一、Induction of the Expression of Heme Oxygenase Gene in PC12 Cellsby Hypoxia（论文文献综述）
其布日[1]（2021）在《额尔敦-乌日勒的活性成分分析及其对小胶质细胞基因调控作用的研究》文中研究说明脑卒中是我国第一大死亡原因,是全球仅次于缺血性心脏病的第二大死亡原因。因此,研发新型抗脑卒中药物意义重大。额尔敦-乌日勒（EW）是蒙医治疗神经系统疾病的经典方剂,具有良好的神经保护作用,对脑卒中引起的半身不遂等症状疗效显着,因而得到广泛的临床应用。然而,EW化学成分复杂,作用机制不明确。因此,必需明确EW的生物活性成分,并阐明其神经保护作用机制。本论文中分析了EW的部分有效成分,并发现了EW对大脑中动脉阻塞/再灌注损伤（MCAO/R）模型大鼠脑内小胶质细胞的基因调控作用、极化作用以及从抗神经性炎症作用。【研究目的】（1）验证EW对MCAO/R模型大鼠病变部位组织内基因表达的调控作用,并分析EW中所含有的神经活性化合物;（2）确定EW在脑卒中恢复期间通过调节小胶质细胞极化来抑制神经炎症的主要化合物;（3）确定EW的分级分离组分中的关键抗炎分子及作用机理以及对神经细胞保护及突触生长的影响;（4）EW中关键活性分子的协同作用对小胶质细胞基因表达谱的影响。【研究方法】（1）建立大鼠MCAO/R模型,连续给药两周。第15天,提取大鼠大脑皮质病变区组织的总RNA,并进行转录组测序（RNA-seq）分析。筛选未处理组、MCAO模型组和EW给药组之间显着差异表达的基因,并分析各个基因的功能以及在缺血性脑卒中恢复过程中的可能作用。（2）根据文献报道收集EW药材中与神经相关的生物活性化学分子信息,采用Chem Draw软件画出结构式并建立数据库,命名为“EW神经活性化合物数据库”;其次,采用五种不同溶剂提取EW可溶解组分,并使用UPLC-QTof-MS分析其活性化合物。（3）以调控小鼠小胶质细胞（BV2细胞株）M1表型表达的细胞因子Cxcl10为筛选标准,利用RT-q PCR法对EW的5种溶剂提物进行快速筛选,选出了调控作用最为显着的提取物,通过两次HPLC半制备分离,得到优化的生物活性小分子组,并利用UPLC-QTof-MS鉴定了其生物活性分子。（4）采用UPLC-QTof-MS鉴定EW的分离组分（命名为F4-6）的关键抗炎分子;利用蛋白免疫印迹分析了F4-6对脂多糖（LPS）刺激的BV2小胶质细胞NF-κB信号通路相关蛋白水平的影响;以及分析F4-6处理的小胶质细胞培养液对神经元（N2a细胞）的增值和突触生长的影响。（5）利用RNA-seq分析讨论EW所含关键活性分子土木香内酯（Ala）和去氢二异丁香酚（Deh）单分子以及混合物对LPS刺激的BV2小胶质细胞基因表达谱（Gene expression pattern profile）的影响,并采用RT-q PCR法对RNA-seq结果进行了验证。【研究结果】（1）Bederson评分显示,给药14天后,EW给药组MCAO/R模型大鼠的评分从治疗前的2.07降至治疗后的0.21（P<0.01）,说明EW显着降低了神经系统损伤。与NT组相比,MCAO模型组大鼠大脑皮质区病变组织内有63个差异表达的基因;而与MCAO模型组相比,EW治疗后有186个差异表达的基因;其中生长因子（Igf1、Igf2和Tgfβ）和颗粒蛋白编码基因Grn等的表达在EW治疗后显着上调（P<0.05）;同时也检测到小胶质细胞标记物的表达大幅增强,以及补成分和分泌蛋白酶的表达。（2）五种不同溶剂提取的EW组分的UPLC-QTof-MS分析发现,在我们建库的11种蒙药的32个小分子化合物中,除决明子外其他10种蒙药（红花、肉豆蔻、甘草、草果、川楝子、栀子、土木香、木香、荜茇和黑种草等）中已报道的16个神经活性相关小分子化合物分别出现在五种溶剂提取物中。（3）快速筛选结果表明,EW石油醚提取物（命名为EW-5）对Cxcl10基因表达的抑制作用最强（P<0.05）。采用HPLC半制备法,对EW进行2次分级分离后最终得到12个组分。其中,组分F4-6对促炎细胞因子（Cxcl10、Tnfα、Il1β和Nos2）表达的抑制作用最显着（P<0.05）。通过UPLC-QTof-MS对F4-6进行了分析,共鉴定出20种化合物,其中包括木香烃内酯、肉豆蔻醚、土木香内酯和亚麻酸;这些小分子在LPS刺激的BV2细胞和小鼠原代小胶质细胞中,显着下调关键促炎细胞因子的表达。（4）土木香内酯（Ala）和去氢二异丁香酚（Deh）是F4-6的关键抗炎活性分子。F4-6、Ala和Deh均下调LPS刺激的小胶质细胞中Ccl2、Cox2和Il6等促炎基因的表达;同时上调Hmox1、Tgfβ、Igf1和Creb1等抗炎基因的表达。此外,F4-6处理的小胶质细胞条件培养液能显着促进N2a细胞的增殖,并可能通过上调Nefh和Dlg4来促进突起的生长。从机理上讲,F4-6显着降低了NF-κB p65蛋白的表达,同时抑制了p65的核转位,导致NF-κB启动的促炎基因转录受到抑制。（5）RNA-seq发现,Ala、Deh和Mix均下调促炎基因和上调抗氧化基因。Mix组的作用比Ala组和Deh组的作用更显着（P<0.05）,其作用不仅仅是简单的Ala和Deh作用的加和。【研究结论】综上所示,本论文首次利用RNA-seq技术,系统的分析了蒙药EW对MCAO/R模型大鼠脑卒中病变区周围细胞的基因表达的调控作用,发现EW显着改善缺血性脑卒中后神经损伤的恢复,并促使小胶质细胞从M1表型极化至M2表型;同时利用UPLC-QTof-MS系统的分析了EW中神经炎症及神经保护等相关的生物活性化合物,发现EW中多种活性化合物组分的协同作用可能是平衡小胶质细胞极化和缺血性脑卒中后的恢复,也验证了EW治疗白脉病（神经系统疾病）的传统功效,为进一步研究EW甚至其他传统药物的治疗机理提供了重要的证据。
朱晓婷[2]（2021）在《解毒益智方对阿尔茨海默病双转基因小鼠行为学及大脑皮层内β-淀粉样蛋白沉积及BACE1表达影响的研究》文中指出选题依据:阿尔茨海默病（AD）致残、致死率高,发病机制复杂,大脑内Aβ异常沉积是AD发生发展的重要病理变化及核心环节,前期研究已证实了解毒益智方具有抑制AD线虫头部Aβ斑块沉积及相关基因表达的作用,随之开展的随机对照临床研究证实解毒益智方应用6个月后MMSE、MoCA、ADL评分变化明显优于口服尼莫地平片的对照组。黄连为解毒益智方中的君药,为该方的主要成分,在本方中发挥“解毒”的重要功效。经查阅国内外文献发现黄连中发挥“解毒”作用的主要物质为黄连多糖（CCP）,因此设计体外细胞实验探究解毒益智方中的君药黄连的主要有效成分CCP对Aβ25-35损伤PC12的保护作用,为“毒损”的病机及“解毒”的治法提供理论依据,为后续研究提供研究基础。因前期开展的研究均是以单基因单细胞的生物为研究对象,不能很好地模拟AD的疾病特点,因此选用APP/PS1双转基因小鼠作为研究对象,该小鼠很好的模拟了中枢神经系统Aβ异常沉积的状态,通过对小鼠的行为学研究及分子生物学研究,进一步评价解毒益智方的治疗作用。目的:通过体外细胞实验探讨基于“补肾益髓、活血化痰解毒”法形成的解毒益智方其中君药的有效成分CCP对Aβ25-35损伤PC12的保护作用。通过行为学、分子生物学等研究手段,对APP/PS1小鼠的认知功能、Aβ沉积、BACE1表达的相关蛋白、基因等方面进行检测和分析,探讨解毒益智方对APP/PS1小鼠的作用机制,为中药治疗AD的推广应用提供可靠的研究证据。方法:1.本研究分别从体外实验、动物实验探究解毒益智方的作用机制。体外实验部分采用MTT还原法、Hoechst33258荧光染色等方法对Aβ25-35诱导的PC12细胞损伤模型进行线粒体活性、细胞活力、细胞凋亡的测定,探究CCP对PC12细胞的保护作用。动物实验部分选用APP/PS1双转基因小鼠为研究对象,随机分为5组,分别是模型组（APP/PS1组）、盐酸多奈哌齐组（Donepezil组）、解毒益智方低剂量组（JDYZFL组）、解毒益智方中剂量组（JDYZFM组）、解毒益智方高剂量组（JDYZFH组）,每组16只小鼠,另选用16只C57小鼠作为正常对照组（Control组）,于每日早晨8:30进行灌胃治疗,各组每日灌胃药物及剂量分别是,正常组和模型组0.5%CMC溶液0.20g·kg-1·d-1;阳性对照组:盐酸多奈哌齐溶液0.30g·kg-1·d-1;解毒益智方高、中、低剂量组药物浓度依次为0.60g·kg-1·d-1,0.3g·kg-1·d-1,0.15g·kg-1·d-1。持续6个月治疗结束。2.以Aβ25-35损伤的PC12细胞为研究对象,通过测定细胞活力、LDH释放率、细胞凋亡率、和线粒体膜电位的水平等评价CCP的神经保护作用。3.通过水迷宫实验,记录解毒益智方对APP/PS1小鼠学习记忆能力的影响。4.通过ELISE及免疫荧光法检测APP/PS1小鼠脑内Aβ水平的变化,观察解毒益智方对APP/PS1小鼠脑内Aβ沉积的影响。5.采用PCR方法检测脑组织SIRT1、NF-κB、BACE1基因量变化,并进一步采用Western blot方法检测大脑皮层内SIRT1、BACE1、NF-κB蛋白的变化,观察解毒益智方对APP/PS1小鼠脑内AMPK/SIRT1-PPARγ-PGC1α-BACE1转运蛋白通路SIRT1、BACE1、NF-κB的影响。结果:1.通过体外研究观察CCP对Aβ25-35诱导的PC12细胞损伤的影响PC12细胞活力测定结果显示:PC12细胞经过浓度为5-50μM的Aβ25–35处理24h后,细胞活力随着Aβ25–35浓度的增加从24%下降至61%。当Aβ25–35在浓度范围为5至50μM时引起PC12细胞中LDH释放增加至对照组的约130-160%。在用不同浓度的CCP（5至200μg/ml）处理PC12细胞24h后,未观察到显着的细胞损失。通过Hoechst33258染色及FCM测定细胞凋亡结果显示:细胞核在荧光显微镜下具有显着的浓缩核和凋亡的细胞形成。与在未处理的PC12细胞中观察到的完整,圆形和相对大的细胞核相比,暴露于50μMAβ25–35 24h的细胞显示出典型的细胞凋亡特征,包括染色质浓缩,核碎裂和凋亡小体的出现。用CCP不同浓度（5,25,50,100,200μg/ml）处理后可有效逆转细胞凋亡,其中100μg/ml效果最明显,FCM分析显示单独暴露于50μMAβ25–35 24h导致58.88±6.12%的凋亡率,这与正常对照组中的7.21±0.82%的值显着不同（P<0.01）。加入100μg/ml的CCP后,细胞凋亡下降至12.51±1.32%。通过JC-1红色荧光与JC-1绿色荧光的比率的变化来检测Aβ诱导的线粒体功能障碍结果显示:当PC12细胞暴露于50μM的Aβ25–35中24h后,与正常对照组相比,显着减弱了JC-1的红色荧光比例,提高了JC-1绿色荧光比例（P<0.01）。用CCP（100μg/ml）预处理Aβ25–35处理的PC12细胞显着抵消了Aβ25–35损伤引起的膜电位损失,JC-1从Aβ25–35处理的PC12细胞中的22.1%变为绿色荧光至84.3%,与正常对照组相近（P>0.05）。通过蛋白质印迹法检测细胞色素C结果显示:经50μMAβ25–35处理PC12细胞24h后细胞色素C在细胞质中的蛋白质表达增加,而预先用CCP（100μg/ml）处理的PC12细胞显着减弱线粒体释放的胞质细胞色素C。2.观察JDYZF对APP/PS1双转基因小鼠学习记忆能力的影响。水迷宫实验结果显示:随着实验天数的后移,各组小鼠潜伏期、路径长度、游泳距离均有所缩短,表明随着训练次数的增加各组小鼠对象限平台的定位记忆能力随之有所提升。与Control组相比,APP/PS1组逃避潜伏期、路径长度、游泳距离均明显延长,差异显着（P<0.01）。首次到达平台的时间明显延长,目标停留次数明显减少,差异显着（P<0.01）。与APP/PS1组相比,Donepezil组、JDYZFL组、JDYZFM组逃避潜伏期、路径长度、游泳距离有所缩短,差异有统计学意义（P<0.05,P<0.01）。首次到达平台的时间缩短,目标停留次数增多,差异有统计学意义（P<0.05,P<0.01）。与Donepezil组相比,JDYZFL组作用与其相当,JDYZFM组略优于Donepezil组,差异有统计学意义（P<0.05）。干预治疗6个月的12月龄小鼠的定位航行实验及空间搜索实验结果优于干预治疗3个月的9月龄小鼠,差异有统计学意义（P<0.05）。3.观察JDYZF对APP/PS1双转基因小鼠脑内Aβ沉积的影响。各组小鼠结果如下:与Control组比较,APP/PS1组大脑皮层内可溶性及不可溶性Aβ1-40、Aβ1-42沉积极数量明显增多,具有极显着统计学意义（P<0.01）。与APP/PS1组相比,JDYZFL组、JDYZFM组及Donepezil组大脑皮层内可溶性及不可溶性Aβ1-40、Aβ1-42沉积数量不同程度降低,具有统计学意义（P<0.05,P<0.01）。与Donepezil组比较,JDYZFM组大脑皮层内可溶性及不可溶性Aβ1-40、Aβ1-42沉积数量有所降低,差异具有统计学意义（P<0.05）。通过免疫荧光法测得小鼠大脑皮层内Aβ表达发现,Control组只产生微量Aβ,而APP/PS1组Aβ表达量明显增高,经过用药干预后,12月龄干预组小鼠可溶性及不可溶性Aβ1-40、Aβ1-42沉积数量较9月龄小鼠明显减少,免疫荧光标记从宏观上可以发现干预组Aβ沉积明显减少,APP/PS1组Aβ沉积明显增多。4.调控BACE1表达的相关因子结果（1）PCR检测结果各组小鼠进行的PCR检测结果显示:与Control组相比,APP/PS1组小鼠大脑皮层内BACE1/GAPDH、NF-κB/GAPDH表达含量明显增高,SIRT1/GAPDH明显降低,差异有显着统计学意义(（P<0.01）。与APP/PS1组相比,Donepezil组、JDYZFL组及JDYZFM组小鼠海马体内BACE1/GAPDH、NF-κB/GAPDH表达含量不同程度降低,SIRT1/GAPDH表达含量不同程度增高,差异具有统计学意义（P<0.05,P<0.01）。JDYZFH组在NF-κB/GAPDH表达上无统计学差异。与Donepezil组相比,JDYZFL组及JDYZFM组BACE1/GAPDH、NF-κB/GAPDH表达含量不同程度降低,差异具有统计学意义（P<0.05）。PCR结果证实药物干预组可通过提高SIRT1mRNA的含量降低NF-κBmRNA、BACE1mRNA的表达,从而抑制Aβ的产生而起到神经保护的作用。各治疗组大脑皮层Aβ的表达均有所降低。连续灌胃6个月的各组小鼠与连续灌胃3个月的小鼠相比,除APP/PS1组及Control组,其他各组SIRT1mRNA的表达均有所提高,NF-κBmRNA、BACE1mRNA的表达均有所降低,差异具有统计学意义（P<0.05）。（2）Westorn blot检测结果各组小鼠的Western blot检测结果显示:与Control组相比,APP/PS1组小鼠大脑皮层SIRT1的蛋白表达明显降低,NF-κB、BACE1蛋白表达显着升高（P<0.01）。与APP/PS1相比,Donepezil组、JDYZFL组、JDYZFM组BACE1、NF-κB表达降低,SIRT1蛋白表达增高差异有统计学意义（P<0.05）。与Donepezil比较,JDYZFL组、JDYZFM组NF-κB蛋白表达有所降低,差异有统计学意义（P<0.05）。JDYZFL组SIRT1、BACE1蛋白表达无显着差异,JDYZFM组SIRT1表达有所提高,BACE1蛋白表达量略有降低,差异有统计学意义（P<0.05）。经过为期3个月及6个月的干预后,各治疗组大脑皮层Aβ的表达均有所降低。连续灌胃6个月的各组小鼠与连续灌胃3个月的小鼠相比,除APP/PS1组及Control组,其他各组SIRT1的蛋白表达均有所提高,NF-κB、BACE1蛋白的表达均有所降低,差异具有统计学意义（P<0.05）。结论:1 CCP能够保护Aβ25-35损伤的PC12细胞,其机制可能与提高细胞活力、抑制细胞凋亡、减少LDH释放、阻断膜电位的丧失,并阻止线粒体细胞色素C释放,修复线粒体功能障碍有关。2 JDYZF各剂量组可不同程度提高APP/PS1双转基因小鼠定位航行实验及空间搜索实验的成绩,说明JDYZF可改善小鼠空间学习及记忆能力。3 JDYZF可不同程度降低APP/PS1双转基因小鼠大脑皮层内Aβ的异常沉积。4 JDYZF抑制BACE1的异常表达,其作用机制可能是通过调控大脑内AMPK/SIRT1-PPARγ-PGC1α-BACE1信号通路的相关因子表达实现的。
吴子菁[3]（2021）在《基于Nrf2/ARE信号通路研究抵当汤调节线粒体自噬改善脑出血后神经损伤的作用机制》文中提出目的:以Nrf2/ARE信号转导通路为基础,以线粒体自噬为主要研究途径,通过整体动物实验和细胞实验,在分子水平探讨抵当汤治疗脑出血的作用机制,阐明抵当汤减轻脑出血大鼠血肿周围组织损伤的干预机制,为临床应用该方治疗脑出血急性期提供更可靠的实验依据。方法:分别建立大鼠自体血注入脑出血模型和CoCl2诱导的PC12细胞缺氧模型,随机分为假手术组（对照组）,模型组,脑血康对照组、抵当汤低、中、高剂量组6组;应用Longa评分法观察抵当汤在改善脑出血大鼠神经功能缺损方面的作用;Tunel染色检测抵当汤对脑出血大鼠病灶组织细胞凋亡的影响;流式细胞术检测抵当汤对CoCl2诱导的PC12细胞凋亡的影响;Western blot检测抵当汤对脑出血大鼠和CoCl2诱导的PC12细胞凋亡相关蛋白的影响,确定抵当汤的神经保护作用。qPCR法检测抵当汤对脑出血大鼠脑组织和CoCl2诱导的PC12细胞线粒体DNA（mtDNA）拷贝数的影响;荧光法检测抵当汤对脑出血大鼠脑组织和CoCl2诱导的PC12细胞ATP含量的影响;生化法检测抵当汤对脑出血大鼠脑组织SOD、CAT、GSH-px、MDA的影响;荧光标记法检测抵当汤对CoCl2诱导的PC12细胞线粒体膜电位的影响,确定抵当汤对线粒体功能的影响。Western blot法检测抵当汤对脑出血大鼠脑组织和CoCl2诱导的PC12细胞线粒体自噬相关蛋白表达的影响;免疫组化法检测抵当汤对脑出血大鼠脑组织线粒体自噬相关蛋白的影响,确定抵当汤对线粒体自噬的影响。Western blot法检测抵当汤及Nrf2抑制剂对CoCl2诱导的PC12细胞Nrf2/ARE信号通路的影响;流式细胞术检测抵当汤及Nrf2抑制剂对CoCl2诱导的PC12细胞凋亡的影响;qPCR法检测抵当汤及Nrf2抑制剂对CoCl2诱导的PC12细胞mtDNA的影响;荧光法检测抵当汤及Nrf2抑制剂对CoCl2诱导的PC12细胞ATP含量的影响;流式细胞术检测抵当汤及Nrf2抑制剂对CoCl2诱导的PC12细胞mt ROS的影响,确定抵当汤Nrf2/ARE信号通路的影响。结果:（1）抵当汤可以改善脑出血大鼠神经功能评分,促进脑出血后神经功能恢复。（2）抵当汤可下调脑出血大鼠和CoCl2诱导PC12细胞缺氧模型中神经细胞凋亡相关蛋白Bax和Caspase-3表达水平以及升高Bcl-2表达水平,从而减少神经细胞凋亡。（3）在大鼠脑出血模型和CoCl2诱导的PC12细胞模型中发现,抵当汤可以降低mtDNA拷贝数,增加ATP含量,恢复线粒体膜电位,表明抵当汤可以改善脑出血后受损神经细胞的线粒体功能。（4）在大鼠脑出血模型中发现,抵当汤可以升高SOD、CAT、GSH-px含量和活性,抑制MDA含量,表明抵当汤可以抑制脑出血后受损神经细胞的氧化应激。（5）在大鼠脑出血模型和CoCl2诱导的PC12细胞模型中发现,抵当汤可以增加Parkin、Pink1和LC3II表达,抑制P62蛋白表达,进而促进线粒体自噬。（6）抵当汤通过激活Nrf2/ARE通路,诱导线粒体自噬,进而改善线粒体功能,缓解缺氧诱导的神经功能损伤。结论:实验证实了抵当汤能够明显改善脑出血模型大鼠神经功能评分,抑制神经细胞凋亡;证实其是通过调控Nrf2/ARE信号通路,促进线粒体自噬,从而降低mtDNA拷贝数、增加ATP含量、恢复线粒体膜电位、抑制氧化应激改善线粒体功能,从而发挥神经保护作用。
陈德云[4]（2021）在《20（R）-人参皂苷Rg3调控Nrf2通路抑制线粒体氧化应激抗脑缺血再灌注损伤的研究》文中提出[目的]复制大鼠大脑中动脉缺血再灌注（middle cerebral artery occlusion/reperfusion,MCAO/R）模型和缺氧缺糖/复氧复糖（oxygen-glucose deprivation/reperfusion,OGD/R）诱导的PC12细胞损伤模型,研究20（R）-人参皂苷Rg3对脑缺血再灌注损伤所致线粒体氧化应激的保护作用,并探讨其潜在的分子机制,为把20（R）-人参皂苷Rg3开发成有效的抗脑缺血神经保护剂提供实验依据。[方法]1、采用线栓法复制大鼠MCAO/R模型,将雄性SD大鼠随机分为假手术组、MCAO/R 组、MCAO/R+Rg3（5 mg/kg）组、MCAO/R+Rg3（10 mg/kg）组、MCAO/R+Rg3（20 mg/kg）组和尼莫地平组（1 mg/kg）,每组8只。缺血2 h再灌注24h后,处死大鼠,取大鼠脑组织。采用DCFH-DA荧光探针检测脑组织内活性氧（reactive oxygen species,ROS）和线粒体内ROS含量,水溶性四氮唑法（water soluble tetrazolium-1,WST-1）检测超氧化物歧化酶（super oxide dismutase,SOD）的活性,硫代巴比妥酸（thiobarbituricacid,TBA）比色法检测丙二醛（malondiadehyde,MDA）的含量;采用透射电镜观察线粒体的结构;采用JC-1荧光探针检测线粒体膜电位,可见分光光度法检测三磷酸腺苷（adenosine triphosphate,ATP）的含量;实时定量聚合酶链反应（real-time polymerase chain reaction,RT-PCR）和 Western Blot法检测脑组织内线粒体小分裂蛋白1（mitochondrial fission 1 protein,Fis1）、线粒体动力相关蛋白1（dynamin-related protein 1,Drp1）、线粒体融合蛋白1/2（mitofusin-1/2,Mfn1/2）、视神经萎缩蛋白 1（optic atrophy 1,OPA1）、Kelch 样环氧氯丙烷相关蛋白-1（Kelch-like ECH-associated protein-1,Keap1）、核因子相关因子2（nuclear factor erythroid2-related factor 2,Nrf2）和血红素加氧酶 1（heme oxygenase 1,HO-1）的mRNA和蛋白表达情况。2、复制PC12细胞OGD/R模型,将实验细胞分为control组、OGD/R组、OGD/R+Rg3（5 μmol/L）组、OGD/R+Rg3（25 μmol/L）组、OGD/R+Rg3（125 μmol/L）组、OGD/R+尼莫地平组（10 μmol/L）。采用倒置显微镜观察细胞形态;采用CCK8试剂盒检测细胞活力;采用WST-1法检测SOD活性、TBA比色法检测MDA含量、可见分光光度法ATP含量;采用JC-1荧光探针试剂盒检测线粒体膜电位;采用DCFH-DA荧光探针检测细胞内ROS的含量;RT-PCR和Western Blot法检测细胞内Keap1、Nrf2、HO-1、Drp1和Mfn1 mRNA和蛋白的表达;采用免疫荧光检测胞核中Nrf2表达。3、选择最佳剂量的20（R）-人参皂苷Rg3对其抗线粒体氧化应激的作用机制进行验证,分为:control 组、OGD/R 组、OGD/R+Rg3（125μmol/L）、OGD/R+Rg3+control siRNA组、OGD/R+Rg3+Nrf2 siRNA组。采用DPPH清除自由基实验检测自由基清除率,采用Nrf2 siRNA转染PC12细胞,沉默Nrf2的表达,用PCR验证转染效率;之后采用Western Blot检测核内NRF2、HO-1、DRP1、MFN1的蛋白表达情况,用WST-1和TBA 比色法试剂盒检测SOD和MDA的含量。[结果]1、整体实验中氧化应激检测结果显示:与假手术组相比,模型组的大鼠脑皮质中ROS和MDA的含量显着升高,SOD的活性降低;20（R）-人参皂苷Rg3（10、20 mg/kg）和尼莫地平组可显着降低大鼠脑皮质中ROS和MDA的含量,增加SOD的活性。2、整体实验中线粒体结构与功能检测结果显示:与假手术组相比,模型组线粒体肿胀明显,线粒体嵴模糊;20（R）-人参皂苷Rg3（20 mg/kg）组可明显减轻线粒体水肿。此外,与假手术组相比,模型组线粒体内的ROS增多,线粒体膜电位下降,合成ATP减少,而20（R）-人参皂苷Rg3（10、20 mg/kg）和尼莫地平组可减少线粒体的ROS,升高线粒体膜电位,增加ATP合成。3、整体实验中线粒体融合和分裂基因检测结果显示:与假手术组相比,模型组Fis1和Drp1的mRNA表达显着增加,Mfn1、Mfn2和Opa1的mRNA表达减少,而20（R）-人参皂苷Rg3和尼莫地平可减少Fis1和Drp1 mRNA的表达,增加Mfn1、Mfn2和Opa1 mRNA的表达。同时DRP1和MFN1的蛋白表达也出现与mRNA一致性改变。4、整体实验中Nrf2信号通路检测结果显示:与假手术组相比,模型组Keap1、Nrf2和HO-1的mRNA和蛋白表达均没有差异。与模型组相比,20（R）-人参皂苷Rg3（20mg/kg）能显着增加Nrf2与Ho-1的mRNA表达,而对Keap1的mRNA表达没有影响。蛋白检测结果显示,与模型组相比,20（R）-人参皂苷Rg3（20mg/kg）组对KEAP1蛋白表达没有影响,而胞浆内的NRF2蛋白表达减少,核内的NRF2的蛋白表达显着增加,HO-1的表达也显着增多。5、细胞实验中细胞活力检测结果显示:与正常对照组相比,OGD/R和H2O2诱导均可显着降低细胞活力。与模型组相比,20（R）-人参皂苷Rg3（25,125 μmol/L）和尼莫地平（10μmol/L）组可增加细胞活力。6、细胞实验中氧化应激指标检测结果显示:与正常对照组相比,OGD/R组ROS、MDA含量显着增加,SOD的活性下降,线粒体膜电位降低,ATP的合成减少。与模型组相比,20（R）-人参皂苷Rg3（25,125 μmol/L）和尼莫地平（10μmol/L）能减少ROS、MDA,并增加SOD活性,升高线粒体膜电位,增加ATP的合成。7、细胞实验中线粒体融合和分裂基因结果显示:与正常对照组相比,OGD/R组显着增加Drp1和降低Mfn1的mRNA和蛋白表达,20（R）-人参皂苷Rg3（25、125μmol/L）和尼莫地平（10 μmol/L）可显着减少Drp1,增加Mfn1 mRNA和蛋白表达。8、细胞实验中Nrf2信号通路检测结果显示:与正常对照组相比,OGD/R模型组Keapl和Nrf2的mRNA和蛋白表达均没有差异,而HO-1的mRNA和蛋白表达有所增加。与模型组相比,20（R）-人参皂苷Rg3（125μmol/L）对Keapl的mRNA和蛋白表达均没有影响,但能显着增加Nrf2与Ho-1的mRNA表达。此外,与模型组相比,20（R）-人参皂苷Rg3（125 μmol/L）组能减少胞浆内NRF2的蛋白表达,增加核内的NRF2的蛋白表达,增加HO-1的蛋白表达。免疫荧光结果显示,与模型组相比,20（R）-人参皂苷Rg3（125 μmol/L）组可明显增加胞核内Nrf2蛋白表达。9、转染Nrf2 siRNA后细胞实验的结果显示:转染Nrf2 siRNA后,与OGD/R+Rg3+control siRNA 组相比,OGD/R+Rg3+Nrf2 siRNA 组的 的 mRNA表达显着降低,细胞核内NRF2和HO-1的蛋白表达量减少。同时,OGD/R+Rg3+Nrf2 siRNA组可增加DRP1蛋白表达和减少MFN1蛋白表达,此外,OGD/R+Rg3+Nrf2 siRNA组还可增加MDA含量,减少SOD活性。提示,转染Nrf2 siRNA后,可逆转20（R）-人参皂苷Rg3的保护作用。[结论]20（R）-人参皂苷Rg3能显着改善大鼠脑缺血再灌注损伤,减轻缺血再灌注导致的线粒体氧化应激,减少线粒体分裂和增加线粒体融合蛋白的表达,维持线粒体的结构与功能的稳定,其分子机制可能与20（R）-人参皂苷Rg3激活Nrf2信号通路,增强下游抗氧化因子表达有关。
罗浩丹[5]（2021）在《海马过表达Gαq改善衰老小鼠学习记忆能力的机制研究》文中提出[目的]Gαq是G蛋白α亚单位家族的重要成员,是体内一个重要的信号通路蛋白。课题组前期研究发现,人神经元样细胞株SY5Y和大鼠神经元样细胞株PC12中过表达Gαq明显增强了细胞的抗氧化损伤能力,机制可能与过表达的Gαq激活ERK、Nrf2通路、抑制NF-κB通路有关。进一步研究发现,过表达Gαq的神经元样细胞中SFPQ明显上调。SFPQ是一种DNA/RNA结合蛋白,参与了多种神经退行性疾病的发生发展。鉴于上述结果均为体外研究所得,本课题拟检测不同年龄小鼠海马中Gaq和SFPQ的表达水平,以明确Gaq、SFPQ表达水平随年龄变化的相关性,并构建D-半乳糖致小鼠衰老模型,研究衰老小鼠海马过表达Gαq后学习记忆能力的变化及相关机制,从模型动物层面为Gaq作为抗神经衰老治疗靶点提供依据。[方法]（1）取年龄为1天、7天、14天、2个月、6个月、18个月的昆明小鼠各5只,麻醉后立即用4℃生理盐水心脏灌注,解剖分离出脑海马,用免疫印迹法（Western Blot,WB）实验检测Gαq与SFPQ蛋白表达水平。（2）取2月龄雄性昆明小鼠40只,随机分成2组,每组20只,模型组（DG组）腹腔注射D-半乳糖构建小鼠衰老模型,对照组（NC组）腹腔注射等量生理盐水。（3）造模结束后用水迷宫实验（Morris water maze,MWM）进行检测,并将模型组随机分成2组,每组10只,治疗组（Gαq+DG组）双侧海马注射腺病毒过表达Gαq,安慰组（VECTOR+DG组）双侧海马注射含空载体的腺病毒,对照组也随机分为2组,Gαq+NC组和VECTOR+NC组,分别给予治疗组和安慰组同样的处理。（4）注射病毒4个星期后,用MWM水迷宫实验检测小鼠学习记忆能力;MMW实验后立即处死小鼠,用化学比色法检测海马过氧化氢酶（CAT）、超氧化物歧化酶（SOD）及谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）的活力;用WB实验检测小鼠海马Gαq、SFPQ、谷胱甘肽巯基转移酶（GST）、血红素加氧酶1（HO-1）、环磷腺苷反应元件结合蛋白（CREB）及其磷酸化形式p-CREB的表达水平;用免疫荧光技术检测Gαq、SFPQ、BCL-2在小鼠海马的表达水平。[结果]（1）小鼠海马内Gαq、SFPQ水平随着年龄增长而逐渐下降,二者表达水平随年龄的变化呈正相关关系。（2）小鼠连续4周腹腔注射D-半乳糖后,学习记忆能力明显下降,海马SFPQ、抗氧化相关蛋白GST、HO-1、记忆相关蛋白p-CREB表达水平明显下调,海马CAT、SOD、GSH-PX等抗氧化酶的活性明显降低。（3）海马过表达Gαq明显改善了衰老模型小鼠学习记忆能力,上调了海马SFPQ、GST、HO-1、p-CREB、抗凋亡蛋白BCL-2的表达水平,增强了衰老模型小鼠海马CAT、SOD、GSH-PX等抗氧化酶的活性。[结论]（1）小鼠海马中Gαq、SFPQ随年龄增加而逐渐减少,衰老模型小鼠海马过表达Gαq后SFPQ明显上调,提示Gαq、SFPQ二者在神经衰老和抗神经衰老过程中存在内在调控关系。（2）海马过表达Gαq可明显改善衰老模型小鼠的学习记忆能力,Gaq可作为体内抗神经衰老的治疗靶点。（3）海马过表达Gαq可以恢复SFPQ,和抗氧化蛋白GST、HO-1表达水平,增强CAT、SOD、GSH-PX等抗氧化酶的活性,减少神经元凋亡并增加记忆相关蛋白p-CREB含量从而改善衰老模型小鼠的学习记忆能力。
侯亚男[6]（2021）在《靶向Nrf2的小分子在神经保护中的研究》文中指出在多种生理代谢途径和酶促反应中,机体都会产生活性氧（ROS）。生理水平的ROS是重要的信号转导分子。然而,ROS的过多积累会导致氧化应激,对蛋白质、DNA和脂质等造成不可逆的损伤。大脑富含不饱和脂肪酸且耗氧量高,对氧化损伤十分敏感。常见的神经退行性疾病,如帕金森症和阿尔茨海默症等,其发展均与氧化应激有关。为了预防或治疗这些疾病,上调细胞内抗氧化防御系统是一种潜在的策略。在细胞内,Nrf2转录因子调控多种抗氧化分子的表达。生理状态下,Nrf2被其抑制蛋白Keap1锚定在细胞质中,并进行泛素化降解。而在亲电试剂进攻或氧化应激等状态下,Nrf2从Keap1逃离,并转移到细胞核中。在核内小Maf蛋白的帮助下,Nrf2与ARE结合,启动一系列抗氧化基因的表达。Nrf2是细胞内抗氧化防御系统的重要调节因子,因此通过激活Nrf2来治疗神经退行性疾病得到越来越多的关注。在本论文中,我们报道了硫辛酰胺、燕麦酰胺类似物、二苯并吡喃酮衍生物、小白菊内酯、异硫氰酸烯丙酯和IM3829衍生物等小分子对PC12细胞具有神经保护效果,且该作用是通过激活Keap1/Nrf2/ARE信号通路实现的。本论文的内容总结归纳如下:1.简要介绍了Keap1/Nrf2/ARE信号通路及其调控方式。同时,阐述了神经退行性疾病和癌症与该信号通路之间的关系。此外,还对最近报道的Nrf2调节剂进行了总结。2.硫辛酰胺、小白菊内酯、异硫氰酸烯丙酯、燕麦酰胺-2c以及化合物3、4、6和7（二苯并吡喃酮类衍生物）均来源于食物或中药材,并且它们具有多种药理学活性。实验结果表明,这些化合物都是有效的Nrf2激活剂。它们能够抵御过氧化氢或6-羟基多巴胺造成的氧化损伤,保护PC12细胞。这些化合物还促进Nrf2的核易位,进而诱导一系列Nrf2下游抗氧化分子的表达,包括谷胱甘肽、血红素加氧酶、醌氧化还原酶和硫氧还蛋白还原酶等。除此之外,通过干扰RNA沉默Nrf2的表达会使这种保护效果消失,这表明Nrf2在这些小分子对细胞的保护过程中发挥至关重要的作用。3.化合物IM3829是一个已被报道的Nrf2抑制剂。我们设计并合成了多个IM3829衍生物,探究它们对Nrf2的作用效果。其中化合物7对Nrf2的激活效果最好,因此接下来我们探究了化合物7对PC12细胞的作用。研究发现,该化合物能够有效保护PC12细胞抵抗氧化损伤,诱导Nrf2激活并促进一系列二相代谢酶的表达。化合物7是一个结构较新颖的Nrf2激活剂,可以作为潜在的预防神经退行性疾病的候选药物。
程杰[7]（2021）在《鼠尾草酸抑制铁死亡减轻脊髓损伤的实验研究》文中认为目的:脊髓损伤（spinal cord injury,SCI）后损伤部位出现各种病理级联反应,导致一系列细胞死亡的发生。反之,死亡的细胞释放众多危险信号,进而加重继发性损伤,形成一种恶行循环。铁死亡是一种新明确的细胞死亡形式,广泛参与中枢神经系统相关疾病的发生发展。鼠尾草酸（carnosic acid,CA）是一种双萜类小分子化合物,具有抗氧化、神经保护等作用,但目前尚缺乏鼠尾草酸对脊髓损伤保护性效应的研究。故本研究的主要目的是:1)制备大鼠脊髓损伤模型,探究铁死亡在脊髓损伤后的表现及其时间进程;2)借用PC12细胞拟神经元细胞构建铁死亡模型,在体外环境中探究鼠尾草酸能否抑制铁死亡;3)探索鼠尾草酸抑制铁死亡的作用机制;4)体内实验探究鼠尾草酸能否促进SCI大鼠神经功能恢复,及其具体机制。方法:1)将SD大鼠随机分为6个组:假手术组、SCI-6h组、SCI-1d组、SCI-3d组、SCI-7d组和SCI-14d组。利用改良的Allen’s重物坠落法制备大鼠脊髓损伤模型。利用生物信息学对脊髓损伤和铁死亡共同靶点进行分析,借用RT-q PCR技术对铁死亡特异性基因PTGS2、RPL8F、HMGB1、ATP5G3、IREB2和CS进行定量分析,免疫印迹（western blot,WB）检测各组中ACSL4、FPN、FTH1、GPX4和x CT的蛋白质表达水平,利用普鲁士蓝染色和铁离子试剂盒测量各组脊髓组织中铁离子水平,试剂盒检测各组GPX4酶活性水平,借用FJB染色分析变性神经元细胞情况;2)细胞增殖活性检测试剂盒（CCK-8）检测不同浓度的鼠尾草酸和erastin对PC12细胞活性的影响,确定后续实验所需药物浓度。实验分为6个组:对照组、模型组、阳性对照组（Fer-1组）、低、中、高剂量鼠尾草酸组。试剂盒检测各组中丙二醛（malonaldehyde,MDA）、谷胱甘肽（glutathione,GSH）、二价铁离子(Fe2+)和谷胱甘肽过氧化物酶4（glutathione peroxidase 4,GPX4）活性的水平。利用流式细胞技术检测鼠尾草酸对细胞内ROS水平的影响。利用Mito-Tracker Red染色及醋酸双氧铀和枸橼酸铅双染色观察鼠尾草酸对线粒体膜电位和形态的影响;3)实验分为九个组:对照组、模型组、低剂量CA干预组、中剂量CA干预组、高剂量CA干预组和Nrf2抑制剂组。采用WB和免疫荧光（immunofluorescence,IF）技术检测鼠尾草酸对Nrf2表达水平和分布的影响,利用RT-q PCR和WB分别检测鼠尾草酸对Nrf2、x CT、GCLM、GCLC、GSS、GPX4、FTH1和FPN的m RNA和蛋白质表达的影响。试剂盒检测鼠尾草酸对MDA、GSH、Fe2+和GPX4酶活性的影响;4)将SD大鼠随机分为4个组:假手术组、模型组、鼠尾草酸低剂量组、鼠尾草酸高剂量组。借用BBB评分和斜板实验评估大鼠的运动功能,采用HE染色观察脊髓形态的变化,利用FJB染色和尼氏染色观察鼠尾草酸对脊髓损伤后神经元细胞状态的影响,利用试剂盒检测鼠尾草酸对脊髓损伤后MDA、GSH、Fe2+和GPX4酶活性的影响,借用RT-q PCR和WB技术分别检测鼠尾草酸对脊髓损伤后铁死亡相关靶点的m RNA水平和蛋白质水平的影响。结果:1)RT-q PCR结果显示,脊髓损伤后PTGS2、RPL8F和HMGB1的m RNA水平高于假手术组（P<0.01）,其中PTGS2在脊髓损伤后6小时表达最高,RPL8F和HMGB1约在第三天达到峰值。WB结果显示,术后第3天ACSL4的表达水平较假手术组显着升高（P<0.01）;脊髓损伤后FPN的表达水平显着降低（P<0.01）,术后第3天表达最低,而FTH1在术后第3天表达水平显着升高（P<0.01）;脊髓损伤后第1天,GPX4和x CT的表达较假手术组显着降低（P<0.01）。脊髓组织铁离子检测结果显示,脊髓损伤后6小时,铁离子水平显着增加（P<0.01）,第3天达到最高峰。术后第1天,GPX4酶活性较假手术组显着降低（P<0.01）,第3天达到最低值。FJB染色结果显示术后6h,变性的神经元数量即显着增加（P<0.01）,术后第3天达到峰值;2)CCK-8结果显示,鼠尾草酸浓度≤20μM对PC12细胞无明显毒性作用（P>0.5）,选择浓度为1、5和10μM的鼠尾草酸用于后续实验。结果显示,鼠尾草酸能够恢复erastin诱导的PC12细胞活力下降。Erastin刺激诱导PC12细胞,能够明显地降低细胞内GSH水平和GPX4酶活力（P<0.01）,同时增加细胞内MDA的含量（P<0.01）,而鼠尾草酸能够逆转erastin所产生的效应。流式结果显示erastin能够增加PC12细胞内ROS水平（P<0.01）,而鼠尾草酸能够降低ROS的含量（P<0.01）。线粒体形态观察结果显示,erastin能够降低线粒体膜电位,导致线粒体皱缩、线粒体嵴减少或消失,而鼠尾草酸能够明显地改善线粒体膜电位和形态的变化;3)RT-q PCR结果显示,鼠尾草酸对PC12细胞内Nrf2的m RNA水平无明显作用,但WB和IF结果显示,与模型组相比,鼠尾草酸显着增加了细胞内Nrf2蛋白质水平,同时促进了其向细胞核内聚积。RT-q PCR和WB的结果显示,鼠尾草酸能够显着地上调PC12细胞内x CT、GCLM、GCLC、GSS、GPX4、FTH1和FPN的m RNA及蛋白质表达水平,而Nrf2特异性抑制剂ML385能够削弱鼠尾草酸的上调效应;4)BBB运动学评分结果显示,术后第7天,SCI+H-CA组的BBB评分优于SCI组（P<0.05）,从术后第14天开始,SCI+L-CA组和SCI+H-CA组的BBB评分高于SCI组。斜板实验结果显示,术后第3天,SCI+H-CA组的斜坡角度大于SCI组（P<0.05）,从术后第7天开始,SCI+L-CA组和SCI+H-CA组的斜坡角度明显优于SCI组（P<0.01）。与SCI组相比,鼠尾草酸能够减轻脊髓组织形态病理学改变,减少变性神经元数量（P<0.01）,增加存活的神经元数目（P<0.01）。鼠尾草酸能够逆转脊髓损伤后高水平的PTGS2的m RNA含量、ACSL4的蛋白质含量、MDA含量和铁离子含量,以及低表达的GSH含量和GPX4酶活性水平。RT-q PCR和WB实验结果显示,与SCI组相比,鼠尾草酸能够上调Nrf2、x CT、GCLC、GCLM、GSS、GPX4、FPN和FTH1的m RNA表达水平及蛋白质表达量。结论:1)铁死亡参与脊髓继发性损伤过程,并且在损伤早期（6 h）即可出现铁死亡现象,于术后第3天最显着;2)鼠尾草酸能够抑制erastin诱导的PC12细胞铁死亡的发生;3)鼠尾草酸能够通过激活Nrf2通路,上调GSH-GPX4轴,同时增加FTH1和FPN的表达水平,提高细胞内源性抗氧化能力,进而抑制铁死亡的发生;4)鼠尾草酸能够通过激活Nrf2通路,抑制铁死亡的发生,增加存活的神经元细胞,减轻脊髓损伤,促进神经功能的恢复。
黄涛[8]（2020）在《α7nAChR激动剂PHA568487对大鼠肾脏缺血再灌注损伤的保护作用及机制研究》文中研究表明研究背景肾缺血再灌注损伤（Renal ischemia/reperfusion injury,IRI）是指肾脏缺血后血流再灌注或氧气再灌注后自身损伤加重,这一独特的病理生理反应可致肾功能严重损害,严重者甚至可致患者死亡。现有研究表明炎症反应的发生在肾IRI中发挥了重要作用,但具体机制仍未完全阐明。迷走神经的神经递质乙酰胆碱可以通过激 α7 烟碱型乙酰胆碱受体（α7 nicotinic acetycholine receptor,α7nAChR）调节炎症反应,缓解炎症。PHA568487为一种乙酰胆碱受体激动剂,通过激活α7nAChR活化胆碱能抗炎通路,在IRI过程中具有调控炎症反应的功能,具有较好的临床应用前景。在机体创伤或病理改变致使细胞损伤时,体内的核因子E2相关因子2（nuclear factor-E2-related factor 2,Nrf2）表达上调,激活氧化应激反应,最终可增强细胞对氧化应激的耐受能力。在缺血再灌注导致的器官损伤中,Nrf2信号通路依赖还原型辅酶以及醌氧化还原酶被激活后产生的诱导效应,对各种代谢引起的氧化应激反应发挥保护作用。血红素加氧酶（heme oxygenase,HO）广泛分布于机体的各组织器官中,具有保护组织免受IRI的作用。目前已有研究发现,激活后的Nrf2/HO-1信号通路广泛参与心、脑、肾和神经系统等组织器官的抗氧化应激损伤,保护细胞免受氧化应激的损伤,发挥抗氧化和抗凋亡的作用。但在肾IRI过程中,PHA568487是否对Nrf2/HO-1通路有调节作用尚无相关报道。环状RNA（circularRNA,circRNA）是一种没有5’帽状结构和3’腺苷酸尾的以首尾相接的方式构成的非编码RNA,它具有调节微小RNA（microRNA,miRNA）的特殊功能。近年来,有文献报道具有调节多种炎症相关人类疾病的功能。CircRNA不仅可以作为预测肾相关疾病的生物标志物,还可以通过调节靶向基因的功能以调节疾病发展进程。且除去传统的炎症通路,PHA568487能否调节circRNA的表达及其与肾IRI炎症过程的相关性仍无一例研究。目的本研究旨在探究α7nAChR激动剂PHA568487对大鼠肾脏缺血再灌注损伤的保护作用,并分析可能涉及的调控机制。我们建立了大鼠肾IRI动物模型,并探究PHA568487预处理对肾IRI大鼠血清中尿素氮、血肌酐水平、血清炎症相关细胞因子的水平、大鼠肾组织的病理变化以及肾组织细胞的凋亡情况等方面的影响以明确PHA568487对大鼠肾IRI是否有缓解作用。最后,我们通过细胞生物学实验探究其下游信号通路及分子机制,为临床药物治疗及靶向治疗提供理论依据。方法1.我们通过大鼠肾组织缺血后复灌注的方法构建肾IRI的Wista大鼠动物模型,并通过再灌注前2 h腹腔注射2.4 mg/kg PHA568487以构建PHA568487预处理的Wista大鼠肾IRI动物模型。（1）观察各组大鼠的一般状态并采集各组大鼠的血液样本和肾组织样本。（2）血液生化检测仪测定血清尿素氮和血肌酐水平,酶联免疫吸附测定法（enzyme linked immunosorbent assay,ELISA）测定各组大鼠血清 C 反应蛋白（C-reactiveprotein,CRP）、白细胞介素-1（interleukin-1g,IL-1r）、肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor α,TNF-α）和IL-6的表达。（3）收集大鼠肾脏组织,制作肾组织病理切片,行高碘酸-雪夫氏染色法（Periodic Acid-Schiff stain,PAS）染色,观察各组大鼠肾组织的病理变化。（4）TUNEL法检测各组大鼠肾组织细胞的凋亡情况。（5）qRT-PCR和Western Blot检测各组大鼠肾组织中Bax、Bcl-2、Caspase-3 mRNA和蛋白的表达情况。2.我们通过将人肾小管上皮细胞HK-2置于缺氧复氧环境下以构建肾IRI的模型;PHA568487预处理以构建PHA568487预治疗的体外肾IRI细胞模型;并使用Nrf-2特异性抑制剂ML385和PHA568487共同提前处理细胞,以探究Nrf-2在IRI的HK-2细胞中的作用。（1）首先我们通过CCK-8法检测各组细胞的增殖活性;（2）流式细胞术检测各组细胞的凋亡率;（3）提取各组细胞的总RNA和总蛋白,采用 qRT-PCR 和 Western Blot 法分别检测 Nrf-2、HO-1、Caspase-3、Bax、Bcl-2 mRNA和蛋白的表达情况。3.首先,我们通过将人肾小管上皮细胞HK-2置于缺氧缺葡萄糖、复氧环境下以构建肾IRI的模型;通过PHA568487预处理以构建PHA568487预治疗的体外肾细胞IRI模型。（1）采用qRT-PCR检测了 PHA568487处理后IRI的HK-2细胞中circYAP1表达情况。（2）随后转染circYAP1过表达质粒到HK-2细胞中并构建IRI细胞模型,使用CCK-8法和流式细胞术检测circYAP1对细胞活力和凋亡的影响。使用ELISA和活性氧（reactive oxygen species,ROS）分别检测circYAP1过表达后对IL-1对、IL-6分泌以及ROS形成的作用。（3）通过生物预测网站预测与circYAP1存在靶向关系的miRNA,通过qRT-PCR检测敲低circYAP1后IRI的HK-2细胞中miR-21-5p表达情况,并使用荧光素酶报告基因实验进一步分析circYAP1与miR-21-5p的结合情况。（4）同时过表达circYAP1和miR-21-5p并构建IRI细胞模型,检测miR-21-5p对细胞活力、凋亡、炎症因子分泌和ROS形成的影响。最后,利用Westen Blot实验检测IRI的HK-2细胞中PI3K/AKT/mTOR信号通路相关蛋白的表达情况。结果1.（1）在构建成功的Wista肾IRI大鼠动物模型中,大鼠食欲降低,进食、饮水均减少,精神萎靡、活动较少且迟缓;血液生化检测结果表明大鼠血清中尿素氮和肌酐水平明显增高;此外,PAS染色显示大鼠肾组织中肾小球体积增大,可观察到间质区内有大量炎性细胞浸润、肾小球细胞呈空泡变性。另外,肾IRI大鼠血清中CRP、TNF-中、IL-1中、IL-6水平明显高于对照组大鼠;而且IRI组大鼠肾组织的细胞凋亡率明显较高,肾组织中Bcl-2 mRNA和蛋白表达水平明显下降而Bax和Caspase-3的表达均明显增高。（2）与IRI组大鼠相比,经过PHA568487预处理的Wista肾IRI大鼠饮水、进食、精神状态和活动量均较好,血清中尿素氮和肌酐水平均有所降低且肾组织病理状态得到改善,这表明PHA568487能够明显改善肾缺血-再灌注损伤大鼠的肾脏组织病变。此外,经过PHA568487预处理,肾IRI大鼠血清中CRP、TNF-中、IL-1中、IL-6水平和组织细胞凋亡率显着降低,且Bcl-2的表达有所回升、Bax和Caspase-3的表达受到抑制。2.（1）在模拟肾IRI的HK-2细胞模型中,细胞增殖活性较对照组有所降低,但细胞凋亡率较高,同时伴随着Nrf2、HO-1、Bcl-2表达水平的降低和Caspase-3和Bax表达水平的提高。（2）经过PHA568487预处理,肾IRI的HK-2细胞的增殖活性增加、凋亡率降低,且PHA568487还能够提高肾IRI的HK-2细胞中Nrf2、HO-1、Bcl-2表达水平并抑制Caspase-3和Bax的mRNA和蛋白表达。（3）与PHA568487预处理组相比,经过PHA568487和Nrf2抑制剂共孵育组的细胞增殖活性明显降低、凋亡率明显增高,Nrf2、HO-1、Bcl-2 mRNA和蛋白的表达水平明显降低,而Caspase-3和Bax mRNA和蛋白的表达水平明显增高。3.（1）与IRI的HK-2细胞相比,PHA568487预处理可以提高HK-2细胞中的circYAP1表达水平。（2）转染circYAP1过表达质粒到HK-2细胞中并构建IRI细胞模型,CCK-8法和流式细胞术结果显示过表达circYAP1后细胞活力增强、细胞凋亡率降低,且可抑制IRI上调IL-1 β和IL-6以及ROS水平的作用。这表明,上调circYAP1表达能够缓解HK-2细胞的炎症损伤。（3）生物信息学数据库和qRT-PCR实验表明有多个miRNA与circYAP1存在靶向互补序列,且在下调circYAP1的HK-2 IRI细胞模型中可检测到相应miRNA表达水平的上升。随后,我们通过荧光素酶报告基因实验验证circYAP1在模拟IRI的HK-2细胞中充当miR-21-5p的海绵。进一步的细胞生物学实验也表明miR-21-5p可能参与了circYAP1调节的HK-2细胞炎症损伤过程,上调miR-21-5p后,原本circYAP1过表达对HK-2细胞炎症损伤的缓解作用减弱。最后,Western Blot实验结果表明circYAP1过表达通过抑制miR-21-5p表达水平,促进PI3K、AKT和mTOR蛋白的磷酸化,激活PI3K/AKT/mTOR信号通路。结论本研究主要集中于α 7nAChR激动剂PHA568487对大鼠肾脏缺血再灌注损伤的保护作用及机制研究,主要得出以下结论:1、PHA568487预处理能够有效保护因缺血-再灌注而引发的肾功能损害,抑制肾组织细胞凋亡;2、PHA568487预处理对肾IRI的保护作用主要是通过其能够抑制炎症因子的表达,抑制促凋亡基因水平、促进凋亡抑制基因表达来实现的;3、Nrf-2/HO-1通路通过抑制促凋亡基因Caspase-3和Bax的表达,促进凋亡抑制基因BCL-2的表达,进而发挥抑制IRI的HK-2细胞凋亡的作用,而PHA568487对HK-2细胞的作用部分是通过Nrf-2/HO-1来实现的。4、在IRI的HK-2细胞中,PHA568487预处理可以提高circYAP1表达水平;CircYAP1通过靶向结合miR-21-5p,减轻HK-2细胞的IRI反应、促进损伤细胞凋亡、激活PI3K/AKT/mTOR信号通路。
李凯旋[9]（2020）在《肉种鸡饲用甲硒氨酸降低种蛋孵化后期死胚率的机理研究》文中研究说明课题组前期研究了饲用不同硒源（亚硒酸钠、酵母硒、甲硒氨酸）及其水平对肉种母鸡及其后代生产性能的影响,结果表明:肉种鸡饲喂甲硒氨酸（SM）和酵母硒（SY）能显着提高肉种鸡产蛋率、孵化率及种蛋的硒含量,总体效果明显优于亚硒酸钠（SS）,且SM同比SS降低了种蛋孵化后期死胚率,其中SM最佳剂量为0.15 mg Se/kg。为此,本论文在建立鸡胚和肝细胞急性氧化应激损伤模型的基础上,比较SM和SS两种硒源对鸡肝细胞氧化应激损伤的保护作用,两者差异化调控肝细胞氧化应激相关Keap1-Nrf2-ARE信号通路的作用靶点以及对抗氧化硒蛋白基因表达效率的影响,深入探讨了 SM上述营养调控作用的分子机制,旨在为其开发和应用提供理论依据。试验一:母源甲硒氨酸对鸡胚急性氧化损伤的保护作用1.1建立鸡胚急性氧化应激模型在种蛋孵化后期第17 d注射0、10、25、50、75μg敌草快（Diquat,DIQ）,24 h后引起鸡胚表观现象明显变化:尿囊绒毛膜出现发红、充血等症状。随着Diquat注射剂量加大,鸡胚死亡数上升,两者间呈显着正相关。其中,25 μg Diquat即可导致鸡胚死亡,检测肝脏总抗氧化能力（T-AOC）、氧化产物丙二醛（MDA）含量显着上升。由此表明,该实验成功建立了 Diquat诱导的鸡胚急性氧化应激损伤模型,Diquat适宜注射剂量为25 μg。1.2母源甲硒氨酸对敌草快诱导急性氧化应激鸡胚的保护作用应用上述构建的鸡胚急性氧化应激模型,本试验采用3×2因子完全随机设计,即3种硒源:基础日粮（硒水平0.04 mg/kg）、基础日粮+0.15 mg Se/kg SS、基础日粮+0.15 mg Se/kg SM;2种Diquat水平:0和25 μg。试验选用40周龄梅黄4号种母鸡180只,随机分为三组,试验期12周（预试验4周,正式试验8周）。各硒源种蛋于孵化期第17 d随机分为2组,分别进行无菌水或Diquat注射,分为CON（基础日粮+无菌水注射）、SS（SS+无菌水注射）、SM（SM+无菌水注射）、CON-DIQ（基础日粮+Diquat 注射）、SS-DIQ（SS+Diquat 注射）、SM-DIQ（SM+Diquat注射）6组,每组8个重复,每个重复20枚。孵化第18d解剖取样分析,第21 d出雏期统计死胚率,获得主要结果如下:1)Diquat注射显着提高了鸡胚死亡率和肝细胞凋亡率,降低了肝脏总抗氧化能力（T-AOC）,增高了自由基（NO）及其氧化产物（蛋白质羰基）水平;组织切片H E染色显微观察显示肝细胞出现空泡化现象;电镜观察显示肝细胞电子密度降低、内质网核糖体脱落、线粒体内脊肿胀或消失现象。2)母源日粮加硒处理显着降低了鸡胚死亡率和肝细胞凋亡率,提高了鸡胚肝脏总抗氧化能力（T-AOC）、抗氧化酶（GPx,TrxR,CAT,γ-GCS）和氧化酶（MPO,XOD,MAO）及二相解毒酶（HO-1、NQO1）活性,降低了自由基（ROS,NO）及其氧化产物（蛋白质羰基,MDA）水平,升高细胞线粒体膜电位,增高抗凋亡蛋白Bcl-2而减低凋亡蛋白Caspase-3水平。由此表明,母源硒明显缓解了种蛋孵化后期Diquat诱导的急性氧化应激反应而降低鸡胚死亡率,SM总体效果明显强于SS。试验二:母源甲硒氨酸对鸡胚肝脏Keap1-Nrf2-ARE信号通路的调控作用在试验一的基础上,进一步探究了母源SM对鸡胚肝脏Keap1-Nrf2-ARE信号通路的影响,实验室分析结果表明:1)母源硒处理显着上调了肝细胞Nrf2 mRNA丰度、Nrf2蛋白表达量及其磷酸化水平,并促进Nrf2蛋白核转位;2)母源SM在一定程度上下调了鸡胚肝细胞20S蛋白酶体活性;增高了主要抗氧化硒酶（GPx1,TrxR）、二相解毒酶（NQO1,HQ1）mRNA丰度及其蛋白表达量。SM的上述总体效果明显优于SS。由此说明,SM能激活Keap1-Nrf2-ARE信号通路,增强Nrf2基因表达及其蛋白磷酸化,同时抑制Nrf2蛋白泛素化降解,进而提高下游基因抗氧化和二相解毒酶的基因表达。试验三:甲硒氨酸对鸡肝LMH细胞急性氧化应激损伤的的保护效果及Keap1-Nrf2-ARE信号通路的调控作用在体内试验的基础上,通过鸡肝LMH细胞体外培养试验,进一步验证SM对急性氧化应激损伤的保护效果及Keap 1-Nrf2-ARE信号通路的调控作用。3.1建立鸡肝LMH细胞急性氧化应激模型1)通过H2O2处理LMH细胞系24 h的实验结果表明:在0-1000μmol/L浓度内,随着H2O2浓度的升高,LMH细胞上清液LDH活性渐增,而细胞存活率渐降,两者呈显着的相关性。其中,1000 μmol/LH2O2处理组细胞存活率在50%左右,可满足后续实验需求。2)在10-100ng/ml浓度范围内,SS或SM同时处理24 h显着提高了 LMH细胞存活率和GPx活性;1000 ng/ml SS处理产生细胞毒性导致细胞死亡,而SM没有这一现象。其中,100 ng/ml硒添加具有最优效果,可满足后续实验要求。由此成功建立了 H2O2诱导的鸡肝LMH细胞急性氧化应激模型,H2O2适宜处理浓度为1000 μmol/ml,硒处理的最佳剂量为100ng/ml。3.2甲硒氨酸对鸡肝LMH细胞急性氧化应激损伤的的保护效果在实验3.1的基础上,深入研究结果表明:1)H2O2处理增加了 LMH细胞ROS、NO和MDA含量,增强了 Capase-3活性,诱导细胞凋亡,提高了 LMH细胞死亡率。2)SM处理能提高LMH细胞T-SOD活性及T-AOC水平,抑制ROS、NO和MDA的生成,升高细胞线粒体膜电位,降低Caspase-3水平和细胞死亡率。由此证实,SM明显缓解了由H2O2诱导的鸡肝LMH细胞急性氧化应激反应,SM总体效果明显强于SS。3.3甲硒氨酸对鸡肝LMH细胞Keap1-Nrf2-ARE信号通路的调控作用在试验3.2的基础上,同时探究了 SM对Keap1-Nrf2-ARE信号通路的调控作用。试验结果表明:SM处理能显着上调LMH细胞Nrf2 mRNA丰度,下调细胞20S蛋白酶体活性;增高GPx、TrxR、HO-1 mRNA丰度,以及GPx活性和TrxR含量。上述总体效果明显优于SS。由此进一步证实,SM能激活Keap1-Nrf2-ARE信号通路,抑制Nrf2蛋白泛素化降解,调控抗氧化硒酶和二相解毒酶的基因表达,从而达到缓解氧化应激的作用。3.4甲硒氨酸对LMH细胞抗氧化硒酶基因表达效率的影响在实验3.1和3.3的基础上,进一步研究结果表明:硒处理显着提高了 LMH细胞Keap2-Nrf2-ARE信号通路下游主要含硒酶（GPx、TrxR、SEPP）mRNA稳定性和蛋白合成速率,SM总体效果强于SS。由此提示,SM高效增强了主要抗氧化含硒酶的基因表达效率。综上所述,母源SM能通过高效激活Keap1-Nrf2-ARE信号通路,增强Nrf2基因表达及其蛋白磷酸化水平,同时抑制Nrf2蛋白泛素化降解,进而促进下游主要抗氧化含硒酶和二相解毒酶的基因表达,增强鸡胚抗氧化功能而缓解鸡胚急性氧化应激损伤,达到降低种蛋孵化后期死胚率的作用效果。
刘雅文[10]（2019）在《褪黑素在铅所致神经细胞毒性中的保护作用研究》文中提出目的:铅是工业上广泛运用的重金属,因其化学性质十分稳定,可在自然环境中长期稳定存在,故铅污染是我国面临的严重环境问题之一。铅对人体的多个系统均有毒性效应,其中尤以神经系统最为严重,然而目前铅所致神经毒性的机制尚未完全明确,有研究认为氧化应激是铅致神经毒性的关键因素。褪黑素（melatonin,MT）是目前市面上常见的膳食补充剂,研究发现其具有抗氧化、抗衰老、抗肿瘤等多项生理功能,但其是否能够减轻铅引起的神经损伤仍不清楚。本研究以PC12细胞作为研究对象探究褪黑素是否对铅所致神经毒性具有保护作用及其可能的机制。方法:用不同剂量的褪黑素（25μM、50μM、100μM、200μM、400μM或800μM）处理细胞,CCK-8实验检测各组细胞的存活率。PC12细胞分为对照组、25μM醋酸铅（Lead acetate,PbAc）染毒组、50μM MT处理组和50μM MT预处理+25μM PbAc组,处理24小时后CCK-8和LDH实验检测各组细胞存活率和损伤率;Hoechst染色实验检测细胞凋亡;免疫荧光法检测Cleaved-Caspase-3和细胞色素C（Cytochrome C,Cyto C）在细胞内的定位和表达;DCFH和Mito SOX荧光染料染色分别检测细胞内和线粒体中活性氧（Reactive oxidative species,ROS）含量;检测细胞内谷胱甘肽（Glutathione,GSH）含量和超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase,SOD）活力。为了探讨MT抗氧化作用的机制,采用Western Blot法检测核因子E2相关因子2（Nuclear factor erythroid 2-related factor 2,Nrf2）和血红素加氧酶-1（Heme oxygenase-1,HO-1）蛋白的表达。结果:CCK-8实验结果显示不同浓度MT对细胞存活率无明显影响,而PbAc处理可降低PC12细胞的存活率,且存活率的下降与PbAc的剂量呈正相关,25μM PbAc处理细胞24h可导致PC12细胞存活率降低至（66.16±8.73）%;而MT预处理后细胞存活率提高至（90.42±6.81）%（P<0.01）。与此结果相一致的是,LDH实验结果显示25μM PbAc处理细胞24h可导致细胞损伤率升高至（25.32±2.94）%,而MT预处理+PbAc组细胞损伤率则降低至（2.91±1.38）%（P<0.001）。Hoechst染色结果表明,PbAc组细胞凋亡率升高至（30.67±4.75）%,而MT预处理+PbAc组细胞凋亡率则降低至（18.15±1.55）%。免疫荧光染色结果表明,PbAc组的PC12细胞内凋亡相关蛋白Cleaved-Caspase-3含量增多,同时胞浆中Cyto C蛋白增多;MT则可抑制PbAc诱导的Cleaved-Caspase-3增多,并减少Cyto C在胞浆中的含量。荧光探针检测结果显示PbAc染毒处理细胞可导致胞浆内和线粒体ROS水平增加（P<0.001）,且细胞形态出现异常;而且细胞抗氧化能力下降,如GSH含量减少、SOD酶活力降低。MT处理则可显着降低细胞胞浆和线粒体ROS水平（P<0.001）,以及细胞内GSH含量和SOD酶活力均提高（P<0.05）。MT组细胞的细胞存活率、损伤率、ROS水平、凋亡相关蛋白和抗氧化物质均无明显变化。Western Blot实验发现50400μM MT可增加细胞内抗氧化蛋白Nrf2和HO-1的水平。结论:一定剂量的褪黑素可减轻铅引起的PC12细胞内氧化应激,并减少细胞死亡,对铅所致神经细胞毒性具有保护作用,其机制可能与激活Nrf2/HO-1通路有关。
二、Induction of the Expression of Heme Oxygenase Gene in PC12 Cellsby Hypoxia（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、Induction of the Expression of Heme Oxygenase Gene in PC12 Cellsby Hypoxia（论文提纲范文）
（1）额尔敦-乌日勒的活性成分分析及其对小胶质细胞基因调控作用的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略词 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 额尔敦-乌日勒的简介 |
| 1.1.1 额尔敦-乌日勒历史沿革 |
| 1.1.2 额尔敦-乌日勒研究进展 |
| 1.1.3 额尔敦-乌日勒所含单药化学成分的国内外研究进展 |
| 1.2 脑卒中简介 |
| 1.2.1 脑卒中分类及病因 |
| 1.2.2 缺血性脑卒中的主要病理生理机制 |
| 1.2.3 治疗脑卒中的策略 |
| 1.3 小胶质细胞简介 |
| 1.3.1 小胶质细胞简介 |
| 1.3.2 小胶质细胞的极化 |
| 1.3.3 小胶质细胞极化与信号通路 |
| 1.3.4 小胶质细胞与其它神经细胞的相互作用 |
| 1.3.5 作用于小胶质细胞的药物 |
| 1.4 中草药的研究方法及进展 |
| 1.5 立题依据及主要研究内容 |
| 1.5.1 立题依据 |
| 1.5.2 主要研究内容 |
| 1.5.3 创新性 |
| 第二章 额尔敦-乌日勒对大鼠大脑中基因表达调控作用及其活性成分的分析 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验材料 |
| 2.2.1 实验动物 |
| 2.2.2 主要试剂与耗材 |
| 2.2.3 主要仪器 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 动物饲养 |
| 2.3.2 MCAO模型 |
| 2.3.3 治疗组 |
| 2.3.4 收集样品,提取RNA和 RNA-seq |
| 2.3.5 序列过滤、比对和组装(Assembly) |
| 2.3.6 差异表达分析 |
| 2.3.7 EW的提取方法 |
| 2.3.8 建立数据库 |
| 2.3.9 UPLC-QTof-MS分析 |
| 2.4 实验结果 |
| 2.4.1 治疗后MCAO/R模型大鼠的神经功能评估 |
| 2.4.2 Illumina测序和参考基因组比对 |
| 2.4.3 EW处理后差异基因表达 |
| 2.4.4 EW-1 中神经活性成分分析 |
| 2.4.5 EW-2 中神经活性成分分析 |
| 2.4.6 EW-3 中神经活性成分分析 |
| 2.4.7 EW-4 中神经活性成分分析 |
| 2.4.8 EW-5 中神经活性成分分析 |
| 2.5 讨论 |
| 2.6 小结 |
| 第三章 额尔敦-乌日勒中活性小分子对小胶质细胞分泌的促炎型细胞因子的转录调控作用 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验材料 |
| 3.2.1 实验动物 |
| 3.2.2 细胞品系 |
| 3.2.3 主要试剂耗材 |
| 3.2.4 仪器设备 |
| 3.2.5 引物 |
| 3.2.6 主要试剂的配制 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 样品的提取制备 |
| 3.3.2 HPLC半制备分离 |
| 3.3.3 UPLC-QTof-MS分析 |
| 3.3.4 小鼠原代小胶质细胞的分离及培养 |
| 3.3.5 BV2 小胶质细胞培养 |
| 3.3.6 EW对小胶质细胞表达的促炎因子的影响 |
| 3.3.7 实时荧光定量PCR |
| 3.3.8 统计学分析 |
| 3.4 实验结果 |
| 3.4.1 EW不同溶剂提取物对Cxcl10 表达的下调作用 |
| 3.4.2 EW-5 半制备馏分的UPLC分析及其对促炎因子表达的下调作用 |
| 3.4.3 F4 半制备馏分的UPLC分析及其对促炎因子表达的下调作用 |
| 3.4.4 F4-6 中生物活性化学物质的分析及鉴定 |
| 3.4.5 木香烃内酯对小胶质细胞释放的促炎因子表达的影响 |
| 3.4.6 肉豆蔻醚对小胶质细胞释放的促炎因子表达的影响 |
| 3.4.7 土木香内酯对小胶质细胞中促炎因子表达的影响 |
| 3.4.8 亚麻酸对小胶质细胞中促炎因子表达的影响 |
| 3.5 讨论 |
| 3.6 小结 |
| 第四章 额尔敦-乌日勒中活性小分子土木香内酯和去氢二异丁香酚抑制小胶质细胞NF-κB信号通路 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验材料 |
| 4.2.1 细胞品系 |
| 4.2.2 主要试剂与耗材 |
| 4.2.3 主要仪器 |
| 4.2.4 引物 |
| 4.2.5 抗体 |
| 4.2.6 主要试剂的配置 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 样品的提取制备 |
| 4.3.2 UPLC-QTof-MS法对F4-6 定性分析 |
| 4.3.3 UPLC-QTof-MS法对F4-6中Ala和 Deh进行定量分析 |
| 4.3.4 细胞培养 |
| 4.3.5 细胞毒性测定 |
| 4.3.6 N2a细胞的细胞增值活力和神经突触生长测定 |
| 4.3.7 提取总RNA和 RT-q PCR |
| 4.3.8 蛋白免疫印迹(Western blot) |
| 4.3.9 统计学分析 |
| 4.4 实验结果 |
| 4.4.1 EW提取物中活性分子的Ala和 Deh的定性 |
| 4.4.2 F4-6 抑制LPS刺激的BV2 细胞促炎因子的表达 |
| 4.4.3 F4-6 促进BV2 细胞LPS刺激后抗炎基因表达 |
| 4.4.4 F4-6 的神经保护作用 |
| 4.4.5 F4-6对LPS诱导的BV2 细胞中NF-κB信号通路激活的影响 |
| 4.5 讨论 |
| 4.6 小结 |
| 第五章 天然产物小分子土木香内酯和去氢二异丁香酚对小胶质细胞基因表达的联合调控作用 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 实验材料 |
| 5.2.1 细胞品系 |
| 5.2.2 主要试剂与耗材 |
| 5.2.3 主要仪器 |
| 5.2.4 引物 |
| 5.3 实验方法 |
| 5.3.1 细胞培养 |
| 5.3.2 提取RNA和文库构建 |
| 5.3.3 序列过滤、比对和组装 |
| 5.3.4 差异表达分析 |
| 5.3.5 差异表达基因的GO和 KEGG富集分析 |
| 5.3.6 实时荧光定量PCR |
| 5.3.7 统计学分析 |
| 5.4 实验结果 |
| 5.4.1 Illumina测序和参考基因组比对 |
| 5.4.2 Ala、Deh和 Mix处理后的差异表达基因 |
| 5.4.3 DEG的GO富集分析 |
| 5.4.4 DEG的 KEGG代谢通路富集分析 |
| 5.4.5 通过RT-qPCR验证DEG数据 |
| 5.5 讨论 |
| 5.6 小结 |
| 第六章 总结与展望 |
| 参考文献 |
| 附录一 |
| 致谢 |
| 攻读博士期间发表的学术论文 |
（2）解毒益智方对阿尔茨海默病双转基因小鼠行为学及大脑皮层内β-淀粉样蛋白沉积及BACE1表达影响的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 英文缩略语 |
| 引言 |
| 文献综述 |
| 综述一 AD的病因病机及治疗进展 |
| 1 中医学对痴呆的系统认识及研究进展 |
| 1.1 中医学对痴呆病名由来及发展的认识 |
| 1.2 中医学对痴呆病因病机的古代认识 |
| 1.3 中医学对痴呆辨证论治及相关研究的认识 |
| 1.4 中医学对痴呆治疗的古今认识 |
| 综述二 西医学对AD的发病机制及治疗进展研究 |
| 1 现代医学对AD的认识及研究进展 |
| 1.1 AD的概述及流行病学 |
| 1.2 现代医学对AD发病因素的认识及研究 |
| 1.3 现代医学对AD发病相关机制的认识 |
| 2 现代医学对AD治疗的认识 |
| 2.1 乙酰胆碱酯酶抑制剂(AchEIs) |
| 2.2 兴奋性氨基酸受体拮抗剂 |
| 2.3 甘露特纳胶囊 |
| 2.4 其他非药物治疗 |
| 3 问题与展望 |
| 综述三 Aβ在脑内异常沉积的机制 |
| 1.Aβ的产生、分布与清除、传递与运输的研究进展 |
| 1.1 Aβ的产生 |
| 2 Aβ的清除 |
| 2.1 细胞的清除作用 |
| 2.2 Aβ被降解酶的清除作用 |
| 2.3 中枢Aβ的清除途径 |
| 2.4 血液成分介导的Aβ清除 |
| 综述四 解毒益智方在阿尔茨海默病中的应用 |
| 1 解毒益智方的创立 |
| 1.1 脑髓理论 |
| 1.2 髓虚毒损 |
| 1.3 补肾益髓,活血化痰解毒法 |
| 2 解毒益智方通过调节SIRT1/AMPK通路抑制BACE1表达改善Aβ的沉积 |
| 3 解毒益智方对阿尔茨海默病的临床应用 |
| 实验研究 |
| 第一章 CCP对Aβ25-35诱导的PC12细胞损伤保护性的研究 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第二章 JDYZF对APP/PS1双转基因小鼠行为学的研究 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第三章 JDYZF对APP/PS1双转基因小鼠脑内Aβ水平变化的影响 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第四章 JDYZF对APP/PS1双转基因小鼠脑内BACE1表达的影响 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 结论 |
| 本文创新点 |
| 参考文献 |
| 附录1 |
| 致谢 |
| 在学期间主要研究成果 |
| 个人简介 |
（3）基于Nrf2/ARE信号通路研究抵当汤调节线粒体自噬改善脑出血后神经损伤的作用机制（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 英文缩略语 |
| 引言 |
| 文献综述 |
| 综述一:中医学对出血性中风的研究概述 |
| 综述二:脑出血的现代医学研究进展 |
| 综述三:线粒体与脑出血后继发脑损伤的研究进展 |
| 实验研究 |
| 第一章 抵当汤对脑出血模型大鼠和CoCl_2诱导的PC12细胞模型的神经保护作用 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 讨论 |
| 5 实验小结 |
| 第二章 抵当汤对脑出血模型大鼠和CoCl_2诱导的PC12细胞模型线粒体功能的影响 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第三章 抵当汤对脑出血模型大鼠和CoCl_2诱导的PC12细胞模型线粒体自噬的影响 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第四章 抵当汤对CoCl_2诱导的PC12细胞模型Nrf2/ARE信号通路的影响 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 本文创新点 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 在学期间主要研究成果 |
| 个人简介 |
（4）20（R）-人参皂苷Rg3调控Nrf2通路抑制线粒体氧化应激抗脑缺血再灌注损伤的研究（论文提纲范文）
| 缩略词表 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 人参皂苷氧化应激损伤作用及其作用机制的研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间获得的学术成果 |
| 致谢 |
（5）海马过表达Gαq改善衰老小鼠学习记忆能力的机制研究（论文提纲范文）
| 缩略词表 |
| 中文摘要 |
| abstract |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 Nrf2-ARE信号通路与阿尔兹海默病发生发展及防治研究的新进展 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间获得的学术成果 |
| 致谢 |
（6）靶向Nrf2的小分子在神经保护中的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 Keap1/Nrf2/ARE通路介绍及其分子作用机制 |
| 1.3 Keap1/Nrf2/ARE通路与神经系统疾病 |
| 1.4 Keap1/Nrf2/ARE通路与癌症 |
| 1.5 小分子Nrf2 调节剂 |
| 1.6 研究内容 |
| 参考文献 |
| 第二章 几种小分子化合物对PC12 细胞的保护作用研究 |
| 2.1 硫辛酰胺的神经保护效果研究 |
| 2.2 燕麦酰胺类似物抵抗氧化应激对PC12 细胞进行双重保护 |
| 2.3 二苯并吡喃酮衍生物通过激活抗氧化防御系统来减轻氧化应激诱导的神经毒性 |
| 2.4 小白菊内酯通过调节Keap1/Nrf2/ARE信号通路来发挥神经保护作用 |
| 2.5 异硫氰酸烯丙酯通过激活Nrf2/ARE信号通路保护PC12 细胞免受氧化损伤 |
| 参考文献 |
| 第三章 IM3829 衍生物激活PC12 细胞中Nrf2/ARE通路 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 结果分析 |
| 3.3 结果讨论 |
| 参考文献 |
| 第四章 实验材料和方法 |
| 4.1 生物部分 |
| 4.2 化学部分 |
| 参考文献 |
| 第五章 总结与展望 |
| 5.1 总结 |
| 5.2 展望 |
| 参考文献 |
| 谱图 |
| 在学期间的科研成果 |
| 致谢 |
（7）鼠尾草酸抑制铁死亡减轻脊髓损伤的实验研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 第一部分 大鼠脊髓损伤模型中铁死亡表现的实验研究 |
| 1 研究内容与方法 |
| 1.1 研究对象 |
| 1.2 内容与方法 |
| 1.3 统计分析 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第二部分 鼠尾草酸抑制铁死亡减轻PC12 细胞损伤的实验研究 |
| 1 研究内容与方法 |
| 1.1 研究对象 |
| 1.2 内容与方法 |
| 1.3 统计分析 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第三部分 鼠尾草酸抑制铁死亡的分子机制研究 |
| 1 研究内容与方法 |
| 1.1 研究对象 |
| 1.2 内容与方法 |
| 1.3 统计方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第四部分 鼠尾草酸改善大鼠脊髓损伤的实验研究 |
| 1 研究内容与方法 |
| 1.1 研究对象 |
| 1.2 内容与方法 |
| 1.3 统计方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 综述 铁死亡在创伤性脑和脊髓损伤中的研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间获得的学术成果 |
| 个人简介 |
| 导师评阅表 |
（8）α7nAChR激动剂PHA568487对大鼠肾脏缺血再灌注损伤的保护作用及机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 本文创新和主要贡献 |
| 中英文对照 |
| 前言 |
| 第一部分 α7nAChR激动剂PHA568487对大鼠肾缺血-再灌注损伤的影响 |
| 1.1 材料与方法 |
| 1.1.1 实验试剂及厂家 |
| 1.1.2 器材及厂家 |
| 1.1.3 动物实验分组及大鼠I/R模型的建立 |
| 1.1.4 分离和收集血液样本 |
| 1.1.5 大鼠一般状态观察、肾功能分析和肾组织结构形态学变化观察 |
| 1.1.6 检测血清中C反应蛋白(C-reactiveprotein,CRP)及肿瘤坏死因子-α( tumor necrosis factor α,TNF-α)的水平 |
| 1.1.7 检测血清中IL-1β、IL-6水平 |
| 1.1.8 大鼠肾组织标本的制备 |
| 1.1.9 高碘酸-雪夫氏染色(Periodic Acid-Schiff stain,PAS) |
| 1.1.10 TUNEL检测 |
| 1.1.11 检测Bax、Bcl-2、Caspase-3 mRNA表达情况 |
| 1.1.12 检测Bax、Bcl-2、Caspase-3蛋白表达情况 |
| 1.1.13 统计学分析 |
| 1.2 结果 |
| 1.2.1 大鼠一般情况观察 |
| 1.2.2 大鼠肾功能检测 |
| 1.2.3 大鼠肾组织结构形态学变化 |
| 1.2.4 检测大鼠血清CRP、TNF-α、IL-1β、IL-6水平 |
| 1.2.5 各组大鼠肾组织细胞凋亡检测 |
| 1.2.6 各组大鼠肾组织中Bax、Bcl-2、Caspase-3 mRNA表达情况 |
| 1.2.7 各组大鼠肾组织中Bax、Bcl-2、Caspase-3蛋白表达情况 |
| 1.3 讨论 |
| 第二部分 α7nAChR激动剂PHA568487激活Nrf2/HO-1信号通路抑制缺血再灌注HK-2细胞模型凋亡的机制研究 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 实验试剂及厂家 |
| 2.1.2 器材及厂家 |
| 2.1.3 细胞培养 |
| 2.1.4 缺氧/复氧细胞模型的建立 |
| 2.1.5 检测mRNA和蛋白表达情况 |
| 2.1.6 细胞增殖活性检测 |
| 2.1.7 细胞凋亡检测 |
| 2.1.8 统计学分析 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 检测细胞增殖活性 |
| 2.2.2 检测细胞凋亡 |
| 2.2.3 检测Nrf2、HO-1、Caspase-3、Bax、Bcl-2 mRNA表达情况 |
| 2.2.4 检测Nrf2、HO-1、Caspase-3、Bax、Bcl-2蛋白表达情况 |
| 2.3 讨论 |
| 第三部分 PHA568487调节Circular RNAYAP1对肾缺血-再灌注损伤细胞的影响 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 实验试剂及厂家 |
| 3.1.2 器材及厂家 |
| 3.1.3 细胞培养及I/R模型的建立 |
| 3.1.4 细胞转染 |
| 3.1.5 检测细胞活力 |
| 3.1.6 检测细胞凋亡 |
| 3.1.7 检测细胞分析的IL-1 β、IL-6浓度 |
| 3.1.8 检测活性氧(ROS)水平 |
| 3.1.9 荧光素酶报告基因实验 |
| 3.1.10 统计学分析 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 在I/R处理HK-2细胞模型中,PHA568487促进circYAP1表达 |
| 3.2.2 过表达circYAP1减轻HK-2细胞的炎症损伤 |
| 3.2.3 CircYAP1靶向调节miR-21 -5p |
| 3.2.4 CircYAP1通过吸附miR-21-5p参与HK-2细胞的炎症损伤 |
| 3.2.5 在炎症损伤的HK-2细胞中,circYAP1通过吸附miR-21-5p激活PI3K/AKT/mTOR信号通路 |
| 3.3 讨论 |
| 结论 |
| 附录 |
| 参考文献 |
| 综述 肾缺血再灌注损伤发生机制及其研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读博士学位期间发表的学术论文及专利 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
| 附件 |
（9）肉种鸡饲用甲硒氨酸降低种蛋孵化后期死胚率的机理研究（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 主要英文缩略词 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 文献综述 |
| 第一节 硒的概况 |
| 1.1 硒的存在形式与生物学功能 |
| 1.2 硒与硒蛋白 |
| 1.3 甲硒氨酸研究进展 |
| 第二节 母体效应 |
| 2.1 母体效应简介 |
| 2.2 禽类母体效应相关研究进展 |
| 2.3 硒的母体效应 |
| 第三节 种蛋孵化和氧化应激 |
| 3.1 鸡胚发育过程 |
| 3.2 种蛋孵化与氧化应激 |
| 3.3 机体抗氧化防御系统 |
| 3.4 机体抗氧化信号通路 |
| 3.5 应对氧化应激的措施 |
| 第四节 本研究的意义与内容 |
| 4.1 本研究的目的与意义 |
| 4.2 本研究的主要内容和技术路线 |
| 第二章 母源甲硒氨酸对鸡胚急性氧化损伤的保护作用 |
| 第一节 鸡胚急性氧化应激模型构建 |
| 1.1 材料与方法 |
| 1.2 结果与分析 |
| 1.3 讨论与小结 |
| 第二节 母源甲硒氨酸对急性氧化应激鸡胚的保护作用 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.2 结果与分析 |
| 2.3 讨论与小结 |
| 第三章 母源甲硒氨酸对鸡胚肝脏Keap1-Nrf2-ARE信号通路的调控作用 |
| 1.1 材料方法 |
| 1.2 结果与分析 |
| 1.3 讨论与小结 |
| 第四章 甲硒氨酸对鸡肝LMH细胞急性氧化应激损伤的保护效果及Keap1-Nrf2-ARE信号通路的调控作用 |
| 第一节 鸡肝LMH细胞系氧化应激模型构建 |
| 1.1 材料与方法 |
| 1.2 结果与分析 |
| 1.3 讨论与小结 |
| 第二节 甲硒氨酸对鸡肝LMH细胞急性氧化应激损伤的保护作用 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.2 结果与分析 |
| 2.3 讨论与小结 |
| 第三节 甲硒氨酸对鸡肝LMH细胞Keap1-Nrf2-ARE信号通路调控作用 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.3 讨论与小结 |
| 第四节 甲硒氨酸对鸡肝LMH细胞抗氧化硒酶基因表达效率的影响 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.2 结果与分析 |
| 4.3 讨论与小结 |
| 第五章 全文讨论 |
| 第六章 结论、创新点和研究展望 |
| 1.1 主要结论 |
| 1.2 创新点 |
| 1.3 研究展望 |
| 参考文献 |
（10）褪黑素在铅所致神经细胞毒性中的保护作用研究（论文提纲范文）
| 全文缩写词 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 设备 |
| 1.3 细胞培养 |
| 1.4 细胞处理 |
| 1.5 CC-8 实验检测细胞存活率 |
| 1.6 LDH实验检测细胞损伤率 |
| 1.7 Hoechst染色检测细胞凋亡率 |
| 1.8 免疫荧光检测Cleaved-Caspase-3和Cyto C的表达 |
| 1.9 荧光染色检测细胞和线粒体内ROS水平 |
| 1.10 蛋白提取 |
| 1.11 蛋白定量 |
| 1.12 Western Blot检测Nrf2和HO-1 蛋白水平 |
| 1.13 GSH含量测定 |
| 1.14 SOD酶活力测定 |
| 1.15 统计分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 褪黑素减少铅所致PC12 细胞死亡 |
| 2.2 褪黑素减少铅所致PC12 细胞核损伤 |
| 2.3 褪黑素抑制Cleaved-Caspase-3 激活和Cyto C释放 |
| 2.4 褪黑素抑制铅所致PC12 细胞ROS水平升高 |
| 2.5 褪黑素抑制铅所致GSH含量减少和SOD酶活力下降 |
| 2.6 褪黑素提高PC12 细胞HO-1 和胞核Nrf2 蛋白的水平 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
四、Induction of the Expression of Heme Oxygenase Gene in PC12 Cellsby Hypoxia（论文参考文献）
- [1]额尔敦-乌日勒的活性成分分析及其对小胶质细胞基因调控作用的研究[D]. 其布日. 内蒙古大学, 2021(11)
- [2]解毒益智方对阿尔茨海默病双转基因小鼠行为学及大脑皮层内β-淀粉样蛋白沉积及BACE1表达影响的研究[D]. 朱晓婷. 长春中医药大学, 2021(01)
- [3]基于Nrf2/ARE信号通路研究抵当汤调节线粒体自噬改善脑出血后神经损伤的作用机制[D]. 吴子菁. 长春中医药大学, 2021(01)
- [4]20（R）-人参皂苷Rg3调控Nrf2通路抑制线粒体氧化应激抗脑缺血再灌注损伤的研究[D]. 陈德云. 昆明医科大学, 2021
- [5]海马过表达Gαq改善衰老小鼠学习记忆能力的机制研究[D]. 罗浩丹. 昆明医科大学, 2021(01)
- [6]靶向Nrf2的小分子在神经保护中的研究[D]. 侯亚男. 兰州大学, 2021(09)
- [7]鼠尾草酸抑制铁死亡减轻脊髓损伤的实验研究[D]. 程杰. 新疆医科大学, 2021(08)
- [8]α7nAChR激动剂PHA568487对大鼠肾脏缺血再灌注损伤的保护作用及机制研究[D]. 黄涛. 山东大学, 2020(04)
- [9]肉种鸡饲用甲硒氨酸降低种蛋孵化后期死胚率的机理研究[D]. 李凯旋. 浙江大学, 2020(01)
- [10]褪黑素在铅所致神经细胞毒性中的保护作用研究[D]. 刘雅文. 华中科技大学, 2019(01)