一、细胞内表达的小干扰RNA靶向丙肝病毒5′保守区的研究（论文文献综述）
齐兴财[1]（2018）在《慢病毒介导的RNAi技术生产转基因羊的初步研究》文中认为RNA干扰（RNA interference,RNAi）是应用于分子生物研究领域的一项新型技术。自从RNAi技术被发现以来,RNAi技术被广泛的应用于动植物遗传性状的改良,功能基因组,基因治疗和抗病育种等一些研究中并且在抗病毒领域的研究中有了重大的突破,有望成为抗病育种的一种新型手段。本实验主要选取O型口蹄疫病毒ON株和小反刍兽疫病毒Nigeria 75/1株,以ON株口蹄疫病毒3C、3D、VP1和小反刍兽疫病毒Nigeria 75/1株的N、F、M蛋白基因作为靶基因。对每一个靶基因设计并合成两对小片段发夹RNA（short hairpin RNA,shRNA）引物,分别命名为VP1-1、VP1-2、3C-1、3C-2、3D-1、3D-2;N1、N2、F1、F2、M1、M2。依据RNAi的原理构建对每一个毒株构建了6个shRNA的重组表达质粒,转染细胞后接种病毒,通过对TCID50的测定和使用实时荧光定量PCR的检测筛选出能高效抑制病毒复制的重组质粒。结果显示,针对ON口蹄疫病毒构建的6个shRNA重组表达质粒抑制率均在71.5%93.2%之间,其中PLKO.1-VP1-2和PLKO.1-3D-1的抑制效果最为明显,分别为93.2%和90.8%;针对Nigeria 75/1小反刍兽疫病毒构建的6个shRNA重组表达质粒抑制率均在17.4%44.1%之间,其中PLKO.1-N1和PLKO.1-M1的抑制效果最为明显,分别为41.8%和44.1%。将能够高效抑制病毒复制的重组质粒进行慢病毒的制备并进行药物筛选得到稳定的细胞系,通过对TCID50的测定和使用实时荧光定量PCR的检测慢病毒干扰载体对病毒复制的抑制作用。结果显示,慢病毒干扰载体PLKO.1-VP1-2和PLKO.1-3D-1的抑制效率在88.3%95.49%;慢病毒干扰载体PLKO.1-N1和PLKO.1-M1的抑制效率为42.34%和44.32%。对研究结果表明,在细胞的水平上挑选出有效抑制ON口蹄疫病毒复制和Nigeria 75/1小反刍兽疫病毒的基因干扰片段并成功制备慢病毒干扰载体,为后续抗口蹄疫病毒和小反刍兽疫病毒的的转基因羊生产培育奠定了实验基础。
余浩[2]（2014）在《促进rAAV在肺癌细胞中高表达的miRNA筛选及机制初探》文中进行了进一步梳理研究背景近年来，基因治疗取得长足的进展，全世界已有上千例基因治疗研究进入临床试验，治疗的范围已从遗传病领域扩展到癌症、心血管疾病、神经系统疾病、传染病（包括AIDS）等领域。然而，呈递基因药物的载体的局限性阻碍了基因治疗的发展。rAAV（Recombinant Adeno-associated Virus）基因药物载体这一后起之秀格外引人注目，腺相关病毒属于细小病毒家族，具有宿主范围广、非致病性、能长期稳定表达外源基因等优点，被认为是最有前景的基因治疗载体之一。一些临床研究的问题如血友病基因治疗中AAV2外壳启动了CD8+T细胞介导的免疫反应，对肝细胞产生细胞毒性，缺陷、帕金森病的临床试验被证明基本无效，对rAAV载体的表达效率提出了更高要求。一些治疗基因，在发挥抗肿瘤作用的同时，还可提高载体的表达效率。2009年Johnson等研究发现，siRNA介导的沉默机制使rAAV载体的表达效率最高可提高15倍和30倍。2011年Wallen等从5520个siRNA文库中筛选出50个能提高rAAV表达至8倍的siRNA。以上研究为本论文提供了良好的借鉴。miRNA是一类长约22nt的小片段RNA分子，能够在转录后水平调控基因表达。它的异常表达与肿瘤发生关系密切，尤其是在肺癌中的影响，引起强烈关注，并得到大量研究。研究目的本论文将探索miRNA在以rAAV作为载体的基因治疗中的作用，在小细胞肺癌细胞NCI-H446细胞系中高通量筛选miRNA文库以发现促进rAAV表达的miRNA序列并利用生物信息学软件对明星miRNA进行靶点和信号通路预测，探索其作用机理，为rAAV-miRNA的基因药物的研究打开一扇门。研究方法（1）细胞培养，建立NCI-H446细胞系；（2）脂质体转染法共转染EGFP siRNA和EGFP质粒以评估和建立良好的转染体系；（3）脂质体转染法转染包含近2000条序列的miRNA文库；（4）转染rAAV-GLUC病毒，以GLUC荧光表达量来衡量rAAV的表达水平；（5）用腔肠素（coelenterazine）配制工作液来检测GLUC荧光强度；（6） MTT法检测转染体系中细胞增殖及活力；（7）用稳健型Z评分，四分位法等统计学算法对筛选数据进行科学的统计和结果鉴定，挑选出可以提高rAAV转染效率的miRNA；（8）使用生物信息学软件如Targetscan，Pictar，DAVID等对筛选出的miRNA进行靶基因和信号通路预测，以进一步探究miRNA作用机理。研究结果（1）重复两次完成了近2000个miRNA序列文库的筛选，获得了信息量丰富的数据，并挑出了促进rAAV高表达的miRNA分子；（2）对初筛的miRNA进行生物学验证，证实了初筛的结果；（3）根据生物信息软件预测结果分析讨论了miRNA参与rAAV转染过程的可能机制。
曾菁,彭芳[3]（2013）在《抗丙型肝炎病毒药物的研究进展》文中进行了进一步梳理丙型肝炎（hepatitis C,HC）是一种发病率高、病死率高的传染病,全球约1.8亿人感染丙型肝炎病毒（hepatitis C virus,HCV）,至今无法治愈。本文概述了近几年来抗HCV药物,包括干扰素及利巴韦林、特殊靶向治疗药物和免疫调节剂等的研究进展。
王改丽[4]（2012）在《RNAi抑制羊传染性脓疱病毒增殖效果的研究》文中研究指明羊传染性脓疱病（Contagious ecthyma, CE）俗称“羊口疮（Orf）”，是由羊感染传染性脓疱病毒（Orf virus，ORFV）引起的一种急性、高度接触性人兽共患传染病。该病传染性强，发病率高，且常呈群发性流行，给世界各养羊国造成了巨大的经济损失，并对人类健康造成很大威胁。目前还没有有效预防Orf的疫苗，且疫苗接种过程本身也会对动物造成一定的损伤，和自然感染一样形成富含病毒的痂皮。ORFV CBP（chemokine-binding protein，CBP）是一种对宿主有致病性的毒力因子和免疫调节因子，干扰和/或破坏宿主的免疫反应，阻碍获得性免疫的产生，且与ORFV反复感染宿主有关。在ORFV复制过程中DNA聚合酶为早期合成蛋白，主要催化DNA的合成及其相辅的活性，在病毒复制过程中发挥着极其重要的作用。RNA干扰（RNA interference, RNAi）是一种由双链RNA诱发的基因沉默现象，已经广泛用于病毒病的基因治疗和药物靶点筛选。故将ORFV CBP和DNA聚合酶作为靶基因，进行小干扰RNA抑制病毒复制的研究，以期为Orf的防控提供新的思路以及为Orf的防治探索新的方法。本实验首先用IFA、CPE分析和TCID50及Real-tme PCR对羊源原代OFTu细胞接种病毒后不同时间段ORFV的增殖情况进行了检测。IFA方检测结果显示感染病毒后8h有较少量绿色荧光出现，到感染后72h大部分细胞都发出了绿色荧光。CPE分析发现在感染病毒后8h有较少量的细胞变性；随着时间的延长，出现病变的细胞逐渐增多，到72h大部分细胞都出现了CPE; Real-time PCR检测结果发现ORFV感染细胞后36h到48h病毒基因组DNA的含量增加迅速，之后增加的速度变缓；TCID50检测结果和基因组DNA的增长趋势一致。在测定了ORFV生长特性的基础上，针对ORFV CBP基因设计合成3对siRNA，转染细胞后感染病毒。首先进行了siRNA在mRNA水平抑制ORFV增殖效果的检测；TCID50测定结果表明：siRNA组病毒感染滴度分别是对照组的1/1.06、1/1.11和1/1.11；Real-time PCR检测结果发现转染siRNA组基因拷贝数分别为对照组的1/1.2、1/1.12和1/1.16；而转染组和对照组细胞的CPE和IFA检测结果没有明显差异；为了验证siRNA的特异性，使用western blotting方法从蛋白水平检测CBP蛋白的含量，检测结果表明siRNA能有效抑制ORFV CBP蛋白的表达，证明所设计合成的siRNA具有特异性；这表明靶向CBP基因的siRNA抑制ORFV增殖作用较弱。最后，针对ORFV DNA聚合酶基因设计合成了3对siRNA，转染细胞后接种病毒。TCID50检测结果显示：与对照组相比转染组病毒的感染滴度降低了59-199倍；Real-time PCR检测结果发现：与对照组相比病毒基因组DNA的拷贝数下降了84%、89%和73%；IFA检测结果显示转染siRNA组只有少数细胞能被荧光抗体标记；之后对siRNA抑制病毒增殖的时效性进行了检测，其有效抑制时间为72-84h；检测结果表明转染到细胞中针对ORFV DNA聚合酶的siRNA持续抑制了病毒感染后的增殖过程。因此在筛选到有效的siRNA干扰靶点后，又设计合成了shR1、sh1R2质粒载体，通过TCID50、IFA和Real-time PCR对shRNA抑制病毒增殖效果进行检测；TCID50检测结果发现：转染shR1和shR2的细胞培养物中病毒感染滴度是阴性对照组的207和58；Real-time PCR检测结果发现：与对照组相比shR1和shR2组抑制病毒增殖效率为90.8%和76%；IFA检测结果显示转染siRNA组只有少数细胞能被荧光抗体标记；表明shR1和shR2均能有效抑制病毒的增殖；该实验结果能为抗ORFV感染和控制Orf发生提供参考依据；同时，也为ORFV感染过程中病毒和细胞基因功能的分析提供了新的思路。
赵延森[5]（2011）在《黄牛和水牛INHA基因RNAi慢病毒载体的构建与鉴定及功能研究》文中研究表明抑制素（inhibin, INH）是由卵巢颗粒细胞和睾丸支持细胞生成和分泌的糖蛋白类激素,是由α-和β-两个亚基通过二硫键连结而成的异二聚体,其中α亚基是抑制素发挥生理功能所必需的。抑制素对雌性动物的主要作用是通过抑制促卵泡素（FSH）的合成和分泌而抑制卵泡发育,促进颗粒细胞的凋亡；对雄性动物的具体作用为抑制精子的发生,降低睾丸的生精能力。因此,干扰抑制素α亚基基因的表达,可降低动物体内的抑制素水平,进而促进卵泡发育和精子的生成,提高排卵率。但是,完全干扰抑制素的合成或分泌是否对动物生殖活动及其他生理机能的维持有影响,尚无文献报道。本研究选择INHA基因作为靶基因,分别设计了7个短发夹RNA序列（shRNA）,采用Gateway克隆技术,分三步构建了表达shRNA的慢病毒载体Va、Vb、Vc、Vd、VH1、Vy、Vs,并包装了表达GFP的慢病毒VGFP进行转染293FT细胞,通过监测绿色荧光强度,旨在比较这7种载体及其相互组合的整合能力、干扰效果、物种特异性和介导方式,为阐明抑制素干扰水平与繁殖及其他生理机能维持的关系,建立适于干扰黄牛和水牛抑制素的转基因动物生产方法提供技术支撑。结果如下：1、适于黄牛的慢病毒载体及其对INH基因表达的抑制率Va、Vb、Vc、Vd、VH1对黄牛INH基因表达的抑制效果显着,而阴性对照载体Vy对黄牛INH基因表达无抑制作用。其中Va和Vb对黄牛IHN基因表达的抑制率均在97%以上,具有高效抑制作用；Vc和Vd对黄牛IHN基因表达的抑制率分别为68.36%和82.0%,具有中效率抑制作用；Lvd和VH1对黄牛IHNA基因表达的抑制率分别为28.30%和35.39%,具有低效抑制作用。2、适于水牛的慢病毒载体及其对INH基因表达的抑制率Vb、Vc、Vd和Vs对水牛INH基因表达的抑制效果显着。其中Va、Vb和Vd对水牛INH基因表达,具有高效抑制作用；Vc和Vs对水牛INH基因表达的抑制率分别为69.01%和66.55%,具有中效抑制作用。3、不同载体组合对INHA基因表达的抑制率取Va、Vb、Vc、Vd和VH1各100μl,制成混合载体Y后转染黄牛卵巢颗粒细胞,72h后发现混合物对黄牛INH基因表达抑制效果不明显。取Va和Vb各250μl制成混合载体E；取Va、Vb和Vc各167μl制成混合载体F；取Va、Vb和Vd各167μl制成混合载体H；取Vc和Vd各250μl制成混合载体J；取Va、Vb、Vc和Vd制成混合载体N,分别转染水牛卵巢颗粒细胞,72h后发现E、F、H、J和N对水牛INHA基因表达的抑制效果显着,其中F、H和J对水牛INHA基因表达的抑制率均在93%以上,具有高效抑制作用；E和N对水牛INHA基因表达的抑制率分别为45.6%和65.13%,具有中效抑制作用。这些结果说明,载体等量组合后,各自的干扰能力发生了变化。4、与质粒DNA载体Lvd介导的RNAi效率比较Lvd对INH基因表达的抑制率为28.30%,远低于Vd的抑制率82.20%。这说明质粒DNA载体介导的RNAi效率低于慢病毒载体。5、慢病毒载体的整合能力经VGFP转染的293FT细胞培养传代至39d时,仍可观察到绿色荧光,且荧光强度没有明显减弱,细胞形态正常,这说明慢病毒载体整合到了宿主基因组且对宿主生长无影响。结论：Va、Vb、Vc和Vd能有效抑制黄牛和水牛INHA基因的表达。靶序列同源性较高且位置较近时,干扰效果相近。不同的载体组合对靶基因表达的抑制率不同,靶序列相近的两个载体组合后,两载体各自的干扰能力下降；靶序列不同的两个载体组合后,两载体各自的干扰能力增强；靶序列相近的两个载体与一个靶序列不同的载体组合后,三者各自的干扰能力都得到了增强,且随着靶序列位置差距的增大,增强幅度加大；当组合中多于三个载体时,各自的干扰能力都降低,且降低幅度很大。靶序列处在靶基因末端时,即使只有7个碱基匹配也同样可以发生干扰。慢病毒载体对靶基因表达抑制效果优于质粒DNA载体。VGFP携带的GFP在293FT细胞内的持续表达说明,本研究包装的病毒载体可将外源基因整合到宿主染色体,使之持续稳定的表达,且可稳定的遗传给后代细胞,可用于后期的转基因动物制备以及基因治疗。
胡华[6]（2011）在《P物质小干扰RNA在变应性鼻炎基因治疗中的作用机制研究》文中指出变应性鼻炎（Allergic rhinitis, AR）又称过敏性鼻炎,是耳鼻喉科常见病、多发病,人群发病率高达5-15%,严重影响患者的生活质量。目前研究表明,变应性鼻炎发病中存在多种基因的异常表达,其中,P物质（Substance P, SP）基因的异常表达与变应性鼻炎严重程度密切相关。调节异常致病基因的表达是治疗基因相关疾病的重要途径,而近年来逐渐兴起的小干扰RNA技术则为这类疾病的基因治疗提供了很好的技术支持。小干扰RNA技术主要是通过设计同目的基因mRNA相对应,长度为21-25bp的短RNA序列,以双链的dsRNA或shRNA的形式导入细胞,导入的dsRNA可被Dicer酶消化生成siRNA,或shRNA表达产生针对目的mRNA的特异序列的siRNA, siRNA进一步同目的mRNA及核酸酶结合形成完全的RNA沉默复合体（RNA-induced silencing complex, RISC）,激活并降解目的mRNA,抑制该基因在细胞内的表达。siRNA技术作为一种高效、特异抑制靶基因表达的方法,既可以用来对目的基因进行功能研究,亦可作为疾病基因治疗的手段。为了研究P物质在变应性鼻炎发病中的作用并探讨SP基因治疗在变应性鼻炎治疗中的作用,我们利用siRNA技术,分别在细胞水平和动物整体水平对P物质siRNA （SP-siRNA）在变应性鼻炎的作用进行研究探讨。我们首先对人,大鼠,小鼠的P物质mRNA序列进行对比分析并使用Whitehead Institute for Biomedical Research的siRNA设计软件设计针对P物质mRNA保守区域的siRNA序列共3条。为验证设计序列的有效性,我们选取变应性疾病研究中常用的肥大细胞-RBL-2H3细胞为对象,进行P物质siRNA干预研究。我们首先通过real time PCR、细胞免疫荧光的方法证明肥大细胞RBL-2H3中存在有内源性P物质表达,并发现P物质的表达在外源DNP-IgE激活后表达增加；针对软件设计的3组P物质siRNA序列,我们使用siRNA研究中广泛应用的shRNA表达载体psilencer 4.1 CMV neo,合成并构建了对应的3组P物质shRNA表达载体及1组阴性对照shRNA （Negative control-shRNA, NC-shRNA）表达载体,通过克隆扩增,制备并抽提4组shRNA质粒；通过细胞电转化的方法,分别将3组shRNA以及阴性对照shRNA瞬时转染入肥大细胞RBL-2H3；同时对shRNA载体转化后的细胞和转染空载体的细胞使用DNP-IgE刺激,通过real time-PCR及细胞免疫荧光的方法,检测IgE刺激后,肥大细胞RBL-2H3内P物质表达情况,筛选出干扰效果最佳的SP-shRNA2载体作为最佳的转染载体,对应的序列为高效的P物质小干扰RNA序列。对SP-shRNA2、阴性对照NC-shRNA转染后的肥大细胞RBL-2H3,通过β-hexosaminidase实验检测不同shRNA质粒转染对肥大细胞RBL-2H3脱颗粒能力的影响。结果发现,与对照shRNA转染组相比,转染P物质shRNA后,肥大细胞RBL-2H3脱颗粒释放β-hexosaminidase水平降低,说明P物质shRNA作用后可显着抑制肥大细胞RBL-2H3的脱颗粒能力。依照细胞实验结果,我们选取对P物质mRNA抑制表达效率最高的shRNA2序列,依照其对应的siRNA序列合成化学修饰的P物质siRNA （SP-siRNA）,给予变应性鼻炎小鼠鼻腔给药,进行动物整体水平的小干扰RNA治疗研究。我们将BABL/C小鼠分别分为1)变应性鼻炎SP-siRNA干预组；2)变应性鼻炎阴性对照siRNA干预组（Negative control-siRNA, NC-siRNA）; 3)变应性鼻炎未干预组。对模型小鼠分别进行4次的腹腔注射致敏后,按照siRNA鼻腔给药干预/OVA鼻腔激发/OVA鼻腔激发/OVA鼻腔激发的顺序依次进行干预和激发操作,共进行4次干预,最后一次鼻腔激发后,麻醉小鼠并提取血清、收集鼻黏膜样本。分别通过ELISA,免疫组化,病理染色,real time RT-PCR,抗体芯片等方法检测P物质siRNA干预后,动物鼻腔鼻黏膜局部P物质表达、嗜酸性粒细胞浸润、嗜酸性颗粒释放及变应性鼻炎相关炎症因子的表达情况。结果发现,P物质siRNA干预后,小鼠鼻黏膜中P物质mRNA含量较阴性对照siRNA处理组和生理盐水对照组显着减少,在鼻黏膜局部SP基因表达下降达70%；免疫组化也表明SP-siRNA干预组鼻黏膜中P物质含量明显降低；小鼠变应性鼻炎症状观测发现SP-siRNA可明显改善小鼠鼻炎症状；病理学染色（嗜酸性粒细胞染色）发现P物质siRNA干预后,鼻黏膜中嗜酸性颗粒释放及嗜酸性粒细胞浸润数量减少；同时鼻黏膜总蛋白抗体芯片检测表明,SP-siRNA干预可显着减少鼻黏膜局部IL-1α、IL-1β、IL-4、IL-6、Eotaxin、Eotaxin-2、CD30L等多种炎性细胞因子的分泌,而鼻腔给予SP-siRNA并未影响AR模型小鼠血清中IgE含量。说明P物质siRNA鼻腔给药可减轻鼻黏膜局部变应性炎症反应。实验证明P物质siRNA能阻断变应性鼻炎的发病过程,SP-siRNA通过抑制肥大细胞RBL-2H3中P物质表达,抑制肥大细胞脱颗粒反应,减少多种变应性鼻炎相关炎症因子的释放；变应性鼻炎小鼠鼻腔SP-siRNA给药抑制鼻黏膜局部P物质表达后,可抑制鼻黏膜局部嗜酸性粒细胞浸润,减少鼻黏膜局部IL-4、IL-6、嗜酸性粒细胞趋化因子等多种炎症因子的分泌,抑制鼻黏膜局部变应性炎症反应,缓解变应性鼻炎症状。实验提示P物质siRNA干预可能是具有治疗前景的变应性鼻炎的基因治疗有效方法。
蒲春文[7]（2011）在《优化选择的串联序列amiRNA表达载体抗乙肝病毒的研究》文中研究指明RNA干扰为治疗人类疾病提供了一个很有前景的方法。前期已有一些学者对于RNAi抗HBV做过研究,但是每个研究小组设计的siRNA分子对病毒的抑制效果有明显的差异,因此还需在HBV的干扰靶点上做大量的工作；另外大多研究进行的都是siRNA的瞬时转染,未构建稳定的转染体系,不能观察清除HBV RNA的远期效果；目前临床应用的抗病毒药物也都需要进行长期治疗,包括干扰素、核苷酸类似物,RNA干扰的作用亦需持久。病毒基因突变是RNA干扰抗病毒失败的重要原因,针对病毒可逃逸RNAi作用的特点,我们设计了可在体内同时表达两个microRNA,靶向不同位点的串联序列amiRNA。即便是病毒一个基因位点的突变就可以逃逸siRNA,而并不能逃逸miRNA的干扰作用。miRNA在体内之所以能广泛存在并发挥作用,是因为它的特点是只要骨架与靶RNA相同,单一一个位点的变化不会影响其发挥作用。目前对于乙肝病毒的研究已从最初的化学合成siRNA、shRNA质粒载体等向应用性较强的microRNA的研究过渡。尽管有学者用化学合成的多个siRNA同时作用于一个细胞,证实了靶向多个区域基因的可行性,但其为剂量依赖性的,需经常向体内注入siRNA。通过质粒等载体在细胞内表达miRNA或siRNA不仅经济方便,还可进行稳定转染,使小干扰RNA持续表达,延长对目的基因的抑制时间。质粒载体能介导更长期的干扰效果,而过多的质粒载体可能对细胞造成一定的影响。串联序列表达载体的优点就在于只需导入一个质粒载体就可发挥作用。amiRNA使得导入的外源性基因在体内自然形成miRNA成为可能,并可同时表达多条miRNA。有学者利用polⅡ启动子表达多个串联的shRNAs,从而抑制了多个基因的表达,其对应蛋白的表达都有明显降低。但有研究提出siRNA可诱导IFN反应,从而存在一些安全性问题。相对于siRNA,由polⅡ启动子介导的amiRNA技术被证实不会引起宿主的免疫反应,亦没对miRNA的内源性途径产生影响,安全有效。有研究采用该种方法将2个串联序列amiRNA导入细胞,但未取得更好的干扰效果,可能是因为并没有找到最佳的干扰序列。另外,关于串联序列amiRNA在HBV DNA水平的干扰效果,尤其是cccDNA方面的干扰效率未见报道。HBV是一个DNA病毒,但必须经过前基因组RNA进行逆转录,使得RNA干扰得以发挥作用,临床中HBV DNA的检测更为实用。cccDNA是HBV的源泉,使得对它的观察更为重要。因为其半衰期较长,所以稳定转染更能接近临床研究情况。目的：本文结合以往研究的经验,针对HBV容易变异的特点,力图寻找针对HBV基因组保守区域的多个有效干扰位点；将构建的质粒瞬时转染入HepG2.2.15,检测各个序列在RNA水平对HBV的干扰效率；挑选干扰效果好的序列,优化设计并构建针对不同位点的串联序列amiRNA表达载体；通过瞬时转染和稳定筛选,全面研究单一序列及串联序列amiRNA表达载体在抑制HBV RNA、DNA和蛋白质表达及cccDNA方面的效果。方法：1.针对病毒容易变异而逃逸RNAi作用的特点,我们首先利用生物信息学软件找到不同基因型HBV基因的保守区域,避开临床常见的病毒变异位点选取4个HBV的RNAi靶位点,分别靶向HBV的S区或X区。2.利用microRNA设计软件,设计4条microRNA序列,并构建四个以CMV为启动子的内源性miR155为骨架的amiRNA表达质粒,分别命名为amiHBV-1、amiHBV-2、amiHBV-3和amiHBV-4。3.将构建成功的4个amiHBV表达载体分别瞬时转染到含有HBV-DNA全基因的人肝母细胞瘤HepG2.2.15细胞株,从mRNA水平研究单一序列amiHBV对HBV mRNA干扰效果,筛选干扰效率高的amiRNA序列,将其中2条干扰效率较高的单一序列串联,构建串联序列amiRNA表达质粒（amiHBV-3-4）。4.将串联序列amiHBV表达质粒瞬时转染入HepG2.2.15细胞,因为ami-HBVI和ami-HBV2在HBV mRNA水平的抑制效率低,在下一步的实验中将其舍去。采用实时定量荧光PCR法分别检测细胞培养上清液和细胞内的HBV DNA；采用CMIA法（Chemiluminescent Microparticle Immunoassay）定量检测分泌蛋白HBsAg和HBeAg的水平变化。5.通过转染后稳定细胞株的筛选,建立amiRNA稳定转染的HepG2.2.15细胞株,采用荧光实时定量检测试剂盒,对amiRNA干扰HBV的复制根源cccDNA的效果进行了研究。结果1.本研究中4个不同靶位的amiRNA载体被构建,4个单一序列及1条串联序列amiHBV表达载体均经测序验证构建成功。2.4个单一序列amiHBV表达质粒以amiHBV-4对HBV mRNA的抑制率最高可达75.6%, amiHBV-3对HBV mRNA的抑制率为61.2%；而amiHBV-1和amiHBV-2对HBVmRNA的抑制率仅为29.3%及14.9%；其中串联序列amiHBV 3-4的干扰效率为87.2%,串联序列组的干扰效率高于单一序列组。3.各组质粒对培养细胞上清中HBV DNA的干扰效率以串联序列质粒组最高可达到94.3%,单一序列组中干扰效率最高的分别为amiHBV-3组60.5%和amiHBV-4组68.0%。对细胞内HBV DNA的干扰效率amiHBV-3组、amiHBV-4组和amiHBV 3-4组分别为71.6%、80.2%和79.7%。4.在转染后72h对细胞上清中HBsAg的抑制效果最好的为串联序列组达到67.4%,其次为amiHBV-4组达到64.6%,再次为amiHBV-3组。对HBeAg的抑制总体效果不及对HBsAg的抑制效果好,串联序列组抑制效果最好,但也只达到了31%。稳定转染后两组（amiHBV 3-4和amiHBV-4）对HBsAg和HBeAg的分泌,均显示了显着的抑制效果。对HBsAg的抑制率最高达97.18%,对HBeAg的抑制率最高达97.00%。5.对HBV cccDNA的干扰情况进行了研究,瞬时转染amiHBV-4组对HBV cccDNA的抑制率为21.9%,串联序列amiHBV3-4组的抑制率（58.4%）明显高于单一序列组。稳定转染后串联序列组HBV cccDNA的抑制率为99.65%,单一序列组的抑制率为93.78%。结论：1.分别靶向HBV S区基因256-276bp和672-692bp位点的单一序列amiRNA对HBV RNA、DNA和表面抗原（HBsAg）均有显着的干扰效果。2.同时靶向HBV S区基因256-276bp和672-692bp两个位点的串联序列amiRNA对HBV RNA、DNA和HBsAg的干扰效果均显着优于单一序列HBVamiRNA的干扰效果。3.瞬时转染靶向HBV S区的串联序列amiRNA对HBsAg的抑制效果显着,对HBeAg的抑制不明显；稳定转染串联序列amiRNA对HBsAg和HBeAg均有显着的抑制效果。4.稳定转染的单一序列或串联序列amiRNA对HBV DNA、cccDNA、HBsAg及HBeAg的抑制效果均优于瞬时转染的抑制效果。5.针对HBV S区基因的单一序列或串联序列amiRNA对HBV RNA、表面抗原（HBsAg）、DNA及cccDNA均有较好的干扰效果,提示HBV S区基因是RNA干扰的有效靶点之一。6.串联序列amiRNA介导的RNA干扰机制能极大程度的抑制HBV的复制、病毒蛋白的表达及复制根源cccDNA。7.本研究串联两个靶位点的amiRNA表达质粒构建成功并显示高效的抗病毒功能,提示针对多个靶基因或靶位点的amiRNA载体的构建和功能的实现具有可行性。
刘晓,王洪梅,宋玲玲,武建明,杨宏军,高运东,仲跻峰,何洪彬[8]（2011）在《RNAi及其抗口蹄疫病毒研究进展》文中研究指明RNAi（RNA interference）技术为基因功能分析提供了有效的手段,并在抗病毒的基因治疗及防控研究中取得了一些阶段性成果。笔者综述了RNAi及其抗病毒研究的现状,重点回顾了RNAi抗口蹄疫病毒（FMDV）的研究进展,并对RNAi抗病毒研究前景进行了展望。
魏强,曹博,郭韬,李广林[9]（2010）在《小干扰RNA抗病毒研究进展》文中研究说明小干扰RNA（siRNA）介导的对同源基因转录后水平的抑制或由此引发的细胞质内同源mRNA降解的转录后基因沉默现象,在抗病毒研究中具有重要意义。由病毒感染引起的各种疾病严重危害着人类的健康,而siRNA在抗病毒感染的研究领域中显示出高度特异性,故受到人们的普遍关注。近年来,siRNA抗病毒方面的研究成为国内外的热点,为临床病毒感染性疾病的防治提供了新的途径。我们就siRNA的机制和特点、siRNA的制备及其抗病毒研究进展做简要综述。
吴志强[10]（2010）在《应用RNA干扰技术抑制手足口病重要病原体的基因表达与复制研究》文中研究表明手足口病（Hand, foot, and mouth disease, HFMD）主要发病于5岁以下儿童,其主要症状为儿童的口腔黏膜、手和脚上出现水疱疹。大部分手足口病发病可自愈,少数发病可并发急性脑膜炎、脑炎和急性心肌炎甚至死亡,是近年来严重危害我国儿童健康的丙类法定报告传染病,目前尚无特效治疗药物。手足口病可由多种小RNA病毒科人肠道病毒属的病毒引起,包括柯萨奇病毒内的多种血清型（Coxsackievirus A16、A4、A5、A9、A10、B2、B5）、肠道病毒71型（Enterovirus71,EV71）以及部分埃可病毒（Echo virus）。其中,肠道病毒71型（EV71）以及柯萨奇病毒A16型（CA16）是手足口病的两大最主要的病原体,在多次爆发的手足口病流行中均占主导地位。EV71感染除手足口病外可致无菌性脑膜炎、脑炎和脊髓灰质炎样的麻痹性疾病等多种与神经系统相关的疾病并引起儿童的死亡。CA16感染症状较EV71感染轻,一般不引起神经系统疾病,但却可能与心肌炎、心包炎密切相关,并引起低龄儿童的死亡。RNA干扰（RNA interference, RNAi）,是一种由双链RNA （dsRNAs）介导的转录后mRNA水平沉默序列上同源的基因表达的一种序列特异性基因沉默机制,它也是生物细胞内基因组抵御外在感染和内部转座的一种古老的防御机制,广泛存在于各种生物,包括动植物、真菌、昆虫和后生动物体内。这个过程可以简单描述如下,dsRNAs首先被细胞内的核糖核酸酶Ⅲ类似物Dicer切割成21-23nt的小干扰RNA （small interfering RNAs, siRNAs）,切割产生的siRNAs与一种多种蛋白的复合体RISC （RNA-induced silencing complex）结合后识别并降解与其同源的mRNAs。在近十年的研究过程中,这一理论被极大地丰富并已经大量投入到了应用中。在2001年,Elbashir发现,于哺乳动物中直接导入21-23nt的siRNAs可诱发RNAi效应。往后的几年,RNA干扰已经很大程度上能够代替基因敲除成为研究基因功能的有力手段。近年来,RNAi被大量应用于哺乳动物细胞的抗病毒研究并取得了卓越的成效。在本研究中,我们首先分离得到了于我国境内流行的CA16病毒和EV71病毒若干,并对分离得到的病毒进行了全基因组的测序分析后将所得病毒的全基因组序列提交GenBank。针对CA16病毒,我们将测序所得shzh05-1株的cDNA序列及其推测的氨基酸序列与GenBank数据库中收录的其他CA16病毒序列进行同源性比对。在序列比较和同源性比对的基础上选择开放读码框保守区不同的靶位点进行siRNAs的设计,并将所设计的siRNAs构建入siRNAs表达载体GeneBuster中。通过双荧光素酶报告基因分析系统,我们筛选得到了能有效抑制CA16病毒靶基因表达的siRNAs 13对。随后通过细胞水平的攻毒保护实验,从不同时间、不同剂量、预给药后感染病毒、感染病毒后治疗性给药、混合给药等多个层次、多个方面进行研究,验证了这13对siRNAs对病毒基因组复制和表达的良好抑制作用和对细胞的良好保护作用。针对手足口病的另外一重要病原体EV71,我们使用本室保存的SHZH98株和测序所得Fuyang-0805株与往年中国大陆流行的同属C4亚型毒株的全基因组序列做同源性比对,选取开放读码框保守区不同的靶位点进行siRNAs的设计后并直接化学合成,筛选得到能有效抑制EV71病毒靶基因表达的siRNAs 3对。随后通过细胞水平的攻毒保护实验比较了这三对siRNAs对不同毒株（Fuyang-0805和SHZH-98）复制的抑制情况,结果表明所设计筛选得到的3对siRNAs对这两株分别与不同时间不同地点在中国大陆流行的EV71病毒基因组的复制和表达均有非常好的抑制作用。抑制手足口病两大重要病原体CA16和EV71复制的小干扰RNA的筛选和验证,为抗手足口病药物的研发提供了重要的理论基础。
二、细胞内表达的小干扰RNA靶向丙肝病毒5′保守区的研究（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、细胞内表达的小干扰RNA靶向丙肝病毒5′保守区的研究（论文提纲范文）
（1）慢病毒介导的RNAi技术生产转基因羊的初步研究（论文提纲范文）
| 缩略词对照表 |
| 摘要 |
| Summary |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 动物抗病育种 |
| 1.1.1 动物抗病育种的研究进展 |
| 1.1.2 动物抗病性的遗传基础 |
| 1.1.3 动物抗病育种的途径 |
| 1.2 RNAi技术 |
| 1.2.1 RNAi干扰的技术原理 |
| 1.2.2 RNAi技术的研究进展 |
| 1.3 转基因动物 |
| 1.3.1 转基因动物的研究进展 |
| 1.3.2 转基因动物的研究方法 |
| 1.3.3 转基因动物的应用 |
| 1.4 研究目的与意义 |
| 第二章 慢病毒介导的RNAi技术生产抗FMDV转基因羊的初步研究 |
| 2.1 实验材料与方法 |
| 2.1.1 毒株、细胞和载体 |
| 2.1.2 实验试剂 |
| 2.1.3 实验仪器 |
| 2.1.4 引物设计与合成 |
| 2.1.5 表达载体的构建 |
| 2.1.6 细胞的培养与病毒的复制 |
| 2.1.7 ON口蹄疫病毒TCID_(50)的测定 |
| 2.1.8 质粒转染BHK21细胞 |
| 2.1.9 转染细胞的攻毒实验及提取攻毒细胞的RNA |
| 2.1.10 Real-timePCR检测细胞内病毒RNA |
| 2.1.11 含重组质粒的细胞测定病毒TCID |
| 2.1.12 慢病毒的制备和稳定细胞系的筛选 |
| 2.1.13 Real-timePCR检测稳定筛选的细胞内病毒RNA |
| 2.1.14 含慢病毒干扰载体的细胞测定病毒的TCID |
| 2.2 实验结果 |
| 2.2.1 重组表达质粒的鉴定 |
| 2.2.2 病毒TCID_(50)的测定和RNA的提取 |
| 2.2.3 RT-PCR检测结果分析 |
| 2.2.4 重组质粒转染BHK21细胞后病毒TCID_(50)的测定 |
| 2.2.5 RT-PCR检测慢病毒干扰载体对FMDV抑制效率 |
| 2.2.6 含有慢病毒干扰载体的细胞测定病毒的TCID |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 第三章 慢病毒介导的RNAi技术生产抗PPRV转基因羊的初步研究 |
| 3.1 实验材料与方法 |
| 3.1.1 毒株、细胞和载体 |
| 3.1.2 实验试剂 |
| 3.1.3 实验仪器 |
| 3.1.4 引物设计与合成 |
| 3.1.5 表达载体的构建 |
| 3.1.6 细胞的培养与病毒的复制 |
| 3.1.7 Nigeria75/1小反刍兽疫病毒TCID_(50)的测定 |
| 3.1.8 质粒转染VERO细胞 |
| 3.1.9 转染细胞的攻毒实验及提取攻毒细胞的RNA |
| 3.1.10 RT-PCR检测细胞内病毒RNA |
| 3.1.11 含重组质粒的细胞测定病毒TCID |
| 3.1.12 慢病毒的制备和稳定细胞系的筛选 |
| 3.1.13 Real-timePCR检测稳定筛选的细胞内病毒RNA |
| 3.1.14 含慢病毒干扰载体的细胞测定病毒的TCID |
| 3.2 实验结果 |
| 3.2.1 重组表达质粒的鉴定 |
| 3.2.2 病毒TCID_(50)的测定和RNA的提取 |
| 3.2.3 RT-PCR检测结果分析 |
| 3.2.4 重组质粒转染VERO细胞后病毒TCID_(50)的测定 |
| 3.2.5 RT-PCR检测慢病毒干扰载体对PPRV抑制效率 |
| 3.2.6 含有慢病毒干扰载体的细胞测定病毒的TCID |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 总结论 |
| 1 本研究的结论 |
| 2 本研究的不足之处 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简介 |
| 导师简介 |
（2）促进rAAV在肺癌细胞中高表达的miRNA筛选及机制初探（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 目录 |
| 第1章 引言 |
| 1.1 基因治疗的研究现状 |
| 1.1.1 基因治疗概况 |
| 1.1.2 基因载体 |
| 1.1.3 基因治疗药物 |
| 1.2 rAAV 与基因治疗 |
| 1.2.1 rAAV 概况 |
| 1.2.2 rAAV 基因药物临床试验进展 |
| 1.2.3 rAAV 基因药物存在的问题及隐患 |
| 1.3 RNAi 与基因治疗 |
| 1.3.1 RNAi |
| 1.3.2 RNAi 临床实验进展 |
| 1.3.3 miRNA 与肺癌 |
| 1.4 RNAi 与 AAV |
| 第2章 促进 rAAV 在肺癌细胞中高表达的 miRNA 筛选及统计学分析 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验材料、试剂和仪器 |
| 2.2.1 实验材料 |
| 2.2.2 实验试剂 |
| 2.2.3 实验仪器 |
| 2.2.4 试剂配制 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 实验过程中无菌操作的要求 |
| 2.3.2 细胞复苏、培养、传代和冻存 |
| 2.3.2.1 细胞的传代培养 |
| 2.3.2.2 细胞冻存 |
| 2.3.2.3 细胞复苏 |
| 2.3.3 脂质体转染 miRNA、siRNA 及 EGFP 质粒 |
| 2.3.4 转染 rAAV-GLUC 病毒 |
| 2.3.5 rAAV-GLUC 荧光检测 |
| 2.3.6 MTT 检测 |
| 2.4 实验结果及分析 |
| 2.4.1 EGFP siRNA 转染预实验 |
| 2.4.2 促进 rAAV 载体表达的 miRNA 筛选及统计学分析 |
| 2.4.3 促进 rAAV 载体表达的 miRNA 的验证 |
| 2.5 小结 |
| 第3章 miRNA 生物信息学预测 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 miRNA 靶基因预测生物信息学原理与方法 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 rAAV 的转染途径 |
| 3.3.2 miRNA 的靶基因预测 |
| 3.3.2.1 小结 |
| 3.3.3 miRNA 信号通路的预测 |
| 3.3.3.1 以 miRNA 预测信号通路 |
| 3.3.3.2 小结 |
| 3.3.4 单个 miRNA 分析 |
| 3.4 小结 |
| 第4章 结论与展望 |
| 4.1 结论 |
| 4.2 展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附录A 1719 个 miRNA 统计数据 |
| 附录B miRNA 数据库 |
| 个人简历、在学期间发表的学术论文与研究成果 |
（3）抗丙型肝炎病毒药物的研究进展（论文提纲范文）
| 1 抗HCV药物的研究 |
| 1.1 干扰素 (IFN) 及利巴韦林 |
| 1.2 特殊靶向治疗药物 |
| 1.2.1 蛋白酶抑制剂 |
| 1.2.2 RNA聚合酶抑制剂 |
| 1.2.3 其他HCV抑制剂 |
| 1.3 免疫调节剂 |
| 1.4 其他药物 |
| 2 抗HCV展望 |
| 3 结语 |
（4）RNAi抑制羊传染性脓疱病毒增殖效果的研究（论文提纲范文）
| 前言 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 第一篇 文献综述 |
| 第1章 RNAi 抗病毒感染研究 |
| 1.1 前言 |
| 1.2 RNAi 机制 |
| 1.3 RNAi 应用于病毒感染 |
| 1.4 RNAi 揭示宿主-病毒相互作用 |
| 1.5 结论 |
| 第2章 羊传染性脓疱病最新研究进展 |
| 2.0 前言 |
| 2.1 病原学及分类 |
| 2.2 基因组结构 |
| 2.3 流行病学 |
| 2.4 动物感染 |
| 2.5 临床表现 |
| 2.6 抗病毒免疫&免疫逃逸 |
| 2.7 诊断方法 |
| 2.8 ORFV 作为疫苗载体 |
| 2.9 临床治疗 |
| 2.10 小结 |
| 第二篇 研究内容 |
| 第1章 ORFV 在 OFTu 细胞中的增殖特性研究 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 1.3 结果 |
| 1.4 讨论 |
| 1.5 小结 |
| 第2章 靶向 ORFV CBP 基因 siRNA 抑制 ORFV 增殖效果研究 |
| 2.1 材料 |
| 2.2 方法 |
| 2.3 结果 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第3章 靶向 ORFV DNA 聚合酶 RNAi 抑制 ORFV 增殖效果研究 |
| 3.1 材料 |
| 3.2 方法 |
| 3.3 结果 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 攻读硕士期间发表的学术论文 |
| 导师简介 |
| 作者简介 |
| 致谢 |
（5）黄牛和水牛INHA基因RNAi慢病毒载体的构建与鉴定及功能研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 1 前言 |
| 1.1 研究问题的由来 |
| 1.2 文献综述 |
| 1.2.1 抑制素的研究进展 |
| 1.2.2 黄牛和水牛INHA基因的研究现状 |
| 1.2.3 RNAi的研究进展 |
| 1.2.4 慢病毒载体的研究进展 |
| 1.2.5 慢病毒载体介导RNAi技术的应用现状 |
| 1.3 研究目的和意义 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 主要试剂和耗材 |
| 2.1.2 主要仪器设备 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 shRNA列设计 |
| 2.2.2 pENTR/U6-INHA-shRNA vector构建和鉴定 |
| 2.2.3 LV-U6-INHA-shRNA载体的构建和鉴定 |
| 2.2.4 慢病毒包装 |
| 2.2.5 慢病毒转染黄牛和水牛GCs及对INHA基因相对表达量的测定 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 PENTR/U6-INHA-sHRNA载体 |
| 3.1.1 pENTR/U6-INHA-shRNA质粒基本特性 |
| 3.1.2 pENTR/U6-INHA-shRNA质粒序列 |
| 3.2 Lv-U6-INHA-sHRNA载体 |
| 3.2.1 Lv-U6-INHA-shRNA质粒基本特性 |
| 3.2.2 Lv-U6-INHA-shRNA质粒序列 |
| 3.3 转染后的病毒特性 |
| 3.4 293FTG细胞系的特性 |
| 3.5 BGC BLASTICIDIN毒性 |
| 3.7 病毒滴度 |
| 3.7.1 cDNA的特异性 |
| 3.7.2 c-INHA的相对表达量 |
| 3.7.3 b-INHA的相对表达量 |
| 3.7.4 INHA在bGC和cGC中的表达水平差异极显着 |
| 3.7.5 同一病毒载体对c-INHA和b-INHA基因表达抑制率不同 |
| 4 讨论 |
| 4.1 关于PENTR/U6-INHA-sHRNA载体的构建方法 |
| 4.2 关于Lv-U6-INHA-SHRNA载体的构建方法 |
| 4.3 慢病毒的生产和滴度测定的讨论 |
| 4.4 干扰机制和效果的讨论 |
| 4.4.1 黄牛和水牛卵巢颗粒细胞中INHA基因表达水平不同 |
| 4.4.2 慢病毒载体对c-IHNA基因表达的抑制效果 |
| 4.4.3 慢病毒载体对b-IHNA基因表达的抑制率 |
| 4.4.4 不同载体组合对靶基因表达抑制效果不同 |
| 4.4.5 慢病毒载体与质粒DNA载体对靶基因表达的抑制效果不同 |
| 4.4.6 慢病毒载体分别对c-INHA和b-INHA基因表达的抑制效果比较 |
| 4.5 293FTG细胞系的建立 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 附录Ⅰ 载体序列比对结果 |
| 附录Ⅱ 质粒图谱 |
| 致谢 |
（6）P物质小干扰RNA在变应性鼻炎基因治疗中的作用机制研究（论文提纲范文）
| 缩略词表 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 第一章 P物质特异小干扰RNA序列设计及表达载体构建 |
| 第一节 材料与方法 |
| 第二节 结果 |
| 第三节 讨论 |
| 第二章 肥大细胞内源性P物质表达研究 |
| 第一节 材料与方法 |
| 第二节 结果 |
| 第三节 讨论 |
| 第三章 肥大细胞转染P物质shRNA研究 |
| 第一节 材料与方法 |
| 第二节 结果 |
| 第三节 讨论 |
| 第四章 P物质siRNA干预治疗变应性鼻炎小鼠研究 |
| 第一节 材料与方法 |
| 第二节 结果 |
| 第三节 讨论 |
| 第五章 SP-siRNA干预治疗对变应性鼻炎炎性细胞因子分泌影响研究 |
| 第一节 材料与方法 |
| 第二节 结果 |
| 第三节 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 附录 发表及参与发表论文 |
| 致谢 |
（7）优化选择的串联序列amiRNA表达载体抗乙肝病毒的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 第一部分 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三部分 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 第四部分 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 结论 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
（8）RNAi及其抗口蹄疫病毒研究进展（论文提纲范文）
| 1 RNAi概述 |
| 2 RNAi抗病毒研究 |
| 3 抗FMDV RNAi研究 |
| 4 展望 |
（9）小干扰RNA抗病毒研究进展（论文提纲范文）
| 1 si RNA的作用机制及特点 |
| 2 si RNA的抗病毒作用及相关进展 |
| 2.1 si RNA抗HIV的研究 |
| 2.2 si RNA抗HBV的研究 |
| 2.3 si RNA抗HCV的研究 |
| 2.4 si RNA抗登革病毒研究 |
| 2.5 si RNA抗流感病毒研究 |
| 2.6 si RNA抗植物病毒的应用 |
| 2.7 si RNA抗其他病毒的研究 |
| 3 si RNA应用于抗病毒治疗时存在的问题 |
| 4 结语 |
（10）应用RNA干扰技术抑制手足口病重要病原体的基因表达与复制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 相关研究背景及进展 |
| 一、手足口病的流行及防治概况 |
| 1、国外流行概况 |
| 2、国内流行概况 |
| 3、防治概况 |
| 二、柯萨奇病毒A16(Coxsackievirus A16,CA16)型研究进展 |
| 1、病毒的分子结构 |
| 2、病毒基因组结构 |
| 3、病毒基因组的编码产物及其功能 |
| 4、病毒的感染与繁殖 |
| 三、肠道病毒71型(Enterovirus 71,EV71)研究进展 |
| 1、病毒的分子结构 |
| 2、基因组结构 |
| 3、病毒的感染与繁殖以及病毒基因组的转录和表达 |
| 四、RNA干扰(RNA interference,RNAi)研究进展 |
| 1、RNAi理论研究进展 |
| 2、RNAi技术的应用 |
| 3、RNAi在抗病毒研究中的应用 |
| 第二章 手足口病重要病原体柯萨奇病毒A16型(CA16)和肠道病毒71型(EV71)中国分离株全基因组序列的测定及分析 |
| 一、前言 |
| 二、材料与方法 |
| 1、实验材料 |
| 2、实验方法 |
| 三、实验结果与分析 |
| 1、病毒株的获得以及接种细胞后的典型CPE |
| 2、病毒基因组cDNA片段的获得 |
| 3、病毒基因组cDNA片段的测序结果 |
| 4、病毒基因组RNA序列的拼接以及序列分析 |
| 四、结论 |
| 第三章 抑制柯萨奇病毒A16型(CA16)复制的小干扰RNA(siRNAs)的快速筛选 |
| 一、前言 |
| 二、材料和方法 |
| 1、实验材料 |
| 2、实验方法 |
| 三、结果与分析 |
| 1、GeneBuster siRNAs表达质粒的构建 |
| 2、融合siRNAs靶标基因报告质粒的构建 |
| 3、双荧光素酶分析系统对siRNA干扰效率的测试和筛选 |
| 4、细胞中siRNAs表达载体对CA16 strain Shzh05-1的抑制作用 |
| 四、结论 |
| 第四章 抑制肠道病毒71型(Enterovirus 71,EV71)复制的小干扰RNA(siRNAs)的快速筛选 |
| 一、前言 |
| 二、材料和方法 |
| 1、实验材料 |
| 2、实验方法 |
| 三、结果与分析 |
| 1、RD-A细胞转染化学合成的Stealth siRNA效率的摸索 |
| 2、化学合成的Stealth siRNA在细胞水平抑制EV71病毒复制的研究 |
| 3、siRNAs在细胞水平抑制EV71病毒复制的剂量依赖关系 |
| 4、siRNAs抑制不同EV71分离株的效果对比 |
| 四、结论 |
| 第五章 研究总结 |
| 参考文献 |
| 攻博期间发表的科研论文 |
| 致谢 |
四、细胞内表达的小干扰RNA靶向丙肝病毒5′保守区的研究（论文参考文献）
- [1]慢病毒介导的RNAi技术生产转基因羊的初步研究[D]. 齐兴财. 甘肃农业大学, 2018(09)
- [2]促进rAAV在肺癌细胞中高表达的miRNA筛选及机制初探[D]. 余浩. 华侨大学, 2014(02)
- [3]抗丙型肝炎病毒药物的研究进展[J]. 曾菁,彭芳. 药学服务与研究, 2013(05)
- [4]RNAi抑制羊传染性脓疱病毒增殖效果的研究[D]. 王改丽. 吉林大学, 2012(09)
- [5]黄牛和水牛INHA基因RNAi慢病毒载体的构建与鉴定及功能研究[D]. 赵延森. 华中农业大学, 2011(05)
- [6]P物质小干扰RNA在变应性鼻炎基因治疗中的作用机制研究[D]. 胡华. 复旦大学, 2011(12)
- [7]优化选择的串联序列amiRNA表达载体抗乙肝病毒的研究[D]. 蒲春文. 大连医科大学, 2011(06)
- [8]RNAi及其抗口蹄疫病毒研究进展[J]. 刘晓,王洪梅,宋玲玲,武建明,杨宏军,高运东,仲跻峰,何洪彬. 安徽农业科学, 2011(04)
- [9]小干扰RNA抗病毒研究进展[J]. 魏强,曹博,郭韬,李广林. 生物技术通讯, 2010(04)
- [10]应用RNA干扰技术抑制手足口病重要病原体的基因表达与复制研究[D]. 吴志强. 武汉大学, 2010(05)