.2.3.4.1 Cry1AC表达框引入中间载体pHANNIBAL-Z |
| 2.2.3.4.2 重组质粒pHANNIBAL-Cry1AC的验证 |
| 2.2.3.5 抗病虫三价中间载体的构建 |
| 2.2.3.5.1 RNAi表达框引入重组质粒pHANNIBAL-Cry1AC |
| 2.2.3.5.2 重组质粒的验证 |
| 2.2.4 四价表达载体的构建 |
| 2.2.4.1 表达载体pART27的改造 |
| 2.2.4.1.1 目的基因的克隆 |
| 2.2.4.1.2 目的基因的酶切与回收 |
| 2.2.4.1.3 目的片段的连接与重组质粒的转化 |
| 2.2.4.1.4 重组质粒pART27-Z的酶切验证 |
| 2.2.4.2 四价抗病虫害的表达载体的构建 |
| 2.2.4.2.1 三价抗病虫表达框插入表达载体pART27-Z |
| 2.2.4.2.2 四价重组质粒的酶切验证 |
| 2.2.5 农杆菌工程菌获得与鉴定 |
| 2.2.5.1 农杆菌感受态细胞的制备 |
| 2.2.5.2 四价抗病虫害的表达载体转化农杆菌 |
| 2.2.5.3 农杆菌转化子鉴定 |
| 2.2.5.4 农杆菌工程菌株的培养与保存 |
| 2.2.6 四价表达载体的遗传转化 |
| 2.2.6.1 甘蔗愈伤诱导 |
| 2.2.6.2 受体材料抗生素PPT筛选浓度测定 |
| 2.2.6.2.1 愈伤组织阶段的PPT抗性试验 |
| 2.2.6.2.2 分化苗阶段的PPT抗性试验 |
| 2.2.6.3 农杆菌介导转化 |
| 2.2.6.3.1 农杆菌工程菌活化 |
| 2.2.6.3.2 共培养 |
| 2.2.6.3.3 抗性愈伤组织筛选与分化 |
| 2.2.6.4 基因枪转化 |
| 2.2.6.4.1 质粒DNA制备 |
| 2.2.6.4.2 仪器部件的灭菌 |
| 2.2.6.4.3 微弹制备 |
| 2.2.6.4.4 微弹涂膜 |
| 2.2.6.4.5 微弹包被验证 |
| 2.2.6.4.6 基因枪轰击 |
| 2.2.6.4.7 抗性愈伤组织筛选与分化 |
| 2.2.7 甘蔗抗性幼苗的生根培养与炼苗 |
| 2.2.7.1 抗性幼苗生根培养 |
| 2.2.7.2 幼苗炼苗 |
| 2.2.7.3 幼苗移栽 |
| 2.2.7.4 转基因植株统计 |
| 2.2.8 转基因植株分子鉴定 |
| 2.2.8.1 DNA水平检测 |
| 2.2.8.1.1 基因组DNA的制备与质量鉴定 |
| 2.2.8.1.2 抗性再生植株Bar基因PCR检测 |
| 2.2.8.1.3 双价抗病干扰序列和Cry1AC基因PCR检测 |
| 2.2.8.2 RNA水平检测 |
| 2.2.8.2.1 总RNA的提取与纯化 |
| 2.2.8.2.2 实时定量RT-PCR检测 |
| 2.2.8.3 蛋白质水平检测 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 三价中间载体的构建 |
| 3.1.1 中间载体pHANNIBAL的改造 |
| 3.1.1.1 目的片段的酶切、回收 |
| 3.1.1.2 重组质粒pHANNIBAL-Z验证 |
| 3.1.2 RNAi中间载体验证 |
| 3.1.2.1 RNAi中间载体质粒电泳分析 |
| 3.1.2.2 RNAi中间载体PCR验证 |
| 3.1.2.3 RNAi中间载体酶切验证 |
| 3.1.3 质粒pUBCG0229-Cry1AC验证 |
| 3.1.3.1 质粒pUBCG0229-Cry1AC电泳分析 |
| 3.1.3.2 质粒pUBCG0229-Cry1AC的PCR验证 |
| 3.1.3.3 质粒pUBCG0229-Cry1AC的酶切验证 |
| 3.1.4 抗虫中间载体pHANNIBAL-Cry1AC的构建 |
| 3.1.4.1 Cry1AC表达框引入中间载体pHANNIBAL-Z |
| 3.1.4.2 重组质粒pHANNIBAL-Cry1AC的验证 |
| 3.1.4.2.1 重组质粒大小及菌液PCR验证 |
| 3.1.4.2.2 重组质粒酶切验证 |
| 3.1.5 抗虫中间载体的构建 |
| 3.1.5.1 双价RNAi表达结构引入重组载体pHANNIBAL-Cry1AC |
| 3.1.5.2 重组质粒验证 |
| 3.1.5.2.1 重组质粒大小验证 |
| 3.1.5.2.2 重组质粒菌液PCR验证 |
| 3.1.5.2.3 重组质粒酶切验证 |
| 3.2 抗病虫及除草剂四价表达载体的构建 |
| 3.2.1 表达载体pART27的改造 |
| 3.2.1.1 目的基因的克隆 |
| 3.2.1.2 目的基因酶切、回收 |
| 3.2.1.3 重组质粒pART27-Z的验证 |
| 3.2.1.3.1 重组质粒大小及PCR验证 |
| 3.2.1.3.2 重组质粒酶切验证 |
| 3.2.2 四价抗病虫害的表达载体的构建 |
| 3.2.2.1 三价抗病虫基因盒引入表达载体pART27-Z |
| 3.2.2.2 重组质粒pART27-MC1YCP-Cry1AC、pART27-MC2YCP-Cry1AC和pART27-MYCP-Cry1AC的验证 |
| 3.2.2.2.1 四价重组质粒大小及PCR验证 |
| 3.2.2.2.2 四价重组质粒酶切验证 |
| 3.4 农杆菌工程菌获得与鉴定 |
| 3.5 四价表达载体的遗传转化 |
| 3.5.1 甘蔗愈伤诱导 |
| 3.5.2 受体材料抗生素PPT筛选浓度测定 |
| 3.5.3 农杆菌介导抗性愈伤组织筛选与分化 |
| 3.5.4 基因枪轰击 |
| 3.5.4.1 基因盒的制备 |
| 3.5.4.2 微弹包被验证 |
| 3.5.4.3 抗性甘蔗愈伤组织筛选与分化 |
| 3.5.5 甘蔗抗性幼苗生根及炼苗 |
| 3.5.5.1 抗性苗诱导生根 |
| 3.5.5.2 炼苗 |
| 3.5.5.3 幼苗移栽 |
| 3.5.6 抗性苗统计 |
| 3.6 抗性植株的分子鉴定 |
| 3.6.1 DNA水平检测 |
| 3.6.1.1 抗性筛选基因的检测 |
| 3.6.1.2 CryIAC基因和RNAi正反向序列检测 |
| 3.6.1.3 转基因植株统计 |
| 3.6.2 RNA水平检测 |
| 3.6.2.1 总RNA的提取与纯化 |
| 3.6.2.2 实时定量RT-PCR检测 |
| 3.6.3 蛋白质水平检测 |
| 4 讨论 |
| 4.1 抗病虫害及除草剂四价表达载体的构建 |
| 4.1.1 RNAi技术 |
| 4.1.2 RNAi表达框与Cry1AC基因的结合 |
| 4.2 多个组成型启动子对转基因甘蔗抗病虫效果的影响 |
| 4.3 PPT的筛选浓度 |
| 4.4 RNA水平检测和感病分析 |
| 5 结论 |
| 6 展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
（9）洁净DNA转化获得2mG2-epsps基因单拷贝整合的抗草甘膦水稻（论文提纲范文）
| 1材料与方法 |
| 1.1材料 |
| 1.2培养基和培养条件 |
| 1.3实验方法 |
| 1.3.1不同浓度草甘膦对水稻愈伤组织生长的影响 |
| 1.3.2不同浓度草甘膦对水稻愈伤组织分化的影响 |
| 1.3.3 2mG2-epsps基因的转化和植株再生 |
| 1.3.4转基因植株的PCR检测 |
| 1.3.5转基因植株的Southern blot分析 |
| 1.3.6 T１代转基因株系的草甘膦抗性检测 |
| 1.3.7数据统计 |
| 2结果与分析 |
| 2.1不同浓度草甘膦对水稻愈伤组织生长的影响 |
| 2.2不同浓度草甘膦对水稻愈伤组织分化的影响 |
| 2.3 2mG2-epsps基因表达框转化水稻 |
| 2.4转基因植株的Southern分析 |
| 2.5 T１代转基因水稻幼苗对草甘膦的抗性 |
| 3讨论 |
（10）无选择标记1Dx5基因的小麦遗传转化（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 文献综述 |
| 1.1 小麦转基因技术研究进展 |
| 1.1.1 小麦转基因技术研究概况 |
| 1.1.2 小麦转基因的常用方法 |
| 1.2 小麦 HMW-GS 相关研究 |
| 1.2.1 HMW-GS 对小麦加工品质的影响 |
| 1.2.2 HMW-GS 基因在小麦遗传转化中的应用 |
| 1.3 无选择标记基因转基因技术研究进展 |
| 1.3.1 无选择标记基因直接转化法 |
| 1.3.2 利用基因枪介导的共转化剔除选择标记基因 |
| 1.3.3 利用位点特异性重组剔除性选择标记基因 |
| 1.3.4 利用转座子介导的再定位 |
| 1.4 本研究的目的、研究内容及技术路线 |
| 1.4.1 研究目的、内容 |
| 1.4.2 技术路线 |
| 2 小麦幼胚再生体系的建立 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 材料 |
| 2.1.2 实验方法 |
| 2.2 结果与分析 |
| 2.2.1 不同基本培养基对愈伤组织诱导的影响 |
| 2.2.2 不同激素对小麦愈伤组织诱导的影响 |
| 2.3 讨论 |
| 3 小麦基因枪转化体系的建立 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 实验材料 |
| 3.1.2 实验方法 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.2.1 氦气压力对 gus 基因表达的影响 |
| 3.2.2 轰击距离对 gus 基因表达的影响 |
| 3.2.3 质粒浓度对 gus 基因表达的影响 |
| 3.3 讨论 |
| 4 小麦高分子量麦谷蛋白亚基基因 1Dx5 线性表达框转化 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 实验材料 |
| 4.1.2 实验方法 |
| 4.2 结果与分析 |
| 4.2.1 线性基因片段的制备 |
| 4.2.2 目的基因的遗传转化及再生 |
| 4.2.3 T_0代再生植株 PCR 筛选 |
| 4.2.4 T_0代转基因植株种子 SDS-PAGE 分析 |
| 4.2.5 转基因植株农艺相关性状 |
| 4.3 讨论 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 在读期间发表的论文 |
| 后记 |
四、基因枪介导转化的外源基因表达框和质粒在水稻中遗传和表达行为的比较研究（论文参考文献）
- [1]杂种落叶松遗传转化及Lol-miR11467功能的初步研究[D]. 张素芳. 东北林业大学, 2020
- [2]抗虫彩叶基因聚合表达载体构建及在毛白杨中的转化研究[D]. 周静. 北京林业大学, 2020
- [3]外源基因DNA甲基化对农杆菌介导的大豆子叶节遗传转化的影响研究[D]. 赵强. 沈阳农业大学, 2020(08)
- [4]CRISPR/Cas9介导的无外源基因插入的马铃薯基因编辑体系[D]. 王灿. 内蒙古大学, 2020(01)
- [5]小麦组织特异性启动子的筛选、功能分析及应用研究[D]. 苏佩佩. 华中科技大学, 2019
- [6]小麦抗赤霉病基因的遗传转化和转乙醇酸基因材料的鉴定[D]. 周忠良. 华中农业大学, 2016(03)
- [7]转cry1Ac基因甘蔗的分子特征及生物学研究[D]. 周定港. 福建农林大学, 2016(05)
- [8]抗病RNAi与抗虫除草剂四价植物表达载体构建与转化甘蔗研究[D]. 张卓. 福建农林大学, 2014(05)
- [9]洁净DNA转化获得2mG2-epsps基因单拷贝整合的抗草甘膦水稻[J]. 赵艳,邓春泉,邓丽蝶. 中国水稻科学, 2014(01)
- [10]无选择标记1Dx5基因的小麦遗传转化[D]. 王勇. 新疆师范大学, 2013(07)