一、自制缝合针模板在眼科的应用（论文文献综述）
张婷[1]（2021）在《转基因兔乳汁中重组吸血蝙蝠唾液纤溶酶原激活剂的纯化、结构分析和药效研究》文中研究指明近年来,血栓性疾病越发受到关注,临床上有逐年渐增之势,严重威胁人类的生命健康。用溶栓药消除血栓是一种临床常用的方法。现有的溶栓药虽然有明确的治疗效果,但也存在治疗窗口期窄,用药量大,纤维蛋白特异性低,再灌注率低,系统出血率高,半衰期短,副作用大等问题。而纤维蛋白特异性高,溶栓效率高,出血风险低,半衰期长,毒副作用低的吸血蝙蝠唾液纤溶酶原激活剂（Desmodus rotundus salivary plasminogen activator alpha 1,DSPAα1）又称去氨普酶（desmoteplase）,有望成为新型、高效的溶栓药物。本研究应用哺乳动物转基因技术,在获得了乳腺特异性表达重组DSPA（recombinant DSPA,rDSPA）转基因兔的基础上,收集兔乳中的表达产物,应用自制的单克隆抗体,用于兔乳的ELISA和Western-blot检测;建立从转基因兔乳汁中分离和纯化rDSPA的方法;对rDSPA进行一级结构和生物活性分析,包括N端和C端氨基酸序列、相对分子量以及体外溶纤活性;应用角叉菜胶制备大鼠尾部血栓模型,并通过此血栓模型研究纯化产物rDSPA的体内溶栓效果及血浆半衰期。1.乳腺特异性表达rDSPA转基因兔的传代繁殖两只原代兔经扩群繁殖、近交和回交,获得乳腺特异性表达rDSPA转基因兔134只,其中经测交确定纯合子兔2只（F2代）。收集兔乳,离心分离乳清,经ELISA检测,兔乳中rDSPA表达水平为1.19±0.26 mg/mL,纤维平板溶圈法（Fibrin Agarose Plate Assay,FAPA）检测F0代、F1代、F2代转基因兔乳清中DSPA的溶纤活性,溶圈直径大小基本一致（18.6-20.4 mm）,结果表明外源基因rDSPA能稳定遗传给后代,此外培育出的纯合子兔能免除繁琐的基因型检测工作量,为rDSPA的转基因兔的保种提供了保障。2.原核表达去氨普酶（DSPA）基因载体的构建采用分子生物学技术,用PCR法扩增pCL25/DSPA表达载体上的编码DSPAαl成熟肽的DNA序列,用于与原核表达载体连接,构建pET-28a/DSPA原核表达载体。pET-28a/DSPA原核表达载体转入Rosetta感受态细胞,进行诱导表达目的蛋白。SDS-PAGE电泳估测大小约为50 kDa。目的蛋白纯化后纯度为92%,远远满足其作为制备rDSPA单克隆抗体的免疫原的纯度要求。3.rDSPA单克隆抗体制备及筛选纯化的原核表达产物加弗氏佐剂免疫BALB/c小鼠,分离B淋巴细胞与SP2/0细胞融合,筛选获得阳性杂交瘤细胞株,分泌PR-mAb杂交瘤细胞注入同系小鼠腹腔制备抗体。本研究共得到36株阳性杂交瘤细胞,从中筛选出12株稳定分泌抗体的细胞株（命名M1-M12）。经ELISA-elution筛选,其中M3、M4两株为多羟基反应单克隆抗体（PR-mAb）,筛选率为16.67%（2/12）。注射M3和M4细胞株的小鼠腹水的抗体效价为1:125000,腹水抗体可用于ELISA和western blot检测。4.转基因兔乳中rDSPA的分离、纯化小鼠腹水抗体经rProtein A亲和层析柱纯化后与CNBr-activated Bestarose 4 FF介质偶联制成免疫亲和层析柱。rDSPA转基因兔乳经超速离心和硫酸铵沉淀预处理后。分别选用自制免疫亲和层析、苯甲醚亲和层析、阳离子交换层析、赖氨酸亲和层析和活性蓝亲和层析纯化rDSPA。结果表明rDSPA转基因兔乳通过超速离心、55%硫酸铵沉淀、苯甲醚亲和层析、阳离子交换层析、赖氨酸亲和层析和活性蓝亲和层析分离纯化,获得纯度为98%的rDSPA。运用阴离子交换层析去除纯化产物中的内毒素,使用内毒素检测试剂盒检测结果表明纯化rDSPA内毒素含量低于0.015 EU/mL,符合注射剂标准。5.乳腺特异性表达rDSPA纯化产物的结构和功能检测运用Edman降解法测定rDSPA的N端氨基酸序列,结果显示rDSPA的N端氨基酸序列为 Val Ala Cys Lys Asp Glu IIe Thr Gln Met Thr Tyr Arg Arg Gln,与设计的 DSPA编码序列的理论N端的第4-18位氨基酸序列完全一致,表明rDSPA编码序列N-端的山羊β-乳球蛋白（β-lactoglobulin）的信号肽已完全切除;运用液相色谱-质谱/质谱联用技术（LC-MS/MS）测定rDSPA的C端氨基酸序列及其它部分的氨基酸序列,结果显示 rDSPA 的 C 端氨基酸序列为 Asp Val Pro Gly Val Tyr Thr Lys Tyr Leu Gly Trp IIe Arg Asp Asn Met His Leu,与设计的rDSPA编码序列的C末端完全一致,共有47%（208个氨基酸）的序列与DSPA编码序列完全同源。经高分辨率质谱仪检测后确定rDSPA的相对分子量为53126.75 Da,大于理论的49535.94 Da,推测是翻译后的糖基化修饰导致;运用纤维平板溶圈法（FAPA）检测纯化产物rDSPA的体外纤溶活性（773333 IU/mg）略高于阿替普酶（580000 IU/mg）。6.rDSPA体内外溶栓效果的初步评价SD大鼠腹主动脉采血,血凝块切成约0.1 cm3方块并称重,分成7组（0.5 μg/mL、1 μg/mL、2 μg/mL DSPA;0.5 μg/mL、1 μg/mL、2 μg/mL 阿替普酶;生理盐水）,37℃孵育16 h,称重剩余血凝块并计算血凝块溶解率。结果显示rDSPA体外大鼠血凝块溶解率（48.34±2.25%）明显高于阿替普酶组（40.91±1.36%）的血凝块溶解率（p<0.05）,表明rDSPA体外溶栓活性强于阿替普酶。8周龄的雄性SD大鼠随机分成4组,每组6只,分成低、中、高剂量rDSPA组（2 mg/kg、8 mg/kg、32mg/kg）和阿替普酶组（8 mg/kg）,安慰剂组,空白对照组。各组大鼠心脏采血检测凝血活酶时间（APTT）、凝血酶原时间（PT）、凝血酶时间（TT）,纤维蛋白原（FIB）和D-二聚体,同时测量大鼠尾部血栓长度。结果显示rDSPA有显着的溶栓效果,rDSPA低（APTT:18.80±1.26 s;TT:35.75±0.41 s）、中（APTT:27.78±1.88 s;TT:39.18±0.82 s）、高（APTT:36.51±1.29 s;TT:37.56±1.07 s）剂量组和阿替普酶组（APTT:27.00±1.76 s;TT:34.05±0.99 s）的 APTT、TT 均较安慰剂组（APTT:12.53±0.54 s;TT:26.87±1.31 s）相比有所延长,且差异极显着（p<0.01）,rDSPA 中（PT:14.28±0.79 s;D-二聚体:2.49±0.07 mg/L）、高（PT:17.07±1.19 s;D-二聚体:3.12±0.55 mg/L）剂量组和阿替普酶组（PT:14.26±0.93 s;D-二聚体:2.53±0.12 mg/L）的PT、D-二聚体水平均比安慰剂组（PT:12.29±0.76 s;D-二聚体:2.30±0.07 mg/L）显着升高（p<0.05）,表明大鼠注射rDSPA和阿替普酶后都有效激活纤溶系统。阿替普酶组（200.22±6.09mg/dL）较rDSPA低（222.40±7.89 mg/dL）、中（228.30±1.72mg/dL）、高（228.19±1.89mg/dL）剂量组的 FIB 水平较有所下降（p<0.05）,rDSPA低、中、高剂量组之间的FIB水平差异不显着,表明rDSPA在溶栓过程中FIB消耗量小于阿替普酶,相比阿替普酶不易引起颅内出血副作用,更具有安全性。rDSPA低（48.96±9.42%）、中（24.71±6.26%）、高（0.00±0.00%）剂量组和阿替普酶组（49.19±6.21%）的大鼠尾栓相对长度百分比明显小于安慰剂组（67.76±6.06%）,即rDSPA低、中、高剂量组的尾栓消溶相对长度明显长于安慰剂组,并与剂量成正比例,且rDSPA高剂量组大鼠尾部不形成血栓。相同剂量的rDSPA中剂量组（24.71±6.26%）和阿替普酶组（49.19±6.21%）的大鼠尾栓相对长度百分比差异极显着（p<0.01）,表明纯化产物rDSPA的溶栓能力明显优于阿替普酶。8周龄的SD雄性大鼠随机分成2组,每组4只,分为rDSPA组和阿替普酶组。rDSPA组和阿替普酶组均以8 mg/kg的剂量尾静脉注射rDSPA或阿替普酶,采集血浆进行纤溶酶-抗纤溶酶复合物（PAP）的测定,计算rDSPA半衰期。结果显示rDSPA组和阿替普酶组大鼠血浆PAP浓度分别在6 min及3 min达到顶峰（133.06±63.90 ng/mL,219.44±1.18 ng/mL）,rDSPA和阿替普酶在SD大鼠体内的血浆半衰期分别为52.41 min和10.41 min。推算rDSPA的半衰期较阿替普酶延长5倍,表明rDSPA可用于单次注射针剂溶栓药的制备。综上所述,本研究成功培育出乳腺特异性表达rDSPA转基因兔,且rDSPA转基因兔具有较高的表达水平,建立了有效的分离纯化的实验室工艺,并保持原有的溶纤溶栓活性,表明该研究迈出临床应用的第一步。rDSPA的一级结构分析表明,重组DSPA编码序列可以在转基因兔乳腺上皮细胞中表达,并剪切去除异源性的信号肽序列,翻译后加工为有溶栓活性的成熟蛋白,这一结果在国内外尚未见报道。大鼠体内外溶栓试验中rDSPA表现出优于阿替普酶的溶栓性能,且rDSPA在大鼠体内的半衰期长于阿替普酶,体内溶栓试验呈现出更安全、更持续的溶栓效果,该结果在国内外也未见报道。本研究成果为开发和生产新的高效溶栓药奠定了实验基础。
王宝剑[2]（2021）在《基于“阳化气，阴成形”理论研究TGF-β1/Smads影响黄韧带肥厚的机制及模型的建立》文中研究指明黄韧带肥厚（Ligamentum flavum hypertrophy,LFH）是退行性腰椎管狭窄症（Degenerative Lumbar Spinal Stenosis,DLSS）的主要病理表现之一。黄韧带（ligamentum flavum,LF）位于上、下椎板之间,从颈椎延伸至骶椎,起到保护和稳定脊柱的作用。黄韧带在纤维化过程中一方面是其自身体积发生增厚的改变,另一方面是其自身弹性的下降在脊柱后伸时出现皱褶、折叠,使椎管容积减小,导致马尾神经、神经根的受压和缺血缺氧。与此同时,肥厚黄韧带中增多的炎性介质会透过硬脊膜而扩撒至神经根,易造成神经根的炎症及水肿。另外,炎性介质还可以激活多种纤维化因子的表达而加速纤维化的进程。因此黄韧带炎症与纤维化的病理改变共同参与、相互影响而导致了 DLSS腰腿痛、间歇性跛行的症状。在退行性脊柱疾病的促炎细胞因子中,IL-1β、TNF-α是最主要的参与者,其在肥厚黄韧带中的高表达已得到初步证实,另外TGF-β 1/Smads被认为是引起纤维化的最重要的信号传导通路,它在各种组织与器官的纤维化和瘢痕组织纤维性修复过程中有着核心的推动作用。但目前关于黄韧带炎性或纤维化信号通路的研究较少。至于Smads通路是否可以介导TGF-β1致使细胞外基质沉积而导致黄韧带的肥厚,以及IL-1β、TNF-α和TGF-β 1/Smads通路中的相关原件与黄韧带厚度、纤维化程度的具体相关性尚未见报道。而在中医机制方面,“阳化气,阴成形”理论对黄韧带肥厚的病机阐明具有重要指导作用,该理论与现代医学“炎症-纤维化”的病理机制相契合。但目前尚无从该角度探讨黄韧带肥厚的报道。黄韧带肥厚动物模型的建立是研究退行性脊柱疾病的基础,也是探索黄韧带增厚机制、发现药物潜在治疗靶点的前提。但极少数研究涉及腰椎黄韧带肥厚动物模型的制作,对于该动物模型目前仍存在争议。实验一基于“阳化气,阴成形”理论研究IL-1β、TNF-α和TGF-β1/Smads在LFH中的表达及相关性目的:通过对比增厚黄韧带与未增厚黄韧带的纤维化程度以及IL-1β、TNF-α和TGF-β 1/Smads通路相关原件的表达水平,探索黄韧带厚度与纤维化程度和以上原件表达的具体相关性,初步证实Smads通路可以介导TGF-β1致使细胞外基质沉积而导致黄韧带肥厚。从“阳化气,阴成形”理论角度阐述黄韧带肥厚的中医病机,以期为中医药干预黄韧带“炎症-纤维化”病理过程提供理论支持。方法:（1）在取得医学伦理批准和患者知情同意的前提下,在临床手术中收集废弃的DLSS组增厚黄韧带和腰椎间盘突出症（Lumbar disc herniation,LDH）组未增厚黄韧带,各25例。（2）通过MRI测量两组黄韧带的厚度并对比其差异。（3）对两组标本组织进行HE染色组织学观察。（4）进行Masson三色法染色后,通过纤维化分级标准以及弹性纤维-胶原纤维比值来对比两组黄韧带总体与各层（腹侧层、中间层、背侧层）纤维化程度的差异。（5）免疫组化法检测两组黄韧带IL-1β、TNF-α、TGF-β 1/Smads（TGF-β1、p-Smad2/3、Smad7）、collagen Ⅰ（Col 1）、collagen Ⅲ（Col 3）的定位、半定量表达。（6）Real-Time PCR 法检测两组黄韧带 IL-1β、TNF-α、TGF-β1/Smads（TGF-β1、Smad2、Smad3、Smad7）、Col1 和 Col 3 mRNA 的定量表达。（7）相关性研究:通过pearson相关与线性回归分析明确DLSS组黄韧带的厚度与其各层纤维化程度、mRNA表达的具体相关性。结果:（1）DLSS 组的黄韧带厚度为 5.13±0.80mm,大于 LDH 组 3.52±0.67mm（p<0.01）。（2）HE染色下,LDH组的未增厚黄韧带弹性纤维呈直线状,排列紧密且整齐,表面光滑连续,以弹性纤维为主,含有少量胶原纤维,细胞数目较少。DLSS组增厚的黄韧带纤维呈波浪状,排列紊乱、疏松,弹性纤维减少,胶原纤维含量增加,成纤维细胞增多。（3）DLSS组的总体纤维化分级为2.44±0.31级,高于LDH组的1.62±0.22级（p<0.05）;DLSS组腹侧层、中间层、背侧层的纤维化分级均高于LDH组（p<0.05或p<0.01或p<0.001）;DLSS组腹侧层、中间层、背侧层的纤维化分级是逐渐递增的,即腹侧层<中间层<背侧层（p<0.05或p<0.01）;DLSS组的弹性纤维-胶原纤维面积比值为1.85±0.54,低于LDH组的2.92±0.37（p<0.01）;DLSS组腹侧层、中间层、背侧层的弹性-胶原纤维比值均低于LDH组（p<0.05或p<0.01）;DLSS组腹侧层、中间层、背侧层的弹性-胶原纤维比值是逐渐递减的,即腹侧层>中间层>背侧层（p<0.05或p<0.01）。（4）免疫组化:DLSS 组的 IL-1 β、TNF-α、TGF-β 1、p-Smad2/3、Col 1和Col 3的蛋白表达均高于LDH组（p<0.05或p<0.01或p<0.001）。DLSS组的Smad7的蛋白表达低于LDH组（p<0.01）。（5）Real-Time PCR:DLSS 组 IL-1β、TNF-α、TGF-β1、Smad2、Smad3、Col 1 和 Col 3 的 mRNA 表达高于 LDH 组（p<0.05 或 p<0.01 或 p<0.001）。DLSS 组 Smad7 的 mRNA 表达低于 LDH 组（p<0.05）;DLSS 组的 IL-1β、TGF-β1、Smad2、Smad3、Col 1和Col 3的mRNA表达在背侧层最高,腹侧层最低,有从背侧层向腹侧层逐渐递减的趋势。Smad7的mRNA表达在背侧层最低,腹侧层最高,有从背侧层向腹侧层逐渐递增的趋势。（6）在DLSS组中,黄韧带腹侧层、中间层以及背侧层的纤维化分级随着黄韧带的厚度的增加而升高。各层的相关系数r分别为0.54,0.73,0.84,说明黄韧带的厚度与背侧层纤维化分级的相关程度最高。黄韧带腹侧层、中间层以及背侧层的弹性纤维-胶原纤维比随着黄韧带的厚度的增加而降低。各层的相关系数r分别为-0.62,-0.72,-0.81,说明黄韧带的厚度与背侧层弹性-胶原纤维比值的相关程度最高。（7）在DLSS组中,黄韧带厚度与背侧层TGF-β 1 mRNA表达的相关程度最高,其次依次为IL-1 β、Col 1等;黄韧带厚度与中间层IL-1 β mRNA表达的相关程度最高,其次依次为Smad7、TGF-β 1等;黄韧带厚度与腹侧层TGF-β 1 mRNA表达的相关程度最高,其次依次为为IL-1 β、Col 3等。结论:（1）相较于未增厚黄韧带,肥厚黄韧带中TGF-β1、Smad2、Smad3（或p-Smad2/3）、Col 1和Col3的mRNA和蛋白均呈高表达,Smad7的mRNA和蛋白呈低表达。初步证实Smads通路可以介导TGF-β1致使细胞外基质沉积而导致黄韧带肥厚。（2）在肥厚黄韧带中,背侧层的纤维化程度大于中间层和腹侧层。其厚度也与各层的纤维化程度呈正线性相关,且以背侧层相关性最高,中间层次之,最后是腹侧层。在肥厚黄韧带中,IL-1β、TNF-α、TGF-β1、Smad2、Smad3、Col 1和Col 3 mRNA表达均高于中间层和腹侧层,Smad7 mRNA表达低于中间层和腹侧层。其厚度也与各层的mRNA表达呈正线性（或负线性）相关,且以背侧层相关性最高,中间层次之,最后是腹侧层。说明黄韧带炎症与纤维化的严重程度由背侧向腹侧逐渐递减,其病理改变可由背侧向腹侧逐渐发展。（3）结合“阳化气,阴成形”理论认为,黄韧带在增龄、急性创伤、慢性劳损等因素作用下易出现微损伤,并诱导了局部炎症反应,当机体处于“阴平阳秘”的生理状态时,这种损伤尚能引发适度的炎症反应,以及正常的纤维化修复和瘢痕的形成,而当机体处于阴阳失衡、阳不化气状态时,持续的炎症反应使细胞因子、趋化因子等代谢产物长期聚集于黄韧带局部,形成了炎症微环境,从而诱发了过度的纤维化修复和瘢痕的形成。该中医理论与现代医学中炎症反应诱发过度的纤维化修复和瘢痕形成的理论相类似。实验二基于三种造模方法诱导大鼠黄韧带肥厚动物模型的建立与评价目的:建立一种新的黄韧带肥厚大鼠模型,并将其与人肥厚黄韧带组织进行比较、评估。同时,探讨腰椎活动范围的增加所诱发黄韧带增厚的机制。方法:（1）将72只大鼠分为A假手术组（切开皮肤等组织后缝合）、B肌肉切除组（切除L5-L6椎旁肌肉）、C骨关节切除组（切除L5-L6棘突和棘上韧带,磨除L5/6双侧关节突关节的一半,关节囊不做缝合处理）以及D肌肉+骨关节切除组（B+C混合）共4组,于造模后的4w、8w、12w共3个时间点取材。（2）通过对黄韧带的HE染色和Masson染色,测量L5/6节段黄韧带总体和背侧层的厚度以及弹性纤维-胶原纤维的比值。（3）通过X线片测量屈曲和背伸位时L5/6节段的活动范围和椎间隙高度。（4）通过免疫组化、免疫印迹、Real-Time PCR法检测黄韧带中炎性因子(IL-1β、TNF-α、TGF-β1/Smads通路相关原件和Col 1、Col 3的表达。（5）将大鼠黄韧带与人肥厚黄韧带的退变程度进行比较、评估。结果:（1）HE染色与黄韧带厚度的测量:三种造模方法均可以引起黄韧带厚度的增加,其中以肌肉+骨关节切除法最明显,其次为骨关节切除法,最后为肌肉切除法。12w时肌肉+骨关节切除组黄韧带的整体厚度是假手术组的1.35倍,骨关节切除组是假手术组的1.14倍,肌肉切除组是假手术组的1.06倍。但三种造模方法均不能引起黄韧带宽度的额外增加。12w时肌肉+骨关节切除组黄韧带背侧层厚度是假手术组的2.09倍,骨关节切除组是假手术组的1.26倍,肌肉切除组是假手术组的0.96倍。三种造模方法中只有骨关节切除法和肌肉+骨关节切除法可以引起黄韧带背侧层厚度及其所占比例的增加,其中以肌肉+骨关节切除法最为明显,其次为骨关节切除法。（2）Masson染色与纤维化程度:三种造模方法均可以引起黄韧带的弹性-胶原纤维比值的下降,其中以肌肉+骨关节切除法最为明显,其次为骨关节切除法,最后为肌肉切除法。12w时肌肉+骨关节切除组黄韧带的弹性-胶原纤维比是假手术组的0.43倍,骨关节切除组是假手术组的0.66倍,肌肉切除组是假手术组的0.95倍。（3）影像学测量:三种造模方法均可以造成屈曲位椎间隙后方高度和活动范围的增加,其中以肌肉+骨关节切除法最明显,骨关节切除法次之,最后是肌肉切除法。（4）免疫组化、免疫印迹、Real-Time PCR:①免疫组化结果显示,肌肉+骨关节切除组所产生的 IL-1 β、TNF-α、TGF-β 1、p-smad2/3、Col 1 和 Col 3的蛋白表达量最多,Smad7的表达量最少,其次为骨关节切除法,最后为肌肉切除法;②免疫印迹结果显示,肌肉+骨关节切除组所产生的IL-1 β、TNF-α、TGF-β1和Col 1的蛋白表达量最多,其次为骨关节切除法,最后为肌肉切除法;③Real-Time PCR结果显示,肌肉+骨关节切除组所产生的IL-1 β、TNF-α、TGF-β1、Smad2、Smad3、Col1和Col 3的mRNA表达量最多,其次为骨关节切除法,最后为肌肉切除法。（5）造模术后12w时假手术组的弹性-胶原纤维的比值为2.79,将其与实验一中数据比较,其退变程度类似于人未增厚的黄韧带（2.92）;肌肉切除组的弹性-胶原纤维的比值为2.65,退变程度仍接近人未增厚的黄韧带（2.92）;骨关节切除组的弹性-胶原纤维的比值为1.84,退变程度接近人轻度肥厚的黄韧带（1.66-2.23）;肌肉+骨关节切除组的弹性-胶原纤维的比值为1.19,退变程度与人中度肥厚的黄韧带相近（1.08-1.66）。结论:（1）建立了一种新的黄韧带肥厚大鼠模型,其退变程度可能类似于人类中度肥厚的黄韧带。（2）三种造模方法均能引起黄韧带退变与增厚,其程度依次为肌肉+骨关节切除法>骨关节切除法>肌肉切除法。（3）在大鼠模型中,黄韧带背侧层的增厚占比例最高,这可能是由于背侧层在屈曲位受到更大的应力导致的。说明机械应力可能是诱发或加速黄韧带增厚的重要因素。（4）腰椎屈曲范围的增加所引发的机械应力可导致黄韧带中炎性因子TNF-α、IL-1 β的高表达,并诱导TGF-β 1/Smads通路致使细胞外基质沉积而导致黄韧带肥厚。
沈皓[3]（2021）在《VEGFA在肝再生及非酒精性脂肪性肝病中的功能及机制研究》文中研究表明第一部分肝细胞中的Gata3/Ramp2调控PEDF/VEGFA分子流影响肝窦内皮细胞再生的研究研究背景与目的肝脏部分切除是治疗肝脏肿瘤的主要方法之一,正常肝脏组织的再生能力是实施肝切除术的生物学基础。但由于大部分肝脏肿瘤在发现时已经发展至中晚期,肿瘤累及的肝段多,肝脏整体功能较差,残余肝段无法代偿失去的肝组织,术后肝衰的风险始终存在。如果能有效的加速肝切除术后的残肝再生,就可以扩大肝切除的适应症,同时降低术后肝衰的发生率,提高手术的安全性,对肝癌的手术治疗具有重要的意义。肝再生是一个肝脏内所有细胞都参与的复杂过程。在肝再生早期,肝细胞先增殖形成细胞簇,其后肝窦内皮细胞（LSEC）,星状细胞等非实质细胞才开始增殖。LSEC增殖迁移进入肝细胞簇形成血管,为新生的肝细胞提供新陈代谢的条件,星状细胞则分泌细胞外基质,重新构成肝脏的微观结构。我们前期研究发现,再生早期肝细胞中促血管生成因子血管内皮生长因子A（VEGFA）表达上调,同时抑制血管生成因子色素上皮衍生因子（PEDF）表达下调;VEGFA-promoter GPF小鼠显示,肝切除术后肝再生早期阶段,肝细胞内的VEGFA表达增加;经VEGFA△hep和PEDFhep小鼠证实,肝再生过程中肝细胞可以通过上调VEGFA以及下调色素上皮衍生因子（PEDF）来促进LSEC增殖,进而调控肝再生过程。本课题拟在此基础上,寻找肝细胞中VEGFA的上游调控相关分子,深入探讨肝细胞调控LSEC影响肝再生的分子机制,以寻找关键靶点和潜在药物。研究方法1、野生型小鼠和肝细胞特异性敲除Met（MetΔhep）小鼠行70%肝切除术后,分选术后早期的肝细胞行转录组测序,对比分析肝再生早期肝细胞中影响血管生成的差异基因并进行PCR验证;2、通过基因沉默或基因过表达技术,将上述差异基因导入小鼠肝细胞系AML-12中,并与内皮细胞系SVEC-40或原代LSEC共培养,进一步筛查验证肝细胞中调控内皮细胞增殖的相关基因;3、通过CRISPR-Cas9联合腺相关病毒技术构建肝细胞特异性过表达或抑制相关基因的基因编辑小鼠,并以其为基础,探索相关基因在两种肝再生模型（70%肝切除术模型和联合肝脏分隔和门静脉结扎的二步肝切除术（ALPPS）模型）中的作用。4、研究相关基因影响肝再生的作用机制,并寻找可能的干预靶点和方法。5、通过肝类器官培养体系,探讨在患者来源的肝脏类器官中干预相关靶点的可行性。研究结果1、野生型小鼠和MetΔhep小鼠行肝切除术后早期阶段的肝细胞转录组测序分析影响血管生成的相关差异基因,结合PCR验证及肝细胞和内皮细胞共培养实验,筛查发现了肝细胞中Gata3下调或Ramp2上调可促进内皮细胞的增殖和成环,即提示Gata3和Ramp2可能是肝细胞调控内皮细胞增殖的候选基因。2、构建肝细胞特异性过表达Gata3（Gata3hep）和肝细胞特异性敲除Ramp2（Ramp2Δhep）小鼠行70%肝切除术,发现Gata3hep和Ramp2Δhep不影响再生早期肝细胞增殖但抑制了后期LSEC增殖,降低了肝再生后期的恢复速率,提示Gata3和Ramp2可能是肝再生中肝细胞启动LSEC增殖的分子开关,前者下调和后者上调联合启动了 LSEC再生。3、ALPPS小鼠模型中,肝细胞中内源性的Gata3或Ramp2表达变化也显示出了类似PHx模型中的互补趋势;且Gata3hep-和Ramp2Δhep-ALPPS小鼠显示两者不影响肝细胞增殖,但影响了 LSEC增殖。4、体内外实验表明,回补VEGFA或中和阻断PEDF可以部分解除Gata3hep和Ramp2Δhep对肝再生后期的抑制作用。5、发现患者来源的肝脏类器官中GATA3的表达水平存在差异;与GATA3中、低表达水平组相比,GATA3高表达组的肝脏类器官的条件培养基明显抑制人脐静脉内皮细胞（HUVEC）的增殖和成环能力;而且,这种相对抑制作用可被PEDF中和性抗体或GATA3的特异性抑制剂K-7174部分解除。结论本研究发现了肝再生进程中Gata3和Ramp2作为肝细胞中的分子开关阀,通过调控VEGFA和PEDF平衡流,影响LSEC的再生启动:即肝再生过程中肝细胞通过下调Gata3和上调Ramp2表达,导致VEGFA生成增多和PEDF减少,启动LSEC增殖影响肝再生。Gata3和Ramp2分别是肝再生的负向和正向调控分子,作为分子开关启动了 LSEC增殖。PEDF中和性抗体或GATA3的特异性抑制剂有望作为一种干预手段,加速肝脏手术后的肝再生,为降低围手术期肝衰风险提供了实验依据。第二部分肝细胞源的VEGFA通过激活肝星状细胞加速非酒精性脂肪性肝病向肝癌转化研究背景与目的随着人类生活习惯的改变以及病毒性肝炎的控制,非酒精性脂肪性肝病（non-alcoholic fatty liver disease,NAFLD）已经成为最常见的慢性肝病。NAFLD 是多种病理状态的总称,其疾病谱包括单纯性肝脂肪变性、非酒精性脂肪性肝炎、NAFLD相关性肝纤维化以及NAFLD相关性肝癌（HCC）。目前尚没有有效控制NAFLD病程进展的治疗方法。VEGFA作为体内重要的促血管生成因子,在多种肝病和恶性肿瘤中发挥重要作用。其在NAFLD中的作用尚不十分清楚,一些研究结果间存在矛盾,这可能与研究对象的不典型,NAFLD病程的复杂性以及VEGFA来源的细胞多样性等因素有关。本研究主要探讨VEGFA在NAFLD病程进展中的作用和机制以及其作为NAFLD治疗靶点的可行性。研究方法1、通过西方饮食联合四氯化碳（WD/CC14）诱导的方式,建立NAFLD-HCC转化的小鼠模型,以完整反应NAFLD病程进展。2、采用PCR、Western、组织免疫化学和免疫荧光等多种方法,分析NAFLD-HCC转化小鼠模型中VEGFA的表达和细胞分布变化与NAFLD病程进展的关系。3、根据GEO数据库中NAFLD相关数据,分析肝内VEGFA的表达变化;结合临床上伴有或不伴有NAFLD的肝脏良性肿瘤患者的瘤旁组织,分析其中的VEGFA变化及细胞分布;4、同理构建肝细胞特异性敲除VEGFA（VegfaΔhep）的NAFLD-HCC小鼠模型,探讨肝细胞源的VEGFA在NAFLD病程中发挥作用的具体机制。5、收集临床上NAFLD相关性HCC（NAFLD-HCC）,乙肝病毒相关性HCC（HBV-HCC）和肝血管瘤患者的瘤旁组织,通过分子生物学检测,分析VEGFA在不同病因背景的肝纤维化过程中的作用。6、通过NAFLD患者来源的肝脏类器官与肝星状细胞（HSC）系LX2共培养实验,探讨肝细胞源VEGFA对HSC活化的影响及其对NAFLD治疗的潜在价值。研究结果1、饮食联合药物诱导的小鼠NAFLD模型能较好的反映人类NAFLD进展过程中的不同病理状态。2、在接受饮食和药物诱导的野生型小鼠（WD/CC14-WT）中,肝细胞来源的VEGFA随着NAFLD的进展而逐渐升高;临床上伴有NAFLD的肝脏良性肿瘤患者的瘤旁组织中,肝细胞来源的VEGFA也呈现了类似趋势。3、与WD/CC14-WT小鼠相比,WD/CC14-VegfaΔhep小鼠纤维化程度明显减轻,肿瘤的发生发展受到抑制,但肝脏的脂肪变性程度没有明显差异。4、肝细胞敲除VEGFA可减轻血管内皮功能障碍,抑制HSC激活。5、在NAFLD-HCC患者的癌旁组织中观察到VEGFA与肝纤维化程度相关,但在HBV-HCC患者中,没有观察到这种相关性。6、体外实验证实,来自NAFLD患者的肝细胞类器官的条件培养基可刺激HSC的活化,VEGFA中和性抗体可以阻断这种活化。结论我们的研究发现了肝细胞来源的VEGFA可以促进NAFLD病程中纤维化进展,加速NAFLD向HCC转化,但对脂肪变性过程没有影响。机制上主要通过激活HSC,引起血管内皮功能障碍。VEGFA中和性抗体可阻断该活化,这为NAFLD治疗提供了潜在的靶点。
方明笋[4]（2021）在《中国被毛孢菌丝体对小鼠心衰模型的治疗作用及机制研究》文中认为中国被毛孢（Hirsutella Sinensis）是从野生冬虫夏草中分离鉴定出的无性型真菌菌株。通过发酵工程进行深层液体发酵获得中国被毛孢菌丝体（Hirsutella sinensis mycelium,HSM）。已有研究显示HSM在肺纤维化和肾纤维化等动物疾病模型中具有抗纤维化作用,但关于HSM对心肌纤维化的作用未见报道。研究表明HSM可通过抑制TGF-β表达,抑制组织纤维化进程。心力衰竭的发病过程中TGF-β介导的心肌纤维化是其主要病理基础。基于以上研究,本论文拟通过主动脉弓缩窄术（transverseaortic constriction,TAC）建立小鼠心衰模型,观察HSM对心衰小鼠的治疗作用,并探讨其具体作用机制。本论文选用C57BL/6J小鼠,通过TAC建立小鼠心力衰竭模型,缩窄用的垫针规格为26G,术后分别于4周、8周、12周,采用超声心动成像、病理组织学检查等方法监测心衰小鼠的病程进展。与假手术组相比,术后4周时小鼠左心室前壁显着增厚,但左心室后壁、心室腔内径和射血分数（EF）无显着变化,病理观察可见血管周围有胶原增生;术后8周时小鼠左心室室壁进一步增厚,左心室前壁与后壁均具有显着性差异,左心室腔内径开始扩张,EF显着下降,心肌胞外基质出现胶原增生;术后12周时小鼠左心室腔内径显着扩张,心肌组织间大量胶原增生可见明显病变,EF显着下降（低于30%）进入心衰期。以上结果表明,本文成功在术后12周建立小鼠慢性心力衰竭模型,为心力衰竭的治疗研究提供模型基础,可用于下一步药效学实验。成功建模后,进行药物干预实验,在TAC术后一周给予HSM干预治疗并设立卡托普利组作为阳性对照,术后12周为实验终点。通过超声心动成像和血流动力学检测评价心脏结构和功能,HE染色和Masson染色观察心肌病理变化等手段评价HSM对心力衰竭小鼠的治疗作用。利用Western blot和RT-qPCR分析心肌检测心室重构相关因子的蛋白和mRNA表达水平变化,探讨HSM治疗心力衰竭的作用机制。实验终点时,①通过超声心动成像,发现HSM可显着提高EF、短轴率（FS）等心功能指标,并降低左心室室壁厚度和心室容积等心室重构指标;②应用血流动力学检查,发现HSM组左心室舒张末期压显着升高,±dP/dt max显着增强,接近假手术组;③HE染色和Masson染色发现HSM可显着抑制心肌肥大和纤维化;④采用Western blotting和RT-qPCR分析心肌组织发现HSM较TAC组可降低心脏组织TGF-β1、Smad3蛋白水平以及Ⅰ型和Ⅲ型胶原mRNA水平。这提示HSM对心脏的保护机制可能是通过调控TGF-β1/Smad3信号通路减轻心肌纤维化程度。总之,本论文成功构建一个适用于新药开发的小鼠心力衰竭动物疾病模型。在此基础上验证了 HSM可以显着改善心力衰竭小鼠的心功能状态,可防止TAC后胶原增生和心室重构。这些结果为HSM的药用研究提供了新的研究方向,并进一步提示可以通过TGFβ1/Smad3信号通路,靶向抑制纤维化相关基因和蛋白来治疗心衰。
陈莎[5]（2021）在《β-石竹烯调节CI-AMPARs膜转运保护急性缺血性脑卒中及卒中后认知功能障碍的作用及机制研究》文中研究表明急性缺血性脑卒中是严重危害人类健康的重大疾病之一,具有发病率高、致死率高、致残率高和复发率高的特点,但迄今为止,其病理生理机制还尚不完全清楚,还未找到其治疗行之有效的方法。因此,深入阐明急性缺血性脑卒中的发病机制,寻找治疗新靶点并开发安全有效的治疗药物具有很高的经济意义和社会价值。大量研究表明脑缺血后细胞间隙谷氨酸过量释放引起兴奋性毒性在脑缺血刺激后神经元细胞死亡过程中起着非常的作用。过量释放的谷氨酸主要激活两种突触后膜受体,NMDARs和AMPARs。AMPARs亚基Glu A2抑制钙离子通透,决定了AMPARs对钙离子通透性,依据AMPARs是否含有Glu A2,将AMPARs分为CI-AMPARs和CP-AMPARs。脑缺血损伤后,大量钙离子经过通透性已改变的AMPARs进入相对脆弱的海马CA1区锥体神经元,使胞内钙超载,引发神经元细胞发生致死性反应。另外,AMPARs介导了中枢神经系统（CNS）绝大多数快兴奋性突触传递,在学习记忆和认知等方面具有重要作用。研究发现脑缺血后神经元细胞内钙离子内流增加还加剧了脑缺血后神经退行性病变进程。长时程增强（long term potentiation,LTP）和长时程抑制（long term depression,LTD）调控的突触可塑性被认为是学习和记忆的生理基础。近期文献报道,CI-AMPARs从突触外和/或细胞内向海马突触膜表面转运募集,因而改变钙离子流,影响突触胞膜上电流变化,调控LTP和LTD过程进而影响认知相关的学习记忆过程。但目前,CI-AMPARs在急性缺血性脑卒中后认知障碍中是否发挥作用还不清楚。内源性大麻系统最早被发现在调节神经行为功能中发挥重要作用,如成瘾,焦虑,摄食等,后来研究发现大麻系统在脑缺血再灌注和一些神经退行性疾病的病理生理机制中发挥重要作用。本课题组在前期工作中筛选到一与大麻素Ⅱ型受体（Cannabinoid receptor type 2,CB2）结合的CB2受体完全激动剂β-石竹烯（β-Caryophyllene,BCP）,初步发现其具有保护神经损伤和提高脑缺血动物的学习记忆能力,但其具体发挥作用的明确机制不详。鉴于有CB2受体激动剂可以调节啮齿类动物内侧前额叶皮质锥体神经元中Ca2+流,即CB2受体可能调节离子稳态和神经元兴奋性的文献报道,为此,我们推测CB2受体β-石竹烯（BCP）具有的保护急性缺血性脑卒中和卒中后认知功能障碍的作用可能与其调节与钙离子通透性相关的CI-AMPARs膜转运相关。基于这一科学假说,我们以小鼠神经元细胞糖氧剥夺复氧模型OGD/R及小鼠急性缺血性脑卒中模型MCAO为研究对象,通过MTT增殖实验、流式凋亡检测、细胞形态学观察、神经行为学评分、转棒实验、TTC染色、H&E染色、MWM水迷宫、物体辨别实验、免疫荧光双标、流式检测钙离子流、膜片钳电生理技术等实验,并初步分析临床急性脑梗病人临床样本与临床资料,从细胞、动物和临床标本水平,在验证与分析CB2受体β-石竹烯（BCP）具有保护急性缺血性脑卒中和卒中后认知功能障碍的作用基础之上,研究了BCP调节CI-AMPARs膜转运与保护急性缺血性脑卒中和卒中后认知功能障碍的关系,并探讨了BCP调节CI-AMPARs膜转运的分子机制。研究方法与结果:1.β-石竹烯保护急性缺血性脑卒中及卒中后认知功能障碍（1）以小鼠神经元细胞HT-22为研究对象,建立氧糖剥夺/复氧（OGD/R）模型,分组:Control组、Control+10μM BCP组（正常对照组）、OGD/R+5μM BCP组、OGD/R+10μM BCP组、OGD/R+20μM BCP组,作用时间24h、48h及72h,运用MTT增殖检测、流式检测细胞凋亡、显微镜下观察细胞形态等方法,从细胞水平验证与分析,BCP对OGD/R模型作用的剂量依赖及时间依赖关系,实验结果在细胞水平明确BCP对神经元细胞氧糖剥夺/复氧（OGD/R）具有保护作用。（2）（1）选用C57BL/6,雄性,6～8周龄小鼠,随机分为假手术组（sham组）、sham+BCP 72mg/kg组（正常对照组）、模型+溶剂组、模型+BCP 36mg/kg治疗组、模型+BCP 72mg/kg治疗组和模型+144mg/kg治疗组,每组6只C57BL/6小鼠,连续灌胃给药6天,第6天采用大脑中动脉闭塞（Middle cerebral artery occlusion,MCAO）建立急性缺血性脑卒中模型。（2）脑急性缺血1小时再灌注7天后,通过改良Longa 5的0～5分制法进行神经行为学评分、神经功能缺失程度评分（Modified Neurological Severity Score:m NSS）和转棒实验,观察BCP对MCAO后小鼠神经及运动功能的影响。2,3,5—氯化三苯基四氮唑（TTC）染色检测各组小鼠脑梗死体积,苏木精-伊红（H&E）染色观察各组小鼠海马区域神经细胞病理结构变化,从动物水平验证与分析BCP具有保护急性缺血性脑卒中小鼠的作用,结果发现BCP有明显剂量依赖性保护急性缺血性脑卒中小鼠模型脑神经损伤的作用。（3）脑急性缺血1小时再灌注7天后,通过Morris水迷宫实验的空间定位航行实验、空间探索实验检测逃避潜伏期、经过目标平台的次数及目标现象活动时间,物体识别实验（Object Recognition Task,ORT）检测各组小鼠的学习记忆功能的变化情况,验证与分析BCP保护急性缺血性脑卒中后学习记忆障碍,结果发现BCP能明显改善急性缺血性脑卒中模型MCAO小鼠的逃避潜伏期、经过目标平台的次数、目标现象活动时间及物体识别指数,即BCP能明显改善急性缺血性脑卒中模型MCAO小鼠的认知功能障碍。2.β-石竹烯促进急性缺血性脑卒中后CI-AMPARs膜转运（1）运用生物素Sulfo-NHS-SS-Biotin标记法提取细胞膜蛋白,再采用Western Blot检测各组细胞中CI-AMPARs关键蛋白AMPARs亚基Glu A2在胞膜表面及总蛋白中的表达变化情况,结果发现BCP可以促进氧糖剥夺/复氧（OGD/R）细胞模型中CI-AMPARs膜表达增加。（2）运用钙离子荧光探针Fluro-3 AM孵育各组细胞,运用流式细胞检测仪和激光共聚焦检测共同观察细胞内外钙离子流情况,结果发现OGD/R细胞模型中,细胞内钙离子流增多,而BCP处理的OGD/R细胞,细胞钙离子内流减少,即BCP可以抑制氧糖剥夺/复氧（OGD/R）细胞模型中钙离子内流。（3）收集小鼠海马标本,提取其膜蛋白应用Western Blotting检测膜蛋白和总蛋白中Glu A2在各实验组中的表达变化情况,制作冰冻切片,应用免疫荧光双染共定位方法（共染突触标志物Synaptophysin及Glu A2）检测各实验组标本中CI-AMPARs关键蛋白Glu A2在突触膜表面的表达情况,结果发现急性缺血性脑卒中模型MCAO中Glu A2在神经突触膜表面聚集减少,而BCP给药后可以增加MCAO后Glu A2在神经突触膜表面的聚集表达,该研究结果提示,BCP可以促进急性缺血性脑卒中MCAO动物模型中CI-AMPARs膜表达增加。（4）应用膜片钳电生理检测技术观察各组小鼠海马CA1区椎体层神经元细胞突触后膜AMPA受体介导的微小兴奋性后电流（m EPSCs）的振幅和频率,结果发现BCP给药后可以缓解急性缺血性脑卒中MCAO模型AMPA受体介导的m EPSCs的振幅和频率增加影响LTP和LTD进程。3.β-石竹烯通过PKA依赖的CI-AMPARs膜转运保护急性缺血性脑卒中及卒中后认知功能障碍（1）采用ELISA技术、Western Blot技术检测氧糖剥夺/复氧（OGD/R）细胞模型、急性缺血性脑卒中MCAO动物模型中及BCP给药后,与神经保护和学习记忆过程、CI-AMPARs转运密切相关的c AMP/PKA信号通路关键分子c AMP、PKA、CREB、BDNF及其活化形式p-PKA、p-CREB的表达变化情况,发现BCP可以激活OGD/R细胞模型及MCAO动物模型中c AMP/PKA信号通路。（2）应用PKA抑制剂H-89,小鼠海马神经元细胞HT-22,分为Control组、OGD/R组、OGD/R+10μM BCP组、OGD/R+10μM BCP+H-89组:运用生物素Sulfo-NHS-SS-Biotin标记法提取细胞膜蛋白,再采用Western Blot检测各组细胞中Glu A2在胞膜表面及总蛋白中的表达变化情况,运用钙离子荧光探针Fluro-3 AM孵育各组细胞,运用流式细胞检测仪和激光共聚焦检测共同观察细胞内外钙离子流情况,结果发现PKA抑制剂H-89可以逆转BCP促进OGD/R细胞模型中CI-AMPARs膜表达增加和抑制钙离子内流的作用,即BCP促进OGD/R细胞模型中CI-AMPARs膜转运是PKA依赖形式的。（3）C57BL/6雄性小鼠,分为Sham组、MCAO组、MCAO+72mg/kg BCP组、MCAO+72 mg/kg BCP+H-89组:收集小鼠海马标本,提取其膜蛋白应用Western Blotting检测膜蛋白和总蛋白中Glu A2在各实验组中的表达变化情况,免疫荧光双染共定位方法检测各实验组标本中CI-AMPARs关键蛋白Glu A2在突触膜表面的表达情况,应用膜片钳电生理检测技术观察各组小鼠海马CA1区椎体层神经元细胞突触后膜AMPA受体介导的微小兴奋性后电流（m EPSCs）的振幅和频率,结果发现,PKA抑制剂H-89可以逆转BCP促进急性缺血性脑卒中MCAO动物模型中CI-AMPARs膜表达增加,可以逆转BCP抑制MCAO模型中AMPA受体介导的m EPSCs的振幅和频率,即BCP促进MCAO动物模型中CI-AMPARs膜转运调控LTP和LTD过程是PKA依赖形式的。（4）Western Blotting同时监测（2）和（3）的各组中c AMP/PKA信号通路关键分子c AMP、PKA、CREB、BDNF及其活化形式p-PKA、p-CREB的表达变化情况,证实BCP可以激活OGD/R细胞模型及MCAO动物模型中c AMP/PKA信号通路。（5）应用PKA抑制剂H-89,小鼠海马神经元细胞HT-22分组:Control组、OGD/R组、OGD/R+10μM BCP组、OGD/R+10μM BCP+H-89组:MTT增殖检测、流式检测细胞凋亡、显微镜下观察细胞形态等方法,结果发现BCP是通过PKA依赖的CI-AMPARs膜转运发挥对神经元细胞氧糖剥夺/复氧（OGD/R）模型发挥保护作用。（6）应用PKA抑制剂H-89,C57BL/6雄性小鼠,分为Sham组、MCAO组、MCAO+72 mg/kg BCP组、MCAO+72 mg/kg BCP+H-89组:脑急性缺血1小时再灌注7天后,通过改良Longa 5的0～5分制法进行神经行为学评分、神经功能缺失程度评分和转棒实验,观察BCP对MCAO后小鼠神经及运动功能的影响。TTC染色检测各组小鼠脑梗死体积,H&E染色观察各组小鼠海马区域神经细胞病理结构变化,结果发现BCP是通过PKA依赖的CI-AMPARs膜转运发挥对MCAO动物模型神经功能损伤的保护作用。（7）应用PKA抑制剂H-89,C57BL/6雄性小鼠,分为Sham组、MCAO组、MCAO+72 mg/kg BCP组、MCAO+72 mg/kg BCP+H-89组:脑急性缺血1小时再灌注7天后,通过Morris水迷宫实验、物体识别实验检测各组小鼠的学习记忆功能的变化情况,结果发现BCP是通过PKA依赖的CI-AMPARs膜转运调控LTP和LTD过程改善急性缺血性脑卒中后认知学习记忆障碍。（8）收集30例临床急性缺血性脑卒中病人取栓治疗前后血清样本,ELISA法检测c AMP的浓度变化,结合病人临床病例资料分析统计c AMP的浓度变化与治疗前后缺血性脑卒中临床指征的关系,发现急性缺血性脑卒中病人取栓后c AMP浓度上调。研究结果表明:（1）明确了BCP具有保护急性缺血性脑卒中神经损伤及卒中后认知功能障碍的作用;（2）首次发现BCP具有促进急性缺血性脑卒中后CI-AMPARs膜转运的作用;（3）发现BCP可通过PKA依赖的CI-AMPARs膜转运抑制神经元细胞钙离子内流,调节神经突触可塑性发挥保护急性缺血性脑卒中及卒中后认知功能障碍的作用。本研究结果为进一步阐明BCP在保护急性缺血性脑卒中及卒中后认知功能障碍的作用和分子机制奠定基础,为寻找急性缺血性脑卒中治疗新靶点并开发安全有效的治疗药物提供了新思路。
游灿[6]（2020）在《无菌治疗包内缝合针生锈及散落的防范与改进》文中进行了进一步梳理目的探讨无菌治疗包内缝合针生锈及散落的防范与改进。方法对本院治疗包内缝合针生锈及散落的原因进行分析和改进。结果治疗包内无缝合针生锈及散落事件发生。结论通过对上述两种问题进行分析并积极采取改进措施,提高了包内一次性物品的质量,有效预防医院感染的发生。
吴爽[7]（2020）在《血塞通对MCAO大鼠及OGD/R损伤SH-SY5Y细胞Lingo-1及EGFR/PI3K/Akt通路和BDNF的作用机制研究》文中提出研究目的:1.探究血塞通对大鼠大脑中动脉局灶性梗死术后14天的神经保护作用,以及对Lingo-1和对其下游EGFR/PI3K/Akt信号通路和BDNF的调控作用。2.探究血塞通对氧糖剥夺/再灌注损伤SH-SY5Y细胞的体外保护作用,以及对PI3K/Akt信号通路和BDNF的调节作用。研究方法:1.取SPF级Sprague-Dawley雄性大鼠,通过改良Longa线栓法来建立大脑中动脉局灶性梗死（Middle Cerebral Artery Occlusion,MCAO）模型（右侧）,大鼠手术后苏醒,再使用EZ Longa评分量表进行评分,1-3分则纳入实验。将造模成功的大鼠进行随机分组,组别为模型组、PNS小剂量组、PNS大剂量组、尼莫地平组。假手术组大鼠不进行MCAO手术,仅沿颈正中切开皮肤,将颈总动脉、颈内和颈外动脉完全暴露后,缝合皮肤即可。TTC染色法评价MCAO模型建立的效果。2.根据前期研究和大鼠与人的体表面积等效药物剂量换算,各组大鼠的给药方式分别为:假手术组、模型组大鼠每日腹腔注射生理盐水,剂量为l mL/100g;PNS小剂量组每日腹腔注射剂量为3.6 mg/100g的血塞通;PNS大剂量组大鼠每日进行7.2 mg/100g腹腔注射血塞通;尼莫地平组大鼠每日予1.44 mg/100g尼莫地平灌胃。（1）模型建立后1-14天,每日观察记录大鼠的一般状态、神经功能学评分及体重变化。（2）造模14天后,取大鼠脑组织,进行HE染色,观察脑组织的病理形态变化。Western Blot方法检测大鼠梗死侧大脑皮质中PSD-95、SYN的蛋白表达情况,实时荧光PCR法（qRT-PCR）及免疫组织化学染色,观察BDNF表达情况。（3）通过qRT-PCR方法、免疫组织化学染色法和Western Blot法进一步探究血塞通对Lingo-1及其下游EGFR/PI3K/Akt通路的作用。3.首先对SH-SY5Y细胞进行培养并建立氧糖剥夺/再灌注损伤模型（Oxygen-Glucose Deprivation/Reoxygenation,OGD/R）,用CCK8法测定细胞存活率来确定最佳OGD/R时间及血塞通的最适干预浓度。（1）将培养的细胞分为正常组、模型组、PNS组,模型组和PNS组提前进行OGD/R模型的建立,qRT-PCR和Western Blot法检测BDNF表达情况。（2）将培养的细胞分为正常组、模型组、PNS组、PNS+LY294002组、LY294002组五个组。除正常组外,每组给予相应的OGD/R处理及合适的药物干预。通过qRT-PCR及Western Blot方法检测血塞通对细胞PI3K/Akt信号通路的调控作用。研究结果:1.动物实验部分实验一:TTC染色结果显示,MCAO手术组大鼠脑组织切片梗死侧（右侧）可见连续的苍白色梗死灶,左侧呈现均匀的红色,说明模型建立成功。体重指数:术前各组大鼠体重未见明显差异（P>0.05）。术后第1天、第3天、第7天和第14天,与假手术组相比,模型组、PNS小剂量组、PNS大剂量组、尼莫地平组大鼠的体重指数明显降低（P<0.01）。假手术组大鼠体重指数随着时间推移逐渐升高,模型组和PNS小剂量组大鼠体重指数随着时间推移逐渐降低,PNS大剂量组和尼莫地平组大鼠体重指数在第1-7天逐渐降低,7天后维持在一定水平,无明显下降。假手术组和模型组大鼠术后14天体重指数较术后第1天显着变化,假手术组显着增加（P<0.01）,模型组显着减少（P<0.05）。mNSS神经功能评分:各手术组造模后EZ Longa评分未见明显差异（P>0.05）。模型组、PNS小剂量组、PNS大剂量组和尼莫地平组MCAO大鼠在给药1天、3天、7天和14天的mNSS神经功能评分均较假手术组高（P<0.01）,且各组MCAO大鼠的mNSS评分随着时间推移逐渐降低。与模型组相比,PNS大剂量组给药3天后的mNSS评分显着降低（P<0.05）。模型组、PNS小剂量组、PNS大剂量组和尼莫地平组MCAO大鼠给药14天后,mNSS评分均较给药第1天明显降低（P<0.05,P<0.01）。PNS大剂量组第1天和第14天mNSS评分差值变化较模型组显着（P<0.05）,而PNS小剂量组和尼莫地平组较模型组相比,未见明显变化。实验二:MCAO术后14天,模型组大鼠PSD95蛋白的表达量较假手术组明显降低（P<0.05）,PNS大剂量组和尼莫地平组PSD95蛋白的表达量较模型组显着升高,具有统计学差异（P<0.05）,PNS小剂量组PSD95蛋白表达的均值较模型组升高,但未见统计学差异（P>0.05）。模型组SD大鼠SYN蛋白的表达量较假手术组明显降低（P<0.05）,PNS大剂量组SYN蛋白的表达较模型组显着升高,具有统计学差异（P<0.01）,PNS小剂量组和尼莫地平组SYN蛋白表达的均值较模型组升高,但未见统计学差异（P>0.05）。模型组、PNS小剂量组、PNS大剂量组、尼莫地平组大鼠BDNF的mRNA表达水平较假手术组显着降低,具有统计学差异（P<0.01）。与模型组相比,PNS大剂量组大鼠BDNF的mRNA表达水平明显升高,具有统计学差异（P<0.01）。免疫组化结果显示,PNS大剂量组和尼莫地平组大鼠脑组织的免疫阳性物质较模型组的分布更为广泛。实验三:MCAO术后14天,qRT-PCR法检测大鼠脑组织梗死侧Lingo-1、EGFR、PI3K、Akt的mRNA的表达情况:模型组大鼠Lingo-1的mRNA的表达量较假手术组明显升高,差异具有统计学意义（P<0.05）。PNS大剂量组和尼莫地平组Lingo-1的mRNA表达较模型组显着降低,差异有统计学意义（P<0.01）。PNS小剂量组Lingo-1的mRNA表达与模型组相比,未见明显降低（P>0.05）。模型组、PNS小剂量组、PNS大剂量组和尼莫地平组四个组的EGFR、PI3K、Akt的mRNA表达水平较假手术组升高,但未见统计学差异（P>0.05）。Western Blot 法检测大鼠脑组织梗死侧 Lingo-1 和 p-EGFR/EGFR、p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt蛋白的表达情况:MCAO术后14天,模型组大鼠Lingo-1蛋白表达量较假手术组明显升高（P<0.01）,PNS大剂量组、尼莫地平组Lingo-1蛋白表达量较模型组显着降低（P<0.05）,PNS小剂量组Lingo-1蛋白表达量均值较模型组减少,但未见统计学差异（P>0.05）。模型组大鼠p-EGFR/EGFR表达较假手术组明显降低,具有统计学差异（P<0.05）,PNS大剂量组和尼莫地平组p-EGFR/EGFR蛋白的比值较模型组明显升高,具有统计学差异（P<0.05）,PNS小剂量组p-EGFR/EGFR蛋白比值的均值较模型组升高,但未见统计学差异（P>0.05）。模型组大鼠p-PI3K/PI3K蛋白的比值较假手术组明显降低（P<0.05）,PNS小剂量组p-PI3K/PI3K蛋白的比值较模型组相比显着升高（P<0.05）,PNS大剂量组和尼莫地平组p-PI3K/PI3K的均值较模型组高,但无统计学意义（P>0.05）。模型组大鼠p-Akt/Akt蛋白的比值较假手术组明显降低（P<0.01）,PNS大剂量组和尼莫地平组p-Akt/Akt蛋白的表达较模型组显着升高,具有统计学差异（P<0.05）,PNS小剂量组p-Akt/Akt蛋白比值的均值较模型组升高,但未见统计学差异（P>0.05）。免疫组织化学染色法检测大鼠脑组织中Lingo-1、p-EGFR、p-PI3K、p-Akt的表达情况:免疫阳性物质被染成深棕色,呈颗粒状或点状散在分布,表达趋势与Western Blot一致。2.细胞实验部分实验四:根据CCK8的测定结果,选择7h为最佳氧糖剥夺时间,此时SH-SY5Y细胞存活率为62.36%,细胞既受到OGD/R的损伤,又能保证大多数细胞活力。选择20 μ g/mL作为血塞通药物的干预浓度,此时SH-SY5Y细胞的存活率最高。血塞通对OGD/R的SH-SY5Y细胞BDNF表达的影响:SH-SY5Y细胞OGD/R损伤后,与正常组相比,模型组的BDNF mRNA表达显着降低,差异有统计学意义（P<0.05）,PNS组BDNF mRNA的表达水平较模型组显着增高,有统计学差异（P<0.01）。与正常组相比,模型组的BDNF蛋白表达显着降低,差异有统计学意义（P<0.05）,PNS组的BDNF蛋白表达较模型组显着升高,具有统计学差异（P<0.01）。实验五:血塞通对OGD/R损伤的SH-SY5Y细胞PI3K/Akt通路的影响:将细胞分为五组,分别为正常组、模型组、PNS组、PNS+LY294002组、LY294002组。SH-SY5Y细胞OGD/R损伤后,正常组、PNS组、PNS+LY294002组、LY294002组Akt mRNA的表达与模型组之间未见差异（P>0.05）。模型组p-Akt与Akt总蛋白比值与正常组相比显着升高,具有统计学差异（P<0.05）,PNS组p-Akt/Akt蛋白表达较模型组相比显着增加,差异具有统计学意义（P<0.05）,PNS+LY294002组p-Akt/Akt蛋白表达较模型组相比未见明显差异（P>0.05）,LY294002组p-Akt/Akt蛋白表达较模型组相比显着降低,具有统计学意义（P<0.01）。研究结论:1.血塞通能促进MCAO大鼠体重指数的增长、改善神经功能,提高SYN、PSD95和BDNF的表达,促进脑梗死大鼠的神经突触形成和神经功能的恢复。2.血塞通可抑制大鼠梗死侧脑组织Lingo-1的过度表达,同时激活EGFR/PI3K/Akt信号通路,提高其磷酸化水平,发挥神经保护作用。3.血塞通能提高OGD/R SH-SY5Y细胞的活力,通过激活PI3K/Akt信号通路,提高BDNF的表达,促进受损神经细胞的存活、再生,发挥神经保护作用。
周焘[8]（2020）在《CaMKⅡγ的过表达及干扰对大鼠肝部分切除术后肝脏再生的影响》文中提出第一部分大鼠肝部分切除术及慢病毒转染模型的建立[目 的]探讨建立SD大鼠肝部分切除及慢病毒转染模型的方法和技巧,为后续肝再生实验研究建立可靠模型基础。[方 法]使用2/3肝部分切除术,利用构建的CaMKⅡγ过表达（LV-CaMKⅡγ）、干扰（LV-CaMKⅡγRNAi）及相应空白载体的慢病毒体系,经盲肠静脉分别转染入肝切除术后大鼠体内,并建立空白对照组。五组实验大鼠观察术后并发症,存活,死亡情况,并分别于切肝后1,3,5,7d处死,取肝组织行慢病毒荧光检测;QPCR,Western Blot检测CaMKⅡγ的mRNA和蛋白表达情况;免疫组化检测CaMKⅡγ的表达和组织空间位置情况。[结 果]1.利用SD大鼠成功建立2/3部分肝切除术动物模型,术后并发症少,存活率高,大部分建模大鼠能存活到实验设计取肝时间,死亡4只大鼠。2.荧光检测示在LV-CaMKⅡγRNAi感染和其对照慢病毒组中观察到红色荧光,两组荧光表达量随时间增加渐减少;在LV-CaMKⅡγ感染和其对照慢病毒组观察到绿色荧光,两组荧光表达量随时间增加逐渐减少。3.QPCR检测和Western Blot检测结果,即同一时点LV-CaMKⅡγ组的mRNA和蛋白表达最高,LV-CaMKⅡγRNAi组的mRNA和蛋白表达最低。术后lday,病毒干预组与对应对照组无差异,术后72小时、第5day、第7day,LV-CaMKⅡγ组的表达高于其对照组（*P<0.05）,LV-CaMKⅡγRNAi的表达低于其对照组（*P<0.05）。LV-CaMKⅡγ组的蛋白在第5天表达最明显。QPCR检测趋势同Western Blot检测,但LV-CaMKⅡγ组的表达在第3天表达最明显。4.免疫组化染色CaMKⅡγ阳性呈棕黄色,细胞质表达量最多,其表达趋势同Western Blot检测相一致。[结论]1.60-70%（2/3）肝切除模型,可最大程度诱发肝再生潜能,受病理因素影响小,准确量化了肝切除体积,易于操作,术后并发症,死亡率低,是研究肝增殖理想的动物模型。2.经盲肠静脉注射慢病毒转染肝细胞,有效改变大鼠肝细胞内CaMKⅡγ基因蛋白的表达,达到了实验研究目的,为进一步探讨CaMKⅡγ对肝再生的影响及其机制研究建立模型基础。此建模方法可靠性高,安全性好,可重复性强,且干扰小。第二部分CaMKⅡγ表达变化对大鼠肝切除术后肝再生的影响及机制研究[目 的]探究CaMKⅡγ对大鼠肝切除术后肝脏再生能力,肝细胞增殖周期,肝脏合成功能恢复等方面的影响及其机制。[方 法]1.使用核磁共振检测大鼠肝体积用于实验动物入组及间接测量切除术后再生肝体积,排水法和MRI法测得肝体积的相关性分析。2.各实验组不同时间点免疫组化法检测肝组织Brdu和PCNA表达情况;免疫荧光法检测Ki67表达情况。3.各实验组不同时间点ELISA法测前白蛋白水平。4.透射电镜观察肝细胞超微结构变化。[结 果]1.核磁共振测大鼠肝体积术后1day,各病毒干预组与空白对照组体积无统计学差异（P>0.05）。术后3day、5day、7day,LV-CaMKⅡγ组的体积增长高于其对照组（*P<0.01）,LV-CaMKⅡγRNAi组体积增长低于其对照组（*P<0.01）。而 3day、5day、7day,con 组,LV-CaMKⅡγ-NC 组,LV-CaMKⅡγRNAi-NC 组之间体积增长无明显差异（P>0.05）。排水法（x）和MRI法测得肝体积（y）,R=0.992,R2=0.983。直线回归方程为y=0.064+0.879x,二者高度相关。2.不同检测方法,PCNA和Ki67的肝增殖趋势相一致。术后1day,各病毒干预组与空白对照组已有表达但阳性染色率无统计学差异（P>0.05）。术后3day、5day、7day,LV-CaMKⅡγ组的阳性染色率高于其对照组（*P<0.01）,LV-CaMKⅡγRNAi的阳性染色率低于其对照组（*P<0.01）。而3day、5day、7day,con组,LV-CaMKⅡγ-NC 组,LV-CaMKⅡγRNAi-NC 组之间无明显差异（P>0.05）。Brdu术后3天各组才开始有表达,表达趋势与PCNA和Ki67相一致。3.血清前白蛋白在术后1day,各病毒干预组与空白对照组浓度无统计学差异（P>0.05）。随天数增加浓度升高,以第3天到第5天升高明显,第5天浓度接近正常水平。术后3day、5day、7day,LV-CaMKⅡγ 组浓度高于其对照组（*p<0.01）,LV-CaMKⅡγRNAi 组浓度低于其对照组（*P<0.01）。而 3day、5day、7day,con组,LV-CaMKⅡγ-NC组,LV-CaMKⅡγRNAi-NC组之间浓度无明显差异（P>0.05）。4.PH术后1天,电镜下con组:线粒体肿胀,可见空泡状结构。LV-CaMKⅡγ组:线粒体数目增多且明显肿胀,粗面内质网数目也增多。LV-CaMKⅡγRNAi组:线粒体及粗面内质网数量少,线粒体不肿胀。术后3天,con组:肝细胞核增大、核仁明显。LV-CaMKⅡγ组:细胞核增大、核仁明显、常染色质增多,核分裂像细胞增多。LV-CaMKⅡγRNAi组细胞核小,核仁不明显,常染色质少。术后5天,con组:可见线粒体,粗面内质网及游离核糖体等结构。LV-CaMKⅡγ组:细胞器丰富,散在游离核糖体,线粒体及粗面内质网结构增多。LV-CaMKⅡγRNAi组:细胞器少,线粒体及粗面内质网数量少,游离核糖体少,胶原纤维的增生。[结 论]肝脏是一种增殖能力极强的器官,肝大部切除术后的SD大鼠可在一周内恢复原有肝脏体积和功能。CaMKⅡγ是一种重要的肝再生调节激酶,增加体内CaMKⅡγ的表达将活化肝细胞合成代谢,促进肝细胞分裂增殖周期,使肝脏体积更快速增长,进而加速肝脏功能的恢复;而干扰CaMKⅡγ的表达将阻滞肝细胞代谢及分裂,减缓肝体积增长和功能恢复。此研究是在前期CaMKⅡγ对肝再生影响研究基础上的重要补充。不仅为肝再生的实验研究提供参考,也为肝再生的临床应用提供理论依据。预计CaMKⅡγ将作为临床应用中调控肝再生的重要靶点。
贺无恙[9]（2020）在《运动调控PGC1a/PINK1/PARKIN信号对老龄重度后肢缺血小鼠骨骼肌功能的影响》文中提出目的:随着人口老龄化的进展,老年人群外周动脉疾病的患病率呈逐年升高的趋势。重度下肢缺血是外周动脉疾病严重的临床表现,不仅导致肢体坏死和截肢,还升高心血管事件风险、增加了死亡率。老年人群对重症肢体缺血易感,但传统的血运重建治疗不能显着降低其截肢率、死亡率。因此改善骨骼肌功能对提高老年重症肢体缺血患者的生活质量、延长预期寿命至关重要。线粒体不仅是骨骼肌细胞的能量工厂,更是决定细胞命运的关键调控环节。运动是靶向作用于线粒体的高效、经济的“非药物处方”,虽然运动能显着提高间歇性跛行患者的运动能力和生活质量,鲜少研究探讨运动干预在重度下肢缺血治疗中的应用。本研究旨在明确运动对老年重症肢体缺血骨骼肌功能的作用,探讨其潜在的分子作用机制,解析运动对老年心血管疾病预后的影响,以期为老年心血管疾病的防治提供新的策略。方法:（1）本研究利用60只14月龄C57BL/6老龄雄性小鼠构建重度下肢缺血模型,分析为期4周的跑台运动方案对骨骼肌功能的影响,并从mRNA及蛋白层面探讨运动对线粒体稳态的潜在调控机制;（2）通过构建体外缺血的C2C12肌管细胞模型,分别用siRNA及小分子抑制剂3MA抑制PGC1a及线粒体自噬,予以电脉冲刺激（EPS）模拟运动对肌管细胞的影响,探索运动对线粒体稳态的分子作用机制;（3）本研究收集350例老年稳定型冠心病患者的血清,测定体力活动水平、握力、SMI以及骨转换标志物与3年主要不良心脑血管事件（MACCE）、心血管死亡率及全因死亡率的相关性,验证运动对老年心血管疾病预后的改善作用。结果:（1）运动促进老龄重度肢体缺血小鼠下肢骨骼肌功能及血流灌注的恢复（p均<0.05）;运动通过升高缺血肢体骨骼肌线粒体膜电位、ATP水平,抑制骨骼肌细胞凋亡（p均<0.05）;同时,运动促进缺血肢体骨骼肌线粒体分裂标志物（DRP1）和线粒体自噬标志物（LC3B）mRNA及蛋白水平的表达,这一效应可通过PGC1a/PINK1/PARKIN信号所介导（p均<0.05）。（2）与动物实验结果一致,EPS干预升高了缺血C2C12肌管细胞PGC1a/PINK1/PARKIN、DRP1、LC3B mRNA表达水平（p均<0.05）;siRNA下调PGC1a基因表达可显着削弱经EPS上调的PINK1/PARKIN、DRP1、LC3B表达水平（p均<0.05）;3MA抑制线粒体自噬后,PGC1a/PINK1/PARKIN、DRP1表达水平升高（p均<0.05）。（3）基线体力活动水平较高的老年冠心病患者,可能通过改善骨骼肌功能,降低了3年MACCE的风险及全因死亡率（p均<0.05）。结论:（1）运动促进重度肢体缺血后骨骼肌血流灌注和功能恢复,同时可通过升高骨骼肌线粒体功能,以改善缺血肢体骨骼肌超微结构、抑制缺骨骼肌细胞凋亡;（2）运动可能通过上调PGC1a/PINK1/PARKIN信号通路,促进线粒体分裂、线粒体自噬,以维持线粒体稳态。（3）升高老年冠心病患者体力活动水平,有利于改善外周动脉疾病等危症-冠心病的不良预后,而这一效应可能通过改善骨骼肌功能、影响骨骼肌质量与心血管疾病潜在分子联系以实现。
孔繁达[10]（2020）在《补肾活血方调控Wnt/β-catenin通路抑制心梗后心室重构治疗慢性心衰机制研究》文中研究说明目的:本研究通过建立心梗后心衰模型,在“心肾相关”理论指导下应用补肾活血方治疗心衰大鼠,观察补肾活血方对大鼠实验疗效,明确其改善大鼠心室重构作用,并以Wnt/β-catenin信号通路为契合点,从在体及离体两个层面进一步探讨补肾活血方改善心室重构的具体分子机制。材料与方法:1.心梗后心衰大鼠模型建立及评价。购买130只SPF级雄性SD大鼠（体重250±20g）,随机选出30只用于心梗后心衰大鼠模型建立及评价,剩余100只用于后续其他实验。将选出的30只大鼠随机分为假手术组与模型组,每组15只。通过结扎大鼠冠脉左前降支（left anterior descending artery,LAD）造成大鼠大面积心肌梗死,随机选取术后存活大鼠3只,于术后第三天行2,3,5-氯化三苯基四氮唑（2、3、5-Triphenytetrazoliumchlor ide,TTC）染色测量大鼠心肌梗死面积,其余术后存活大鼠进行力竭式游泳,1次/日,并减半喂食（按体重计算标准饲料量/2）,持续4周,造成慢性心衰大鼠模型,假手术组大鼠冠脉LAD只挂线,不结扎,术后正常饮食。造模过程中,观察大鼠存活状况,造模结束后计算大鼠存活率,观察两组大鼠体征（包括心率、呼吸频率、尿量等）,采用超声法测量大鼠射血分数（ejection fraction,EF）,称取大鼠体重及心脏重量计算心重指数（heart weight index,HWI）,酶联免疫吸附（enzyme-linked immuno sorbent assay,ELISA）法检测大鼠血清脑钠肽（brain natriuretic peptide,BNP）、血管紧张素Ⅱ（angiotensin Ⅱ,Ang Ⅱ）含量。通过上述方法综合评价心梗后心衰模型制备的可靠性。2.补肾活血方对慢性心衰大鼠心功能及“心肾相关”指标的影响。购买的130只SPF级雄性SD大鼠,上述实验使用30只,剩余100只。在剩余的100只SPF级雄性SD大鼠中随机挑选20只作为假手术组,其余80只大鼠通过结扎大鼠冠脉LAD造成心肌梗死,术后进行力竭式游泳及饥饿,造成慢性心衰大鼠模型（造模操作手法同上述实验）。将造模后存活大鼠随机分为模型组、补肾活血组、赖诺普利组。赖诺普利组大鼠给予赖诺普利片配置成的混悬液2.0mg/kg·d（按人鼠剂量换算）灌胃,每天1次,每次3ml;补肾活血组大鼠给予补肾活血方熬制汤剂灌胃,剂量为18.0g/kg·d（按人鼠剂量换算）,每天1次,每次3ml;假手术组和模型组大鼠每日给予常规等容积蒸馏水灌胃,每天1次,每次3ml。各组均给药4周。药物治疗4周后超声检测各组大鼠舒张末期左心室内径（LVEDD）,收缩末左心室内径（LVESD）并计算EF值及左心室短轴缩短分数（FS）,处死大鼠取材,制作心肌病理切片并采用HE染色法（纵切）观察各组大鼠心肌形态改变,Elisa法测定各组大鼠血清BNP表达水平,免疫蛋白印记（Western blotting,WB）法检测大鼠肾组织中Klotho蛋白表达水平,反转录聚合酶链式反应（reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR）法检测大鼠肾组织骨桥蛋白（osteopontin,OPN）信使核糖核酸（messenger ribonucleic cid,m RNA）表达情况。3.观察补肾活血方对心梗后心衰大鼠模型Wnt/β-catenin信号通路的干预,探讨补肾活血方抗心肌肥大改善心室重构机制。动物造模及药物治疗同上。药物治疗4周后,采用HE染色法（横切）观察心肌横截面面积,Elisa法测定各组大鼠血清Wnt3a表达水平,WB法检测各组大鼠心肌β-连环蛋白（β-catenin）、散乱蛋白1（dishevelled 1,Dvl1）、磷酸化糖原合酶激酶3β（phosphorylated glycogen synthase kinase-3β,p-GSK3β）水平,RT-PCR法检测大鼠心肌组织Myc m RNA表达情况。4.观察补肾活血方对H9C2心肌细胞肥大模型Wnt/β-catenin信号通路的干预,探讨补肾活血方抗心肌肥大机制,明确补肾活血方调控Wnt/β-catenin信号通路的主要靶点。含药血清制备:购买20只大鼠,随机选出10只给予补肾活血方熬制汤剂18.0g/kg·d灌胃,每天1次,每次3ml,灌胃1周后取材收集大鼠血清,离心制备补肾活血方含药血清;另外10只大鼠给予等量蒸馏水灌胃,1周后取材收集大鼠血清,离心制备正常大鼠血清。购买H9C2细胞株,根据实验设计分为四组。应用96孔板培养细胞。正常组心肌细胞共转染Top-flash质粒、p RL-TK质粒及对照质粒,转染时添加正常大鼠血清培养液;模型组心肌细胞用Ang Ⅱ(10-8mol/L)刺激24h,然后共转染Top-flash质粒、p RL-TK质粒及对照质粒,转染时添加正常大鼠血清培养液;中药组心肌细胞用Ang Ⅱ(10-8mol/L)刺激24h,然后共转染Top-flash质粒、p RL-TK质粒及对照质粒,转染时添加补肾活血方含药血清培养液;中药实验组心肌细胞用Ang Ⅱ(10-8mol/L)刺激24h,然后共转染Top-flash质粒、p RL-TK质粒及持续活化型β-catenin质粒,转染时添加补肾活血方含药血清培养液。为消除误差,实验另设对照,将上述分组中Top-flash换为Fop-flash。将96孔板置于37℃、5%CO2培养箱中48h,应用Dual-Glo?Luciferase Assay System双荧光报告系统检测细胞荧光值。另取24孔板,孔中铺圆形玻片,按上述分组方法培养细胞并转染,转染后取出玻片用显微镜观察心肌细胞面积,鬼笔环肽法观察心肌细胞F-actin荧光强度及细胞形态。结果:1.造模完成时,模型组大鼠死亡4只,LAD结扎后大鼠心电图显示ST段明显抬高,幅度超过0.1m V;TTC染色显示术后大鼠心肌梗死面积为39.46%。造模结束时模型组大鼠心率、呼吸频率高于假手术组,尿量少于假手术组（P﹤0.01）;模型组大鼠EF均值低于45%,低于假手术组（P﹤0.01）;模型组大鼠心重指数高于假手术组（P﹤0.01）;模型组大鼠血清BNP、Ang Ⅱ水平明显高于假手术组（P﹤0.01）。2.用药4周后,与假手术组比较,模型组大鼠LVEDD、LVESD升高,EF、FS值降低,血清BNP水平明显升高,心肌结构紊乱,部分胞核溶解,肾组织Klotho蛋白表达降低,OPN m RNA表达升高（P﹤0.01）;与模型组大鼠比较,补肾活血组大鼠LVEDD、LVESD降低,EF、FS值升高,血清BNP水平明显降低,心肌结构改善,肾脏Klotho蛋白表达升高,OPN m RNA表达降低（P﹤0.01）;与赖诺普利组比较,补肾活血组大鼠超声指标、肾组织Klotho蛋白及OPN m RNA表达无差异（P﹥0.05）。3.用药4周后,与假手术组比较,模型组大鼠心肌横截面面积增大,Wnt经典通路配体Wnt3a血清水平降低,心肌组织β-catenin、Dvl1、p-GSK3β蛋白表达明显升高,心肌组织Myc m RNA表达升高（P﹤0.01）;与模型组比较,补肾活血组及赖诺普利组大鼠心肌横截面面积变小,血清Wnt3a水平升高,心肌组织Dvl1、p-GSK3β蛋白表达明显降低,心肌组织Myc m RNA表达降低（P﹤0.01）,补肾活血组心肌组织β-catenin表达较高（P﹤0.01）,赖诺普利组心肌组织β-catenin蛋白表达变化不明显（P﹥0.05）;与赖诺普利组相比,补肾活血组大鼠心肌横截面面积无差异（P﹥0.05）,血清Wnt3a水平较高,心肌组织β-catenin、Dvl1、p-GSK3β蛋白表达较低,Myc m RNA表达降低（P﹤0.01）。4.显微镜下观察正常组H9C2细胞,可见细胞多呈长梭形。模型组H9C2细胞面积增大,F-actin荧光强度明显高于正常组（P﹤0.01）,细胞内微丝增多增粗,细胞横向增宽,形态不规则,提示H9C2细胞肥大模型成功,双荧素酶报告系统显示模型组H9C2细胞荧光值明显高于正常组（P﹤0.01）;相比于模型组,中药组H9C2细胞面积缩小,细胞多呈梭形,F-actin荧光强度降低,细胞内微丝较细,双荧素酶报告系统的荧光值降低（P﹤0.01）;相比于中药组,中药实验组H9C2细胞面积增大,细胞形态不规则、粗大,细胞内F-actin荧光强度增强（P﹤0.01）,微丝增多增粗,双荧光系统荧光值明显升高（P﹤0.01）。结论:1.结扎LAD可见大鼠心电图ST段明显升高并有大面积心肌梗死,说明手术流程可靠;术后大鼠经力竭式游泳、饥饿造成慢性心衰模型,其体征符合临床表现,心脏重量增加,心功能（BNP、EF值）降低,心衰时RAAS系统主要指标Ang Ⅱ升高,贴近临床,是可靠的慢性心衰造模方法。2.补肾活血方可提高慢性心衰大鼠心功能（BNP、EF值）,改善心肌排列,改善心室结构（LVEDD、LVESD）,调节“心肾相关”因子Klotho、OPN的表达,明确“心肾相关”理论对于慢性心衰治疗的指导地位。3.补肾活血方可下调大鼠心肌组织中β-catenin、Dvl1、p-GSK3β蛋白表达,下调Myc m RNA表达,表明补肾活血方可调控Wnt/β-catenin信号通路中的多个信号分子靶点,并通过Wnt/β-catenin信号通路发挥抑制心肌肥大作用。补肾活血方对Wnt/β-catenin信号通路主要干预靶点在Dvl1。4.实验显示,Ang Ⅱ可刺激H9C2细胞肥大,且其机制与激活Wnt/β-catenin信号通路有关,补肾活血方可通过抑制Wnt/β-catenin信号通路达到抑制心肌肥大的作用,其作用靶点位于通路传导中β-catenin的上游,结合体内实验可推断补肾活血方对Wnt/β-catenin信号通路主要干预靶点在Dvl1。
二、自制缝合针模板在眼科的应用（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、自制缝合针模板在眼科的应用（论文提纲范文）
（1）转基因兔乳汁中重组吸血蝙蝠唾液纤溶酶原激活剂的纯化、结构分析和药效研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 符号说明 |
| 第一部分 文献综述 |
| 1 血栓性疾病与溶栓药物的研究进展 |
| 1.1 血栓的概述及溶栓机理 |
| 1.2 去氨普酶(DSPA)研究进展 |
| 1.3 其它生物溶栓药物的研究进展 |
| 1.4 问题及展望 |
| 2 乳腺生物反应器研究进展 |
| 2.1 乳腺生物反应器简介 |
| 2.2 乳腺生物反应器优势 |
| 2.3 作为乳腺生物反应器的常用动物 |
| 2.4 乳腺生物反应器应用 |
| 2.5 问题与展望 |
| 3 蛋白质分离纯化研究进展 |
| 3.1 蛋白质分离纯化概述及其常用技术 |
| 3.2 乳腺生物反应器生产的重组蛋白的分离纯化 |
| 3.3 DSPA的分离纯化 |
| 3.4 问题与展望 |
| 参考文献 |
| 第二部分 研究内容 |
| 第一章 乳腺特异性表达rDSPA转基因兔的传代繁殖 |
| 1 材料 |
| 1.1 动物 |
| 1.2 实验仪器 |
| 1.3 实验试剂 |
| 1.4 常用试剂的配制 |
| 1.5 DSPA编码区设计 |
| 2 方法 |
| 2.1 rDSPA转基因兔传代扩群 |
| 2.2 rDSPA转基因兔乳中rDSPA体外活性检测 |
| 2.3 rDSPA转基因兔乳中rDSPA表达水平检测 |
| 3 结果 |
| 3.1 rDSPA转基因兔传代扩群 |
| 3.2 rDSPA转基因兔后代测交 |
| 3.3 rDSPA转基因兔乳中rDSPA体外活性检测 |
| 3.4 rDSPA转基因兔乳中rDSPA表达水平检测 |
| 4 讨论 |
| 5 参考文献 |
| 第二章 原核表达去氨普酶(DSPA)基因载体的构建 |
| 1 材料 |
| 1.1 载体 |
| 1.2 实验仪器 |
| 1.3 实验试剂及耗材 |
| 1.4 常用试剂配制 |
| 2 方法 |
| 2.1 DSPA功能基因的引物设计 |
| 2.2 PCR扩增pCL25/DSPA表达载体 |
| 2.3 PCR产物和表达载体双酶切 |
| 2.4 PCR产物和表达载体酶切产物纯化 |
| 2.5 DSPA与pET-28a表达载体连接 |
| 2.6 DSPA与pET-28a表达载体连接产物转化TOP10 |
| 2.7 菌落PCR鉴定 |
| 2.8 pET-28a/DSPA重组质粒提取 |
| 2.9 pET-28a/DSPA重组质粒转化Rosetta |
| 2.10 pET-28a/DSPA原核表达载体诱导DSPA蛋白表达 |
| 2.11 亲和层析柱纯化DSPA |
| 2.12 蛋白透析 |
| 2.13 浓缩及定量 |
| 3 结果 |
| 3.1 pCL25/DSPA表达载体的构建 |
| 3.2 pET-28a/DSPA原核表达载体诱导DSPA蛋白表达及可溶性鉴定 |
| 3.3 Ni-NTA Resin亲和层析柱纯化DSPA |
| 4 讨论 |
| 5 参考文献 |
| 第三章 rDSPA单克隆抗体制备及筛选 |
| 1 材料 |
| 1.1 实验动物及免疫原 |
| 1.2 实验仪器 |
| 1.3 实验试剂及材料 |
| 1.4 常用试剂配制 |
| 2 方法 |
| 2.1 小鼠免疫 |
| 2.2 小鼠血清检测 |
| 2.3 细胞融合 |
| 2.4 阳性杂交瘤细胞株的筛选 |
| 2.5 阳性杂交瘤细胞株的单克隆化 |
| 2.6 多羟基反应单克隆抗体(PR-mAb)的筛选 |
| 2.7 阳性杂交瘤细胞的扩大培养和冻存 |
| 2.8 rDSPA单克隆抗体(PR-mAb)的大量制备 |
| 3 结果 |
| 3.1 免疫小鼠血清检测 |
| 3.2 阳性杂交瘤细胞株的筛选 |
| 3.3 阳性杂交瘤细胞株的单克隆化鉴定结果 |
| 3.4 多羟基反应单克隆抗体(PR-mAb)的筛选 |
| 3.5 小鼠腹水抗体制备及腹水抗体ELISA检测 |
| 3.6 小鼠腹水抗体纯化及SDS-PAGE蛋白电泳检测 |
| 3.7 纯化抗体的ELISA检测 |
| 4 讨论 |
| 5 参考文献 |
| 第四章 转基因兔乳中rDSPA的纯化 |
| 1 材料 |
| 1.1 纯化原料 |
| 1.2 实验仪器 |
| 1.3 实验试剂及耗材 |
| 1.4 常用试剂配制 |
| 2 方法 |
| 2.1 兔乳前处理 |
| 2.2 硫酸铵沉淀兔乳清蛋白 |
| 2.3 DSPA及兔乳清蛋白等电点预测 |
| 2.4 小鼠单抗与亲和介质的偶联 |
| 2.5 免疫亲和层析法纯化转基因兔乳中rDSPA |
| 2.6 强阳离子交换层析法纯化转基因兔乳中rDSPA |
| 2.7 苯甲醚亲和层析法纯化转基因兔乳中rDSPA |
| 2.8 赖氨酸亲和层析法纯化转基因兔乳中rDSPA |
| 2.9 活性蓝亲和层析法纯化转基因兔乳中rDSPA |
| 2.10 纯化产物脱盐 |
| 2.11 FAPA 法检测rDSPA |
| 2.12 SDS-PAGE检测rDSPA |
| 2.13 Western Blot检测rDSPA |
| 2.14 纯化产物纯度测试 |
| 2.15 纯化产物去除内毒素 |
| 2.16 纯化产物内毒素检测 |
| 2.17 rDSPA注射剂配制 |
| 3 结果 |
| 3.1 兔乳前处理 |
| 3.2 硫酸铵沉淀兔乳清蛋白 |
| 3.3 DSPA及兔乳清蛋白等电点预测 |
| 3.4 纯化小鼠单抗与亲和介质的偶联 |
| 3.5 免疫亲和层析法纯化转基因兔乳中rDSPA |
| 3.6 强阳离子交换层析法纯化转基因兔乳中rDSPA |
| 3.7 苯甲醚亲和层析法纯化转基因兔乳中rDSPA |
| 3.8 赖氨酸亲和层析法纯化转基因兔乳中rDSPA |
| 3.9 活性蓝亲和层析法纯化转基因兔乳中rDSPA |
| 3.10 转基因兔乳中rDSPA的最终纯化方案 |
| 3.11 纯化产物脱盐 |
| 3.12 纯化产物SDS-PAGE及Western Blot检测 |
| 3.13 纯化产物纯度测试 |
| 3.14 纯化产物去除内毒 |
| 3.15 纯化产物内毒素检测 |
| 3.16 DSPA注射剂配制 |
| 4 讨论 |
| 5 参考文献 |
| 第五章 乳腺特异性表达rDSPA纯化产物的结构和功能检测 |
| 1 材料 |
| 1.1 检测样品 |
| 1.2 实验仪器 |
| 1.3 实验试剂及耗材 |
| 2 方法 |
| 2.1 rDSPA转基因兔乳汁中rDSPA信号肽序列切割位点预测 |
| 2.2 蛋白质N端测序 |
| 2.3 蛋白质C端测序 |
| 2.4 相对分子量测序 |
| 2.5 纯化产物体蛋白三维结构模拟 |
| 2.6 纯化产物体外活性测试 |
| 3 结果 |
| 3.1 rDSPA转基因兔乳汁中rDSPA信号肽序列切割位点预测 |
| 3.2 蛋白质N端测序 |
| 3.3 蛋白质C端测序 |
| 3.4 相对分子量测序 |
| 3.5 纯化产物蛋白三维结构模拟 |
| 3.6 纯化产物体外活性测试 |
| 4 讨论 |
| 5 参考文 |
| 第六章 rDSPA体内外溶栓效果的初步评价 |
| 1 材料 |
| 1.1 检测样品 |
| 1.2 实验动物 |
| 1.3 实验仪器 |
| 1.4 实验试剂及耗材 |
| 1.5 常用试剂配制 |
| 2 方法 |
| 2.1 体外血凝块溶解试验 |
| 2.2 角叉菜胶制备大鼠尾部血栓模型 |
| 2.3 体内溶栓试验 |
| 2.4 大鼠血浆rDSPA半衰期试验 |
| 2.5 数据统计分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 rDSPA体外血凝块溶解效果评价 |
| 3.2 大鼠尾部血栓模型制备结果 |
| 3.3 rDSPA对大鼠尾部血栓模型溶栓效果评价 |
| 3.4 大鼠血浆rDSPA半衰期评价 |
| 4 讨论 |
| 5 参考文献 |
| 全文结论 |
| 附录一 |
| 附录二 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
| 致谢 |
（2）基于“阳化气，阴成形”理论研究TGF-β1/Smads影响黄韧带肥厚的机制及模型的建立（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略词 |
| 第一部分 文献综述 |
| 综述一 黄韧带肥厚的机制及动物模型建立的研究进展 |
| 参考文献 |
| 综述二 TGF-β1/Smads信号通路与纤维化 |
| 参考文献 |
| 第二部分 实验研究 |
| 实验一 基于“阳化气,阴成形”理论研究IL-1β、TNF-α和TGF-β1/Smads在LFH中的表达及相关性 |
| 前言 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 标本收集 |
| 1.2 纳入与排除标准 |
| 1.3 影像学测量 |
| 1.4 主要器械、设备、试剂等 |
| 1.5 手术方式 |
| 1.6 标本的取材、运输等标准操作规程 |
| 1.7 HE染色与组织形态学观察 |
| 1.8 Masson染色与纤维化观察 |
| 1.9 免疫组化法检测两组黄初带IL-lp、TNF-α、TGF-β1/Smads (TGF-β1、p-Smad2/3、Smad7)、Col1和Col3蛋白的定位、半定量表达 |
| 1.10 实时焚光聚合酶链式反应（Real-Time PCR)检测IL-1β、TNF-α、TGF-β1/Smads (TGF-β1、Smad2、Smad3、Smad7)、Col1、Col3&mRNA表达 |
| 1.11 统计学方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 一般资料 |
| 2.2 HE染色结果 |
| 2.3 Masson染色结果 |
| 2.4 免疫组化结果 |
| 2.5 Real-Time PCR结果 |
| 2.6 DLSS组内黄韧带厚度和各层纤维化分级的相关性分析 |
| 2.7 DLSS组内黄韧带厚度和各层弹性-胶原纤维比的相关性分析 |
| 2.8 DLSS组内黄韧带厚度和各层mRNA表达的相关性分析 |
| 3 讨论 |
| 3.1 炎症与纤维化是黄韧带肥厚的主要病理机制 |
| 3.2 黄韧带背侧层是退变的起点 |
| 3.3 基于“阳化气,阴成形”理论探讨黄韧带“炎症-纤维化”病理过程 |
| 3.4 基于“阳化气,阴成形”理论探讨DLSS的中医药治疗 |
| 3.5 其他 |
| 4 结论 |
| 参考文献 |
| 实验二 基于三种造模方法诱导大鼠黄韧带肥厚动物模型的建立与评价 |
| 前言 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 主要器械、设备、试剂等 |
| 1.3 实验动物的分组与取材 |
| 1.4 实验动物的造模 |
| 1.5 影像学测量 |
| 1.6 HE染色与大鼠黄韧带厚度的测量 |
| 1.7 Masson染色与大鼠黄韧带纤维化观察 |
| 1.8 免疫组化法检测各组黄初带IL-1β、TNF-α、TGF-β1/Smads (TGF-β1、p-Smad2/3、Smad7)、Col1、Col3蛋白的定位、半定量表达 |
| 1.9 免疫印迹法定性、半定量分析IL-1β、TNF-α、TGF-β1和Coll蛋白在各组黄韧带内表达 |
| 1.10 Real-Time PCR检测 IL-1β、TNF-α、TGF-β1/Smads (TGF-β1、Smad2、Smad3、Smad7)、Col1、Col3的mRNA表达 |
| 1.11 统计学方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 HE染色与大鼠黄韧带厚度的结果 |
| 2.2 Masson染色与大鼠黄韧带纤维化的结果 |
| 2.3 影像学测量结果 |
| 2.4 免疫组化结果 |
| 2.5 免疫印迹结果 |
| 2.6 Real-Time PCR结果 |
| 2.7 大鼠黄韧带与人增厚黄韧带的比较 |
| 2.8 模型成功率 |
| 3 讨论 |
| 3.1 大鼠黄韧带肥厚模型的建立方法 |
| 3.2 大鼠黄韧带肥厚的病理表现 |
| 3.3 机械应力是诱发或加速黄韧带肥厚的重要因素 |
| 3.4 基于“阳化气,阴成形”理论探讨大鼠黄韧带增厚模型的建立 |
| 4 结论 |
| 参考文献 |
| 结语 |
| 不足与展望 |
| 创新点 |
| 致谢 |
| 附件 |
（3）VEGFA在肝再生及非酒精性脂肪性肝病中的功能及机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 第一部分肝细胞中的Gata3/Ramp2 调控PEDF/VEGFA分子流影响肝窦内皮细胞再生的研究 |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 肝细胞源的VEGFA通过激活肝星状细胞加速非酒精性脂肪性肝病向肝癌转化 |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 文献综述 血管新生在肝脏损伤后修复中作用的研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间发表论文情况 |
| 致谢 |
（4）中国被毛孢菌丝体对小鼠心衰模型的治疗作用及机制研究（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 冬虫夏草发酵菌丝体 |
| 1.1.1 冬虫夏草发酵菌丝体概述 |
| 1.1.2 冬虫夏草发酵菌丝体的药理作用 |
| 1.2 心力衰竭 |
| 1.2.1 心力衰竭的流行病学 |
| 1.2.2 心力衰竭的机制 |
| 1.2.3 心力衰竭动物疾病模型 |
| 1.3 选题意义及研究内容 |
| 1.3.1 选题意义 |
| 1.3.2 研究内容 |
| 第二章 小鼠主动脉弓缩窄心力衰竭模型构建 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验材料及试剂 |
| 2.2.1 实验动物 |
| 2.2.2 实验试剂和药物 |
| 2.2.3 主要实验仪器 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 小鼠主动脉弓心衰模型的建立 |
| 2.3.2 彩色多普勒血流成像鉴定模型 |
| 2.3.3 M型超声心动图测定小鼠心室结构和心功能 |
| 2.3.4 小鼠左心室质量指数测量 |
| 2.3.5 病理组织学检查小鼠心肌病变程度 |
| 2.3.6 统计学方法 |
| 2.4 结果与分析 |
| 2.4.1 TAC手术小鼠的存活情况及并发症 |
| 2.4.2 TAC术后模型鉴定 |
| 2.4.3 TAC术后不同时期左心室质量指数变化 |
| 2.4.4 TAC术后不同时期小鼠的心室结构变化 |
| 2.4.5 TAC术后不同时期小鼠的心功能变化 |
| 2.4.6 TAC术后不同时期心肌HE染色 |
| 2.4.7 TAC术后不同时期心肌Masson染色 |
| 2.5 讨论 |
| 2.6 本章小结 |
| 第三章 中国被毛孢菌丝体对小鼠主动脉弓缩窄心衰模型的治疗作用 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验材料及试剂 |
| 3.2.1 实验动物 |
| 3.2.2 实验试剂和药物 |
| 3.2.3 主要试剂的配制 |
| 3.2.4 主要实验仪器 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 小鼠主动脉弓心衰模型的建立 |
| 3.3.2 动物分组及给药方法 |
| 3.3.3 M型超声心动图测定小鼠心室结构和心功能 |
| 3.3.4 小鼠左心质量指数测量 |
| 3.3.5 血流动力学检测小鼠心功能 |
| 3.3.6 病理组织学检查小鼠心肌病变程度 |
| 3.3.7 Western blot检测小鼠心肌中纤维化相关基因相对蛋白表达水平 |
| 3.3.8 RT-qPCR检测小鼠心肌中纤维化相关基因mRNA的转录水平 |
| 3.3.9 统计学方法 |
| 3.4 结果与分析 |
| 3.4.1 TAC手术小鼠的存活情况 |
| 3.4.2 HSM对TAC术后心衰小鼠左心室质量指数的影响 |
| 3.4.3 HSM对TAC术后心衰小鼠左心室结构的影响 |
| 3.4.4 HSM对TAC术后心衰小鼠心功能的影响 |
| 3.4.5 HSM能有效改善TAC术后小鼠心肌组织病理改变 |
| 3.4.6 HSM抑制TAC术后心衰小鼠心肌纤维化相关基因的表达 |
| 3.5 讨论 |
| 3.6 本章小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
（5）β-石竹烯调节CI-AMPARs膜转运保护急性缺血性脑卒中及卒中后认知功能障碍的作用及机制研究（论文提纲范文）
| 英汉缩略语名词对照 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 第一部分 β-石竹烯保护急性缺血性脑卒中及卒中后认知功能障碍 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 第二部分 β-石竹烯促进急性缺血性脑卒中后CI-AMPARs膜转运 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 第三部分 β-石竹烯通过PKA依赖的CI-AMPARs膜转运保护急性缺血性脑卒中及卒中后认知功能障碍 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 文献综述 AMPARs转运调节与突触可塑性之间的关系 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的论文 |
（6）无菌治疗包内缝合针生锈及散落的防范与改进（论文提纲范文）
| 1 缝合针表面生锈可能存在的原因 |
| 2 处理措施 |
| 4 结论 |
（7）血塞通对MCAO大鼠及OGD/R损伤SH-SY5Y细胞Lingo-1及EGFR/PI3K/Akt通路和BDNF的作用机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 符号说明 |
| 第一部分 文献综述 |
| 综述一 缺血性中风的中医理论渊源和Lingo-1及其下游信号通路的研究现状 |
| 1 中医学对缺血性中风的认识 |
| 2 中医药在缺血性中风治疗中的优势 |
| 3 缺血性中风的研究现状 |
| 4 Lingo-1及其下游信号通路的研究进展 |
| 5 小结 |
| 参考文献 |
| 综述二 中药材三七及三七皂苷R_1的研究进展 |
| 1 中药材三七及其主要活性成分简述 |
| 2 三七皂苷R_1及研究现状 |
| 3 名贵中药三七及制剂的应用及前景 |
| 参考文献 |
| 前言 |
| 第二部分 动物实验研究 |
| 实验一 血塞通对MCAO大鼠神经功能恢复的作用 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验步骤 |
| 3 实验结果 |
| 4 小结 |
| 参考文献 |
| 实验二 血塞通对MCAO大鼠术后神经可塑性的作用 |
| 1 材料与方法 |
| 2 实验结果 |
| 3 小结 |
| 参考文献 |
| 实验三 血塞通对MCAO大鼠Lingo-1及其下游EGFR/PI3K/Akt信号通路的调节作用 |
| 1 材料与方法 |
| 2 实验结果 |
| 3 小结 |
| 参考文献 |
| 第三部分 细胞实验研究 |
| 实验四 血塞通对氧糖剥夺/再灌注损伤SH-SY5Y细胞BDNF表达的影响 |
| 1 实验材料与方法 |
| 2 实验结果 |
| 3 小结 |
| 参考文献 |
| 实验五 血塞通对氧糖剥夺/再灌注损伤SH-SY5Y细胞PI3K/Akt信号通路的作用 |
| 1 实验材料及方法 |
| 2 实验结果 |
| 3 小结 |
| 参考文献 |
| 结语 |
| 附录1 EZ Longa评分表 |
| 附录2 mNSS评分量表 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（8）CaMKⅡγ的过表达及干扰对大鼠肝部分切除术后肝脏再生的影响（论文提纲范文）
| 缩略词表 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 第一部分 大鼠肝部分切除及慢病毒转染动物模型的建立 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 CaMKⅡγ表达变化对大鼠肝切除术后肝再生的影响及机制研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 肝切除术后肝再生调控机制的研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间获得的学术成果 |
| 致谢 |
（9）运动调控PGC1a/PINK1/PARKIN信号对老龄重度后肢缺血小鼠骨骼肌功能的影响（论文提纲范文）
| 英汉缩略语名词对照 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一部分 运动对老龄重度下肢缺血小鼠骨骼肌功能的影响 |
| 第一节 CLI小鼠模型的构建 |
| 1.材料与器械 |
| 2.实验方法 |
| 3.实验结果 |
| 第二节 运动对老龄CLI小鼠骨骼肌功能及肢端血流的影响 |
| 1.材料与器械 |
| 2.实验方法 |
| 3.统计学方法 |
| 4.实验结果 |
| 第三节 运动对老龄CLI小鼠骨骼肌线粒体功能及超微结构的影响 |
| 1.材料与器械 |
| 2.实验方法 |
| 3.统计学方法 |
| 4.实验结果 |
| 第四节 运动对老龄CLI小鼠骨骼肌线粒体动力学及线粒体自噬的影响 |
| 1.材料与器械 |
| 2.实验方法 |
| 3.统计学方法 |
| 4.实验结果 |
| 第二部分 运动调控线粒体分裂、线粒体自噬的信号转导机制 |
| 第一节 运动对缺血肢体骨骼肌PGC1a/PINK1/PARKIN的影响 |
| 1.材料与器械 |
| 2.实验方法 |
| 3.统计学方法 |
| 4.实验结果 |
| 第二节 运动通过PGC1a/PINK1/PARKIN对线粒体分裂、线粒体自噬的调节机制 |
| 1.材料与器械 |
| 2.实验方法 |
| 3.统计学方法 |
| 4.实验结果 |
| 第三部分 运动对老年患者心血管病预后的影响 |
| 1.材料与器械 |
| 2.实验方法 |
| 3.统计学方法 |
| 4.结果 |
| 讨论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 文献综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读博士学位期间论文发表及承担的科研项目 |
（10）补肾活血方调控Wnt/β-catenin通路抑制心梗后心室重构治疗慢性心衰机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 英文缩略词表 |
| 前言 |
| 论文一 心梗后心衰大鼠模型的建立与评价(前言) |
| 材料与方法 |
| 实验结果(附论文图片) |
| 讨论 |
| 小结 |
| 论文二 基于“心肾相关”理论探讨补肾活血方对Klotho、OPN及心室重构的影响(前言) |
| 材料与方法 |
| 实验结果(附论文图片) |
| 讨论 |
| 小结 |
| 论文三 基于Wnt/β-catenin通路补肾活血方抑制心梗后心衰大鼠心肌肥大机制研究(前言) |
| 材料与方法 |
| 实验结果(附论文图片) |
| 讨论 |
| 小结 |
| 论文四 补肾活血方调控Wnt/β-catenin通路抑制HC92 心肌细胞肥大机制研究(前言) |
| 材料与方法 |
| 实验结果(附论文图片) |
| 讨论 |
| 小结 |
| 结论 |
| 本研究创新性的自我评价 |
| 参考文献 |
| 综述一 Wnt/β-catenin 信号通路与心室重构的关系 |
| 参考文献 |
| 综述二 “心肾相关”理论源流及研究进展 |
| 参考文献 |
| 个人简介 |
| 在学期间科研成绩 |
| 致谢 |
四、自制缝合针模板在眼科的应用（论文参考文献）
- [1]转基因兔乳汁中重组吸血蝙蝠唾液纤溶酶原激活剂的纯化、结构分析和药效研究[D]. 张婷. 扬州大学, 2021
- [2]基于“阳化气，阴成形”理论研究TGF-β1/Smads影响黄韧带肥厚的机制及模型的建立[D]. 王宝剑. 中国中医科学院, 2021(02)
- [3]VEGFA在肝再生及非酒精性脂肪性肝病中的功能及机制研究[D]. 沈皓. 中国人民解放军海军军医大学, 2021(01)
- [4]中国被毛孢菌丝体对小鼠心衰模型的治疗作用及机制研究[D]. 方明笋. 浙江大学, 2021(01)
- [5]β-石竹烯调节CI-AMPARs膜转运保护急性缺血性脑卒中及卒中后认知功能障碍的作用及机制研究[D]. 陈莎. 重庆医科大学, 2021(01)
- [6]无菌治疗包内缝合针生锈及散落的防范与改进[J]. 游灿. 当代护士(中旬刊), 2020(08)
- [7]血塞通对MCAO大鼠及OGD/R损伤SH-SY5Y细胞Lingo-1及EGFR/PI3K/Akt通路和BDNF的作用机制研究[D]. 吴爽. 北京中医药大学, 2020(04)
- [8]CaMKⅡγ的过表达及干扰对大鼠肝部分切除术后肝脏再生的影响[D]. 周焘. 昆明医科大学, 2020
- [9]运动调控PGC1a/PINK1/PARKIN信号对老龄重度后肢缺血小鼠骨骼肌功能的影响[D]. 贺无恙. 重庆医科大学, 2020(01)
- [10]补肾活血方调控Wnt/β-catenin通路抑制心梗后心室重构治疗慢性心衰机制研究[D]. 孔繁达. 辽宁中医药大学, 2020(01)