一、83例大肠癌多药耐药基因的检测（论文文献综述）
冯小雪[1]（2021）在《Ⅱ、Ⅲ期左半结肠癌中医证型与耐药基因、KRAS、MMR表达间的关系及意义》文中提出目的:探讨Ⅱ、Ⅲ期左半结肠癌中医证型与To Po-Ⅱ、P-gP、TS及KRAS、MMR表达间的差异,为左半结肠癌客观辨证及从中医证型角度选择化疗方案和靶向药物提供参考。方法:将符合纳入标准的117例Ⅱ、Ⅲ期左半结肠癌患者进行中医辨证分型,应用免疫组化染色法检测To Po-Ⅱ、TS、P-gP、MMR,PCR法检测KRAS,比较To Po-Ⅱ、TS、P-gP、KRAS、MMR表达在Ⅱ、Ⅲ期左半结肠癌不同中医证型间的差异。结果:1.117例患者中,湿热蕴结证43例（36.75%）,气滞血瘀证61例（52.14%）,气血两虚证13例（11.11%）,未出现脾肾阳虚证和肝肾阴虚证。2.不同中医证型患者间To Po-Ⅱ、P-gP、TS表达存在统计学差异（P<0.05）;气滞血瘀证患者To Po-Ⅱ阳性率（90.16%）高于湿热蕴结证（69.77%）（P<0.017）,气滞血瘀证与气血两虚证、湿热蕴结证与气血两虚证患者间To Po-Ⅱ阳性率无统计学差异（P>0.017）;湿热蕴结证患者P-gP阳性率（79.07%）高于气滞血瘀证（24.59%）和气血两虚证（30.77%）（P<0.017）,气滞血瘀证与气血两虚证患者P-gP阳性率无统计学差异（P>0.017）;气血两虚证患者TS阳性率（38.46%）高于湿热蕴结证（4.65%）（P<0.017）,气滞血瘀证与湿热蕴结证、气滞血瘀证与气血两虚证患者TS阳性率差异无统计学意义（P>0.017）。3.KRAS状态在三个证型间的差异有统计学意义（P<0.05）,气滞血瘀证患者KRAS野生型（86.89%）高于气血两虚证（53.85%）,气血两虚证患者KRAS突变率（46.15%）高于气滞血瘀证（13.11%）（P<0.017）。KRAS状态在湿热蕴结证与气滞血瘀证、湿热蕴结证与气血两虚证患者间无统计学差异（P>0.017）。4.MMR状态在各中医证型之间无统计学差异（P>0.05）。结论:1.Ⅱ、Ⅲ期左半结肠癌气滞血瘀证患者较湿热蕴结证患者可能从To Po-Ⅱ抑制剂中获益。2.P-gP可能是Ⅱ、Ⅲ期左半结肠癌湿热蕴结证患者的客观化辨证指标,该证型的患者对P-gP抑制剂可能易发生原发性耐药,气滞血瘀证、气血两虚证的患者则可能从P-gP抑制剂中获益。3.Ⅱ、Ⅲ期左半结肠癌气血两虚证患者较湿热蕴结证患者可能易诱导5-FU原发性耐药。4.Ⅱ、Ⅲ期左半结肠癌气滞血瘀证患者较气血两虚证患者可能从抗EGFR靶向治疗中获益,如西妥昔单抗或帕尼单抗等;气血两虚证患者可能从贝伐珠单抗治疗中获益。
李璐[2]（2021）在《牡荆素通过PI3K/Akt/mTOR信号通路调控大肠癌的多药耐药的研究》文中提出作为消化道常见的肿瘤之一,大肠癌（Colorectal Cancer,CRC）在全球的发病率及死亡率有逐年升高的趋势,给众多家庭和社会造成了巨大的健康威胁和经济负担。对于大肠癌的治疗,手术和化疗仍然是重要的治疗策略。然而,不尽人意的是,肿瘤细胞中多药耐药（Multidrug Resistance,MDR）的出现,使得化疗效果不佳。因此,克服大肠癌多药耐药和提高化疗效果是目前位于首位的问题。MDR是指肿瘤细胞由于化疗药物的持续给药或者短期大剂量给药,使肿瘤细胞对于各种结构不同、机制各异的化疗药物产生耐药的现象。MDR的发生、发展是多因素介入的结果,其中外排药物转运蛋白的活化最为经典机制。本课题所研究的转运蛋白主要包括是P-糖蛋白（P-gp）,作为腺苷酸依赖的膜转运蛋白的一员,P-gp表达水平与药物敏感性及细胞内药物积聚程度呈负相关,P-gp以ATP依赖的机制将药物底物泵出细胞,阻止肿瘤细胞摄取包括癌症治疗剂在内的化合物,从而降低了广泛抗肿瘤药物的能力,造成耐药现象。PI3K/Akt/mTOR信号传导通路是存在于各种肿瘤细胞中,调节着许多癌症发生发展,在肿瘤细胞中扮演重要角色,大量的研究发现PI3K/Akt/mTOR信号传导通路通过细胞凋亡、细胞自噬参与肿瘤的耐药,并且还发现其与膜转运蛋白P-gp有关。黄酮类化合物在大肠癌多药耐药过程中起到重要的逆转作用,作为其一的牡荆素受到了广泛的关注。牡荆素（Vitexin）是从山楂中提取的,山楂有健脾消食的功效,可以保护消化道,且现代药学研究发现,牡荆素具有广泛的抗肿瘤作用。但牡荆素与大肠癌MDR及PI3K/Akt/mTOR信号通路的关系鲜有报道。本研究旨在探讨牡荆素是否通过PI3K/Akt/mTOR信号通路调控大肠癌的MDR。目的:研究牡荆素通过PI3K/Akt/mTOR信号通路调控大肠癌多药耐药方法:1体外培养耐奥沙利铂的HCT116/L-OHP细胞,用MTT法检测不同浓度牡荆素（Vitexin）作用于大肠癌耐药细胞HCT116/L-OHP 24h,48h,72h后的细胞的抑制率,并计算牡荆素的半数抑制浓度(IC50)。2体外培养HCT116细胞、HCT116/L-OHP细胞、用牡荆素（Vitexin）处理的HCT116/L-OHP细胞（根据MTT实验结果选择牡荆素的抑制率在10%以内为无毒性牡荆素作用浓度）。MTT法检测不同浓度奥沙利铂（L-OHP）作用于三组细胞的抑制率,并计算半数抑制浓度(IC50)和耐药指数（RI）;Western blot法检测P-gp的表达;q RT-PCR法检测MDR1 mRNA的表达。3体外培养HCT116细胞、HCT116/L-OHP细胞,Western blot法检测Akt、p-Akt、mTOR、p-mTOR的表达,q RT-PCR法检测Akt、mTOR mRNA的表达。4体外培养HCT116/L-OHP细胞,低、中、高浓度牡荆素处理的HCT116/L-OHP细胞（为确保牡荆素对大肠癌耐药细胞HCT116/L-OHP无明显的细胞毒性作用,选择牡荆素的抑制率在10%以内,因此选取30μmol/L、60μmol/L和90μmol/L作为低、中、高浓度处理组）。Western blot法检测Akt、p-Akt、mTOR、p-mTOR及P-gp的表达;q RT-PCR法检测Akt、mTOR及MDR1 mRNA的表达变化。5应用SPSS 25.0进行统计分析,得出实验结论。结果:1 MTT法实验结果显示:0、30、60、90、120、150、180μmol/L的牡荆素处理的大肠癌耐药HCT116/L-OHP 24h、48h、72h后,其抑制率与药物浓度呈相关性（P<0.05）。IC50分别为170.59±0.67μmol/L、162.81±1.05μmol/L、147.04±2.32μmol/L。2 MTT法实验结果显示,奥沙利铂在大肠癌细胞HCT116组的IC50为14.52±5.44μg/m L,在大肠癌耐药细胞HCT116/L-OHP组的IC50为108.53±7.58μg/m L,RI为7.47,两组之间有明显差异（P<0.05）,奥沙利铂在经牡荆素处理的HCT116/L-OHP细胞组的IC50下降为52.85±1.85μg/m L,RI下降为2.05（P<0.05）。3 Western blot、q RT-PCR实验结果显示,在大肠癌细胞HCT116组中P-gp及MDR1 mRNA的表达处于低水平,在大肠癌耐药细胞HCT116/L-OHP组中的P-gp及MDR1 mRNA处于高水平（P<0.05）,经牡荆素处理后的大肠癌耐药细胞HCT116/L-OHP组中的P-gp及MDR1 mRNA的表达水平明显减少（P<0.05）。4 Western blot实验结果显示p-Akt和p-mTOR在大肠癌耐药细胞HCT116/L-OHP组中表达水平明显高于大肠癌细胞HCT116组（P<0.05）,而Akt、mTOR无明显差别（P>0.05）;q RT-PCR实验结果显示Akt、mTOR mRNA在大肠癌细胞HCT116组和大肠癌耐药细胞HCT116/L-OHP组中表达无明显差异（P>0.05）。5 Western blot实验结果显示经不同浓度牡荆素处理的HCT116/L-OHP组中p-Akt、p-mTOR、P-gp表达均明显减少,且与药物浓度呈相关性（P<0.05）;Akt、mTOR的表达变化则无意义（P>0.05）;q RT-PCR实验结果显示经不同浓度牡荆素处理的HCT116/L-OHP组中Akt、mTOR的表达较未经牡荆素处理的对照组无明显变化（P>0.05）,而MDR1 mRNA表达较未经牡荆素处理的对照组明显减少,且与药物浓度呈相关性（P<0.05）。结论:1牡荆素能够调控大肠癌耐药细胞HCT116/L-OHP中MDR1 mRNA及P-gp的表达,逆转耐药细胞耐药性。2牡荆素可能能够通过下调PI3K/Akt/mTOR信号通路中Akt和mTOR的磷酸化水平,调控大肠癌耐药细胞HCT116/L-OHP中MDR1mRNA及P-gp的表达,逆转耐药细胞耐药性。
王开雷[3]（2020）在《粉防己碱逆转大肠癌LOVO/5-Fu多药耐药性的研究》文中研究指明研究背景和意义:大肠癌是全球第四大常见的癌症,每年大约有639 000人因大肠癌而死亡。近年来,我国大肠癌患者的发病率和死亡率呈现出一种显着上升的趋势,而且很多大肠癌患者在明确诊断时已经为中晚期,其治疗效果较差。寻找一种有效且可靠的治疗大肠癌的方法已成为一项现代医学亟需解决的问题。目前,有多种方法可用于治疗大肠癌,包括手术、放射治疗、化疗和生物治疗等。现阶段的医学指南认为手术和化疗为大肠癌主要而有效的治疗手段。尽管通过手术治疗可以使部分早期大肠癌患者得到根治性治疗,但是很多大肠癌患者在临床明确诊断时已经为肿瘤中晚期,手术切除肿瘤后部分患者会出现肿瘤的复发转移,因此化疗就成为大肠癌患者手术之后必要的治疗方法之一。大肠癌患者在手术治疗之后辅助以化疗,可以在很大程度上防止肿瘤复发转移;对部分中晚期大肠癌患者通过手术治疗无法将肿瘤完全切除干净时,通过化疗可以将残余肿瘤细胞杀灭或者抑制肿瘤细胞继续生长;对于有些肿瘤患者在确诊时已为晚期,且有广泛转移而无法进行手术,通过化疗可使肿瘤体积缩小,使患者的部分症状缓解,有时候甚至达到可以实施手术的可能。但是,在大肠癌患者进行化疗的过程中,除部分原发耐药者之外,还有部分肿瘤患者可能在治疗的过程中随着化疗疗程的增加,最终出现对某种化疗药物的耐药,甚至出现对多种化疗药物耐药,进而导致化疗失败,肿瘤复发转移。有研究表明由于肿瘤多药耐药的出现,大约有三分之一的大肠癌患者会出现肿瘤复发、转移。因此,多药耐药的出现是大肠癌化疗失败的主要原因之一。在大肠癌的化疗药物中,五氟尿嘧啶（5-Fluorouracil,5-Fu）作为最有效的临床药物之一,在临床治疗中有着广泛的应用,但是多药耐药的大肠癌细胞对5-Fu产生的耐药性也是大肠癌患者在临床化疗中失败的常见原因之一。因此探讨大肠癌细胞的耐药机制,寻找一种新的、有效的能够逆转大肠癌多药耐药的方法是当前在大肠癌研究中的热点问题之一。鉴于此原因,我们建立了具有良好稳定性和耐药性的五氟尿嘧啶耐药的大肠癌LOVO/5-Fu耐药细胞系,并利用LOVO/5-Fu耐药细胞株研究大肠癌耐药的分子机制,将多药耐药的大肠癌LOVO/5-Fu耐药细胞逆转为对化疗药物敏感的肿瘤细胞,同时研究其可能的逆转机制。P糖蛋白（P-glycoprotein,P-gp）是细胞膜上重要的转运蛋白,属于ABC转运蛋白（ATP依赖性转运蛋白）超家族成员,在引起肿瘤细胞产生多药耐药性（multidrug resistance,MDR）中起重要的作用。肿瘤细胞发生MDR的原因很多,其中的重要原因之一是P-gp增多,而P-gp是肿瘤细胞MDR1基因编码的。在人类中,MDR1 mRNA在肾上腺、胰腺、大肠、小肠等组织中是低表达状态,它参与了人体正常组织细胞的生长;在MDR表型的肿瘤细胞中,MDR1/P-gp有过量表达现象。有体外实验研究表明,MDR1基因和P-gp的表达水平越高,则MDR细胞内抗肿瘤药物的浓度越低,其耐药性越强。另有研究表明P-gp具有药物泵的功能,它可以将进入肿瘤细胞内的化疗药物主动地泵出细胞外,从而使蓄积在肿瘤细胞内的抗肿瘤药物减少,进而使肿瘤细胞发生MDR。C-jun N端激酶（c-jun N-terminal kinase,JNK）也被人们称之为应激活化蛋白激酶（stress-activated protein kinase,SAPK）,是一类丝氨酸/苏氨酸激酶,是哺乳类动物细胞中丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase,MAPK）家族中的重要成员之一。JNK信号通路在渗透压、氧化应激、电离辐射等多种环境应激因素以及生长因子、细胞因子（如TNF、IL21）作用下均可被激活,从而导致JNK/SAPK信号通路中的苏氨酸和丝氨酸双磷酸化而将其活化,最终导致JNK/c-jun信号通路被激活。在细胞生长、应激反应、癌基因转化、细胞分化以及细胞凋亡等多种生理和病理过程中JNK/SAPK信号通路均发挥着重要的作用。有研究发现,大肠癌的发生、发展以及耐药机制与JNK信号通路有着密切的关系。粉防已碱（Tetrandrine,Tet）又称汉防己甲素,是一种双苄基异喹啉生物碱,是从中草药粉防己根块中提取的。它具有抗炎、降低血压、阻断钙离子通道等广泛的药理作用,有研究报道称其可在体内外均表现有较好的逆转白血病细胞多药耐药的作用,其逆转耐药的机制为下调MDR1 mRNA/P-gp的表达、使抗肿瘤药物在细胞内积聚,同时使抗肿瘤药物的敏感性增加,进而导致肿瘤细胞凋亡。基于此,我们推测Tet可能会通过调节MDR1 mRNA/P-gp的表达,进而调节大肠癌在化疗过程中产生的MDR。我们在本研究中将Tet在体外作用于大肠癌LOVO/5-Fu耐药细胞株,研究Tet对大肠癌LOVO/5-Fu耐药细胞株的生长抑制及其诱导凋亡的情况,进而了解其对多药耐药的大肠癌LOVO/5-Fu细胞的逆转作用及其逆转机制。研究结果表明Tet通过抑制MDR1基因的表达,使P-gp的表达降低,进而逆转大肠癌LOVO/5-Fu对5-Fu的耐药。同时通过对JNK信号通路的研究发现,Tet可调控细胞内JNK和c-jun的磷酸化水平,进而调控细胞的耐药性。Tet可能成为逆转大肠癌多药耐药的一个重要逆转药物。方法:1.建立LOVO/5-Fu多药耐药细胞系本实验采取逐渐递增5-Fu药物浓度,并持续作用于大肠癌敏感细胞LOVO细胞株,进行体外诱导使其产生耐药性,逐步筛选出具有多药耐药性的LOVO/5-Fu细胞株。多次使用MTT法检测其多药耐药性,从而确认我们建立的LOVO/5-Fu多药耐药细胞系拥有良好的多药耐药性和稳定性。2.分析MDR mRNA和P-gp蛋白在大肠癌细胞LOVO和耐药细胞LOVO/5-Fu中的表达实时荧光定量PCR（Realtime-PCR）检测LOVO和LOVO/5-Fu细胞中多药耐药基因的MDR mRNA表达,Western blot检测LOVO和LOVO/5-Fu细胞中P-gp蛋白的表达。揭示MDR mRNA和P-gp蛋白在大肠癌LOVO和LOVO/5-Fu细胞中的表达情况。3.MTT法确定逆转剂的浓度使用不同浓度的Tet分别作用于LOVO细胞和LOVO/5-Fu细胞,MTT实验检测Tet对细胞抑制率的影响。4.耐药逆转试验使用Tet作用于LOVO/5-Fu细胞之后,MTT实验检测细胞抑制率,并进一步计算出IC50以及耐药指数。5.流式细胞术检测细胞周期分布Tet分别作用于LOVO和LOVO/5-Fu细胞后,采用流式细胞术检测各组细胞周期分布情况。6.流式细胞术检测细胞凋亡Tet分别作用于LOVO和LOVO/5-Fu细胞后,采用流式细胞术检测各组细胞凋亡率的变化情况。7.流式细胞术检测细胞P-gp的表达Tet分别作用于LOVO和LOVO/5-Fu细胞后,采用流式细胞术检测各组细胞P-gp的表达情况。8.PCR检测MDR1基因表达Tet分别作用于LOVO和LOVO/5-Fu细胞后,采用PCR检测MDR1基因表达情况。9.Western blot 检测 P-gp、JNK、p-JNK、c-jun、p-c-jun 蛋白Tet分别作用于LOVO和LOVO/5-Fu细胞后,采用Western blot检测各组细胞 P-gp、JNK、p-JNK、c-jun、p-c-jun 的表达情况。结果在本实验研究中,我们发现与对照组大肠癌细胞LOVO细胞相比,五氟尿嘧啶耐药的LOVO/5-Fu细胞中MDR mRNA表达水平明显上调,P-gp蛋白含量明显增高。进一步研究我们还发现使用Tet作用于LOVO/5-Fu细胞之后,可以增强LOVO/5-Fu细胞对五氟尿嘧啶的敏感性。使用Tet作用于LOVO和LOVO/5-Fu细胞之后,可以使LOVO/5-Fu细胞凋亡率升高,使被阻滞在G1期的细胞增多,而进入分裂期的细胞较前明显减少;LOVO/5-Fu细胞MDR1表达量和P-gp蛋白含量较未使用Tet作用之前明显降低。Tet作用于LOVO/5-Fu细胞后,p-JNK较未使用Tet的LOVO/5-Fu组细胞明显升高,其下游分子p-c-jun表达量也显着增加;加入JNK信号通路抑制剂SP600125之后,Western blot检测结果显示,Tet作用组细胞的p-JNK、p-c-jun较未加入JNK信号通路抑制剂SP600125之前表达量显着降低;各个组总JNK和c-jun表达量无明显变化。结论1、本实验方法建立的LOVO/5-Fu耐药细胞系有良好的耐药性和稳定性。2、LOVO/5-Fu组细胞中MDR mRNA表达水平和P-gp蛋白含量比LOVO组细胞中明显上调。3、Tet体外可以逆转人大肠癌多药耐药细胞株LOVO/5-Fu细胞的MDR。4、Tet可以通过对人大肠癌多药耐药细胞株LOVO/5-Fu细胞凋亡率和细胞周期的调控,改变细胞的MDR。5、Tet逆转人大肠癌多药耐药细胞株LOVO/5-Fu细胞MDR的机制可能是通过调控JNK信号通路,下调MDR mRNA和P-gp蛋白的表达来实现的。
黄艳洁[4]（2020）在《miR-15a-5p通过Wnt/β-catenin通路调控大肠癌多药耐药的研究》文中认为大肠癌（colorectal cancer,CRC）是常见的消化道恶性肿瘤,目前临床上治疗中晚期大肠癌仍以化疗作为辅助手术治疗的主要手段,但由于肿瘤多药耐药的发生,常常会影响化疗疗效,因此寻找化疗药物的耐药靶点是提高大肠癌临床治疗效果的关键。多药耐药是指肿瘤细胞不仅对一种药物产生耐药性,而且对作用机制和化学分子结构均不同的其他药物也产生交叉耐药。肿瘤产生多药耐药的重要原因之一是由于多药耐药基因1（multidrug resistance 1 gene,MDR1）编码的P-糖蛋白（P-glycoprotein,P-gp）的过度表达,P-gp是三磷酸腺苷结合盒式（ATP-binding cassette,ABC）结构转运蛋白超家族中的一员,可以利用ATP水解释放的能量,在化疗药物尚未发挥细胞毒性作用时就将其泵出到细胞外,从而导致肿瘤细胞产生耐药性。大量研究发现,Wnt/β-catenin信号通路的异常激活可参与调节多种肿瘤的多药耐药,并且发现Wnt/β-catenin信号通路可以通过调控P-gp的表达从而影响肿瘤的多药耐药。micro RNA是一类非编码小分子单链RNA,可以调控靶基因的表达。其中miR-15a-5p是miR-15家族的成员,近年来研究表明其可以通过靶向结合多种编码基因m RNA的3’UTR,抑制靶m RNA的翻译或促进靶m RNA的降解,对基因进行转录后调控。但目前关于miR-15a-5p在大肠癌中的表达情况及与大肠癌多药耐药的关系鲜见报道。本研究旨在探讨miR-15a-5p在大肠癌中的表达情况以及在大肠癌多药耐药中的作用机制。目的:在组织水平检测miR-15a-5p与P-gp在大肠癌组织中的表达情况并分析二者的相关性。在细胞水平研究miR-15a-5p对Wnt/β-catenin信号通路中的关键蛋白Wnt3a、β-catenin及P-gp表达的影响,探讨miR-15a-5p在大肠癌多药耐药中的调节作用及机制。方法:1.通过实时荧光定量PCR法检测miR-15a-5p和MDR1 m RNA在大肠癌组织和癌旁正常肠黏膜组织中的表达情况,并分析miR-15a-5p和MDR1 m RNA在大肠癌组织中表达的相关性。2.通过实时荧光定量PCR法检测miR-15a-5p在大肠癌细胞HCT-116及大肠癌耐药细胞HCT-116/LOHP细胞中表达情况。3.通过Western blot实验检测Wnt3a、β-catenin、P-gp在大肠癌细胞HCT-116及大肠癌耐药细胞HCT-116/LOHP细胞中表达情况。4.通过细胞转染,将HCT-116/LOHP细胞分为五组:空白对照组、转染miR-15a-5p mimics NC的对照组、转染miR-15a-5p mimics的实验组、转染miR-15a-5p inhibitor NC的对照组、转染miR-15a-5p inhibitor的实验组,通过实时荧光定量PCR法检测miR-15a-5p的表达,MTT实验检测各组细胞在不同浓度奥沙利铂下的增殖情况并计算其生长抑制率、半数抑制浓度(IC50)以及耐药指数（RI）。5.通过实时荧光定量PCR法检测转染后各组Wnt3a、β-catenin、MDR1m RNA的表达情况,通过Western blot实验检测转染后各组Wnt3a、β-catenin、P-gp的表达情况。结果1组织水平1.1 miR-15a-5p及MDR1 m RNA在大肠癌组织与癌旁正常肠黏膜组织的表达情况miR-15a-5p在大肠癌组织中的表达量为0.51（0.25）,明显低于癌旁正常肠黏膜组织1.17（2.95）。MDR1 m RNA在大肠癌组织中的表达量为2.21（4.07）,明显高于癌旁正常肠黏膜组织1.13（2.28）,（P均<0.05）。1.2大肠癌组织中miR-15a-5p表达与MDR1 m RNA表达的相关性Spearman相关分析显示,大肠癌组织miR-15a-5p表达与MDR1m RNA表达呈负相关关系（r=-0.343,P<0.05）。2细胞水平2.1 MTT实验验证HCT-116/LOHP细胞对奥沙利铂的耐药奥沙利铂对HCT-116细胞和HCT-116/LOHP细胞的半数抑制浓度(IC50)分别为（13.51±2.62）μg/ml和（103.08±12.29）μg/ml（P<0.01）,计算得出耐药指数RI为7.63。2.2实时荧光定量PCR检测miR-15a-5p在HCT-116细胞和HCT-116/L-OHP细胞中的相对表达量分别为1.00±0.00和0.16±0.05,差异有统计学意义（P<0.01）。2.3 Western blot实验检测HCT-116/LOHP细胞中Wnt3a、β-catenin及P-gp的相对表达量均高于HCT-116细胞,差异有统计学意义（P<0.05）。2.4实时荧光定量PCR检测转染后各组miR-15a-5p的表达情况,空白对照组、转染miR-15a-5p mimics NC的对照组、转染miR-15a-5p mimics的实验组、转染miR-15a-5p inhibitor NC的对照组、转染miR-15a-5p inhibitor的实验组中miR-15a-5p的相对表达量分别为1.00±0.00、1.08±0.10、277.01±20.81、1.07±0.12和0.38±0.04。转染miR-15a-5p mimics组HCT-116/LOHP细胞中miR-15a-5p的相对表达量明显升高（F=527.82,P<0.001）,转染miR-15a-5p inhibitor组HCT-116/LOHP细胞中miR-15a-5p的相对表达量明显下降（F=79.93,P<0.001）。2.5 MTT实验检测转染后各组细胞对奥沙利铂的耐药情况,奥沙利铂对miR-15a-5p mimics NC对照组的半数抑制浓度(IC50)为（100.35±10.57）μg/ml,miR-15a-5p mimics实验组为（40.78±2.47）μg/ml,差异有统计学意义（P<0.01）。奥沙利铂对miR-15a-5p inhibitor NC对照组半数抑制浓度(IC50)为（102.08±5.95）μg/ml,miR-15a-5p inhibitor实验组为（132.77±7.97）μg/ml,差异有统计学意义（P<0.01）。奥沙利铂对空白对照组的半数抑制浓度(IC50)为（99.98±2.63）μg/ml,空白对照组与阴性对照组HCT-116/LOHP细胞的差异均无统计学意义（P均>0.05）。2.6通过Western blot实验发现,HCT-116/LOHP细胞转染miR-15a-5p mimics实验组与转染miR-15a-5p mimics NC对照组相比Wnt3a、β-catenin与P-gp表达均降低（P<0.05）,空白对照组与转染miR-15a-5p mimics NC对照组相比Wnt3a、β-catenin与P-gp表达均无明显变化（P>0.05）。2.7通过Western blot实验发现,HCT-116/LOHP细胞转染miR-15a-5p inhibitor实验组与转染miR-15a-5p inhibitor NC对照组相比Wnt3a、β-catenin与P-gp表达均升高（P<0.05）,空白对照组与转染miR-15a-5p inhibitor NC对照组相比Wnt3a、β-catenin与P-gp表达均无明显变化（P>0.05）。2.8实时荧光定量PCR法检测结果显示HCT-116/LOHP细胞转染miR-15a-5p mimics实验组与转染miR-15a-5p mimics NC对照组相比Wnt3a、β-catenin与MDR1m RNA表达均降低（P<0.05）,空白对照组与转染miR-15a-5p mimics NC对照组相比Wnt3a、β-catenin与MDR1m RNA表达均无明显变化（P>0.05）。2.9实时荧光定量PCR法检测结果显示HCT-116/LOHP细胞转染miR-15a-5p inhibitor实验组与转染miR-15a-5p inhibitor NC对照组相比Wnt3a、β-catenin与MDR1m RNA表达均升高（P<0.05）,空白对照组与转染miR-15a-5p inhibitor NC对照组相比Wnt3a、β-catenin与MDR1m RNA表达均无明显变化（P>0.05）。结论:1.miR-15a-5p在大肠癌组织中低表达,MDR1在大肠癌组织中高表达,并在组织水平证明二者表达呈负相关关系。2.miR-15a-5p在大肠癌耐药细胞HCT-116/LOHP中的表达水平明显低于敏感细胞HCT-116,Wnt3a、β-catenin及P-gp在大肠癌耐药细胞HCT-116/LOHP细胞中表达水平明显高于敏感细胞HCT-116细胞,miR-15a-5p及Wnt/β-catenin信号通路在大肠癌多药耐药的形成中发挥重要作用。3.上调miR-15a-5p表达可显着提高大肠癌耐药细胞HCT-116/LOHP对化疗药物的敏感性,而下调miR-15a-5p表达可显着降低大肠癌耐药细胞HCT-116/LOHP对化疗药物的敏感性,表明miR-15a-5p参与调控大肠癌多药耐药。4.上调miR-15a-5p表达能显着抑制Wnt/β-catenin信号通路的关键蛋白表达,如Wnt3a、β-catenin及其下游P-gp的表达,而下调miR-15a-5p表达则显着增加Wnt3a、β-catenin及P-gp的表达,miR-15a-5p通过影响Wnt/β-catenin通路的活性,介导转运蛋白P-gp的表达从而参与调控大肠癌多药耐药。
黄晓伟[5]（2019）在《藤龙补中颗粒抑制CT26大肠癌生长和转移作用及机制》文中进行了进一步梳理目的:研究藤龙补中颗粒（Teng-Long-Bu-Zhong granules,TLBZG）治疗CT26大肠癌生长和转移作用及机制。方法:实验研究共分成两部分。第一部分,用CT26大肠癌细胞建立皮下BALB/c小鼠模型,待肿瘤组织长至可测量范围时,根据肿瘤体积大小将小鼠按照随机原则分成对照组、5-氟尿嘧啶组（5-Fu）、复方斑蝥胶囊组、TLBZG组、5-Fu+复方斑蝥组胶囊、5-Fu+小剂量TLBZG组、5-Fu+中剂量TLBZG组、5-Fu+大剂量TLBZG组,给予无菌水、复方斑蝥胶囊、不同剂量TLBZG灌胃或和5-Fu腹腔注射治疗;每3天用电子卡尺测量肿瘤最大长径与横径一次。治疗2周后取血用流式细胞仪检测CD3+、CD4+、CD8+T细胞和NK细胞。治疗3周后处死小鼠,剥离肿瘤称重。分别用TUNEL法、β-半乳糖酶染色法、Western blot和免疫组化法、ELISA法检测细胞凋亡、细胞衰老、蛋白表达、细胞因子。第二部分,BALB/c小鼠尾静脉注射CT26细胞建立肺转移模型,根据体重大小将小鼠按照随机原则分成对照组、5-Fu组、复方斑蝥胶囊组、TLBZG组、5-Fu+复方斑蝥胶囊组、5-Fu+小剂量TLBZG组、5-Fu+中剂量TLBZG组、5-Fu+大剂量TLBZG组,给予无菌水、复方斑蝥胶囊、不同剂量TLBZG灌胃或和5-Fu腹腔注射治疗;治疗3周后处死小鼠,取肺称重,计算肺表面转移结节数量。HE染色法观察肺组织转移情况。免疫组化法和Western blot法检测蛋白表达和磷酸化。结果:第一部分:TLBZG可以抑制CT26肿瘤生长;下调PI3K和AKT磷酸化,活化Caspase-3、8和9,促PARP剪辑,诱导细胞凋亡;上调p16和p21相关基因表达,抑制RB磷酸化,降低E2F1靶基因CDK2和Cyclin-E1表达,促进细胞衰老;下调HIF1α表达,降低VEGF表达,抑制血管生成;升高CD3+、CD4+、CD8+T细胞和NK细胞,升高IL-4、IL-12和IFN-γ水平。藤龙补中颗粒同时可增强5-Fu的治疗作用。第二部分:TLBZG可以降低肺表面转移结节和肺质量。藤龙补中颗粒可以抑制Wnt/β-catenin及其下游靶基因MMP-2与MMP-9表达。藤龙补中颗粒可增强化疗的治疗作用。结论:1.藤龙补中颗粒能够抑制CT26大肠癌细胞的生长和转移,并提高化疗效果。2.藤龙补中颗粒可以诱导CT26大肠癌细胞凋亡,其机制与下调PI3K和降低AKT磷酸化以及活化Caspases-3、8和9,促PARP剪辑有关。3.藤龙补中颗粒可以促进CT26大肠癌细胞衰老,其机制与上调p16和p21,下调RB磷酸化以及抑制E2F1靶基因CDK2和Cyclin-E1表达有关。4.藤龙补中颗粒可以抑制CT26大肠癌血管生成,其机制与抑制HIF1α-VEGF信号转导相关。5.藤龙补中颗粒可以增强大肠癌荷瘤小鼠免疫功能,其机制与升高CD3+、CD4+、CD8+T细胞和NK细胞以及升高IL-4、IL-12和IFN-γ水平有关。6.藤龙补中颗粒能够抑制CT26大肠癌细胞肺转移,其机制与抑制Wnt/β-catenin信号通路表达及其下游靶基因MMP-2和MMP-9的表达有关。
袁亚男[6]（2019）在《PI3K/Akt/GSK3β通路介导ABC转运蛋白调控大肠癌多药耐药的研究》文中认为大肠癌（colorectal cancer,CRC）是消化道常见的恶性肿瘤之一,且全球发病率有逐年升高趋势,给众多家庭和社会造成了巨大的经济负担。手术是早期大肠癌的根治方法,而中晚期大肠癌患者则依赖于化疗、放疗以提高5年生存率。然而,由于原发性或继发性化疗耐药,尤其是肿瘤细胞中多药耐药（MDR）的出现是导致化疗失败的主要原因之一,使得化疗效果不佳,患者的预后差。因此,克服大肠癌多药耐药和提高化疗效果是目前亟待解决的问题。多药耐药意指肿瘤细胞对初次接触的药物即产生抗药性,并且对结构和机制均不同的未接触过的多种抗肿瘤药物也产生交叉耐药。产生MDR的机制复杂多样,但以转运蛋白的活化最为主要。本课题所研究的转运蛋白包括两种,即P-糖蛋白（P-gp）,多药耐药相关蛋白2（MRP2）,这两种转运蛋白同属于ABC家族,其中P-gp由ABCB1基因编码,MRP2由ABCC2基因编码。目前研究发现,PI3K/Akt信号通路的激活在大肠癌多药耐药过程中起到调节的作用,并且是细胞生存通路之一。GSK3β（糖原合成酶激酶3β）作为其下游的主要靶因子之一,PI3K/Akt通路激活后通过磷酸化GSK3β丝氨酸9位点来抑制其的活性,它还通过调节细胞增殖、凋亡及周期等参与肿瘤细胞的发生与发展,是肿瘤细胞的关键调节因子。据报道,GSK3β-Ser9磷酸化增加可上调P-gp的表达,促使胆管癌细胞多药耐药的发生。但在大肠癌中GSK3β与ABC转运蛋白之间的关系鲜有报道。目的:研究PI3K/Akt信号通路通过下游的GSK3β途径调控ABC转运蛋白的表达参与大肠癌多药耐药方法:1.实验分为三组:大肠癌HCT-15细胞作为对照组,HCT-15+GSK3β抑制剂（Indirubin-3’-monoxime,HY-19807）、HCT-15+PI3K/Akt通路抑制剂（GDC-0032,HY-13898）分别作为实验组。2.Western blotting法检测三组细胞内Akt、p-Akt、总GSK3β、p-GSK3β-Ser9及ABC转运蛋白（P-gp、MRP2）的表达变化。3.qRT-PCR法检测各组细胞内ABC转运蛋白mRNA的表达变化。4.采用CCK-8法检测奥沙利铂对三组细胞的半数抑制浓度,计算抑制率及耐药指数。5.细胞划痕实验及细胞周期实验检测不同抑制剂对细胞迁移能力及细胞周期的影响。6.应用SPSS19.0统计学软件进行统计分析,得出实验结论。结果:1 Western Blot实验结果1.1 GSK3β抑制剂（HY-19807）作用于人结肠癌HCT-15细胞后,GSK3β-Ser9磷酸化增加,P-gp、MRP2的表达较未用药的HCT-15组升高明显,差异有统计学意义（P<0.05）,GSK3β上游的Akt及p-Akt表达变化不明显,差异无统计学意义（P>0.05）。1.2 PI3K/Akt通路抑制剂（HY-13898）作用于人结肠癌HCT-15细胞后,p-GSK3β-Ser9、p-Akt表达下调,Akt表达增加,P-gp、MRP2蛋白的相对表达量均显着低于对照组,差异有统计学意义（P<0.01）。1.3应用不同抑制剂后与对照组相比总GSK3β在两个实验组中的表达变化不明显,无统计学意义（P>0.05）。2实时荧光定量PCR（qRT-PCR）实验结果2.1 HY-19807作用于HCT-15细胞后,GSK3β活性受抑制,qRT-PCR结果显示ABCB1 mRNA、ABCC2 mRNA表达较对照组升高明显,差异有统计学意义（P<0.01）。2.2 HY-13898作用于HCT-15细胞后,GSK3β被激活,qRT-PCR结果显示ABCB1 mRNA、ABCC2 mRNA相对表达量均明显低于对照组,差异有统计学意义（P<0.01）。3不同抑制剂作用于HCT-15细胞后对奥沙利铂敏感性的影响3.1应用HY-19807作用于人结肠癌HCT-15细胞后,奥沙利铂对HCT-15细胞的半数抑制浓度(IC50)由（19.83±0.8）μg/mL升至（27.15±1.57）μg/m L,耐药指数为1.36,差异有统计学意义（P<0.01）。3.2应用HY-13898作用于人结肠癌HCT-15细胞阻断PI3K/Akt信号通路激活后,奥沙利铂对HCT-15细胞的半数抑制浓度(IC50)由（19.83±0.8）μg/m L降至（9.93±1.77）μg/m L,耐药指数为0.5,差异有统计学意义（P<0.01）。4细胞划痕实验结果4.1细胞划痕24、48h后倒置显微镜下观察可见HCT-15细胞24h迁移率为（23.61±0.99）%,48h迁移率（34.76±10.75）%。4.2应用HY-19807作用于HCT-15细胞后,24h迁移率为（21.63±3.79）%,48h迁移率为（19.90±4.05）%,与对照组相比细胞迁移能力无明显促进,差异无统计学意义（P>0.05）。4.3应用HY-13898作用于HCT-15细胞后,24h迁移率为（12.63±0.52）%（P<0.01）,48h迁移率（17.76±7.83）%（P<0.05）。与对照组相比,细胞迁移能力受到抑制,尤以24h作用最为明显,差异具有统计学意义。5细胞周期实验结果5.1大肠癌HCT-15细胞不做任何处理,经流式细胞仪分析,G1期细胞占比（59.61±0.73）%,S期占比（23.38±0.74）%。5.2应用HY-19807处理HCT-15细胞2小时后,G1期细胞占（45.69±0.96）%,S期细胞占（39.77±0.92）%,与对照组相比较,G1期细胞百分率显着减少,S期细胞百分率显着增加,差异有统计学意义（P=0.000）。5.3应用HY-13898处理HCT-15细胞24小时后,G1期细胞占比（84.17±1.35）%,同时S期细胞占比（6.90±0.59）%,与对照组相比较,G1期细胞百分率明显增加,同时S期细胞百分率显着减少,差异有统计学意义（P=0.000）。结论:1 GSK3β抑制剂能够增加HCT-15细胞中p-GSK3β-Ser9及P-gp、MRP2蛋白的表达,PI3K/Akt通路抑制剂能够降低HCT-15细胞中p-GSK3β-Ser9及P-gp、MRP2蛋白的表达,从蛋白水平证实GSK3β-Ser9磷酸化状态能够调控大肠癌多药耐药相关蛋白的表达。2 GSK3β抑制剂能够增加HCT-15细胞中ABCB1 mRNA及ABCC2mRNA的表达,PI3K/Akt通路抑制剂能够降低HCT-15细胞中ABCB1mRNA及ABCC2 mRNA的表达,从基因水平证实通过改变GSK3β-Ser9磷酸化表达能够调控大肠癌多药耐药相关蛋白基因的表达。3 GSK3β抑制剂使HCT-15细胞对奥沙利铂的敏感性降低,PI3K/Akt通路抑制剂可增强HCT-15细胞对奥沙利铂的敏感性,GSK3β-Ser9的磷酸化水平影响大肠癌细胞对奥沙利铂的敏感性。4在大肠癌细胞中,PI3K/Akt通路通过GSK3β途径调控ABC转运蛋白的表达。此外,GSK3β-Ser9的磷酸化水平能够影响大肠癌细胞的增殖能力。
杜梦楠[7]（2018）在《microRNA-143-3p、NF-κB p65、P-gp在大肠癌中的表达及与多药耐药关系的研究》文中研究指明大肠癌（colorectal cancer,CRC）是世界范围内最常见的癌症之一,其发病率和死亡率均居于前五位。在中国大肠癌的发病率在过去30年里稳步增加,这给家庭和社会造成了巨大的负担。术后放化疗是中晚期大肠癌患者的主要治疗手段。但由于原发性或继发性化疗耐药,特别是多药耐药（MDR）的出现使化疗效果不佳,患者预后差。这种现象是目前临床治疗过程中的主要障碍。MDR被定义为在对一种药物出现耐药后,同时抵抗一系列结构和机制无关的抗癌药物。MDR的发生和发展涉及很多基因的改变和作用,其中ABC转运蛋白家族中MDR1（多药耐药蛋白1）是研究最多的,MDR1的编码蛋白P-gp（P-糖蛋白）是一种ATP能量依赖性药物输出泵,可将细胞内药物泵至细胞外,从而降低药物在细胞内的蓄积,导致化疗效果下降。近年来微小RNA（miRNA,microRNAs）受到广泛的关注。miRNA是一类长度约20个核苷酸序列的非编码小分子RNA,具有调节基因表达的功能。成熟的miRNA通过与RNA诱导沉默复合物（RISC）结合形成RISC复合物,后者可特异性识别靶mRNA的3′非编码区,从而引起靶mRNA的降解、翻译抑制,在转录后水平调控一个或多个基因的表达。miRNA作为内源性小分子RNA几乎在所有肿瘤中均有异常表达。miR-143位于人类第5号染色体上,在多种肿瘤中发挥抑癌作用。有研究发现miR-143的异常表达可调节细胞增殖、细胞生长、克隆形成,细胞凋亡,细胞周期等。有报道显示miR-143可抑制前列腺癌细胞cyclin D1的表达。但miR-143-3p与大肠癌多药耐药的关系鲜有文献报道。目的:本实验在组织水平通过检测miR-143-3p、NF-κB p65与P-gp在大肠癌组织及正常黏膜组织中的表达,分析miR-143-3p、NF-κB p65、P-gp与临床病理学特征的关系及三者的相关性。细胞水平通过转染miR-143-3p mimics、miR-143-3p inhibitor、miR-143-3p mimics NC、miR-143-3p inhibitor NC检测NF-κB p65 mRNA、MDR1 mRNA的表达,并分析其相关性。方法:1.收集2016年6月至2017年3月河北省承德市多家医院经手术切除并经术后病理证实为大肠癌的初治患者。其中石蜡标本110例其中大肠癌组织69例,正常肠黏膜组织41例（距离癌灶边缘>10cm）。新鲜组织80例,其中大肠癌组织50例,正常肠黏膜组织30例（距离癌灶边缘>10cm）。2.采用免疫组化SP法检测NF-κB p65蛋白和P-gp在大肠癌组织和正常肠黏膜组织中的蛋白表达水平,并分析NF-κB p65蛋白和P-gp表达与临床病理特征之间的关系以及二者在大肠癌组织中表达的相关性。3.采用蛋白印迹法（Western blot）检测NF-κB p65蛋白和P-gp在大肠癌组织和正常肠黏膜组织中的表达情况。4.采用实时荧光定量PCR技术（qRT-PCR）检测miR-143-3p、NF-κB p65mRNA和MDR1 mRNA在大肠癌组织和正常肠黏膜组织的表达情况,进一步分析大肠癌组织中miR-143-3p、NF-κB p65 mRNA和MDR1 mRNA的表达与临床病理特征之间的关系。5.细胞水平通过转染miR-143-3p mimics、miR-143-3p inhibitor、miR-143-3p inhibitor NC及miR-143-3p mimics NC阴性对照观察NF-κB p65 mRNA、MDR1 mRNA的表达情况。6.应用SPSS19.0统计学软件进行统计学分析,得出实验结论。结果1免疫组化结果1.1 NF-κB p65蛋白与P-gp在大肠癌组织和正常肠黏膜组织中的表达NF-κB p65蛋白在大肠癌组织中阳性表达率为（81.4%）显着高于正常肠黏膜组织（24.4%）,差异有统计学意义（P<0.05）。P-gp在大肠癌组织中阳性表达率为（89.9%）显着高于正常肠黏膜组织（19.5%）,差异有统计学意义（P<0.05）。1.2大肠癌中NF-κB p65蛋白与P-gp表达与临床病理学特征的关系大肠癌中NF-κB p65表达水平与大肠癌的分化程度、浸润深度,淋巴结转移有关,差异有统计学意义（P<0.05）。大肠癌中P-gp表达水平与大肠癌的分化程度、浸润深度相关,差异具有统计学意义（P<0.05）。1.3大肠癌中NF-κB p65蛋白表达与P-gp表达的相关性大肠癌组织中NF-κB p65蛋白和P-gp的表达呈正相关,差异有统计学意义（rs=0.490,P<0.05）;2 Western Blot实验结果大肠癌组织中NF-κB p65蛋白的表达显着高于癌旁正常肠粘膜组织,差异具有统计学意义（P<0.05）。大肠癌组织中P-gp的表达显着高于癌旁正常肠粘膜组织,差异具有统计学意义（P<0.05）。3实时荧光定量PCR（qRT-PCR）实验结果3.1大肠癌组织中MDR1 mRNA和NF-κB p65 mRNA的表达均明显高于正常肠黏膜组织,差异均有统计学意义（P<0.05）。大肠癌组织中miR-143-3p的表达明显高于正常肠黏膜组织,差异有统计学意义（P<0.05）。3.2 MDR1 mRNA和NF-κB p65 mRNA在大肠癌组织中的表达均与组织分化程度、Duke’s分期、淋巴结转移有关,差异均有统计学意义（P<0.05）,而与性别、年龄、肿瘤部位、肿瘤形态、浸润深度均无关,差异均无统计学意义（P>0.05）。3.3 miR-143-3p在大肠癌组织中的表达与大肠癌组织分化程度、Duke’s分期、淋巴结转移、浸润深度均有关,差异均有统计学意义（P<0.05）,而与性别、年龄、肿瘤部位、肿瘤形态均无关,差异均无统计学意义（P>0.05）。3.4大肠癌组织miR-143-3p表达与MDR1 mRNA表达的关系Spearman相关分析显示,大肠癌组织中miR-143-3p表达与MDR1 mRNA表达呈负相关,且具有统计学意义（r=-0.467,P<0.01）。3.5大肠癌细胞中转染miR-143-3p mimics 24h后与空白对照组相比NF-κB p65 mRNA和MDR1 mRNA的表达均下降。3.6大肠癌细胞中转染miR-143-3p inhibitor 24h后与空白对照组相比NF-κB p65 mRNA和MDR1 mRNA均高表达。3.7大肠癌细胞中转染miR-143-3p mimics NC和miR-143-3p inhibitor NC 24h后与空白对照组相比NF-κB p65 mRNA和MDR1 mRNA的表达无明显变化。结论:1.NF-κB p65蛋白与P-gp在大肠癌组织中的表达显着高于癌旁正常黏膜组织,两者表达成正相关,从蛋白水平上证实二者均参与大肠癌的发生、发展过程。2.NF-κB p65 mRNA、MDR1 mRNA在大肠癌中的表达显着高于癌旁正常黏膜组织,两者表达成正相关,从基因水平上证实了二者共同参与了大肠癌发生发展的过程。3.大肠癌组织中miR-143-3p表达降低与分化程度、Duke’s分期、浸润深度、淋巴结转移有关。与NF-κB p65 mRNA、MDR1 mRNA表达均呈负相关。4.在大肠癌细胞中miR-143-3p对NF-κB p65 mRNA、MDR1mRNA表达具有调控作用
邓松华[8]（2017）在《天马颗粒剂的拆方研究及其精减方对大肠癌PI3K/Akt/mTOR信号通路的作用》文中提出目的:对天马颗粒剂进行拆方研究,通过删减非药效因素,优化天马颗粒剂的配方组成。观察天马颗粒剂精减方体内外抗肿瘤效果,并探讨其对PI3K/Akt/mTOR信号通路的作用。方法:（一）拆方研究:应用SPSS17.0软件,按17因素（17味中药）,2水平（原始剂量和0剂量）,建立正交表L20(217)进行分组。选用体重（200±20）g的SPF级SD大鼠,分别予20组药物,2次/天,连续灌胃7天,腹主动脉采血制备含药血清。20组含药血清以5%、10%、20%的浓度分别处理人大肠癌细胞HCT8、HCT116、HT29、CoLo320、SW480和SW620,分别作用24h、48h和72h,采用CCK-8法检测6种大肠癌细胞增殖活力,每组筛选出最佳细胞增殖抑制率,通过正交设计方差分析,推断天马颗粒剂原方中的有效药物。（二）体外实验:将天马颗粒剂精减方按成人剂量的2.5倍、5倍、10倍和原方按成人剂量10倍对SD大鼠灌胃制备含药血清。各组含药血清以5%、10%、20%的浓度分别处理人大肠癌细胞HCT8、HCT116、HT29、CoLo320、SW480和SW620,分别作用24h、48h和72h,采用CCK-8法检测6种大肠癌细胞增殖活力,筛选出敏感的细胞株及最佳增殖抑制的含药血清浓度、作用时间。用浓度为20%的各组含药血清处理HCT116细胞24h,观察细胞形态的变化,采用AnnexinV-PI双染法流式细胞术检测细胞凋亡和PI单染法流式细胞术检测细胞周期。（三）体内实验:建立人大肠癌细胞HCT116移植瘤裸鼠模型,天马颗粒剂精减方低、中、高剂量、原方以及纯净水分别对移植瘤裸鼠灌胃,共4周。从给药当天起,每4天用游标卡尺测量各组移植瘤裸鼠肿瘤长短径1次并计算肿瘤体积,绘制肿瘤生长曲线;末次灌胃后处死移植瘤裸鼠,称量各组肿块的长短径和重量;采用Western blot法检测肿瘤组织PI3K/Akt/mTOR信号传导通路蛋白表达;采用肿瘤组织HE染色观察天马颗粒剂精减方体内抗肿瘤的效果。结果:（一）拆方研究:原方中蜈蚣、全蝎、半边莲、黄柏、三棱、大黄、胆南星、海藻、黄芪、山药在天马颗粒剂对大肠癌细胞的增殖抑制中,均发挥主要作用（均P<0.05）,且蜈蚣为方中主药（P=0.001）;而重楼、莪术、夏枯草、当归、党参、车前子、火麻仁在天马颗粒剂对大肠癌细胞的增殖抑制中无明显作用（均P>0.05）。（二）体外实验:（1）HCT116细胞的增殖抑制率均显着高于HCT8、HT29、Colo320、SW480和SW620（均P<0.05）;精减方高剂量组和原方组的20%含药血清对HCT116细胞的增殖抑制无显着差异（P>0.05）,但均显着高于其它组（均P<0.05）;精减方高剂量组20%含药血清作用24h、48h、72h的细胞增殖抑制率比较均无显着差异（均P>0.05）,原方组20%含药血清作用24h和72h的细胞增殖抑制率无显着差异（P>0.05）,且均显着高于作用48h的（均P<0.05）。（2）与对照组相比,各给药组的HCT116细胞变圆,透光性性差,部分细胞形态不规则,可见有细胞脱落漂浮于培养基中;天马颗粒剂精减方各组随剂量增加,细胞形态越来越不规则,透光性越来越差,漂浮的细胞逐渐增多,贴壁生长的细胞越来越稀疏。（3）各给药组HCT116细胞凋亡率与对照组比较均有显着性差异（均P<0.01）;精简方高剂量组的凋亡率与原方组比较无显着差异（P>0.05）,但均高于精减方低、中剂量组（均P<0.01）;精减方低、中、高剂量组的调亡率比较均有显着性差异（均P<0.01）。（4）天马颗粒剂精减方由低剂量到高剂量,随着浓度的增加,G0/G1期细胞逐渐增多,而S期细胞逐渐减少。精减方高剂量组G0/G1期细胞与原方组无显着差异（P>0.05）,均显着多于其它组（均P<0.05）;精减方高剂量组S期细胞和原方组无显着差异（P>0.05）,均显着少于其它组（均P<0.05）。G2期细胞差异无统计学意义（P>0.05）。（三）体内实验:（1）移植瘤体积比较,对照组与精减方低剂量组无显着差异（P>0.05）,与精减方中、高剂量组、原方组差异均有统计学意义（均P<0.05）。精减方低剂量组与中剂量组无显着差异（P>0.05）,与精减方高剂量组、原方组差异均有统计学意义（均P<0.05）;精减方中、高剂量组与原方组,任两组比较差异均无统计学意义（均P>0.05）。各给药组和给药时间的交互作用差异有统计学意义（F=77.659,P<0.01）;（2）移植瘤重量比较,各给药组均显着低于对照组（均P<0.01）;精减方高剂量组与原方组无显着差异（P>0.05）,但均显着低于其它给药组（均P<0.01）;（3）移植瘤相对增殖率比较,精减方低剂量组与精减方中、高剂量组及原方组差异均有统计学意义（均P<0.05）,精减方中、高剂量组、原方组任两组间比较,差异均无统计学意义（均P>0.05）,给药组和给药时间的交互作用有统计学意义（F=2.038,P<0.05）;（4）肿瘤组织PI3K/Akt/mTOR信号通路蛋白表达,各给药组与对照组差异均有统计学意义（均P<0.01）;精减方高剂量组和原方组无显着差异（P>0.05）;精减方低、中、高剂量组间差异均统计学意义（均P<0.01）。（5）移植瘤组织HE染色,各给药组均可见融合成片的坏死区域。随精减方剂量增加,凋亡细胞越来越多。精减方高剂量组和原方组均可见大量空泡,在坏死区域和肿瘤组织区域交界处大量炎症细胞浸润。结论:天马颗粒剂精减方的配方为:蜈蚣2g,全蝎3g,半边莲15g,黄柏6g,三棱10g,胆南星3g,海藻10g,黄芪20g,山药20g,大黄6g。天马颗粒剂精减方可抑制HCT116细胞增殖,诱导HCT-116细胞凋亡,使HCT-116细胞阻滞在G0/G1期。天马颗粒剂精简方可抑制HCT-116细胞移植瘤裸鼠移植瘤生长,可能与其下调PI3K/Akt/mTOR信号通路蛋白表达有关。天马颗粒剂精简方与原方体内外抗肿瘤效果无显着差别。
林久茂[9]（2016）在《白花蛇舌草逆转大肠癌多药耐药的作用及其机制研究》文中研究说明大肠癌是最常见的消化道恶性肿瘤之一,据报道每年全球新增发病例数高达120多万,每年逾60万人死于大肠癌。近年来我国大肠癌的发病率和死亡率逐年递增,且有年轻化趋势,严重威胁患者的生命和健康。虽然手术切除是目前治疗大肠癌的首选方式,但对于术后复发及失去手术机会或转移性大肠癌患者,化疗仍是其主要治疗手段。而大肠癌多药耐药（MDR）的产生是目前临床大肠癌化疗失败的主要原因之一,进而导致肿瘤的复发、转移。虽然随着各学科的飞速发展,为逆转耐药带来了新的思路；但无论是传统的化学逆转剂还是基因逆转、免疫逆转等新策略,或因为机制单一、毒副作用大、或因为使用难度高等原因,限制了临床的使用。因此,寻求安全、有效的耐药逆转剂以提高大肠癌对化疗的敏感性和逆转其MDR,成为临床医生和科研工作者共同关注的目标,并对提高临床疗效和改善患者的生活质量具有重要的科学价值和现实意义。肿瘤MDR是指化学治疗过程中肿瘤细胞对某一化疗药物产生耐药性的同时,对其它作用机制不同、结构不同的药物也产生耐药性的现象。MDR产生的机制是一个复杂的过程,是多基因、多途径共同参与的结果,多药耐药的产生取决于肿瘤细胞内药物浓度、药物作用靶点,以及靶点和药物间相互作用等；其机制包括药物外排增加、损伤修复增强、细胞凋亡抵抗、相关信号通路调控异常以及miRNA表观遗传学调控异常等。因此,围绕这些研究能够较系统地阐明药物逆转大肠癌MDR的作用及其分子机制。前期研究表明白花蛇舌草（HDW）治疗大肠癌疗效明确,可诱导大肠癌细胞凋亡、抑制细胞增殖和肿瘤血管新生及逆转肿瘤耐药的作用,但其逆转大肠癌MDR的作用研究尚不系统,且其具体作用机制也未阐明。因此,研究白花蛇舌草逆转大肠癌MDR的作用及其作用机制,将进一步为该药用于临床治疗大肠癌提供合理、准确的理论依据。第一部分 白花蛇舌草提取物的制备目的：制备质量稳定、可靠的白花蛇舌草提取物。方法：采用乙醇回流提取的方法制备白花蛇舌草乙醇提取物（EEHDW）,分别以芦丁和没食子酸作为标准检测EEHDW的黄酮类和酚类化合物含量；采用HPLC分析法检测EEHDW的指纹图谱；采用酸度计检测EEHDW的pH值。结果：乙醇水溶液可以将白花蛇舌草中总黄酮及总酚成分有效的提取出来；EEHDW的总黄酮含量为71.534 mg/g、RSD为1.146%,总酚含量为111.272 mg/g、RSD为0.683%,建立了HPLC指纹图谱,其pH值为7.0,且该方法精密度,稳定性,重复性良好。结论：本研究可用于白花蛇舌草提取物的质量控制,并获得了质量稳定、可控、标准的EEHDW,可为后续的细胞实验和动物实验研究提供药物保障。第二部分 白花蛇舌草对大肠癌细胞耐药的逆转作用及其机制研究目的：探讨白花蛇舌草乙醇提取物（EEHDW）对大肠癌HCT-8/5-FU细胞MDR的逆转作用及其对HCT-8/5-FU细胞药物外排、细胞增殖凋亡、相关信号通路活化和miRNAs表达的影响。方法：采用MTT法检测细胞活力验证大肠癌HCT-8/5-FU细胞的多药耐药性及EEHDW的逆转作用；分别采用HPLC分析、倒置荧光显微镜观察和流式细胞仪（FCM）检测5-FU、阿霉素（ADM）和罗丹明（Rh123）在细胞内的蓄积探讨EEHDW对HCT-8/5-FU细胞药物外排功能的影响；采用MTT检测细胞活力、显微镜观察细胞形态、集落形成检测细胞存活、FCM检测细胞周期等研究EEHDW对HCT-8/5-FU细胞增殖的影响；采用DAPI染色、AnnexinV/PI染色FCM分析研究EEHDW对HCT-8/5-FU细胞凋亡的影响；采用Transwell和细胞粘附实验观察EEHDW对HCT-8/5-FU细胞迁移、侵袭和粘附的影响;采用RT-PCR和Western Blot检测EEHDW对HCT-8/5-FU细胞药物外排相关因子（ABCC1/MRP1、ABCB1/P-gp、ABCG2/BCRP）、细胞增殖调控因子（Cyclin D1）、CDK4、p21)、细胞凋亡调控因子（Bcl-2、Bax）的mRNA和蛋白表达的影响；采用Western Blot检测EEHDW对HCT-8/5-FU细胞ERK、JNK、p38、PI3K/AKT信号通路活化的影响；采用miRNA表达谱芯片检测分析和QPCR验证检测EEHDW对HCT-8/5-FU细胞miRNAs表达的影响。结果：HCT-8/5-FU细胞株具有多药耐药性,可作为大肠癌MDR的细胞模型;EEHDW可增加HCT-8/5-FU细胞对5-FU的敏感性：EEHDW能增加5-FU、ADM、Rh123的细胞内蓄积,抑制细胞的药物外排功能；EEHDW可抑制细胞增殖、诱导细胞凋亡,抑制细胞的迁移、侵袭和粘附；EEHDW能显着下调细胞中ABCC1/MRP1、 ABCB1/P-gp、 ABCG2/BCRP、Cyclin D1、CDK4、Bcl-2的mRNA和蛋白表达,上调p21、Bax的mRNA和蛋白表达,并具有一定的剂量依赖作用；EEHDW对HCT-8/5-FU细胞ERK1/2、JNK、p38、PI3K/Akt等信号转导通路活化有显着的抑制作用；EEHDW对HCT-8/5-FU细胞的miRNA表达具有广泛的调控作用,能上调HCT-8/5-FU细胞中miR-92b、miR-1247、miR-4800-5p、miR-1224、miR-1260、miR-4669、miR-4298的表达,抑制miR-582-5p、miR-4454、miR-222、miR-483-5p、miR-4443的表达。结论：大肠癌HCT-8/5-FU细胞具有多药耐药性；EEHDW具有逆转大肠癌MDR的作用；通过调控多药耐药相关因子和细胞增殖凋亡相关因子表达、多条信号转导通路活化和多个miRNAs表达是EEHDW逆转大肠癌MDR的重要作用机制。第三部分 白花蛇舌草对裸鼠大肠癌耐药移植瘤生长的抑制作用及其机制研究目的：探讨白花蛇舌草乙醇提取物（EEHDW）在体情况下对大肠癌耐药移植瘤生长的抑制作用及其分子作用机制。方法：采用雄性BALB/c裸鼠接种大肠癌HCT-8/5-FU细胞及HCT-8细胞构建皮下移植瘤动物模型,通过5-FU干预给药验证大肠癌HCT-8/5-FU移植瘤的耐药性；大肠癌HCT-8/5-FU移植瘤耐药模型裸鼠分为对照组（生理盐水）、EEHDW、5-FU及EEHDW联合5-FU干预等4组,分别给予相应药物干预处理6周,通过检测移植瘤体积和重量研究EEHDW对大肠癌耐药移植瘤生长的影响；通过PCNA和TUNEL检测研究EEHDW对HCT-8/5-FU移植瘤细胞增殖和凋亡的影响；采用RT-PCR和IHC检测EEHDW对移植瘤组织药物外排相关因子（ABCC1/MRP1、ABCB1/P-gp、ABCG2/BCRP）、细胞增殖周期调控因子（Cyclin D1、CDK4、p21）、细胞凋亡调控因子（Bcl-2、Bax）的mRNA和蛋白表达的影响；采用Western Blot检测EEHDW对移植瘤细胞ERK、JNK、p38、PI3K/AKT信号通路活化的影响；采用QPCR检测EEHDW对移植瘤细胞miRNAs表达的影响。结果：构建的裸鼠大肠癌HCT-8/5-FU细胞移植瘤对5-FU具有耐药性,可作为大肠癌耐药研究的动物模型；EEHDW及联合组能显着抑制移植瘤的生长,且联合治疗疗效更佳；EEHDW及联合组可抑制大肠癌耐药移植瘤细胞的增殖和诱导细胞凋亡；EEHDW及联合组可显着抑制HCT-8/5-FU移植瘤细胞中ABCC1/MRP1、ABCB1/P-gp、ABCG2/BCRP、Bcl-2、Cyclin D1、CDK4的mRNA和蛋白表达,促进p21、Bax的mRNA和蛋白表达；EEHDW及联合组能抑制HCT-8/5-FU移植瘤细胞ERKl/2、JNK、p38和PI3K/Akt等信号通路的活化；EEHDW及联合组可上调HCT-8/5-FU移植瘤细胞miR-92b、miR-1247、miR-4800-5p、miR-1224、miR-1260、miR-4669、miR-4298的表达,下调miR-582-5p、miR-4454、miR-222、miR-483-5p、miR-4443的表达。结论：成功构建了大肠癌耐药移植瘤动物模型；EEHDW在体具有抑制大肠癌耐药移植瘤生长的作用,可增加移植瘤细胞对5-FU的敏感性；EEHDW在体对大肠癌耐药移植瘤耐药相关因子和细胞增殖凋亡相关因子表达、相关信号转导通路活化和miRNAs表达有显着调控作用。
孙晨博[10]（2016）在《自噬相关基因mTORC1、mTORC2及Beclin1与大肠癌耐药及靶向治疗分子机制的相关研究》文中指出目的检测自噬调控基因mTORC1、mTORC2、Beclin1与多药耐药基因MDR-1在大肠癌患者癌组织中的水平,分析自噬对大肠癌多药耐药的影响;以人结直肠癌耐药细胞株HCT-8/5-FU为研究对象,研究大肠癌中自噬调控基因mTORC1,mTORC2及Beclin1的表达对大肠癌耐药的影响及其机制,探讨mTORC1,mTORC2及Beclin1对大肠癌靶点治疗及其化疗的协同影响作用。材料与方法收集滨州医学院附属医院病理科2006年01月至2010年01月手术治疗的279例大肠癌患者组织和资料,所有患者都是首次发现,术前没有进行任何治疗,术后所有患者进行了联合治疗。通过回访中心和电话对所有病例进行随访。应用免疫组化Envision法检测279例大肠癌中mTORC1、mTORC2核心分子Raptor和Rictor以及mTOR、Beclin1、LC3和MDR-1的表达,采用χ2检验分析各蛋白与临床病理参数的相关性;运用Kaplan-Meier统计学方法探讨结直肠癌患者预后的影响因素。使用慢病毒转染技术抑制HCT-8/5-FU细胞株中Beclin1的表达,分别用雷帕霉素、KU0063794和5-FU联合干预HCT-8/5-FU细胞株,分别用RT-PCR和Western blot实验在RNA和蛋白水平检测各组细胞LC3-II、NF-kB、MDR-1、Bcl-2、Bax、MDR-1、Cleavage Caspase-3、CyclinDl 的表达,平板克隆实验、CCK-8检测细胞增殖活性,Transwell评估肿瘤侵袭能力,MDC染色显示自噬水平,Hoechst33342检测细胞凋亡。选择健康BALB/c裸鼠,皮下种植瘤细胞,观察裸鼠成瘤情况,每天腹腔注射雷帕霉素、KU0063794及5-FU, 4周后处死裸鼠后取移植瘤分析,并且分别用免疫组化、RT-PCR和Western blot实验在RNA和蛋白水平检测移植瘤组织中MDR-1、LC3-Ⅱ, NF-kB的表达。结果大肠癌标本中Beclin1、LC3、mTOR、Raptor、Rictor和MDR-1的阳性率分别为 90.32%、87.09%、46.23%、42.65%、62.72%和 72.75%,较正常组织均增加。LC3蛋白在中+低分化大肠癌中的表达高于高分化大肠癌,mTOR、Raptor、Rictor、LC3在淋巴结转移组的表达高于无淋巴结转移组;Beclin1水平升高与分化程度和淋巴结转移均无明显相关性。LC3和Beclin1、Rictor水平具有正相关性,与Raptor、mTOR水平具有负相关性,Beclin1与mTOR水平无明显相关性。Raptor与Rictor的水平具有负相关性。MDR-1与Beclin1、LC3和Rictor的表达呈正相关表达,而Raptor与mTOR的表达呈负相关。Kaplan-Meier生存分析显示,Rictor、Beclin1、LC3均阳性,Raptor、mTOR、MDR-1均阴性,并且无淋巴结转移的大肠癌患者五年生存率大于Rictor、Beclin1、LC3均阴性,Raptor、mTOR、MDR-1均阳性及淋巴结转移。干扰RNA有效抑制了 Beclin1基因在mRNA和蛋白水平的表达,并且显着下调了 Bax、LC3-II和CleavageCaspase-3的表达,上调了 Bcl-2的表达。此外,抑制Beclin1分别在体外和体内明显增加了肿瘤细胞的增殖、迁移和侵袭活性,减弱了肿瘤细胞凋亡活性,并且肿瘤细胞对5-FU的敏感性显着降低。KU0063794有效抑制了 mTORC1和mTORC2,并且显着上调了 LC3-II的表达,下调了NF-kB,MDR-1和CyclinD1的表达。此外,同时抑制mTORC1和mTORC2分别在体外和体内明显降低了肿瘤细胞的增殖、迁移和侵袭活性,增强了肿瘤细胞凋亡活性,并且肿瘤细胞对5-FU的敏感性显着增高。结论1 Beclinl、Raptor与Rictor在大肠癌组织中水平升高,与大肠癌发生、发展、转移及生存密切相关,对于判断大肠癌患者的预后具有重要参考价值。2.大肠癌中MDR-1的表达与Beclin1、LC3、Raptor、Rictor密切相关;检测Beclin1、Rictor、Raptor蛋白表达,可为判断大肠癌的多药耐药以及合理筛选有效的化疗药物提供新的理论依据。3.抑制自噬调控基因mTORC1、mTORC2的表达、增加Beclin1的表达可以降低肿瘤细胞的增殖、迁移和侵袭活性,增强肿瘤细胞的凋亡,从而抑制肿瘤的发生发展。4.靶向抑制mTORC1、mTORC2、上调Beclin1可逆转肠癌细胞的耐药性,可增加大肠癌靶点治疗及常规化疗的协同作用,对于提高大肠癌的临床治疗效果具有重要意义。
二、83例大肠癌多药耐药基因的检测（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、83例大肠癌多药耐药基因的检测（论文提纲范文）
（1）Ⅱ、Ⅲ期左半结肠癌中医证型与耐药基因、KRAS、MMR表达间的关系及意义（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 中英文缩略词表 |
| 前言 |
| 第一部分 临床研究 |
| 1.资料与方法 |
| 1.1 一般资料 |
| 1.2 诊断标准 |
| 1.3 纳入及排除标准 |
| 1.4 观察指标及检测方法 |
| 1.5 统计学方法 |
| 1.6 技术路线图 |
| 2.结果 |
| 2.1 患者的证型分布及各证型患者的基线资料比较 |
| 2.2 不同中医证型患者的To Po-Ⅱ、P-gP、TS表达 |
| 2.3 不同中医证型患者的KRAS状态 |
| 2.4 不同中医证型患者的MMR状态 |
| 3.讨论 |
| 3.1 分层探讨结直肠癌中医辨证客观指标的意义 |
| 3.2 Ⅱ、Ⅲ期左半结肠癌证型分布特点 |
| 3.3 To Po-Ⅱ、P-gP、TS表达在各中医证型间的关系及意义 |
| 3.4 KRAS状态在各中医证型间的关系及意义 |
| 3.5 MMR状态在各中医证型间的关系及意义 |
| 4.结语 |
| 4.1 结论 |
| 4.2 创新与不足 |
| 参考文献 |
| 第二部分 文献综述 |
| 综述一 大肠癌中医辨证概况及证型研究进展 |
| 参考文献 |
| 综述二 结直肠癌中医证型客观指标研究进展 |
| 参考文献 |
| 附录1 美国癌症联合委员会(AJCC)/国际抗癌联盟(UICC)第8版结直肠癌TNM分期系统 |
| 附录2 结肠癌患者临床资料收集表 |
| 致谢 |
| 研究生在读期间科研成果 |
（2）牡荆素通过PI3K/Akt/mTOR信号通路调控大肠癌的多药耐药的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 英文缩写 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 附图 |
| 附表 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 中医药逆转大肠癌多药耐药的机制研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（3）粉防己碱逆转大肠癌LOVO/5-Fu多药耐药性的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 符号说明 |
| 前言 |
| 第一部分 LOVO/5-Fu耐药细胞系的建立及其MDR和P-gp的表达情况 |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 结论 |
| 讨论 |
| 第二部分 粉防己碱逆转大肠癌LOVO/5-Fu细胞多药耐药性的研究 |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 结论 |
| 讨论 |
| 附录 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
| ENGLISH ARTICLEⅠ |
| ENGLISH ARTICLEⅡ |
（4）miR-15a-5p通过Wnt/β-catenin通路调控大肠癌多药耐药的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 英文缩写 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 附图 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 Wnt/β-catenin 信号通路与大肠癌研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（5）藤龙补中颗粒抑制CT26大肠癌生长和转移作用及机制（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 中英文缩略语对照表 |
| 引言 |
| 1.第一部分藤龙补中颗粒对大肠癌肿瘤生长作用 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 细胞株 |
| 1.1.2 主要仪器 |
| 1.1.3 主要试剂 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 实验药品准备 |
| 1.2.2 细胞培养 |
| 1.2.3 皮下移植瘤动物模型及治疗 |
| 1.2.4 细胞凋亡检测 |
| 1.2.5 Caspases活性检测 |
| 1.2.6 细胞衰老检测 |
| 1.2.7 免疫细胞检测 |
| 1.2.8 免疫因子检测 |
| 1.2.9 Western Blot |
| 1.2.10 免疫组化法 |
| 1.3 统计学分析 |
| 1.4 结果 |
| 1.4.1 TLBZG对大肠癌生长影响 |
| 1.4.2 TLBZG对大肠癌细胞凋亡作用及机制 |
| 1.4.2.1 TLBZG对大肠癌细胞凋亡作用 |
| 1.4.2.2 TLBZG对大肠癌细胞Caspases活性影响 |
| 1.4.2.3 TLBZG对 PARP剪辑作用 |
| 1.4.2.4 TLBZG对 PI3K-AKT信号转导作用 |
| 1.4.3 TLBZG对大肠癌细胞衰老作用及机制 |
| 1.4.3.1 TLBZG对大肠癌细胞衰老作用 |
| 1.4.3.2 TLBZG对 p16和p21 表达作用 |
| 1.4.3.3 TLBZG对 RB-E2F1 作用 |
| 1.4.3.4 TLBZG对 E2F1 靶基因表达作用 |
| 1.4.4 TLBZG对大肠癌血管生成及相关基因表达影响 |
| 1.4.4.1 TLBZG对大肠癌血管生成影响 |
| 1.4.4.2 TLBZG对 VEGF表达影响 |
| 1.4.4.3 TLBZG对 HIF1α表达影响 |
| 1.4.5 TLBZG对大肠癌荷瘤鼠免疫功能影响 |
| 1.4.5.1 TLBZG对大肠癌荷瘤小鼠免疫器官影响 |
| 1.4.5.2 TLBZG对大肠癌荷瘤小鼠CD3+T细胞影响 |
| 1.4.5.3 TLBZG对大肠癌荷瘤小鼠CD4+T 细胞影响 |
| 1.4.5.4 TLBZG对大肠癌荷瘤小鼠CD8+T 细胞影响 |
| 1.4.5.5 TLBZG对大肠癌荷瘤小鼠NK细胞影响 |
| 1.4.5.6 TLBZG对大肠癌荷瘤小鼠细胞因子影响 |
| 2.第二部分TLBZG大肠癌肺转移作用 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 细胞株 |
| 2.1.2 主要仪器 |
| 2.1.3 主要试剂 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 实验药品准备 |
| 2.2.2 细胞培养 |
| 2.2.3 建立尾静脉模型 |
| 2.2.4 HE染色 |
| 2.2.5 Western blot检测 |
| 2.3 统计学分析 |
| 2.4 结果 |
| 2.4.1 TLBZG对大肠癌转移影响 |
| 2.4.2 TLBZG对大肠癌转移灶MMPs表达影响 |
| 2.4.3 TLBZG对大肠癌转移灶Wnt3和β-catenin表达影响 |
| 3.分析与讨论 |
| 3.1 中医对大肠癌的认识 |
| 3.2 现代医学对大肠癌的认识 |
| 3.3 藤龙补中汤 |
| 3.4 藤龙补中颗粒对细胞凋亡作用机制 |
| 3.5 藤龙补中颗粒对细胞衰老作用机制 |
| 3.6 藤龙补中颗粒对血管生成作用机制 |
| 3.7 藤龙补中颗粒对免疫功能作用机制 |
| 3.8 藤龙补中颗粒对肿瘤转移作用机制 |
| 结论 |
| 问题与展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录一 :文献综述 中医药对大肠癌多药耐药作用及机制* |
| 参考文献 |
| 附录二 :在校期间发表论文 |
| 附录三 :其余发表论文 |
| 附录四 :参加学术会议 |
（6）PI3K/Akt/GSK3β通路介导ABC转运蛋白调控大肠癌多药耐药的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 英文缩写 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 附图 |
| 附表 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（7）microRNA-143-3p、NF-κB p65、P-gp在大肠癌中的表达及与多药耐药关系的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 英文缩写 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 附图 |
| 附表 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（8）天马颗粒剂的拆方研究及其精减方对大肠癌PI3K/Akt/mTOR信号通路的作用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 引言 |
| 1 中医对大肠癌的认识 |
| 1.1 大肠癌的中医病名 |
| 1.2 病因病机 |
| 1.3 中医治法 |
| 2 天马颗粒剂 |
| 2.1 天马颗粒剂创制的理论基础 |
| 2.2 天马颗粒剂的来源 |
| 2.3 天马颗粒剂的临床应用 |
| 2.4 天马颗粒剂的实验研究 |
| 3 PI3K/AKT/MTOR信号通路 |
| 3.1 PI3K/AKT/MTOR信号通路的物质组成 |
| 3.2 PI3K/AKT/MTOR信号通路的活化过程 |
| 3.3 PI3K/AKT/MTOR信号通路对大肠癌发生发展的作用 |
| 4 研究内容 |
| 4.1 基于正交实验设计的拆方研究 |
| 4.2 筛选对精减方敏感的肿瘤细胞 |
| 4.3 精减方含药血清对HCT116 细胞凋亡和周期的影响 |
| 4.4 精减方对移植瘤裸鼠的抑瘤效果 |
| 第一章 基于正交实验设计天马颗粒剂的拆方研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 实验细胞及动物 |
| 1.1.2 实验药物 |
| 1.1.3 实验试剂 |
| 1.1.4 实验耗材和仪器 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 正交交实验设计 |
| 1.2.2 含药血清制备 |
| 1.2.3 细胞培养 |
| 1.2.4 制作标准曲线 |
| 1.2.5 细胞增殖检测 |
| 1.3 数据分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 20组含药血清对肿瘤细胞的增殖抑制 |
| 2.2 方差分析 |
| 3 讨论 |
| 3.1 拆方研究与正交实验设计 |
| 3.2 含药血清与血清药理学 |
| 3.3 CCK-8 法细胞增殖检测 |
| 3.4 天马颗粒剂精减方方解 |
| 4 结论 |
| 第二章 天马颗粒剂精减方的体外实验研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 实验细胞及动物 |
| 1.1.2 实验药物 |
| 1.1.3 实验试剂 |
| 1.1.4 实验耗材和仪器 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 含药血清制备 |
| 1.2.2 细胞培养 |
| 1.2.3 细胞增殖检测 |
| 1.2.4 观察细胞形态 |
| 1.2.5 细胞凋亡检测 |
| 1.2.6 细胞周期检测 |
| 1.3 数据分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 筛选敏感细胞、含药血清浓度和给药时间 |
| 2.2 HCT116 细胞形态改变 |
| 2.3 对HCT116 细胞凋亡的影响 |
| 2.4 对HCT116 细胞周期的影响 |
| 3 讨论 |
| 3.1 细胞凋亡和ANNEXIN-V/PI双染法 |
| 3.2 细胞周期和PI染色法 |
| 4 结论 |
| 第三章 天马颗粒剂精减方的体内实验研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 实验细胞及动物 |
| 1.1.2 实验药物 |
| 1.1.3 实验试剂 |
| 1.1.4 实验耗材和仪器 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 细胞培养 |
| 1.2.2 裸鼠造模 |
| 1.3 观察指标 |
| 1.3.1 肿瘤体积、质量和相对增殖率 |
| 1.3.2 移植瘤组织PI3K/AKT/mTOR信号通路蛋白检测 |
| 1.3.3 肿瘤组织HE染色 |
| 1.4 数据分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 移植瘤体积和生长曲线 |
| 2.2 移植瘤重量 |
| 2.3 移植瘤相对增殖率 |
| 2.4 肿瘤组织AKT/PI3K/MTOR信号通路蛋白表达 |
| 2.5 移植瘤组织HE染色 |
| 3 讨论 |
| 3.1 裸鼠及移植瘤裸鼠模型 |
| 3.2 天马来颗粒剂精减方对移植瘤裸鼠肿瘤生长的影响 |
| 3.3 PI3K/AKT/MTOR信号通路 |
| 4 结论 |
| 全文总结 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 附录 |
（9）白花蛇舌草逆转大肠癌多药耐药的作用及其机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 缩写词 |
| 前言 |
| 第一部分 白花蛇舌草提取物的制备 |
| 1. 引言 |
| 2. 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 实验方法 |
| 3. 实验结果 |
| 3.1 EEHDW的总黄酮含量 |
| 3.2 EEHDW的总酚含量 |
| 3.3 EEHDW的HPLC指纹图谱和质控 |
| 3.4 EEHDW的pH值 |
| 4. 分析与讨论 |
| 第二部分 白花蛇舌草大对肠癌细胞耐药的逆转作用及其机制研究 |
| 1. 引言 |
| 2. 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 实验方法 |
| 3. 实验结果 |
| 3.1 HCT-8/5-FU细胞多药耐药性(MDR)验证 |
| 3.2 EEHDW对HCT-8/5-FU耐药性的影响 |
| 3.3 EEHDW对HCT-8/5-FU细胞药物外排功能的影响 |
| 3.4 EEHDW对HCT-8/5-FU细胞增殖的影响 |
| 3.5 EEHDW对HCT-8/5-FU细胞凋亡的影响 |
| 3.6 EEHDW对HCT-8/5-FU细胞迁移、侵袭和粘附的影响 |
| 3.7 EEHDW对HCT-8/5-FU细胞耐药泵、增殖、凋亡相关因子表达的影响 |
| 3.8 EEHDW对HCT-8/5-FU细胞相关信号转导通路的影响 |
| 3.9 EEHDW对HCT-8/5-FU细胞microRNA(miRNA)表达的影响 |
| 4. 分析与讨论 |
| 第三部分 白花蛇舌草对裸鼠大肠癌耐药移植瘤生长的抑制作用及其机制研究 |
| 1. 引言 |
| 2. 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 实验方法 |
| 3. 实验结果 |
| 3.1 大肠癌5-FU耐药移植瘤模型的建立与验证 |
| 3.2 EEHDW对大肠癌HCT-8/5-FU耐药细胞移植瘤生长的影响 |
| 3.3 EEHDW对大肠癌HCT-8/5-FU移植瘤细胞增殖和凋亡的影响 |
| 3.4 EEHDW对HCT-8/5-FU移植瘤细胞药物外排泵、增殖、凋亡相关因子表达的影响 |
| 3.5 EEHDW对HCT-8/5-FU移植瘤相关细胞信号转导通路的影响 |
| 3.6 EEHDW对HCT-8/5-FU移植瘤miRNAs表达的影响 |
| 4. 分析与讨论 |
| 结论 |
| 问题与展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 文献综述 |
| 参考文献 |
| 作者简历 |
（10）自噬相关基因mTORC1、mTORC2及Beclin1与大肠癌耐药及靶向治疗分子机制的相关研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略词表 |
| 引言 |
| 第一部分: 大肠癌组织中自噬相关基因mTORC1、mTORC2及Beclin1的表达与多药耐药的相关性及其临床意义 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 附图 |
| 参考文献 |
| 第二部分: mTORC1、mTORC2和Beclin1对大肠癌耐药以及靶向和常规治疗影响机制的研究 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 附图 |
| 参考文献 |
| 结论 |
| 本研究创新性自我评价 |
| 文献综述 |
| 参考文献 |
| 硕士期间发表文章情况 |
| 致谢 |
四、83例大肠癌多药耐药基因的检测（论文参考文献）
- [1]Ⅱ、Ⅲ期左半结肠癌中医证型与耐药基因、KRAS、MMR表达间的关系及意义[D]. 冯小雪. 甘肃中医药大学, 2021(01)
- [2]牡荆素通过PI3K/Akt/mTOR信号通路调控大肠癌的多药耐药的研究[D]. 李璐. 承德医学院, 2021(01)
- [3]粉防己碱逆转大肠癌LOVO/5-Fu多药耐药性的研究[D]. 王开雷. 山东大学, 2020(09)
- [4]miR-15a-5p通过Wnt/β-catenin通路调控大肠癌多药耐药的研究[D]. 黄艳洁. 承德医学院, 2020(02)
- [5]藤龙补中颗粒抑制CT26大肠癌生长和转移作用及机制[D]. 黄晓伟. 上海中医药大学, 2019
- [6]PI3K/Akt/GSK3β通路介导ABC转运蛋白调控大肠癌多药耐药的研究[D]. 袁亚男. 承德医学院, 2019(02)
- [7]microRNA-143-3p、NF-κB p65、P-gp在大肠癌中的表达及与多药耐药关系的研究[D]. 杜梦楠. 承德医学院, 2018(04)
- [8]天马颗粒剂的拆方研究及其精减方对大肠癌PI3K/Akt/mTOR信号通路的作用[D]. 邓松华. 湖南中医药大学, 2017(05)
- [9]白花蛇舌草逆转大肠癌多药耐药的作用及其机制研究[D]. 林久茂. 福建中医药大学, 2016(11)
- [10]自噬相关基因mTORC1、mTORC2及Beclin1与大肠癌耐药及靶向治疗分子机制的相关研究[D]. 孙晨博. 滨州医学院, 2016(04)