一、Tissue-specific expression of GFP reporter gene in germline driven by GATA-2 promoter and enhancers in zebrafish(论文文献综述)
许月园[1](2021)在《猪基因组顺式调控元件鉴定及功能SNP注释》文中进行了进一步梳理测序技术的迅速发展促进了猪参考基因组的日益完善。然而猪基因组中绝大多数的顺式调控元件尚不明确,这限制了猪作为动物蛋白供应和生物医学模型的遗传改良与应用。为了弥补这方面的空白,本研究采用类似于DNA元件百科全书(ENCODE)和Roadmap表观基因组计划的策略,基于转录组测序(RNA-seq)、染色质可及性测序(ATAC-seq)和组蛋白修饰(H3K27ac和H3K4me3)的染色质免疫共沉淀测序(Ch IP-seq),系统地阐述了4个猪种的12种不同组织中的顺式调控元件及其功能。为了进一步探索猪基因组的三维结构,本研究进行了高通量染色体构象捕获(Hi-C)实验。此外,由于猪基因组的单核苷酸多态性(SNP)位点大多位于非编码区域,以致于很难解释这些SNP的功能,因此本研究结合猪的表观基因组特征对SNP进行了功能注释。本研究的主要结果如下:(1)本研究通过自建库总共生成了199个数据集。基于猪sus Scr11参考基因组,总共鉴定出3316个猪基因组未被注释的新转录本,其中包括1713个长链非编码RNA(lnc RNA);总共鉴定出220,723个无冗余的猪基因组潜在顺式调控序列,其中包括37,838个启动子,146,399个增强子和137,838个开放染色质区域。通过与前人研究结果的对比以及双荧光素酶报告基因检测系统的实验验证,证实了本研究所鉴定顺式调控元件的准确性和可靠性。(2)基于不同组织内的基因表达量或增强子H3K27ac信号强度,本研究识别出4510个组织特异性基因和15,753个组织特异性增强子,功能富集分析结果也进一步证实了它们的组织特异性。此外,在每个品种的每种组织内分别鉴定了414-1306个超级增强子、418-1899个宽H3K4me3峰和13,971-20,138个活性启动子,并且发现这些顺式调控元件与猪的基因表达相关。(3)构建了猪骨骼肌组织的Hi-C互作图谱,鉴定出40kb分辨率下的2305个拓扑相关结构域(TAD)和11,838个染色质环(loop),基于相同TAD内增强子和/或基因的斯皮尔曼相关系数,筛选出了显着相关的增强子-基因对(R>0.5)、增强子-增强子对(R>0.5)和基因-基因对(R>0.8)。此外,本研究发现79.15%的猪TAD边界与人类基因组功能保守,表明TAD结构在猪和人类之间具有很强的保守性。(4)比较了顺式调控元件在不同物种之间的保守性,发现人类与猪的保守性高于人类与小鼠的保守性。猪和人类的一对一同源基因在相对应地多个组织中呈现出相似的表达模式,并且同源基因附近(±500 kb)的H3K27ac信号强度在两个物种之间的斯皮尔曼相关系数显着高于非同源基因附近的H3K27ac信号强度的相关系数。这些结果可以为猪作为动物模型研究人类疾病提供重要的参考价值。(5)本研究对4个猪种的5种组织分别进行了基因表达的品种间差异分析,总共鉴定出7708个无冗余的差异表达基因(FDR<0.05),这些差异基因的活性启动子或显着相关增强子的H3K27ac信号强度与这些差异基因的变化趋势一致,该结果表明品种间基因的差异表达可能与其启动子或增强子的差异组蛋白修饰相关。(6)本研究总共鉴定出了251,361个位于活性启动子或增强子区域且中西方猪等位基因频率差异的SNP。其中Chr1:190035161位点的T/C SNP和Chr12:5451199位点的G/C SNP可能与大白猪和恩施黑猪之间差异表达的基因SIX1,SIX4和ACOX1相对应的顺式调控元件活性相关。本研究还发现增强子在已发表的全基因组关联研究(GWAS)显着相关的SNP附近高度富集,说明这些增强子在猪复杂性状的遗传调控中具有潜在的调控功能。(7)根据SNP位点所在的功能区域及其影响转录因子结合的可能性,本研究对22,926,176个SNP(最小等位基因频率不小于0.0407)进行了注释和分类,最终筛选出了6,071,960个潜在的功能SNP位点,为筛选影响猪重要经济性状或疾病表型的关键调控位点提供了重要参考资源。其中位于猪基因组Chr14:23914097位置的T/C SNP可作为猪黑色素瘤研究的一个关键候选位点。
崔爽[2](2021)在《肿瘤中EphA2超级增强子的识别及其功能与机制的研究》文中认为超级增强子(Super-enhancer,SE)是由连续排列的增强子串联形成的增强子簇,能够促进关键基因的表达,这些关键基因在机体发育和疾病发生过程中定义了细胞的身份。与增强子相比,超级增强子在基因组上跨度范围更广、转录因子结合密度更大以及诱导转录的能力更强。大量研究表明超级增强子在多种肿瘤中被异常激活,调控癌症中的关键癌基因,促进肿瘤的发生与发展。本文通过生物信息学方法,识别了一个在10种不同肿瘤细胞中活性高于正常组织或细胞中的超级增强子,EphA2-SE。本研究首次揭示了EphA2-SE在肿瘤中的功能以及对靶基因EphA2的转录调控机制。本研究首先在超级增强子数据库内识别了一个新的超级增强子并进行了实验验证。以本实验室前期开发的SEA超级增强子数据库为基础,结合其它三个超级增强子数据库,以组蛋白H3K27ac为识别标志在十种不同肿瘤细胞中识别出了一个超级增强子,EphA2-SE。ChIP实验结果表明活性组蛋白修饰H3K27ac富集在超级增强子的三个组分增强子上。染色质互作关系网站分析结果显示EphA2-SE的靶基因为邻近的上下游基因ARHGEF19和EphA2。BRD4抑制剂JQ1能够抑制超级增强子驱动基因的表达,实验结果表明JQ1能够以浓度依赖性和时间依赖性的方式降低EphA2-SE靶基因EphA2的表达。生物信息学分析发现EphA2在宫颈癌、结直肠癌、乳腺癌、胰腺癌、肺癌、胸腺癌和胃癌中的表达高于正常组织,并且高表达的EphA2与结直肠癌、肺癌、乳腺癌和胰腺癌肿瘤患者的不良预后密切相关。以上结果表明,EphA2-SE在10种不同肿瘤细胞中均具有活性,主靶基因为EphA2,EphA2对BRD4抑制敏感并与多种肿瘤患者的生存期降低相关。本研究进一步解析了EphA2-SE在肿瘤细胞中对EphA2的调控机制,明确了EphA2-SE的核心成分及主转录因子。通过双荧光素酶报告系统确认了EphA2-SE的组分增强子活性,在HeLa、HCT-116和MCF-7三种肿瘤细胞中E1组分增强子活性远高于另外两个组分增强子并且是最小的核心活性单元。结合生物信息学分析与siRNA实验明确了结合在EphA2-SE上的转录因子,FOSL2和TCF7L2结合在E1组分增强子的不同位置共同促进E1组分增强子的活性。FOSL2和TCF7L2在E1增强子上结合位点的缺失导致E1增强子活性的显着下调。siRNA介导的FOSL2的TCF7L2的表达下调导致EphA2表达的降低。这些结果表明E1组分增强子通过招募FOSL2和TCF7L2转录因子发挥增强子活性并将转录因子募集到EphA2启动子处促进EphA2的强烈转录。本研究最后明确了EphA2-SE在肿瘤细胞中的功能。通过RNA-seq高通量测序以及体内外细胞生物学特性分析发现EphA2-SE通过促进EphA2的表达推动肿瘤的发展进程。利用Crispr/Cas9技术在HeLa、HCT-116和MCF-7三种肿瘤细胞建立了EphA2-SE敲除细胞系。在三种细胞中EphA2-SE缺失后EphA2的表达均明显下调,表明在三种细胞中EphA2-SE的靶基因为EphA2。KEGG和GO分析显示EphA2-SE参与肿瘤细胞的生长和迁移。EphA2-SE的缺失阻断了PI3K/AKT和WNT信号通路进而影响细胞的生物学特性。EphA2-SE缺失导致肿瘤细胞增殖、侵袭和迁移能力的降低,细胞周期进程的改变。但EphA2的回复能够挽救EphA2-SE缺失带来的影响。裸鼠体内成瘤实验结果表明EphA2-SE的缺失导致EphA2的表达降低,并在体内影响肿瘤的生长与血管形成。以上结果表明EphA2-SE通过驱动靶基因EphA2介导PI3K/AKT和WNT信号通路影响细胞的增殖、克隆形成、侵袭和迁移。综上所述,EphA2-SE是一个位于人类1号染色体并且在10种肿瘤细胞中活性高于正常组织或细胞的超级增强子,靶基因之一为EphA2,EphA2对BRD4抑制敏感并与多种肿瘤患者的不良预后相关。阐明了EphA2-SE的核心成分E1增强子通过招募转录因子FOSL2和TCF7L2驱动靶基因EphA2表达的分子机制。EphA2-SE通过驱动靶基因EphA2介导PI3K/AKT和WNT信号通路影响HeLa、HCT-116和MCF-7细胞的增殖、克隆形成、侵袭和迁移,并且在体内影响肿瘤生长与瘤内新生血管的形成。这些结果表明EphA2-SE在今后有望成为肿瘤治疗的潜在靶点。
沈丹[3](2020)在《Tc1/mariner转座子挖掘、高活性成员鉴定及其在增强子捕获中的应用》文中进行了进一步梳理随着越来越多生物基因组测序工作的完成,科学界对转座子在生命科学的重要性的理解和认识也逐渐加深。已有研究表明转座子在生物界分布广泛,对基因和基因组进化发挥重要作用,并可能影响物种分化和品种(品系)形成。另外由于转座特性,一些DNA转座子被成功开发成遗传操作工具,如SB,PB和Tol2等,在转基因、基因治疗和功能基因组学研究领域中得到广泛应用,并取得重要进展。其中,Tc1/mariner超家族是一类广泛分布的DNA转座子。到目前为止,已经鉴定到了 10多个具有天然活性的Tc1/mariner转座子,但只有人工分子重构的SB转座子得到广泛应用。本研究对斑马鱼基因组的Tc1/mariner超家族进行了系统挖掘和高活性成员应用评估,并对Tc1/mariner超家族中的DD41D/VS家族的分布和传播等进化特性进行了系统研究,主要包括以下研究内容:1.重头挖掘了斑马鱼基因组中的Tc1/mariner转座子,并进行了系统分类、插入年龄分析、转座酶结构域预测等研究;2.DD41D/VS转座子家族的分布、插入年龄分析、横向传播规律等研究;3.ZB转座子在哺乳动物中的转座活性和特性分析;4.ZB转座子在斑马鱼增强子捕获中的应用研究,捕获增强子鉴定验证;5.ZB转座子介导鼠精子突变体库构建及增强子捕获研究。主要结果如下:1、对Tc1/mariner超家族中另一个家族DD41D(Visitor,VS)进化分析表明:VS转座子在动物中分布广泛,在140个非脊椎动物和30个脊椎动物(其中12个为哺乳动物,包括1个灵长类)和1个植物检测到VS分布。VS在脊椎动物和非脊椎动物中发生了多次横向传播。进化关系和序列相似性矩阵分析显示DD41D/VS与DD37D/maT和DD34D/mariner关系更近,而DD40D是源自DD41D家族,而非一个独立的进化分支。插入年龄分析表明脊椎动物中VS的插入年龄差异明显,鳍鱼类和蟾蜍为年轻插入,其次是蝙蝠和有袋动物,而无颚鱼类和蜥蜴中主要是古老的VS转座插入。细胞试验表明源自蝙蝠基因组中结构完整的VS转座子已经失去转座活性。2、通过斑马鱼基因组的Tc1/mariner超家族的系统挖掘,共鉴定到10个自主和77个非自主Tc1/mariner转座子,占5.41%(90.69 Mb)。进化关系分析显示:Tc1-1DR,Tc1-4DR,Tc1-8BDR,Mariner-6DR,Mariner-7DR,Mariner-13DR,Mariner-15DR和Tc1-21DR这八个转座子属于DD34E/Tc1家族,而Mariner-14DR属于DD37E/TRT家族,Mariner-18DR属于DD×D/pogo家族。这些转座酶都具有保守的DNA结合结构域(DBD)和催化结构域(DDE/D)。其中Tc1-8BDR(命名为ZB转座子)全长1597 bp,中间为1个可编码341 aa的转座酶基因,两侧是201 bp的TIRs,且目标位点重复序列(TSD)为“TA”。ZB转座子在斑马鱼基因组中有25个拷贝,其中能编码完整转座酶的拷贝有20个,同源性大于99%。插入年龄分析显示,ZB转座子最年轻,可能具有较高的活性。3、细胞实验表明高剂量时ZB活性显着高于其他三个常用转座子(SB、PB和Tol2)(p<0.05),且ZB和SB、PB和Tol2一样也存在转座酶过量抑制现象,但存在细胞和剂量差别,在低剂量(10 ng)转座子转染HepG2细胞和高剂量(500 ng)转染Hela细胞时,四个转座子均出现了过量抑制,但是在高剂量(500ng)转染HepG2细胞时,ZB和Tol2没有出现抑制现象。ZB转座后留下“CA/TG”三碱基“足迹”,与SB和Frog Prince转座子相同。ZB插入偏好性分析表明,ZB转座子是非随机插入到基因组中,对基因调控序列有一定的偏好性,且偏好插入6个TA碱基短回文序列(ATATATAT)。4、设计构建了 ZB和Tol2转座子介导的斑马鱼增强子捕获载体,并通过显微注射,分别获得60和87个ZB和Tol2转座子介导的斑马鱼增强子捕获品系。经荧光显微镜检测,ZB介导的增强子捕获效率与Tol2相近,生殖系传递效率分别为55.56%(n=108)和55.77%(n=156)。且ZB比Tol2更倾向于产生单一GFP表达模式后代(p<0.05),Tol2更倾向于产生多GFP表达模式的后代(表型数≥2)。通过Sp-PCR成功注解了 4个ZB(ZK32,ZK36,ZK47和ZK68)和2个Tol2(TK1和TK4)介导的增强子捕获品系。VISTA注解共获得13个潜在的增强子,并对其中的8个进行了增强子鉴定和活性验证。5、设计构建了鼠增强子捕获载体及ZB转座子介导鼠精子突变体库。通过显微注射,分别制备了 ZB转座子和转座酶的转基因鼠,并成功构建含转座子和转座酶的双转基因公鼠4只(精子突变体库),与野生的母鼠杂交制备突变体。通过常规PCR和Linker-PCR对12窝,共135个后代小鼠检测,获得72只ZB转座子转基因阳性鼠,61个后代的插入位点与父本的转座子原插入位点一致,11个后代插入到了新位点,ZB转座子重新转座的效率为15.3%(11/72),高于SB和PB(约10%)。并获得GFP阳性鼠3只(n15、n19和n111),VISTA注解获得11个潜在的增强子。总体而言,本文系统揭示了Tc1/mariner转座子超家族中DD41D/VS家族在生物界的进化规律,及Tc1/mariner转座子在斑马鱼基因组上构成、种类、进化动力学等特性,成功挖掘了高活性ZB转座子,并系统评估了其转座活性和特性,构建了 ZB介导的鼠精子突变体库,在模式动物斑马鱼和鼠上进行增强子捕获应用研究。证实ZB能够高效介导基因转移,在转基因、基因治疗、功能基因组学等研究中具有很大应用潜力。
范同强[4](2019)在《早期胚胎发生阶段细胞命运决定的染色质可及性研究》文中提出形成不同组织或细胞的细胞谱系在早期胚胎发育时期已经得到了广泛的研究,但是哺乳动物、植物和真菌的潜在基因调控网络的共同特征以及在早期胚胎发育期间驱动细胞命运转变的表观遗传变化仅得到部分的研究。理解细胞命运决定机理是一个引人入胜的生物学问题,并且在过去的十年里得到了广泛的关注。随着基因组研究的深入,真核生物基因组非编码区在转录调控中的重要作用不断被揭示。真核生物的非编码调节区约占全基因组的97%,其中包括许多调节元素,如,启动子、增强子和沉默子。这些调节元件不仅具有重要的生物学功能,而且与许多重要疾病密切相关。在真核生物的非编码区,转录因子(TFs)和转录因子部分结合区域构成真核生物复杂的转录调控系统,关于这方面,近年来一直是研究的热点。正常的生命活动需要大量的转录因子,并且已经证明许多转录因子在细胞命运决定中起着决定性的作用。多细胞生物的发育始于单细胞受精卵,其经历快速的细胞分裂和细胞发育。卵子受精后,与精子融合形成受精卵,胚胎开始发育。生物体从受精卵发育成多细胞生物体的过程是复杂且受到严格调控的,其受多种转录因子和基因复合物的调控。这一胚胎发育的早期阶段对于确保生物体的适应性也是至关重要的。本文选择了六个具有代表性的物种,包括人类(Homo sapiens Linnaeus)、小鼠(Mus musculus Linnaeus)、果蝇(Drosophila melanogaster Meigen)、秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans Maupas)、拟南芥(Arabidopsis thaliana L.Heynh)和酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae Meyen ex E.C.Hansen),以此来比较不同物种细胞命运决定潜在的调控机理的异同点。在这里,本文使用ATAC-seq数据集在早期胚胎发育过程中对人、小鼠、果蝇、线虫、拟南芥和酿酒酵母的染色质变化进行了综合性的联合研究。通过利用染色质可及性和早期胚胎转录组的动态变化,鉴定了一系列参与早期胚胎发育的细胞命运决定的转录因子。通过重建早期胚胎细胞命运决定的调控回路,且在另外五个物种中发现了很多与人类早期胚胎细胞命运转录因子同源的转录因子,且这些转录因子同样具有细胞命运决定的功能,如,在果蝇中,lz-Med-Mad-pnr-toytll-zen通路控制眼睛细胞命运和发育;prd、fkh、pnr和pan对腺体细胞命运决定是必不可少的;su(Hw)、ac、Su(H)、Kr、tll、D、pnr、pnt和gcm促进神经系统发育。hlh-2、pha-4、hlh-1和pal-1对线虫表皮细胞命运决定具有重要的作用。在拟南芥中,JKD、GL2、GL3和EGL3形成调控回路控制根表皮细胞模式,HAT2、HAT3、BZR1和BIM1促进幼苗发育,KAN、PHB、PHV和BIM1形成调控复合物促进叶片发育和决定叶片正极性。在酵母中,RIM101、FKH1、FKH2、MSN2、MSN4、ABF2、DAL80和CBF1形成调控回路参与响应逆境胁迫。本研究为跨物种早期胚胎发育中细胞命运决定的进化机理提供了一个有趣的研究方向。
钟亚东[5](2019)在《基于Cre/loxP改进增强子捕获研究肝脏和胰腺β细胞的发育和再生》文中指出肝脏和胰腺是来源于胚胎内胚层的两个重要的消化器官。肝脏在新陈代谢过程中发挥着广泛的作用,包括糖类代谢,脂类的体内平衡和酮体的产生,氨基酸的新陈代谢,对摄入各类化合物的解毒以及维持血液中代谢物和蛋白质的生理浓度。肝实质细胞(占肝脏细胞类型70-75%)负责执行绝大多数这些肝功能,并且和胆管上皮细胞(占肝脏细胞类型10-15%)一起组成肝实质。胰腺分别由执行内分泌功能和外分泌功能的两类腺体构成。外分泌腺细胞产生并且分泌消化酶,占整个胰腺细胞质量的95%。四种胰腺内分泌细胞负责产生不同的胰腺激素,α细胞产生胰高血糖素,β细胞产生胰岛素,δ细胞产生抑生长素,PP细胞产生胰腺多肽。斑马鱼和哺乳动物的肝脏和胰腺在发育的分子调控方面显示出惊人的相似性,它们拥有相同的细胞和亚细胞结构,并且共同拥有保守的生理学功能。所有这些标准都使得斑马鱼能作为一种研究肝脏和胰腺β细胞发育和再生的可靠动物模型。成体中的肝胰器官都具有维持组织更新和损伤后再生的能力,既可以是通过剩余细胞复制而来,也可以通过多潜能的前体细胞分化而来,或则由其他类型的细胞转分化而来。哺乳动物的研究提供了以上所有机制都存在的证据,具体由哪种机制参与肝胰器官的稳态维持和损伤后的再生应答取决于具体的实验操作和分析方法。但是,具体有哪些前体细胞或分化的细胞能贡献给肝胰组织的稳态平衡或者损伤后的再生,以及控制这个过程的分子途径仍然充满了未知。因此去寻找参与肝脏和胰腺β细胞维持稳态或者参与损伤后再生的前体细胞,以及控制这一过程的关键调控基因将是非常引人入胜的研究。目前还未见到肝脏和胰腺β细胞在正常发育和损伤后再生过程中,能直观地在活体中反映特异基因表达的方法手段。在本研究中,我们以组织特异性标记肝脏和胰腺β细胞的转基因斑马鱼为动物模型,结合增强子捕获,大规模地筛选参与肝胰发育,维持生理功能和损伤后再生的相关基因。我们分别构建了标记肝实质和胰腺β细胞的转基因斑马鱼,Tg(fabp10:loxPCFPNTR-loxP-DsRed)和Tg(ins:loxP-CFPNTR-loxP-DsRed),然后再与Tg(10×UAS:Cre,cryaa:Venus)杂交,分别得到以Cre/loxp系统为基础的标记肝脏和胰腺的双转基因鱼Tg(fabp10:loxP-CFPNTR-loxP-DsRed;10×UAS:Cre,cryaa:Venus)和Tg(ins:loxP-CFPNTR-loxP-DsRed;10×UAS:Cre,cryaa:Venus)。与CFP荧光蛋白所融合的硝基还原酶NTR能把无害的剧毒前体MtZ还原为剧毒,从而导致所含NTR的细胞的死亡。我们发现在10毫摩尔浓度MtZ处理24小时后,肝实质细胞和胰腺β细胞都能被完全地诱导凋亡,并且在撤除药物后的24小时和48小时出现明显的再生。通过大量注射含有转座子原件Tol2的GAL4到1细胞期胚胎,我们构建了1000条增强子捕获的F0.在肝脏和胰腺的转基因鱼Tg(fabp10:loxPCFPNTR-loxP-DsRed;10×UAS:Cre,cryaa:Venus)和Tg(ins:loxP-CFPNTR-loxPDsRed;10×UAS:Cre,cryaa:Venus)中,含有在上游激活元件UAS控制下表达的同源重组酶CRE,只有当UAS元件被GAL4转录因子结合的情况下,Cre才能在细胞质表达。让这些增强子捕获F0分别与标记肝脏和胰腺的Tg(fabp10:loxPCFPNTR-loxP-DsRed;10×UAS:Cre,cryaa:Venus)和Tg(ins:loxP-CFPNTR-loxPDsRed;10×UAS:Cre,cryaa:Venus)杂交,然后观察肝脏和胰腺β细胞的荧光标记的颜色变化,从而筛选潜在的肝胰特异性插入。通过1000次杂交筛选,我们得到了一些能使肝脏和胰腺β细胞从蓝色标记变成红色标记的增强子插入,然后定位插入的基因组位置。所有靠近插入位置的候选基因都用原为杂交鉴定能否在肝胰特异性表达的基因。同时运用转基因品系的优势,用能在硝基还原酶Nitroreductase作用下变成细胞毒素的甲硝唑Mtz,特异性的损伤了肝脏实质细胞和胰腺β细胞,并且对这两类细胞的再生过程进行了筛选。我们运用此种方法在肝脏和胰腺β细胞发育和再生过程中,都鉴定出了组织特异性表达的基因,并且对此永久谱系标记方法与传统增强子捕获的效果进行了比较,我们发现基于Cre/LoxP的增强子捕获能筛选到发育再生过程中瞬间表达和相对较弱表达的基因。值得注意的是,在肝脏发育过程中表达的基因rnd2,在β细胞发育过程中表达的基因rab3da和在肝脏再生过程中表达的基因ensab在此改进的筛选中表现出比传统增强子捕获更高的效率。因此,运用永久标记的增强子捕获为筛选器官发育和再生过程中较弱表达,瞬时表达又潜在重要的基因提供了有运用前景的方法。
任刚[6](2015)在《转录因子、染色质重塑复合物以及远程染色质相互作用对基因表达调控的研究》文中进行了进一步梳理基因的转录调控是一个精细、复杂的过程,是在大量的反式作用因子包括序列特异性转录因子、组蛋白修饰酶和染色质重塑酶共同协调作用下进行的。同时调控过程发生在染色质结构的背景下,这也影响基因的转录调控。为了解染色质结构在基因转录调控中的功能,本文首先研究了CTCF(又叫11-锌指蛋白或CCCTC-结合因子)蛋白在远程染色质相互作用中的功能。最近基因组范围的研究揭示哺乳动物的基因组形成拓扑相关结构域(Topologically associated domains,TADs)和子功能域。同时以前的研究表明绝缘体结合蛋白:CTCF主要在维持染色质结构域边界中发挥关键作用。然而,本研究中发现绝大部分的CTCF结合位点在染色质结构域内与增强子交错分布,并不显示其染色质结构域边界的功能,尤其是分布在结构域内的CTCF结合位点与附近的增强子活性呈正相关,通过本研究得出如下结论:1、用改进的高分辨率的Super-C方法,分别在小鼠ES和CD4 T细胞中鉴定出90518个和81773个高可信度相互作用,这些相互作用分布于启动子,P300结合的增强子以及CTCF结合的绝缘子之间。2、通过分析Super-C得到的高分辨率的相互作用,发现CTCF结合位点和增强子在基因组的分布相互交织,存在广泛的相互作用;并与增强子-启动子的相互作用以及增强子活性呈正相关。3、在ES和TH2细胞中的分析结果表明,细胞特异性基因的表达与细胞特异性启动子-增强子相互作用呈正相关。4、利用CRISPR/Cas9技术敲除CTCF结合位点后严重降低了增强子-启动子的相互作用及增强子活性。证明CTCF的主要功能之一是通过与这些基因调控区域直接结合,促进增强子和启动子之间通过形成DNA环而产生相互作用,调控基因表达。5、干扰CTCF表达后导致不同细胞间同一基因表达的变异增加,这表明CTCF介导的稳定的启动子-增强子相互作用在维持基因表达的稳定性方面起重要作用。目前尽管已有大量的关于不同转录因子和组蛋白修饰的研究,但有关这些转录因子和组蛋白修饰是如何协同调控基因表达的具体机制仍不清楚。为了阐明转录因子和组蛋白修饰复合物协同调控基因表达的具体机制,本研究分析了在细胞抗病毒活性中至关重要的序列特异性调控因子干扰素调节因子1(Interferon regulatory factor 1,IRF1)和干扰素调节因子2(Interferon regulatory factor 2,IRF2),是如何与BAF染色质重塑复合物相互协作、共同调控Toll样受体3(Toll-like receptor 3,TLR3)基因的表达的。通过本研究得出如下结论:6、TLR3基因和其他干扰素诱导基因的诱导表达必需有IRF2因子的参与。7、虽然IRF1和IRF2都与BAF染色质重塑复合物直接结合,IRF2主要调控细胞正常状态下TLR3基因启动子的活性,而IRF1主要调控干扰素刺激状态下TLR3基因启动子的活性。这表明IRF1和IRF2因子在招募BAF复合物、基因诱导表达的不同阶段发挥着不同的功能。8、IRF2的主要功能是在细胞未受干扰素刺激的状态下,保持TLR3基因基础水平的表达,主要是通过维持TLR3基因启动子区域处于开放的染色质结构与活化的组蛋白修饰状态(H3K9/K14乙酰化和H3K4三甲基化修饰)来实现的;而IRF1则主要是在干扰素刺激后迅速取代TLR3基因启动子区域的IRF2,进而快速激活TLR3基因的高表达。因此,在细胞抗病毒应答中,对IRF转录因子家族成员之间的分工对于协调基因的转录激活至关重要。本研究的结果将为人们理解复杂的基因表达调控提供理论基础。
屈永贵[7](2014)在《若干斑马鱼转基因品系的建立及其初步功能研究》文中研究表明心脏形成是一个错综复杂的过程,信号途径与转录因子和粘附分子对心脏细胞增殖、分化,心脏细胞的多样性以及不同心脏细胞的形态发生起调控作用。通过构建心脏组织高表达基因启动子和增强子的转基因品系来确定基因的生物学功能,对理解心脏发育的机制和发展有效地治疗手段奠定了理论基础。GFP和RFP可在不同物种中作为活体报告基因,真实地追踪基因的表达和蛋白质的定位,,因此可用于研究基因对心脏发育的调控功能。To12是发现于青鳉中的一个鱼源转座系统,利用To12转座酶系统构建转基因斑马鱼品系能显着提高转基因成功的效率,该To12转座子系统为斑马鱼心脏发育候选基因的功能研究提供了很大方便。HDGC3基因是本研究室筛选鉴定的一个在心脏和肌肉中高表达的心脏发育候选基因。本室前期研究结果表明HDGC3在斑马鱼的心脏和肌肉组织中有高水平的表达,为了进一步研究HDGC3在心脏发育过程中的功能,本文基于To12转基因技术,建立了若干心脏转基因斑马鱼模型。我们分别利用斑马鱼cmlc2和Titin启动子构建了转基因表达载体pTo12(cmlc2:HDGC3-EGFP)和pTo12(Titin: HDGC3-EGFP),将这两个转基因载体分别与To12转座酶按照一定比例混合注射到斑马鱼一细胞期受精卵中,在荧光显微镜下筛选鉴定出有绿色荧光表达的胚胎,建立了稳定遗传的HDGC3斑马鱼转基因品系:Tg (cmlc2:HDGC3-EGFP)和Tg (Titin:HDGC3-EGFP),并初步分析了在转基因斑马鱼品系过表达HDGC3对心脏发育的影响;同时,我们克隆了HDGC3基因启动子序列,利用该启动子序列建立了Tg (HDGC3:EGFP)转基因品系。通过检测绿色荧光表达获得的结果表明:HDGC3基因在斑马鱼胚胎发育早期的心脏和肌肉表达。这些转基因斑马鱼实验模型的建立对于研究HDGC3基因在心脏发育中的功能具有重要意义。
庄兰芳[8](2011)在《家蚕转基因载体元件的结构优化及在基因功能分析中的应用研究》文中认为家蚕既是支撑蚕丝产业的生物基础,又是鳞翅目昆虫研究的典型模式种类,同时,也是开发新一代生物反应器和新型昆虫产业的材料。近几年来对其的科学研究所取得的成果具有较高的学术价值,代表了国际同领域的先进水平,特别是在遗传连锁图谱、家蚕基因组序列与结构等方面,使得结构基因组学开始过渡到了功能基因组学。在家蚕中基因功能的研究方法很多,转基因技术不乏为一个很优秀的手段。本文就有关基因功能研究中的家蚕转基因技术和方法开展了一些研究工作,主要的研究内容和得到的结果如下:1、家蚕转基因效率与转座子内部序列的相关分析自从基于piggyBac转座子方法的家蚕转基因成功问世以来,越来越多的研究学者利用该项技术来进行家蚕生物反应器和家蚕具有潜在经济性能的功能基因研究。然而该项技术的显微注射费时费力,而且成功率仅在3%~5%之间,不利于它的大规模推广与应用。为了提高家蚕转基因成功率,我们对piggyBac转座子载体进行了改造,敲除了载体中的冗余序列,构建得到了四种不同左右臂长度组合的转座子,分别进行了细胞水平和转基因家蚕水平的检测,其中左臂长333 bp、右臂长179 bp的转座子效率最高,经多次转基因实验证实,此种载体能将家蚕转基因效率提高2-7倍,更有利于开展家蚕转基因的研究。2、家蚕hsp70启动子的克隆及功能研究通过PCR的方法克隆得到家蚕热激蛋白70基因(Bombyx mori hsp70)的5’侧翼的两个长度分别为538 bp和305 bp的序列hsp70-538和hsp70-305。生物信息分析结果表明这两段序列在TATA序列的上游存在保守的热激元件(Heat Shock Element, HSE) CTnGAAnnTTCnAG。采用双荧光报告基因技术研究表明这两段序列在BmN细胞中都表现出热激活性,转基因家蚕实验证明hsp70-305在家蚕个体中也具有热激活性,可以认为这两个片段具有hsp70热激启动子特性,便于在家蚕中进行条件诱导的研究。3. IRES在家蚕表达系统中的应用通过化学合成的方法得到了来源于猪脑心肌炎病毒(Encephalomyocarditisvirus, EMCV)和禾谷缢管蚜虫病毒(Rhopalosiphum padi virus,RhPV)的四种不同长度的的内部核糖体进入序列(Internal Ribosome Entry Site, IRES) IRES,并将它们构建到pFastBac双荧光载体中,通过Bac-to-Bac的方法得到了相应的重组病毒后,在细胞及家蚕的3个组织中比较了它们的活性,结果显示IRES593的活性最高,家蚕组织中以中部丝腺的活性最高,其次是脂肪体和后部丝腺。4、启动子陷阱在家蚕基因功能研究应用中的技术探讨启动子陷阱是一种高通量、既能制造突变体同时又能得到被突变基因序列的研究方法,在陷阱系统的设计上我们综合了如上所述的3点成果,构建得到了两种转基因家蚕,一种是分别由hsp70、A3启动子控制表达转座酶的家蚕pBhsp70transposase3 xP3EGFP和pB A3 transpo sase3 xP3EGFP,另一种是带有检测基因EGFP的启动子陷阱家蚕。根据我们的初步研究结果表明:第一,由组成型启动子A3控制表达的转座酶能更有效地启动家蚕中转座子的再转座;第二,由于转座臂内可能残留有piggyBac转座酶启动子,因此陷阱中报告基因的方向应与原始转座酶的方向相反。piggyBac转座子插入位点特性的分析为更好的利用piggyBac转座子,本文还分析了piggyBac转座子在转基因家蚕基因组中的整合位点特征,得知有6%插入到内含子,12%插入到外显子,8%插入到基因的5’末端,3%插入到基因的3’末端,18%插入到了重复序列,53%插入到了基因间序列。本论文所取得的成果为基因功能研究提供了参考,为家蚕转基因效率的提高提供了技术储备,同时也为基因陷阱研究奠定了一定的研究基础。
高艳[9](2006)在《Pax6基因突变小鼠糖代谢异常分子机制的研究》文中进行了进一步梳理的因素,体内胰岛素的水平在糖尿病的发生、发展中起着决定性的作用。 胰岛素作为直接控制血糖水平的激素,其合成、分泌和成熟受很多因素的影响。其中,蛋白原转换酶1/3(proprotein convertase1/3,PC1/3)、蛋白原转换酶2(proprotein convertase2,PC2)在胰岛素的翻译后修饰过程起着十分重要的作用;PC1/3、PC2共表达于β细胞;而在α细胞、δ细胞及PP细胞则只有PC2存在。PC1/3、PC2联合作用完成了对胰岛素的剪切,胰岛素原经剪切成为成熟的胰岛素和C肽,才能发挥生理作用。此外,PC1/3、PC2在下丘脑和其它的内分泌器官中也有表达,对ACTH和α-MSH等内分泌肽的成熟起着同样的作用,PC1、PC2功能障碍将影响体内成熟激素的水平,进而可以影响机体对葡萄糖等物质的代谢过程。 胰高血糖素样肠肽1(glucagon-like peptide-1,GLP-1)是由小肠和大肠粘膜上皮的L型内分泌细胞分泌的一种参与调节血糖水平和短期摄食的内分泌型多肽。L型细胞来源于肠腺窝前体细胞,与胰岛的α细胞来源于共同的祖细胞,α细胞分泌的Glucagon和L型细胞分泌的GLP-1受同一基因Proglucagon的调控。研究证明在Proglucagon基因的启动子序列上有Pax6的结合位点,即Pax6可能影响Proglucagon基因的转录调控。 第一部分 ENu诱变和筛选得到Pax6基因突变小鼠 材料和方法: 本研究对191只雄性C57BL/6J近交系小鼠进行ENU化学诱变,获得3172只G1代。通过对G1代进行行为学、形态学、神经功能、学习记忆、听力、视觉生理、骨代谢、血糖和心功能等进行监测,筛选出595只与人类疾病相关的显性基因突变个体和117个可遗传品系,其中包括一个小眼品系DEBA。对此小眼小鼠品系DEBA利用微卫星标记技术和分子克隆技术,寻找突变基因,并对突变基因进行测序以确定突变位点,同时通过PCR和酶切的方法建立基因鉴定方法,Western Blot检测突变基因编码蛋白的表达。 结果: 1、ENU诱变并筛选得到小眼DEBA小鼠品系。
二、Tissue-specific expression of GFP reporter gene in germline driven by GATA-2 promoter and enhancers in zebrafish(论文开题报告)
(1)论文研究背景及目的
此处内容要求:
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景,再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题,并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例:
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
(2)本文研究方法
调查法:该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法:用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法:通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法:通过调查文献来获得资料,从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法:依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法:对研究对象进行“质”的方面的研究,这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法:通过具体的数字,使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法:运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法:这是社会科学用来分析社会现象的一种方法,从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法:通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、Tissue-specific expression of GFP reporter gene in germline driven by GATA-2 promoter and enhancers in zebrafish(论文提纲范文)
(1)猪基因组顺式调控元件鉴定及功能SNP注释(论文提纲范文)
摘要 |
ABSTRACT |
缩略词表(ABBREVIATIONS) |
1 前言 |
1.1 研究问题的由来 |
1.2 文献综述 |
1.2.1 顺式调控元件的功能及相关表型变异研究 |
1.2.2 DNA元件百科全书计划 |
1.2.3 猪基因组顺式调控元件研究进展 |
1.2.4 顺式调控元件的物种保守性 |
1.2.5 中西方猪的品种特征及差异比较 |
1.2.6 猪基因组SNP的功能研究进展 |
1.3 研究目的和意义 |
2 材料与方法 |
2.1 技术路线 |
2.2 实验材料 |
2.2.1 组织样品 |
2.2.2 细胞样品 |
2.3 实验方法 |
2.3.1 RNA-seq文库构建和测序 |
2.3.2 ChIP-seq文库构建和测序 |
2.3.3 ATAC-seq文库构建和测序 |
2.3.4 原位Hi-C文库构建和测序 |
2.3.5 细胞培养 |
2.3.6 双荧光素酶报告基因 |
2.3.7 反转录PCR(RT-PCR) |
2.3.8 高通量测序数据分析 |
3 结果 |
3.1 猪基因组的转录表达分析 |
3.1.1 RNA-seq数据质控 |
3.1.2 基因表达的组织特异性分析 |
3.1.3 新转录本的鉴定 |
3.2 猪基因组顺式调控序列的鉴定与分析 |
3.2.1 测序数据的比对与质控 |
3.2.2 顺式调控序列的鉴定 |
3.2.3 顺式调控元件的组织特异性 |
3.2.4 顺式调控元件的验证 |
3.3 猪三维基因组结构的鉴定与分析 |
3.3.1 猪骨骼肌组织Hi-C互作图谱构建 |
3.3.2 A/B compartment的划分 |
3.3.3 TAD的鉴定以及TAD内显着相关增强子-基因对的筛选 |
3.3.4 loop的鉴定以及loop锚点的motif富集分析 |
3.4 顺式调控元件及TAD的物种保守性分析 |
3.4.1 顺式调控元件在不同物种之间的保守性比较 |
3.4.2 猪和人类同源基因的表达模式比较 |
3.4.3 TAD的物种保守性分析 |
3.5 猪不同品种间的多组学差异分析 |
3.5.1 品种间差异表达基因的鉴定 |
3.5.2 组蛋白修饰的差异分析 |
3.5.3 基因组序列差异与组蛋白修饰差异的关联分析 |
3.6 猪基因组功能区域SNP的筛选 |
3.6.1 中外猪种差异等位基因频率SNP的鉴定 |
3.6.2 猪GWAS相关SNP附近的增强子富集 |
3.6.3 猪基因组功能SNP的注释与等级分类 |
4 讨论 |
4.1 猪基因组顺式调控序列的概况 |
4.2 猪基因组的三维染色质结构 |
4.3 顺式调控元件的物种保守性 |
4.4 猪品种间基因表达、基因组序列和组蛋白修饰的差异分析 |
4.5 具有潜在调控功能的猪基因组SNP |
5 小结 |
5.1 本研究的主要结果与结论 |
5.2 本研究的创新点与特色 |
5.3 本研究不足之处与下一步工作建议 |
参考文献 |
附录 |
攻读学位期间发表的论文题录 |
致谢 |
(2)肿瘤中EphA2超级增强子的识别及其功能与机制的研究(论文提纲范文)
摘要 |
Abstract |
第1章 绪论 |
1.1 课题的研究背景及意义 |
1.2 增强子的研究进展 |
1.2.1 增强子概述及其鉴定 |
1.2.2 增强子类型及作用方式 |
1.3 超级增强子研究进展简介 |
1.3.1 超级增强子概述 |
1.3.2 超级增强子的鉴定 |
1.3.3 超级增强子与3D基因组结构 |
1.3.4 超级增强子相关数据库 |
1.4 超级增强子与疾病的关系 |
1.4.1 超级增强子与肿瘤的关系 |
1.4.2 超级增强子在治疗中的应用 |
1.5 Eph/ephrin及 EphA2 的研究进展 |
1.5.1 Eph/ephrin的研究概况 |
1.5.2 EphA2 的研究进展 |
1.5.3 EphA2 与恶性肿瘤的研究进展 |
1.6 本文的主要研究内容及技术路线 |
1.6.1 文章的主要研究内容 |
1.6.2 技术路线 |
第2章 实验材料和方法 |
2.1 实验材料 |
2.1.1 实验动物及细胞系 |
2.1.2 实验试剂及仪器 |
2.1.3 常用网站和软件 |
2.2 实验方法 |
2.2.1 核酸的提取 |
2.2.2 实时定量PCR |
2.2.3 染色质免疫共沉淀(ChIP) |
2.2.4 蛋白质免疫印迹(Western Blot) |
2.2.5 双荧光素酶载体的构建与检测 |
2.2.6 敲除细胞系的建立 |
2.2.7 MTT增殖与克隆形成 |
2.2.8 细胞周期 |
2.2.9 细胞划痕 |
2.2.10 细胞侵袭和迁移 |
2.2.11 小鼠皮下成瘤 |
2.2.12 H&E染色与组织免疫荧光 |
2.2.13 ChIP-seq 数据与RNA-seq 数据 |
2.2.14 统计学分析 |
2.2.15 实验室质量控制 |
第3章 EphA2-SE的识别与鉴定 |
3.1 引言 |
3.2 超级增强子的生物信息学分析 |
3.2.1 超级增强子的识别 |
3.2.2 组分增强子的划分及活性检测 |
3.3 超级增强子靶基因的预测 |
3.4 EphA2 在肿瘤中的表达以及与预后关系的研究 |
3.4.1 EphA2在TCGA数据库肿瘤样本中的表达分析 |
3.4.2 EphA2 表达与预后相关 |
3.5 EphA2对BRD4 抑制敏感 |
3.6 本章小结 |
第4章 EphA2-SE在肿瘤细胞中对EphA2 的转录调控机制 |
4.1 引言 |
4.2 EphA2-SE核心组分的识别 |
4.3 EphA2-SE对 EphA2 调控机制的探究 |
4.3.1 结合E1 组分增强子的转录因子识别 |
4.3.2 E1 组分增强子上FOSL2和TCF7L2 转录因子结合位点分析 |
4.3.3 FOSL2和TCF7L2 调控E1 增强子活性及EphA2 表达 |
4.4 本章小结 |
第5章 RNA-seq高通量测序分析EphA2-SE的功能 |
5.1 引言 |
5.2 EphA2-SE缺失细胞系的建立 |
5.2.1 敲除靶点有效性的检测 |
5.2.2 稳转细胞系的建立 |
5.3 HeLa、HCT-116和MCF-7 细胞中差异表达基因分析 |
5.4 三种肿瘤细胞中共差异表达基因分析 |
5.5 本章小结 |
第6章 EphA2-SE影响肿瘤细胞基本生物学功能的研究 |
6.1 引言 |
6.2 EphA2-SE对肿瘤细胞生物学特性的影响 |
6.2.1 EphA2-SE影响肿瘤细胞的增殖与克隆形成 |
6.2.2 EphA2-SE对肿瘤细胞侵袭与迁移的能力的影响 |
6.2.3 EphA2-SE信号通路分析 |
6.3 EphA2-SE对裸鼠体内成瘤的影响 |
6.4 本章小结 |
结论 |
参考文献 |
附录 Ⅰ |
附录 Ⅱ |
附录 Ⅲ |
附录 Ⅳ |
附录 Ⅴ |
附录 Ⅵ |
攻读博士学位期间取得创新性成果 |
致谢 |
个人简历 |
(3)Tc1/mariner转座子挖掘、高活性成员鉴定及其在增强子捕获中的应用(论文提纲范文)
摘要 |
Abstract |
符号说明 |
第1章 文献综述 |
1.1 转座子 |
1.1.1 转座子的分类 |
1.1.2 DNA转座子的分类 |
1.1.3 Tc1/mariner转座子超家族的分类和进化 |
1.1.4 转座子的开发应用 |
1.2 目前脊椎动物中应用最广泛的转座子 |
1.2.1 SB转座子 |
1.2.2 PB转座子 |
1.2.3 Tol2转座子 |
1.3 转座子作为高效增强子捕获基因捕获工具 |
1.3.1 增强子的概念 |
1.3.2 增强子注释的方法 |
1.3.3 转座子作为脊椎动物ET的工具 |
1.3.4 三种捕获载体(增强子捕获载体,启动子捕获载体和基因捕获载体) |
1.4 本论文研究的目的及意义 |
第2章 Tc1/mariner超家族中DD41D家族Visitor(VS)的进化分析 |
2.1 材料方法 |
2.1.1 数据挖掘 |
2.1.2 序列和系统发育分析 |
2.1.3 VS转座活性分析 |
2.2 结果 |
2.2.1 VS转座子广泛分布在生物界 |
2.2.2 VS的进化动力学分析 |
2.2.3 VS转座子的结构特征 |
2.2.4 蝙蝠VS的转座活性评估 |
2.3 讨论 |
2.3.1 脊椎动物和哺乳动物中DNA转座子的入侵 |
2.3.2 脊椎动物和哺乳动物中DNA转座子的活性 |
2.3.3 VS与Tc1/mariner其他家族关系比较 |
第3章 斑马鱼基因组转座子的挖掘及进化分析 |
3.1 材料与方法 |
3.1.1 斑马鱼基因组中转座子组成和占比的获得 |
3.1.2 进化树的构建 |
3.1.3 转座子和转座酶各个结构的预测 |
3.1.4 转座子年龄的估计 |
3.1.5 转座子拷贝数的统计 |
3.2 结果 |
3.2.1 斑马鱼基因组中转座子的分布及含量 |
3.2.2 斑马鱼Tc1/mariner自主转座子的分析 |
3.2.3 活性斑马鱼转座子ZB |
3.3. 讨论 |
3.3.1 斑马鱼基因组中转座子的高丰度 |
3.3.2 斑马鱼转座子的多样性 |
3.3.3 斑马鱼转座子进化动力学比较 |
第4章 ZB转座子在哺乳动物细胞中的转座特性研究 |
4.1 材料与方法 |
4.1.1 ZB转座子和转座酶载体的构建 |
4.1.2 细胞培养 |
4.1.3 高剂量转座子浓度下,不同转座子转座活性的比较 |
4.1.4 低剂量转座子浓度下,不同转座子的转座活性比较 |
4.1.5 ZB转座子的转座“足迹” |
4.1.6 制备ZB转座子文库及Illumina sequencing |
4.1.7 插入位点分析 |
4.2 结果 |
4.2.1 ZB转座子与SB,PB,Tol2转座子的转座效率比较 |
4.2.2 ZB和SB转座子的交互作用 |
4.2.3 ZB转座子通过“剪切和粘贴”机制进人类基因组 |
4.2.4 ZB转座子的插入偏好 |
4.3 讨论 |
4.3.1 ZB转座子在人细胞中的高活性 |
4.3.2 转座酶越多,转座效率越低 |
4.3.3 ZB转座后留下足迹 |
4.3.4 ZB转座子的整合偏好 |
第5章 ZB转座子在斑马鱼中的增强子捕获应用 |
5.1 材料与方法 |
5.1.1 实验动物及试剂 |
5.1.2 斑马鱼增强子捕获载体的构建 |
5.1.3 斑马鱼显微注射 |
5.1.4 转座子在斑马鱼基因组中整合位点的鉴定 |
5.1.5 斑马鱼增强子的预测 |
5.1.6 克隆潜在增强子至增强子验证载体 |
5.1.7 斑马鱼整胚原位杂交(WISH)及潜在增强子的转录分析 |
5.2 结果 |
5.2.1 ZB和Tol2介导的增强子捕获效率比较 |
5.2.2 ZB介导的斑马鱼增强子捕获品系的注解 |
5.2.3 Tol2介导的斑马鱼增强子捕获品系的注解 |
5.2.4 潜在增强子的转录活性检测 |
5.3 讨论 |
5.3.1 转座子在转基因斑马鱼中的应用 |
5.3.2 ZB转座子可产生转基因斑马鱼 |
5.3.3 ZB倾向产生单一表型的斑马鱼后代 |
5.3.4 ZK系斑马鱼潜在增强子的注解 |
5.3.5 潜在增强子的实验验证 |
5.3.6 增强子可以转录出增强子RNA(eRNA) |
第6章 ZB转座子在小鼠增强子捕获中的应用 |
6.1 材料与方法 |
6.1.1 实验动物及饲养 |
6.1.2 小鼠增强子捕获载体和SB转座子介导的ZB转座酶表达载体的构建 |
6.1.3 sp-PCR鉴定小鼠插入位点 |
6.1.4 双转基因公鼠(突变体库)的制备 |
6.1.5 小鼠潜在增强子的预测 |
6.2 结果 |
6.2.1 ZB转座子制备转基因小鼠 |
6.2.2 ZB转座子用于精子突变体库的构建 |
6.2.3 增强子捕获小鼠品系的注解 |
6.2.4 荧光小鼠的增强子注解 |
6.3 讨论 |
6.3.1 ZB转座子可产生转基因小鼠 |
6.3.2 小鼠后代中可产生突变小鼠 |
6.3.3 荧光小鼠的增强子预测 |
全文结论 |
主要创新点 |
参考文献 |
附录一 VS在生物界中的分布汇总 |
附录二 斑马鱼中自主和非自主转座子汇总 |
攻读学位期间获得的科研成果 |
致谢 |
(4)早期胚胎发生阶段细胞命运决定的染色质可及性研究(论文提纲范文)
摘要 |
ABSTRACT |
引言 |
1 文献综述 |
1.1 转录调控机制 |
1.1.1 启动子 |
1.1.2 增强子 |
1.1.3 超级增强子 |
1.1.4 转录因子 |
1.1.5 染色质可及性 |
1.2 调控基因组学方法 |
1.2.1 下一代测序 |
1.2.2 调控基因组学方法 |
1.2.3 ATAC-seq |
1.2.3.1 ATAC-seq发展历程 |
1.2.3.2 ATAC-seq应用 |
1.2.4 R语言环境和Bioconductor项目 |
1.3 细胞命运决定 |
1.3.1 早期细胞命运决定 |
1.3.2 第二细胞命运决定 |
2 材料与方法 |
2.1 ATAC-seq数据获取 |
2.2 ATAC-seq数据分析 |
2.3 基因组注释和peak calling |
2.4 重叠开放染色质区域的表达和相关性分析 |
2.5 Peaks分布和功能富集分析 |
2.6 转录因子基序鉴定和GO注释 |
2.7 转录因子调控网络构建 |
2.8 公共基因表达谱获取 |
3 结果与讨论 |
3.1 不同发育阶段染色质动态变化 |
3.2 顺式调控元件功能注释 |
3.3 参与胚胎发育的转录因子的鉴定 |
3.4 细胞命运决定转录因子调控网络 |
4 结论 |
5 展望 |
参考文献 |
附录 |
个人简介 |
致谢 |
(5)基于Cre/loxP改进增强子捕获研究肝脏和胰腺β细胞的发育和再生(论文提纲范文)
摘要 |
Abstract |
第1章 综述 |
1.1 肝脏的功能和肝病 |
1.1.1 肝脏的结构功能 |
1.1.2 我国肝病的流行以及肝病发病机制 |
1.2 肝脏再生研究与临床治疗 |
1.2.1 肝实质细胞再生 |
1.2.2 肝前体细胞再生 |
1.2.3 肝脏成体干细胞及其调控机制 |
1.2.4 肝细胞移植治疗 |
1.3 胰内分泌腺和糖尿病 |
1.4 胰内分泌腺β细胞再生研究和糖尿病的治疗 |
1.4.1 胰内分泌腺β细胞的再生来源 |
1.4.2 产生全新胰腺内分泌细胞的策略 |
1.4.3 糖尿病治疗前景 |
1.5 增强子和基因捕获在斑马鱼基因表达中的运用 |
1.5.1 增强子和基因捕获的载体结构 |
1.5.2 转座子整合到基因组的效率 |
1.5.3 增强子捕获作为组织特异性的标记 |
第2章 材料和方法 |
2.1 实验材料 |
2.1.1 实验用动物以及饲养条件 |
2.1.2 实验用的试剂、耗材和仪器 |
2.1.3 主要实验仪器 |
2.1.4 菌株和质粒 |
2.1.5 LB培养基 |
2.1.6 各种缓冲液的配制 |
2.1.7 Antibody staining相关溶液的配制 |
2.1.8 蛋白质免疫印记相关溶剂 |
2.1.9 分子克隆相关溶液 |
2.2 实验方法 |
2.2.1 DNA和 RNA提取 |
2.2.2 核酸琼脂糖凝胶制备 |
2.2.3 用全胚或鱼鳞制备基因组模板 |
2.2.4 cDNA的制备 |
2.2.5 PCR |
2.2.6 载体构建 |
2.2.7 制备大肠杆菌DH5α感受态 |
2.2.8 大肠杆菌的转化 |
2.2.9 挑选并鉴定阳性克隆 |
2.2.10 纯化质粒 |
2.2.11 制备anti sense RNA探针 |
2.2.12 纯化探针 |
2.2.13 斑马鱼whole mount原位杂交 |
2.2.14 抗体染色 |
2.2.15 合成mRNA |
2.2.16 纯化mRNA |
2.2.17 注射斑马鱼胚胎 |
2.2.18 增强子捕获Founder的转座效率分析 |
2.2.19 反向PCR鉴定增强子插入 |
2.2.20 CRISPR/Cas9 定点突变 |
第3章 实验结果 |
3.1 引言 |
3.2 构建基于Cre/loxP的双转基因鱼系,分别标记肝脏和胰腺β细胞 |
3.2.1 质粒构建 |
3.2.2 Tg(fabp10:loxP-CFPNTR-loxP-DsRed;10XUAS:Cre,cryaa:Venus)和Tg(ins:loxP-CFPNTR-loxP-DsRed;10XUAS:Cre,cryaa:Venus)转基因报告鱼系的构建 |
3.3 规模产生增强子捕获鱼系 |
3.4 增强子捕获筛选和鉴定肝脏和胰腺β细胞表达基因的流程 |
3.5 rnd2 为肝脏特异发育过程中特异表达的基因 |
3.6 rab3da为胰腺β细胞发育过程中特异表达的基因 |
3.7 Cre/loxp-based增强子捕获筛选参与器官再生的基因 |
第4章 实验总结与讨论 |
4.1 实验总结 |
4.1.1 基于Cre/loxP的增强子捕获提高了筛选器官的靶向性 |
4.1.2 基于Cre/loxP的增强子捕获能高效筛选表达较弱或者瞬时表达的基因 |
4.1.3 基于Cre/loxP的增强子捕获为再生器官的谱系追踪提供了思路 |
4.2 讨论 |
4.2.1 转基因鱼的构建 |
4.2.2 增强子捕获筛选 |
4.2.3 目标基因的鉴定 |
4.2.4 Cre/Loxp增强子捕获的运用前景 |
参考文献 |
致谢 |
博士在读期间发表的论文及科研工作 |
(6)转录因子、染色质重塑复合物以及远程染色质相互作用对基因表达调控的研究(论文提纲范文)
摘要 |
ABSTRACT |
第一章 文献综述 |
1.1 人类及小鼠基因组百科全书研究计划的概述 |
1.2 增强子功能的研究进展 |
1.2.1 增强子的定义及功能研究 |
1.3 Chromosome conformation capture (3C)相关技术研究进展 |
1.3.1 3C, 4C, 5C, Hi-C技术 |
1.3.2 CHIA-PET技术 |
1.4 基因组规模增强子远距离调控的研究进展 |
1.5 CTCF蛋白在染色质高级构像及基因调控作用的研究进展 |
1.5.1 CTCF蛋白的经典功能概述 |
1.5.2 CTCF蛋白最新功能的研究进展 |
1.6 本研究的目与意义 |
第二章 Super-C方法全基因组范围(Mouse ES/Th2)相互作用分析 |
2.1 材料与方法 |
2.1.1 主要材料 |
2.1.2 主要试剂和仪器 |
2.1.3 主要试验方法 |
2.2 实验结果与讨论 |
2.2.1 Supe-C方法的开发 |
2.2.2 Super-C相互作用分辨率的分析 |
2.2.3 基因组范围鉴定特异性增强子-启动子远距离相互作用 |
2.2.4 Th2细胞中基因组范围增强子-启动子相互作用分析 |
2.2.5 ES/Th2细胞拓扑力构结构域的异同 |
2.2.6 基因表达与启动子区相互作用的数量呈正相关 |
2.2.7 CTCF结合呈正相关与染色质相互作用,增强子活性和基因表达 |
2.2.8 CTCF位点和增强子互作增加增强子启动子的相互作用 |
2.3 本章小结 |
第三章 相关DNA片段增强子活性的检测 |
3.1 材料与方法 |
3.1.1 主要试剂与仪器 |
3.1.2 主要仪器 |
3.1.3 主要方法 |
3.1.4 引物合成及载体构建 |
3.1.5 细胞培养与转染 |
3.1.6 荧光素酶活性检测 |
3.2 实验结果及讨论 |
3.2.1 pGL4.23-luc/minP-EnX载体的构建 |
3.2.2 不同DNA片段在 3T3细胞中的活性分析 |
3.3 本章小结 |
第四章 CTCF介导增强子-启动子远距离相互作用(CRISPR/CAS9验证) |
4.1 材料与方法 |
4.1.1 主要试剂与仪器 |
4.1.2 主要仪器 |
4.1.3 主要方法 |
4.2. 实验结果及讨论 |
4.2.1 多个基因附近有多个CTCF结合位点的敲除 |
4.2.2 Sell基因下游CTCF结合位点的敲除 |
4.2.3 Runx3基因上游CTCF结合位点的敲除 |
4.4 本章小结 |
第五章 CTCF基因的RNA干扰研究 |
5.1 材料与方法 |
5.1.1 主要试剂与仪器 |
5.1.2 主要方法 |
5.2 实验结果及讨论 |
5.2.1 shRNA片段的克隆及鉴定 |
5.2.2 有效干扰序列的筛选 |
5.2.3 EL4细胞的转染 |
5.2.4 CTCF基因沉默的结果与分析 |
5.3 本章小结 |
第六章 CTCF蛋白的“转录稳定剂”作用研究 |
6.1 试验材料与方法 |
6.1.1 主要试剂与仪器 |
6.1.2 主要方法 |
6.2 数据分析 |
6.3 实验结果及分析 |
6.4 本章小结 |
第七章 在细胞抗病毒不同阶段IRF1和IRF2对TLR3基因转录激活的调控 |
7.1 材料与方法 |
7.1.1 主要材料 |
7.1.2 主要试剂和仪器 |
7.1.3 主要试验方法 |
7.2 实验结果与讨论 |
7.2.1 干扰素调节因子IRF1、IRF2结合位点介导BAF复合物发挥作用 |
7.2.2 IRF1、IRF2在TLR3基因表达调控中功能不同 |
7.2.3 IRF1、IRF2的蛋白水平决定其与TLR3基因启动子的结合 |
7.2.4 IRF2维持TLR3基因启动子区域保持染色质开放性、活性组蛋白修饰 |
7.2.5 IRF2介导BAF复合物结合到其他干扰素下游靶基因 |
7.3 本章小结 |
结论 |
本研究的创新点 |
存在问题及展望 |
参考文献 |
致谢 |
作者简介 |
(7)若干斑马鱼转基因品系的建立及其初步功能研究(论文提纲范文)
摘要 |
ABSTRACT |
1 前言 |
1.1 斑马鱼 |
1.2 斑马鱼转基因概述 |
1.2.1 转基因技术 |
1.2.2 Tol2转座子系统 |
1.2.3 Gateway克隆技术 |
1.3 斑马鱼心血管发育及调控机理 |
1.3.1 斑马鱼心血管发育过程 |
1.3.2 斑马鱼心血管发育的分子调控机制 |
1.3.3 HDGC3与心脏发育 |
1.4 本课题的研究意义、内容和目的 |
2 材料与方法 |
2.1 材料 |
2.1.1 菌株 |
2.1.2 质粒 |
2.1.3 斑马鱼品系 |
2.1.4 主要试剂、酶和试剂盒 |
2.1.5 主要耗材及仪器 |
2.1.6 主要是试剂的配制 |
2.2 方法 |
2.2.1 分子克隆 |
2.2.2 转基因斑马鱼的构建 |
3 结果与分析 |
3.1 pTol2(cmlc2:HDGC3-EGFP)表达载体的构建及其表达分析.. |
3.1.1 pTol2(cmlc2:HDGC3-EGFP)表达载体的构建 |
3.1.2 pTol2(cmlc2:HDGC3-EGFP)表达载体的表达分析 |
3.2 pTol2(HDGC3:EGFP)表达载体的构建及其表达分析 |
3.2.1 pTol2(HDGC3:EGFP)表达载体的构建 |
3.2.2 pTol2(HDGC3:EGFP)表达载体的表达分析 |
3.3 pTol2(Titin:HDGC3-EGFP)表达载体的构建及其表达分析 |
3.3.1 pTol2(Titin:HDGC3-EGFP)表达载体的构建 |
3.3.2 pTol2(Titin:HDGC3-EGFP)表达载体的表达分析 |
3.4 HSP-FLP重组质粒的构建及其表达分析 |
3.4.1 pMD18-T-FLP克隆载体鉴定 |
3.4.2 HSP-FLP-EGFP表达载体的鉴定 |
3.4.3 pTol2-HSP-FLP-ires-EGFP表达载体的鉴定 |
3.4.4 pTol2-HSP-FLP-EGFP重组表达载体显微注射验证 |
3.4.5 HSP-FLP重组蛋白表达载体的表达分析 |
3.4.6 HSP-FLP重组蛋白表达载体转基因斑马鱼的鉴定 |
4 讨论 |
4.1 绿色荧光蛋白 |
4.2 利用Tol2构建的转基因斑马鱼 |
4.3 启动子诱捕方法在模式生物中的潜在应用 |
4.4 关于Gateway重组系统 |
4.5 构建转基因斑马鱼的意义 |
5 结语 |
6 其他工作 |
6.1 重组质粒pET-28a-Dnajb6b的构建与鉴定 |
6.2 Dnajb6b融合蛋白诱导表达及纯化 |
6.3 Dnajb6b基因蛋白的多克隆抗体的制备与特异性检测 |
6.4 Dnajb6b基因蛋白在斑马鱼不同发育时期的表达 |
参考文献 |
附录一 |
附录二 |
致谢 |
(8)家蚕转基因载体元件的结构优化及在基因功能分析中的应用研究(论文提纲范文)
摘要 |
Abstract |
第1章 绪论 |
1.1 家蚕基因组的研究进展 |
1.2 家蚕后基因组(Post-genomics)研究 |
1.2.1 cDNA微阵列与基因芯片法 |
1.2.2 表达序列标签(EST) |
1.2.3 蛋白质组学(Proteomics) |
1.2.4 反向遗传学(Reverse genetics) |
1.2.5 转基因技术 |
1.3 基因陷阱(Gene trap)在基因功能研究中的作用 |
1.3.1 增强子陷阱 |
1.3.2 启动子陷阱 |
1.3.3 基因陷阱 |
1.3.4 蛋白N端捕获陷阱 |
1.3.5 快速高通量的实现 |
1.4 IRES元件的作用 |
第2章 转座子臂长与转基因效率的关系 |
2.1 引言 |
2.2 研究目的 |
2.3 研究内容 |
2.4 材料与方法 |
2.4.1 生物材料 |
2.4.2 主要试剂 |
2.4.3 构建质粒 |
2.4.4 细胞转染和筛选的GFP阳性细胞 |
2.4.5 显微注射和转基因蚕的筛选 |
2.5 结论 |
2.5.1 转座酶质粒对于绿色荧光蛋白表达率的剂量效应 |
2.5.2 不同ID序列长度对转座子效率的影响 |
2.5.3 家蚕转基因 |
2.6 讨论 |
第3章 家蚕hsp70启动子和IRES的克隆及功能研究 |
3.1 引言 |
3.2 研究目的 |
3.3 研究内容 |
3.4 材料与方法 |
3.4.1 生物材料 |
3.4.2 方法 |
3.5 结果与讨论 |
3.5.1 构建了带有家蚕hsp70启动子的双荧光质粒和转基因载体质粒 |
3.5.2 家蚕hsp70基因上游的HSE元件分析 |
3.5.3 家蚕hsp70基因上游片段的热激活性分析 |
3.5.4 家蚕hsp70基因上游片段的热激累积效应 |
3.5.5 长度不同的上游片段之间的活性比较 |
3.5.6 长度不同的家蚕hsp70上游片段之间的HSE元件比较 |
3.5.7 家蚕转基因及在家蚕个体中hsp70-305的热激活性 |
3.5.8 IRES功能分析 |
3.6 小结 |
第4章 启动子陷阱在家蚕基因功能研究应用中的技术探讨 |
4.1 引言 |
4.2 材料与方法 |
4.2.1 家蚕品种、菌种和质粒 |
4.2.2 试剂 |
4.2.3 RT-PCR |
4.2.4 Realtime-PCR |
4.2.5 转基因载体pBHSP70PIG3×P3EGFP的构建 |
4.2.6 转基因载体pBA3transposase3xP3EGFP的构建 |
4.2.7 转基因载体pBIRESEGFP3xP3RFP的构建 |
4.2.8 显微注射及阳性个体筛选 |
4.3 结果 |
4.3.1 pBIRESEGFP3xP3RFP启动子陷阱载体的设计和转基因实验 |
4.3.2 转基因载体pBhsp70transposase3xP3EGFP和pBA3transposase3xP3EGFP |
4.3.3 pBhsp70transposase3xP3EGFP的杂交检测 |
4.3.4 pBA3transposase3xP3EGFP的转基因实验和杂交检测 |
4.4 讨论 |
第5章 piggyBac转座子插入位点特性的分析 |
5.1 引言 |
5.2 材料与方法 |
5.2.1 生物材料 |
5.2.2 主要试剂 |
5.2.3 家蚕DNA的抽提 |
5.2.4 插入位点分析 |
5.2.5 TA克隆 |
5.2.6 数据来源与分析方法 |
5.3 结果与分析 |
5.3.1 插入位点的侧翼序列 |
5.3.2 piggyBac转座元件在基因组的分布 |
5.4 讨论 |
总结及问题 |
创新点 |
攻读学位期间发表的学术论文 |
参考文献 |
致谢 |
(9)Pax6基因突变小鼠糖代谢异常分子机制的研究(论文提纲范文)
第一部分:利用ENU诱变产生Pax6基因突变小鼠疾病模型 |
一 前言 |
二 材料和方法 |
三 实验结果 |
3.1 诱变繁殖的结果 |
3.2.Pax6突变小鼠品系的建立 |
3.3 突变基因的鉴定 |
3.4 Western blot结果 |
四 讨论 |
五 小结 |
参考文献 |
第二部分 Pax6基因突变小鼠血糖异常表型分析 |
一 前言 |
二 材料和方法 |
三 实验结果 |
3.1 小鼠基础代谢指标检测 |
3.2 胰岛形态学观察 |
3.3 分离胰岛形态观察 |
3.4 葡萄糖耐受实验 |
3.5 胰岛素耐受实验 |
3.6 血液胰岛素和胰高血糖素检测 |
四 讨论 |
五 小结 |
参考文献 |
第三部分 Pax6调控糖代谢作用机制的研究 |
一 前言 |
二 材料和方法 |
三 实验结果 |
3.1 实时荧光定量RT-PCR结果 |
3.2 PC1、PC2 Western Blot结果 |
3.3 染色体免疫共沉淀结果 |
3.4 荧光素酶实验 |
3.5 Western Blot检测胰岛中SOX2的表达 |
3.6 下丘脑中ACTH和α-MSH含量 |
四 讨论 |
五 小结 |
参考文献 |
第四部分 Pax6对小肠GLP-1调控机制研究 |
一 前言 |
二 材料和方法 |
三 实验结果 |
3.1 GLP-1 mRNA半定量RT-PCR结果 |
3.2 实时荧光定量RT-PCR方法分析小肠中Glp-1的表达量 |
3.3 荧光素酶实验 |
3.4 短期摄食实验 |
四 讨论 |
五 小结 |
参考文献 |
结论 |
综述一 转录因子Pax6研究进展 |
一 Pax6的基因家族及其结构特点 |
二 Pax6的组织分布 |
三 pax6的生物学作用 |
3.1 Pax6在眼睛发育中的作用 |
3.2 Pax6在中枢神经系统发育中的作用 |
3.3 Pax6对激素分泌的调节作用 |
3.4 Pax6对细胞粘附分子的调控 |
3.5 Pax6在细胞-细胞信号转导中的作用 |
3.6 Pax6与细胞增生 |
四 结论和展望 |
参考文献 |
综述二 PC1/3、PC2在糖代谢相关激素成熟过程中的协同作用 |
一 PC1/3、PC2的形成 |
二 PC1/3和PC2在胰岛分泌细胞激素成熟中的作用 |
三 PC1/3在GLP-1成熟中的作用 |
四 PC1/3、PC2在POMC成熟过程中的作用 |
参考文献 |
英文缩略词 |
致谢 |
在学期间发表的学术论文 |
四、Tissue-specific expression of GFP reporter gene in germline driven by GATA-2 promoter and enhancers in zebrafish(论文参考文献)
- [1]猪基因组顺式调控元件鉴定及功能SNP注释[D]. 许月园. 华中农业大学, 2021
- [2]肿瘤中EphA2超级增强子的识别及其功能与机制的研究[D]. 崔爽. 哈尔滨工业大学, 2021
- [3]Tc1/mariner转座子挖掘、高活性成员鉴定及其在增强子捕获中的应用[D]. 沈丹. 扬州大学, 2020(01)
- [4]早期胚胎发生阶段细胞命运决定的染色质可及性研究[D]. 范同强. 浙江农林大学, 2019(07)
- [5]基于Cre/loxP改进增强子捕获研究肝脏和胰腺β细胞的发育和再生[D]. 钟亚东. 西南大学, 2019(01)
- [6]转录因子、染色质重塑复合物以及远程染色质相互作用对基因表达调控的研究[D]. 任刚. 西北农林科技大学, 2015(06)
- [7]若干斑马鱼转基因品系的建立及其初步功能研究[D]. 屈永贵. 湖南师范大学, 2014(09)
- [8]家蚕转基因载体元件的结构优化及在基因功能分析中的应用研究[D]. 庄兰芳. 浙江大学, 2011(07)
- [9]Pax6基因突变小鼠糖代谢异常分子机制的研究[D]. 高艳. 郑州大学, 2006(11)
标签:启动子论文; 斑马鱼论文; 基因组论文; 转座子论文; 荧光素酶报告基因论文;