一、一种新型的非病毒基因转运载体——纳米粒基因转运体（论文文献综述）
刘晓亭[1]（2020）在《新型核酸纳米载体的设计及在肿瘤细胞成像和药物递送中的应用研究》文中进行了进一步梳理目前医学水平和诊断技术得到了快速的发展,但癌症的发病率和死亡率仍然处在较高水平,是威胁人类健康和生命的重大疾病之一。癌症的早期诊断和精准治疗是决定癌症能否得到成功治愈的关键因素。近年来,肿瘤标志物的不断发现为癌症早期诊断提供了保障,细胞内肿瘤标志物种类较多,表达水平也有所差异,对于一些低表达丰度的肿瘤标志物需要建立更加灵敏的分析方法。另一方面,化学治疗作为癌症治疗的经典方法之一,但化疗通常会受到化疗药物低溶解性、强的毒副作用及耐药性等问题的制约,因此,需要开发具有特定功能的纳米载体进行化疗药物的递送。本论文致力于新型核酸纳米载体的设计及在肿瘤细胞成像和药物递送方面的应用研究。通过对目前已报道的核酸纳米载体进行总结,发现随着核酸纳米载体研究的深入,仍然存在一些不足和挑战:（1）现有的核酸纳米载体多为细胞质递送化疗药物,耐药细胞中细胞膜上过表达的外排转运体会将细胞质中的药物重新泵出细胞,降低细胞内的药物浓度,限制化疗效果,因此,如何构建药物作用位点靶向的核酸纳米载体对于提高药物的作用效果具有重要意义;（2）在应对化疗过程中出现的药物耐受性的问题上,常用的策略是利用纳米载体避开外排转运体介导的药物外排,而直接抑制外排转运体的表达是一种更根本的策略来应对药物耐受性;（3）细胞内许多肿瘤标志物的表达丰度偏低,目前多数具有细胞成像和药物递送双重功能的核酸纳米载体输出方式为1:1式,极大的限制了检测的灵敏度和药物释放,构建具有信号放大特性的核酸纳米载体来实现活细胞内肿瘤标志物的灵敏检测及药物释放是一个关键问题。基于以上问题和挑战,设计了三种新型的核酸纳米载体用于活细胞内肿瘤标志物的成像及药物递送。本文主要分为以下五章内容:第一章为绪论部分,主要分析了癌症诊断和治疗上所面临的严峻挑战,介绍了用于核酸纳米载体设计的经典核酸结构单元、金纳米颗粒,概述了核酸纳米载体在癌症诊断与治疗中的研究进展,并以此为基础总结了目前核酸纳米载体在细胞成像和药物递送上存在的问题。第二章,构建了一种内源性刺激响应核靶向的纳米载体（AuNP-mRS-DSs）用于活细胞内MRP1 mRNA的成像和药物递送。纳米载体由三部分组成:（ⅰ）金纳米颗粒（AuNP）,用于装载DNA和淬灭荧光;（ⅱ）mRNA识别序列（mRS）通过金-硫键连接到AuNP表面,用于MRP1 mRNA的特异性识别;（ⅲ）可拆卸的亚单位（DS）,由Cy5标记的DNA连接链和核仁素识别基序（含AS1411适体）杂交而成,并通过DNA连接链连接到mRS上,用于装载阿霉素（Dox）、结合核仁素及荧光信号的输出。首先,纳米载体的核仁素识别基序靶向肿瘤细胞表面过表达的核仁素,然后整个纳米载体在核仁素介导的内化作用下进入细胞。随后,mRS特异性识别过表达的MRP1 mRNA,从而释放束缚的DS,被AuNP淬灭的Cy5荧光恢复。最后,利用核仁素从细胞质到细胞核穿梭的作用,DS靶向细胞核递送Dox。细胞内荧光成像可以实现耐药细胞和非耐药细胞的区分。此外,通过荧光成像可以观察到耐药细胞中释放的可拆卸亚单位的分布。与游离阿霉素（IC50>8.00 μM）相比,将 Dox 装载到 AuNP-mRS-DSs 后对 MCF-7/ADR细胞的IC50更低为2.20 μM,这表明利用核酸纳米载体载药对耐药的乳腺癌细胞具有极好的抑制效果。该纳米载体在癌症化疗敏感性预测和耐药性的规避上具有重要意义。第三章,构建了多功能分子信标（MBs）修饰的金纳米颗粒作为纳米载体（MBs-AuNP）,用于活细胞内耐药相关mRNA的协同抑制及原位成像。MBs-AuNP由两部分构成:（ⅰ）三种特殊设计的分子信标修饰到AuNP表面,用于结合耐药相关的mRNAs,装载Dox并输出荧光信号;（ⅱ）AuNP,用于装载MBs,介导MBs进入细胞并淬灭荧光。被细胞摄取后,MBs-AuNP与三种不同的耐药相关 mRNA（MDR1 mRNA、MRP1 mRNA 和 BCRP mRNA）杂交,通过抑制mRNAs的翻译过程来减少外排蛋白的表达,同时,被AuNP淬灭的荧光团远离金纳米粒,荧光恢复,实现mRNAs的原位成像。实时定量聚合酶链反应（qRT-PCR）和蛋白印迹结果表明,经MBs-AuNP处理后耐药肿瘤细胞内耐药相关mRNA和外排蛋白的表达均有所下降。与游离Dox相比,Dox-MBs-AuNP对HepG2/ADR（IC50:0.35 vs 1.06μM）和 MCF-7/ADR（IC50:2.78 vs>5μM）具有更好的细胞毒性。通过荧光成像分析可直接观察细胞内杂交事件并实现耐药和非耐药肿瘤细胞的区分。该纳米载体能够通过基因沉默来下调多种外排蛋白的表达,实现对沉默事件的原位监测,提供了一种从基因水平应对药物耐受性的策略。第四章,构建了一种端粒酶特异性的DNAzyme驱动的DNA walker作为纳米载体（tsDNA-AuNP）用于细胞内端粒酶的活性分析及药物递送。该纳米载体由三部分构成:（ⅰ）AuNP,用于装载DNA并淬灭荧光;（ⅱ）行走链,由端粒酶引物和含DNAzyme序列的发卡结构杂交而成,用于结合端粒酶及切割底物发卡;（ⅲ）含有DNAzyme切割位点的底物发卡,用于装载阿霉素并输出荧光信号。该纳米载体内化入胞后,端粒酶引物在端粒酶的作用下发生延伸,打开含DNAzyme序列的发卡结构,释放被封闭的DNAzyme序列,然后行走链沿着三维的轨道运动,在外加Mn2+的作用下切割含DNAzyme切割位点的底物发卡,输出荧光信号并释放阿霉素,随后进行下一轮的切割反应。该方法能够实现低至10个HeLa细胞中端粒酶活性的检测,通过荧光成像的方法能够实现肿瘤细胞和正常细胞的区分,此外,该核酸纳米载体也能够用于端粒酶抑制剂的筛选。第五章为结论部分,主要总结了本论文的创新点及前景展望。
马萍[2]（2020）在《中药多糖为载体的基因传递及其诱导细胞重编程研究》文中认为谱系重编程在肝病治疗,特别是终末期肝病（End-stage liver disease,ESLD）治疗领域被深入研究。安全高效的基因载体是该技术成功应用的关键。当归多糖（Angelica sinensis polysaccharide,ASP）表面覆盖大量活性基团,易于被阳离子化修饰,是一种新型、安全、高效的基因载体,近年来被广泛应用于基因传递。本论文使用水提醇沉法制备ASP,选用聚乙烯亚胺（Polyethyleneimine,PEI）对ASP进行阳离子化修饰,利用阳离子化当归多糖（ASP-PEI）与质粒HNF1A之间的静电相互作用力,制得cASP-pHNF1A自组装纳米粒,并且进一步对该纳米粒介导的肝脏细胞重编程做了研究。实验结果显示,cASP-pHNF1A自组装纳米粒形态圆整,大小均一,细胞转染效率高。诱导的人源肝细胞（Induced human hepatocytes,ihHeps）能表达肝脏标志蛋白ALB,AAT,CK18,CK19和药物代谢酶CYP450,UGT,GST,摄取和排泄吲哚菁绿（Indocyanine Green,ICG）,储存糖原,摄取低密度脂蛋白（Low Density Lipoprotein,LDL）。因此,阳离子化当归多糖作为一种天然的基因载体,能够高效地介导细胞重编程,功能化的ihHeps细胞为肝细胞移植及其他细胞治疗手段在ELSD中的应用提供了可能。第一章综述对肝病的研究进展做了简单的概述;对细胞疗法在肝病及肝功能衰竭治疗领域中的应用进行了阐述;分别讨论了病毒型和非病毒型两大类基因载体的优缺点,对两类基因载体在肝细胞谱系重编程中的研究进展做了总结;查阅大量文献资料,概括论述和展望了天然多糖作为新型非病毒基因载体在谱系重编程中的应用;提出了本论文的研究目的、研究意义以及主要研究内容,对本论文的设计思路做出系统的规划,为本论文实验任务的顺利开展提供理论指导和依据。第二章中药多糖的提取、分离、纯化及结构解析本章研究内容围绕当归多糖的提取展开。使用传统水提醇沉工艺获取当归粗多糖,使用三氯乙酸除蛋白法和D315大孔树脂柱层析法对其进行纯化,得到精制的ASP。使用硫酸-咔唑法测定ASP中糖醛酸的含量,高效液相凝胶色谱法测定ASP的分子量为3255Da,刚果红实验结果表明ASP具有三螺旋结构,ASP的单糖组成为甘露糖:鼠李糖:葡萄糖醛酸:半乳糖:阿拉伯糖:木糖=0.23:0.17:14.41:0.39:1.68:0.87。第三章中药多糖的阳离子化修饰及表征本章研究内容围绕当归多糖的阳离子化修饰展开。选用聚乙烯亚胺作为阳离子化修饰试剂,在三乙胺的催化下,PEI能够与ASP在交联剂N,N’-羰基二咪唑（CDI）的作用下发生交联,PEI结合在多糖分子骨架上,完成对当归多糖的阳离子化修饰。Zeta电位测定、伯氨基含量测定和元素分析测定结果显示ASP-PEI带正电荷,N元素、H元素和C元素的含量明显高于ASP,实验数据一致表明PEI分子成功连接至ASP分子表面。采用傅立叶红外变换色谱（FT-IR）和核磁共振（NMR）技术对ASP-PEI的结构做进一步解析,相较于ASP而言,ASP-PEI的特征吸收峰放生了轻微位移,并且出现了新的质子峰,分析结果符合多糖阳离子化修饰的结构改造。第四章cASP-pHNF1A自组装纳米粒的制备、表征及细胞转导效率研究本章研究内容围绕cASP-pHNF1A自组装纳米粒的制备、表征及细胞转导效率展开。ASP-PEI与质粒HNF1A发生共沉淀,形成自组装纳米粒。粒径和电位的测定以及透射电镜的结果显示cASP-pHNF1A自组装纳米粒表面带正电荷、粒径在20-50nm之间、大小均一、呈规则的圆球状,有利于细胞内吞作用,提高基因传递的效率。MTT实验结果显示,自组装纳米粒的细胞毒性明显低于商业化的标准转染试剂PEI和Lipfectamine2000,与Lipfectamine3000近乎相等,符合基因载体安全、低毒的条件。使用GFP报告基因和qRT-PCR技术分别对纳米粒的细胞转导效率做了定性和定量分析,结果显示ASP-PEI与质粒HNF1A的质量比为20:1时制得的纳米粒的细胞转导效率最高,因此将其应用于后续肝脏细胞重编程研究。第五章cASP-pHNF1A自组装纳米粒介导的体细胞重编程研究本章研究内容围绕cASP-pHNF1A自组装纳米粒介导的肝脏细胞重编程展开。构建cASP-pHNF1A自组装纳米粒,成功高效地将HFFs细胞重编程为成熟的功能性人源肝脏细胞ihHeps。免疫印迹技术和免疫荧光染色的检测结果显示,ihHeps能够表达肝脏特异性蛋白ALB、AAT、CK18和CK19。qRT-PCR结果显示ihHeps能够分泌药物Ⅰ相代谢酶CYP450和Ⅱ相代谢酶UGT、GST。吲哚菁绿（ICG）摄取和排泄实验、过碘酸-希夫氏碱染色反应（PAS）反应以及LDL摄取实验结果表明ihHeps具有肝脏代谢、摄取、排泄、糖原储存以及调节脂蛋白合成和分泌的作用。
王建萍[3]（2019）在《碳量子点介导纳米基因传递与U251干细胞诱导分化研究》文中提出脑胶质瘤（GBM）在所有肿瘤疾病中,是最为强侵袭性、难治疗的肿瘤之一,而胶质瘤干细胞（GSC）是导致GBM发展以及后续复发的基本因素,因此针对肿瘤干细胞的治疗是彻底根治肿瘤的过程。近年来,随着再生医学、组织工程、基因治疗等技术的快速发展,采用基因工程的方法作为一种抑制胶质瘤的治疗手段,其作用越来越突出。其中,病毒载体方法是应用最广的基因传递方法,但仍然存在一定的局限性。人们把目光更多地转向了非病毒载体系统和联合基因治疗。利用物美价廉的原料制备高效的非病毒纳米载体是基因治疗研究的热点之一。本课题着重制备了新型非病毒纳米载体——碳量子点（Carbon quantum dots,CDs）,并以此为载体进行U251干细胞的神经分化研究,以及相关的诱导分化以及体内验证和机理研究,为GBM的基础研究以及临床治疗提供新方法、新思路。第一章综述基于GBM的世界性难题、干细胞学说的提出、基因疗法的优势以及在基因载体的多样化基础,本章内容分两大部分即GBM的研究进展和CDs的研究进展,分别进行总结与概述。介绍了GBM的疾病现状、研究方向以及治疗手段,包括各自方法的优缺点以及在理论研究、临床研究、临床中的治疗应用现状;着重介绍CDs作为新型纳米基因载体,主要包括其发展、制备方法、在基因传递中的广泛应用以及展望,对本课题的提出奠定坚实的理论基础。第二章CDs的制备与表征本章制备并优化CDs的处方工艺,具体包括:以壳聚糖季铵盐和无水乙二胺（EDA）为原材料,在预实验基础上通过一系列实验设计,制备16种CDs样品;在此基础上,考察了两种除菌方法即过滤除菌和加热除菌,以荧光强度、DNA凝胶电泳、CDs携带EGFP质粒能力为指标,考察各个处方得到最佳量子点样品为第七组样品:即后反应温度为160℃,EDA用PBS稀释5倍,所占体系总体积比为20%,除菌法为过滤除菌法;基因与CDs的最佳基因转染比为1:10,以后将此样品作为后续转染、诱导的基础,进行一系列相应研究。进一步对最佳量子点样品进行TEM、粒径电位、IR、细胞毒性等表征。经实验结果得知,CDs对细胞的毒性较小,几乎无毒,具明亮绿色荧光,可作为非病毒载体应用于组织工程研究。第三章CDs介导的U251干细胞体外诱导分化研究本章主要从以下三个方面进行开展,首先对U251细胞进行干细胞诱导培养基（ES培养基）培养,通过流式细胞仪筛选CD133+的U251细胞,得到U251干细胞作为后续实验的种子细胞。经八种入胞抑制剂的入胞机制筛选,说明CDs纳米基因传递系统通过网格蛋白、穴陷小泡介导的细胞内吞作用实现入胞。其次,以Wnt3a、Brn2、Ascl-1三种转录因子自由组合,进行最佳因子组合筛选,从免疫荧光（immunofluorescence,IF）结果得出,Wnt3a、Brn2因子组合在最短时间内可实现U251干细胞向神经细胞分化,因此将其组合作为最佳基因组合做进一步研究。后续U251干细胞经CDs载最佳基因组合进行转染诱导,经四次转染后,细胞首先从形态上呈现类似于神经细胞的结构形态,之后由IF、酶联免疫分析（ELISA）、反转录-PCR（QT-qPCR）和蛋白印迹（Western blotting,WB）实验从定性定量角度证明,干性标记物蛋白CD133表达呈现明显下调的迹象;GFAP作为胶质细胞的特性随转染诱导的时间延长表达下调,神经细胞相关蛋白（NeuN,β-Tubulin III（Tuj1））随转染时间的延长呈现逐渐上调,探讨了神经分化效能;另外也考察了基因转录水平和蛋白水平,实验结果表明CDs成功将基因Wnt3a和Brn2转入细胞内进行生物转录与翻译,并且有向神经细胞分化的可行性,在GBM的基础理论研究方面提供了又一新思路。第四章CDs介导的U251干细胞体内诱导分化研究本章主要研究U251干细胞以及诱导后的U251干细胞在裸鼠体内原位移植后的分化情况。从裸鼠生存状态、体重变化、成瘤性、组织切片HE染色、免疫组化等方面评价体内神经诱导效能,并通过基因芯片对分化机理进行初步研究。结果表明实验组裸鼠生存状态相对良好,体重相对稳定,HE和免疫组化染色表明,实验组异型性相对对照组不是很明显,肿瘤细胞转而呈向神经细胞分化的趋势。通过对基因芯片数据分析得知,p53等癌基因相关通路的相关蛋白呈下调趋势。研究结果与体外研究数据相一致,可为胶质疾病提供可靠的临床前研究数据与依据。第五章Wnt、Notch通路研究本章通过Wnt通路和Notch通路相关因子的表达情况,研究转录因子与两个通路之间的关系。首先进行QT-qPCR检测,考察Notch信号通路关键基因Notch1和HES-1的表达强弱,发现通路蛋白的降低与U251干细胞的分化密切相关。其次,采用免疫组化法检测Wnt通路中相关蛋白的表达水平可知,U251干细胞经CDs的载神经转录因子的诱导分化实现向神经细胞分化,同样证明在U251干细胞的诱导分化方面,Wnt通路具有重要作用。
苏一巾[4]（2016）在《UTMD联合纳米粒介导TGFβ1和TIMP1稳定动脉粥样硬化易损斑块的实验研究》文中研究指明动脉粥样硬化是一种慢性进行性的内皮损伤和炎症反应引起的血管内膜病变。其中斑块破裂后脱落栓子及随后的血栓形成是引起急性心脑血管缺血性卒中的主要原因,而斑块破裂几乎均发生在易损斑块的基础之上。因此,稳定易损斑块是防治动脉粥样硬化及其并发症发生的前提和基础。易损斑块中,纤维帽的完整性及对破裂的抵抗能力主要依靠细胞外基质合成与降解的动态平衡。基质金属蛋白酶和金属蛋白酶组织抑制因子（tissue inhibitor of metalloproteinase,TIMP）在维持这一平衡上发挥重要作用。与动脉粥样硬化有关的主要是TIMP1。转化生长因子β1（transforming growth factor β1,TGFβ1）可促进细胞外基质的合成与分泌,调节基质金属蛋白酶的含量与活性,刺激TIMP的合成,在保持粥样斑块炎症和纤维化之间的平衡中起关键作用。是动脉粥样硬化始发的保护因素,同时也是维持斑块稳定性的重要因素。本实验采用氧化铁纳米粒将TGFβ1和TIMP1两种目的质粒进行包裹,在超声靶向微泡破坏（ultrasound targeted microbubble destruction,UTMD）的作用下,携载目的质粒的纳米粒成功转入动脉粥样硬化易损斑块内部,到达细胞外基质,阻断细胞外基质的降解,促进细胞外基质的合成,达到稳定易损斑块的治疗目的。本研究主要分为三个章节:第一章 目的质粒的构建与功能验证目的:构建靶向巨噬细胞的pSNAV2.0-TGFβ1-TIMP1重组腺病毒表达载体,并验证目的质粒的功能,为后期转染实验准备材料。方法:从目的基因的引物合成到扩增,再到重组腺病毒表达载体的构建及测序。进行细胞培养,质粒提取,细胞转染,倒置荧光显微镜观察重组腺病毒转染HEK293细胞的表达情况,qRT-PCR技术和Western-Blot技术分别检测TGFβ1和TIMP1的表达情况。结果:qRT-PCR技术检测结果显示,TGFβ1的表达含量为7.17%±0.15%,明显高于对照组（2.62%±0.47%）和空载组（2.38%±0.33%）;TIMP1的表达含量为4.84%±0.15%,明显高于对照组（1.98%±0.06%）和空载组（2.27%±0.08%）。Western-Blot技术检测结果显示,TGFβ1过表达组的灰度值为11946.175,明显高于对照组（3882.841）和空载组（4488.205）;TIMP1过表达组的灰度值为15241.338,明显高于对照组（5610.619）和空载组（5579.690）。说明目的质粒构建成功。结论:本实验目的质粒构建成功,可用于后期转染实验。第二章UTMD联合纳米粒促进载TGFβ1-TIMP1质粒转染巨噬细胞的实验研究目的:UTMD联合氧化铁纳米粒进行体外基因转染实验,通过检测转染率及目的基因的治疗效果评估UTMD联合纳米粒促进细胞内基因转染的可行性。方法:制备靶向巨噬细胞的氧化铁纳米粒,细胞实验分为3组:A组为对照组,B组为质粒+纳米粒组,C组为UTMD+质粒+纳米粒组。选择最佳超声辐照条件,分组进行基因转染实验。转染后48小时,通过流式细胞仪检测转染率及细胞凋亡率,并通过Western-Blot及qRT-PCR技术检测目的基因的治疗效果;通过CCK-8细胞毒性实验检测该技术对细胞活性的影响。结果:本实验采用UTMD联合氧化铁纳米粒共同促进目的质粒转染,实验组转染率最高,约为质粒+纳米粒组的1.8倍;实验组的凋亡率最高,约为质粒+纳米粒组的8倍。qRT-PCR结果显示,TGFβ1的表达含量为26.77%±3.67%,明显高于对照组（9.58%±0.75%）和空载组（8.75%±0.63%）;TIMP1的表达含量为19.82%±1.23%,明显高于对照组（6.23%±1.01%）和空载组（6.28%±0.59%）。Western-Blot技术检测结果显示,C组TGFβ1的灰度值为19944.794,明显高于A 组（2722.548）和 B 组（2811.669）;C 组 TIMP1 的灰度值为 22625.167,明显高于A组（5116.447）和B组（5955.539）。CCK8实验显示对照组细胞存活率最高为0.977±0.005,实验组最低为0.976±0.004,各组间无明显差异,显示UTMD技术与纳米粒对细胞的活性均无明显影响。说明该技术安全可行。结论:UTMD联合纳米粒促进载TGFβ1-TIMP1质粒转染巨噬细胞,明显诱导体外巨噬细胞凋亡,抑制易损斑块的生长,该实验可望为动脉粥样硬化易损斑块的基因治疗提供实验基础。第三章UTMD联合纳米粒促进载TGFβ1-TIMP1质粒转染动脉粥样硬化易损斑块的实验研究目的:UTMD联合纳米粒介导目的质粒转染兔腹主动脉粥样硬化易损斑块,通过检测靶基因分子水平改变、腹主动脉易损斑块超微结构等评估体内基因转染效果,评价该基因传递方法促进体内基因转染的可行性。方法:建立兔腹主动脉粥样硬化易损斑块模型,实验分组:A组:正常健康组;B组:模型组;C组:质粒+纳米粒组;D组:UTMD+质粒+纳米粒组;E组:UTMD+质粒+纳米粒+磁场组。实验处理前及实验处理后10周对兔腹主动脉易损斑块进行常规超声及超声造影分析评估。并通过Western-Blot技术检测目的基因的治疗效果。对兔腹主动脉易损斑块进行HE染色,使用图象分析系统测量每张切片中兔腹主动脉平均内膜厚度（IT）、中膜厚度（MT）,斑块厚度（PT）,计算内膜/中膜厚度比值（IT/MT）和斑块/内膜厚度比值（PT/IT）。结果:术后第10周,二维高频超声显示各实验组腹主动脉内-中膜回声增强,以B组增厚最为明显,血流信号可见部分充盈缺损,C组、D组、E组腹主动脉内-中膜厚度与A组、B组相比降低,有统计学意义。易损斑块增大,以B组最为明显,C组、D组腹主动脉易损斑块增大,但增幅较B组减小,E组易损斑块增大不明显。第10周各组腹主动脉易损斑块处PSV1及其与上游PSV2相比,各组间无明显差异。超声造影显示,外加磁场后,血管内部的造影剂向血管壁运输增加。结论:UTMD联合纳米粒促进重组目的质粒的靶向转染,明显诱导动脉粥样硬化易损斑块巨噬细胞凋亡,有效抑制易损斑块的生长,该方法可以有效促进体内基因转染。
刘洋[5]（2013）在《RVG29修饰脑靶向纳米药物递释系统的研究》文中研究指明神经退行性疾病（Neurodegenerative diseases）是一类以脑部神经元发生退行性病变为特征的慢性疾病,其临床症状体现在运动或记忆方面的障碍,主要是由于负责相关功能的神经元或其髓鞘发生缺失所导致的。常见的神经退行性疾病包括帕金森病（Parkinson’s disease, PD）口阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease, AD）等。神经退行性疾病的主要特点是病程长、进展缓慢、神经元一旦发生死亡无法再生以及疾病的进程不可逆转。因此,实现神经退行性疾病的早期诊断和治疗至关重要。在神经退行性疾病的早期阶段,脑部结构和功能的变化并不明显,需要依赖于特定的疾病标记物分子的变化情况进行诊断。近年来分子荧光探针已广泛应用于肿瘤等疾病的诊断成像研究,它的主要优点是灵敏度高,适用于疾病早期标记物的检测,因此本课题选择分子荧光探针作为神经退行性疾病的诊断策略。基因药物特别是近年来研究较为深入的RNA干扰（RNA interfering, RNAi）药物,由于其治疗的特异性强并且治疗效果明显,具有非常广阔的临床应用前景。所以,本课题选择基因治疗作为神经退行性疾病的主要治疗手段。如何实现诊断和治疗药物的脑部递送是本课题主要关注和重点解决的问题。血脑屏障（blood-brain barrier, BBB）主要是由脑毛细血管内皮细胞（brain capillary endothelial cells, BCECs）形成紧密连接组成的,主要存在于血液和中枢神经系统（central nervous system, CNS）之间的屏障结构。它的存在一方面起到神经保护的作用,保证中枢神经系统较少被外来物质侵扰,维持高度的稳态,同时为脑内输送营养物质；另一方面,BBB的致密结构也阻碍了用于脑部疾病诊断和治疗的药物通过非侵入性给药方式进入脑内。本课题选用由狂犬病毒糖蛋白衍生的一段29个氨基酸序列的多肽（命名为RVG29）作为脑靶向分子,将其修饰于药物递释系统中,利用RVG29与其BBB上受体结合介导的穿细胞作用,将药物从血液转运至脑部,实现脑靶向药物递释。实现有效的脑部药物递送除了选择合适的脑靶向策略之外,对于药物的递释载体系统的选择和优化也至关重要。聚左旋赖氨酸树枝状分子（Dendrigraft L-lysines, DGLs）是由赖氨酸单体聚合形成的具有树枝状结构的高分子。由于赖氨酸单体之间利用肽键连接,所以DGLs在体内可以被酶类降解；与此同时,赖氨酸是组成生物体内蛋白的基本氨基酸,所以DGLs在体内免疫原型低,生物相容性高；DGLs表面具有丰富的氨基,可以通过共价连接等方式,对其进行多种功能化修饰。此外,DGLs表面丰富的氨基也可以通过静电复合作用与基因药物复合,作为基因递释载体。因此,本课题选择DGLs作为诊断和治疗药物递释的载体。本课题第一章中首先对RVG29多肽的脑靶向性进行了评价。将RVG29多肽通过双功能聚乙二醇（polyethylene glycol, PEG）连接于研究应用较为成熟的聚酰胺-胺树枝状分子表面,构建了RVG29修饰的脑靶向药物递释系统,重点评价了其体内外的脑靶向性,主要考察了其脑部基因递释的能力。本课题第二章研究主要是针对在帕金森病早期阶段的凋亡诊断。在此阶段主要发生了由casapase-3激活诱导的神经元凋亡。为了提高荧光成像的对比度,引入了荧光能量共振转移技术（fluorescence resonance energy transfer, FRET）技术。将荧光能量共振转移荧光对（荧光分子和其淬灭剂）分别修饰于DGLs表面,利用可以被激活型caspase-3特异性识别和剪切的多肽序列DEVD作为连接分子,通过caspase-3激活的发生与否来控制FRET效应的开启或关闭,进一步结合脑靶向多肽RVG29的修饰,构建成为DGLS-RVG29-FRET纳米器件,能够实现体内激活型caspase-3特异性的响应并进行荧光成像,进而可以进行帕金森病的早期凋亡诊断。本课题第三章研究构建了DGLS-PEG-RVG29包载DNA的脑靶向基因递释系统。RVG29修饰的DGLs脑靶向基因递释系统保留了聚酰胺-胺系统的脑靶向基因递释特性,同时给药系统的生物安全性有所提高。本课题第四章的研究中,将第三章中构建的脑靶向基因递释系统应用于帕金森病的治疗。以下调脑内的caspase-3水平作为治疗靶点,因为caspase-3的激活不仅可以直接诱导神经细胞凋亡,还可以通过上调脑胶质细胞中炎症因子的水平,产生神经细胞毒作用,间接引起神经细胞的死亡。在鱼藤酮诱导的帕金森病大鼠模型上,RVG29修饰的DGLs脑靶向基因递释系统能够高效的递送干扰caspase-3表达的治疗基因进入脑内。通过疾病早期多次给药,降低caspase-3酶原的水平,减少caspase-3的激活。从行为学,免疫组化等指标考察了RVG29修饰的DGLs脑靶向基因递释系统的在疾病动物模型上的药效。通过脑组织凋亡分析和脑中细胞炎症水平的测定,阐述了产生治疗效果的双重作用机制。在本课题第五章的研究中,针对阿尔茨海默病的两个典型的病理特征,一是由于BACE1（beta-site APP-cleaving enzyme1）代谢途径失调引发的淀粉样蛋白（amyloid beta, Aβ）沉积；另一种是tau过度磷酸化代谢异常引起的细胞内神经纤维缠结。BACE1的水平可以利用RNA干扰进行基因药物调节。研究发现一段6个氨基酸的D型肽可以抑制神经纤维的缠结。利用DGLs的树枝状结构,除了对其进行基本的脑靶向修饰外,将具有治疗作用的多肽也修饰其上,进一步包载能够特异性干扰BACE1表达的基因药物,实现基因-多肽药物向脑内的共递送。针对于AD病理机制的进行双靶点干预治疗,达到治疗AD的目的。通过BACE1水平的测定和水迷宫行为学实验进行治疗的药效学评价,通过对淀粉样蛋白以及磷酸化的tau的免疫染色,对于治疗的机制进行探索。
曹霞[6]（2011）在《新型无机纳米载体的构建及其药物/基因的高效传递研究》文中进行了进一步梳理纳米载体在药物/基因传递中具有特殊的价值和意义。纳米载体粒径大小在10～100nn,可将药物分子包裹其中或吸附在其表面,通过靶向分子与细胞表面特异性受体结合,在细胞摄取作用下进入细胞内,实现安全有效的靶向药物输送和基因治疗。无机纳米粒载体因具有生物安全、高效、价廉等优点,已成为近年来新型药物/基因传递系统研究的热点。本论文重点围绕新型无机纳米粒载体的构建及其在药物/基因传递中的应用开展研究,主要分为四个部分：第一部分纳米载体在药物/基因传递中的应用研究进展对纳米药物载体及基因载体的国内外研究现状进行了综述,主要内容包括：纳米载体的特点及制备新技术、纳米药物缓控释系统的优点、基因载体的分类与特点、非病毒纳米基因传递系统的优点、新型纳米载体在药物/基因传递系统中的应用进展、基于组织工程的三维支架以及软骨种子细胞的定向诱导分化研究进展等。文献综述为论文后续实验工作的开展奠定了基础。第二部分新型多孔二氧化硅纳米粒在药物传递中的应用研究以生物安全的硅胶为载体材料,运用纳米技术,自行研制出具有高效增溶、长效缓释作用的新型多孔二氧化硅纳米粒（Porous silica nanoparticles, PSNs）。分别选择水溶性药物水飞蓟宾葡甲铵（Silybin meglumine, SLBM和难溶性药物水飞蓟宾（Silybin, SLB）为模型药物,研究PSNs新载体在水溶性药物和难溶性药物72h高效长效制剂开发中的应用可能,为3天给药1次的高效长效新制剂开发提供技术支撑。1.水溶性药物72h高效长效新制剂的研制：以水溶性药物水飞蓟宾葡甲铵）为模型药物,PSNs为载体,制备了水飞蓟宾葡甲铵72h高效长效制剂（3d-SLBM）。体外评价研究结果表明：3d-SLBM的主药含量为29.46 mg/50mg,载药量为58.91±0.39%,包封率为58.43±0.62%；体外释药特性研究结果显示,3d-SLBM中SLBM的释放适宜在低浓度的碳酸钠溶液中进行,72 h累积释放大于80%；体内药动学研究结果显示：比格犬口服3d-SLBM,高效液相法测定犬体内血药浓度,3d-SLBM的Tmax 24 h与参比制剂Tmax 0.5 h相比大大增加,3d-SLBM的MRT 38.89 h与参比制剂的MRT 7.31 h相比显着延长,显示出长效缓释特征；3d-SLBM中游离药物的相对生物利用度达到803.99%；体外溶出结果与体内吸收具有良好的相关性,体外溶出结果可以间接反映其体内质量；药效实验结果表明：3d-SLBM组小鼠血浆中AST（291.83±76.03 IU/L）和ALT（774.92±223.85 IU/L）值明显低于CCl4对照组（AST：901.00±174.32 IU/L,ALT：1997.58±335.08 IU/L）,具有统计学意义（P<0.01）。说明3d-SLBM的生物利用度高、保肝效果好。2.难溶性药物72h高效长效新制剂的研制：以难溶性药物水飞蓟宾为模型药物,综合运用固体分散速释技术、亲水凝胶骨架缓释技术和PSNs长效缓释技术制备了水飞蓟宾72h高效长效制剂（3d-SLB）。体外评价研究结果表明：3d-SLB中SLB的释放适宜在低浓度的碳酸钠溶液中进行,72 h累积释放大于80%；体内药动学研究结果显示：比格犬口服3d-SLB,高效液相法测定犬体内血药浓度,3d-SLB的Tmax 24h与参比制剂Tmax 1h相比大大增加,3d-SLB的MRT 32.15 h与参比制剂的MRT 6.11 h相比显着延长,显示出长效缓释特征；3d-SLB中游离药物的相对生物利用度达到458.98%,体外溶出结果与体内吸收具有良好的相关性,体外溶出结果可以间接反映其体内质量；药效实验结果表明：3d-SLB小鼠血浆中AST（149.90±28.14 IU/L）和ALT（843.33±169.18 IU/L）值明显低于CCl4对照组（AST:901.00±174.32 IU/L,ALT：1997.58±335.08 IU/L）,具有统计学意义（P<0.01）。说明3d-SLB生物利用度高、保肝性能优越。第三部分载基因纳米粒的制备及其在基因传递中的应用研究选择生物安全的磷酸钙纳米粒（Calcium phosphate nanoparticles, CPNPs）和PSNs,制备载基因DNA-CPNPs和DNA-PSNs;通过对载基因纳米粒进行修饰,成功制备了多糖修饰的DNA-CPNPs和钙离子化DNA-PSNs;着重研究了DNA-CPNPs、多糖修饰的DNA-CPNPs、钙离子化DNA-PSNs 3 （?）中新型载基因纳米粒对干细胞的传递效果。1.DNA-磷酸钙纳米粒的制备及其干细胞的传递研究：用反相微乳法制备了DNA-CPNPs,对其进行表征,并将其应用于干细胞的转染。研究结果表明：DNA-CPNPs的粒径为20-50 nm；琼脂糖电泳结果表明：磷酸钙：质粒质量比为2：1时,CPNPs携带质粒量最大,可有效阻滞DNA的迁移；活细胞工作站测定结果显示：游离DNA因没有纳米粒载体的作用,细胞未显红色,说明游离DNA未进入细胞内,而DNA-CPNPs 2 h开始有少数细胞显红色,随着时间的推移,越来越多的外源基因进入细胞,说明纳米粒可有效携带基因进入细胞；激光共聚焦显微镜观察核转运结果显示：2 h未见细胞核内显红色,说明DNA-CPNPs此时尚未进入细胞核,4 h进核亦不明显,8 h有少量进核,18h可见细胞核内呈明显的红色,表明此时外源DNA在纳米粒作用下进核明显；活细胞工作站和共聚焦显微镜测定结果均显示纳米粒可被干细胞吞噬。MTT法测定细胞毒性,结果显示：DNA-CPNPs的毒性明显低于市售转染试剂Lipofectamine2000 （P<0.01）;ELISA测定结果表明,DNA-CPNPs在干细胞中的转染效果与转染试剂Lipofectamine2000相当（P>0.05）。实验研究结果表明：DNA-CPNPs转染效率高、毒性低,可以作为一种生物安全的非病毒基因载体。2.多糖修饰的DNA-磷酸钙纳米粒的制备及其干细胞的传递研究：选择DNA-CPNPs,通过对载基因纳米粒进行修饰,成功制备了多糖修饰的DNA-CPNPs,初步研究了多糖修饰的DNA-CPNPs在干细胞中的转运情况。透射电镜测定结果表明：多糖修饰的DNA-CPNPs呈球型、粒径分布稳定、分散均一,粒径在50nm左右；ELISA测定结果表明：与市售脂质体lipofectamine2000相比,多糖修饰的DNA-CPNPs在干细胞中具有更高的转染效率。3.钙离子化DNA-多孔二氧化硅纳米粒的制备及其性能评价：选择PSNs为载体,通过对其进行修饰,成功制备了钙离子化DNA-PSNs,初步研究了钙离子化DNA-PSNs在干细胞中的转运。琼脂糖电泳结果表明：钙离子化的PSNs能够与质粒DNA较好的结合,阻滞其电泳迁移,而未修饰的PSNs与DNA结合能力弱,不能有效阻滞DNA迁移；EDS能谱分析结果表明：钙离子有效结合到PSNs上；倒置荧光显微结果表明：与DNA-PSNs相比,钙离子化DNA-PSNs能够转染更多的细胞,说明钙离子化DNA-PSNs可以作为一种有效的非病毒基因载体。第四部分三维纳米基因传递系统的构建及其在干细胞诱导分化中的应用研究将细胞外基质修饰纳米粒技术与基于组织工程的三维支架技术相结合,构建非病毒三维纳米基因传递系统。以细胞外基质（ECM）成分为支架材料,制备嵌合有DNA-CPNPs的三维支架,成功构建了兼具高效、缓释特征的非病毒三维纳米基因传递系统（3 dimensional nanoparticles gene delivery system,3D-NGDS）。1.三维纳米基因传递系统的构建及其性能评价：以细胞外基质黏附实验为基础,选择对干细胞黏附及增殖效果好的纤维粘结蛋白、胶原为支架材料,制备胶原/FN/壳聚糖三维支架；在此基础上,采用冷冻干燥法制备嵌合DNA—CPNPs的三维纳米基因传递系统（3D-NGDS）,并观测其孔径、孔隙率、吸水率、保水率,结果表明：3D-NGDS中存在较大孔径（≥100μm）的孔道,吸水率和保水率与支架材料的配比有关。研究结果表明：3D-NGDS多孔、生物安全,适宜干细胞生长。2.三维纳米基因传递系统的基因转运研究：以碘化丙啶标记基因,通过活细胞工作站观测,结合免疫组化的方法,对3D-NGDS中基因的细胞内转运进行了研究；运用Picogreen Dye法测定不同支架不同时间培养液中DNA的含量,绘制DNA累积释放曲线,结果显示3D-NGDS中DNA累积释放率3d达到33.4%,21d达到69.7%；而游离DNA-三维支架3d DNA累积释放率达到87.7%,3D-NGDS对DNA具有良好的缓释作用。ELISA法测定二维体系及3D-NGDS 3-15天细胞表达的TGF-β1浓度,结果表明：3D-NGDS在3-15天内,蛋白表达水平维持在10 ng/ml左右,其中第6天表达浓度达到12.6 ng/ml,显着高于二维转染体系（P<0.01）,达到了外加TGF-β1因子有效浓度,显示出明显的高效特征。通过观测干细胞在二维及3D-NGDS中转染15天的甲苯胺蓝（GAG）染色图及Ⅱ型胶原免疫组化染色图,结果表明：二维单层培养细胞的GAG染色和Ⅱ型胶原免疫组化染色均为阴性,干细胞在3D-NGDS中培养15天后,GAG染色和Ⅱ型胶原免疫组化染色均为阳性,说明种子细胞已成功分化成软骨细胞,分泌软骨细胞特征性的细胞外基质：Ⅱ型胶原和GAG。三维纳米基因传递系统作为一种新型的非病毒基因载体,可以实现外源基因在种子细胞中的高效持续表达,为后续组织工程和再生医学研究提供新技术、新思路。
曹兴[7]（2010）在《磁性纳米基因载体介导Mcl-1特异性shRNA治疗肝细胞癌的实验研究》文中进行了进一步梳理肝细胞癌（hepatocellular carcinoma, HCC）是最常见的一种肝癌。乙肝、丙肝病毒感染或肝硬化引发的慢性炎症最终往往导致肝癌的发生。肝癌是我国癌症中的第2号杀手,每年死亡人数约占全世界死于肝癌人数的53%。凋亡的调节机制非常复杂,人们对凋亡调节基因,特别是其中的B细胞淋巴瘤／白血病基因-2（B cell lymphoma/leukemia-2,Bcl-2）这一基因家族进行了深入的研究。髓样细胞白血病基因-1（myeloid cell leukemia-1, Mcl-1）是Bcl-2基因家族中重要的抗凋亡成员,也是肝细胞癌中目前已知的重要抗凋亡因子,因此研究Mcl-1基因在肝癌组织中的异常表达对了解肝癌发生的可能机制及抗肿瘤治疗的可能途径有重要意义,是未来抗肿瘤治疗策略中的一个新靶点。RNA干扰技术（RNAi）是近年发展起来的新技术,RNAi引发的基因沉默作用是特异的和有效的,具有抑制作用强、稳定性高、细胞摄取相对容易等优点,为肿瘤的基因治疗提供新的、有前途的手段。是当前基因治疗研究最广为应用的基因沉默工具。小干扰RNA（siRNA）选择性抑制基因表达使基因治疗达到最大的特异性,但是弱小的细胞内导入能力、有限的血液稳定性及非特异的免疫原性阻碍了siRNA基因治疗的发展。相比普通的siRNA,具有短发卡结构的shRNA产生的RNAi效应更强,但国内外的研究都没能有效解决将siRNA导入体内细胞的转染效率低下的问题。基因转运需要合适的载体,理想的基因转运系统,应具有较高的基因转染效率、良好的靶向性和生物相容性、较高的稳定性及生物可降解性。目前的病毒载体和非病毒脂质体载体都存在不同程度的缺陷,因而寻找一种理想的基因载体就成为当务之急。纳米基因转运体的研制是目前国际纳米生物和肿瘤基因治疗研究领域重要的前沿性课题。纳米粒与DNA的连接多通过静电吸引作用来完成。DNA的磷酸骨架所带的负电荷只能与表面带正电性的载体结合。因此,需要利用生物活性分子对纳米颗粒的表面进行改性,使其表面携带阳离子物质,以起到防止纳米颗粒团聚,并有利于结合DNA分子的作用。Fe304磁性纳米粒兼具有磁靶向和被动靶向的特点,可以通过在其表面进行氨基功能化修饰,增加其稳定性和转染效率。基于以上背景和已有的研究成果,我们先用免疫化学Envision法测定抗凋亡因子Mcl-1在肝癌组织及癌旁组织中的表达,探讨凋亡机制失衡导致肝癌的发生的关系及临床病理学意义。结果显示,与高分化的肝癌组织相比,在低分化、增殖旺盛的肝癌组织中Mcl-1蛋白表达显着增强,62例肝癌组织中,Mcl-1阳性表达率为64.5%,高于临近癌旁组织,且与肝癌Edmonson grade分级、肿瘤直径、肝内外转移有关（P<0.05）,为下一步的肿瘤基因治疗提供了实验基础。我们设计、合成了Mcl-1siRNA,并且与空载体质粒psiRNA-Hhlneo链接构建重组质粒Mcl-1shRNA真核表达载体psiRNA1-3,通过酶切电泳、基因测序证实是否正确构建,通过转染高表达Mcl-1的人肝癌HepG2细胞检测Mcl-1mRNA下降水平,筛选出最佳的shRNA。结果重组质粒psiRNA-Hh 1 neo-shRNA经酶切电泳、基因测序证明寡核苷酸片段成功插入预计位点,且序列与我们设计合成的完全一致,说明我们成功地构建shRNA真核表达载体psiRNA1-3。重组质粒载体转染人肝癌HepG2细胞后,HepG2细胞Mcl-1 mRNA含量较转染前及对照组均有明显的下降（P<0.01）,说明我们制备的shRNA能有效抑制Mcl-1基因的表达,其中尤以psiRNA3抑制作用明显,抑制率达到58.3%。故在后续研究中,我们均以psiRNA3作为实验模板,探讨针对Mcl-1基因RNA干扰对肿瘤的治疗作用。通过改进的共沉淀法制备PLL修饰的Fe304磁性纳米粒（DMNP）,用透射电镜、激光粒度分析仪考察其形态、粒径、Zeta电位,MTT法观察其细胞毒性,不同的基因／纳米粒材料比制备基因纳米复合物,通过其形态、粒径、Zeta电位、基因保护实验考察磁性基因载体的理化特性,转染pEGFP-Cl绿色荧光蛋白质粒观察基因转染效率。结果制备的葡聚糖包裹的Fe304纳米粒径均一,分散性良好。PLL修饰的氨基功能化Fe304粒径（32±4）nm, Zeta电位为+18.23mV,对基因有较好的保护作用,选此条件下制备的基因纳米复合物进行基因转染,持续作用时间较脂质体和裸基因均要长。故后续研究中以此磁性纳米基因载体进行基因治疗研究。培养人肝癌HepG2细胞后,以DMNP进行转染,并观察外加磁场作用下对基因沉默效果的影响,72h后用RT-PCR和Western Blot检测Mcl-1 mRNA和Mcl-1蛋白的抑制率,用流式细胞仪及荧光显微镜检测细胞周期的改变和细胞凋亡情况,从体外考察基因治疗效果；建立裸鼠肝癌动物模型,以基因纳米复合物作瘤内多次注射,绘制肿瘤生长曲线,24天后切取肿瘤检测瘤重抑制率,从动物在体模型考察基因治疗效果。结果发现RNA干扰治疗组在外加磁场作用下Mcl-1mRNA和蛋白质的抑制率均明显提高,分别达到72.3%和54.2%,较未加磁场作用的治疗组与阴性治疗组抑制率均显着增强（均P<0.05）。移植瘤动物实验表明RNA干扰治疗组的肿瘤生长明显减慢,较假性治疗组明显增强（P<0.01）。说明我们制备的磁性纳米基因载体（DMNP）介导的Mcl-1shRNA对Mcl-1高表达的肝细胞癌有良好的治疗效果。
王瑞[8]（2009）在《新型纳米DNA转运体系的构建及其在软骨损伤治疗等方面的应用研究》文中指出目的通过对高分子量壳聚糖进行控制性降解,使其成为低分子量壳聚糖,构建一种新型的纳米基因传送系统,能够在体内外安全高效地进行基因传递,表征其理化性质,为关节软骨损伤提供简便有效的治疗措施。研究纳米局部转运系统（Nanometer Local Delivery System, NLDS）在体内外的转运机制,评估局部的基因表达量及基因转染的持续性、安全性、有效性、可控性。检测其生物学特性。分离、培养、冻存、复苏和传代兔关节软骨细胞。评估该系统体内外转染软骨细胞的效果,以及对软骨缺损的动物模型的转染效果。探索体内外应用纳米局部转运系统传递生长因子基因来促进软骨损伤修复的条件和方法,并根据体外的实验数据进行必要的条件优化,进而利用其携带生长因子基因对软骨缺损的动物模型进行转染,促进软骨修复。同时,将其与抗TNF的反义核酸技术结合,对其在假体无菌性松动和类风湿关节炎的应用进行探索性研究。方法采用NaNO2氧化法降解,将HMWC降解为合适分子量的LMWC,以FITC标记壳聚糖后,用凝胶渗透层析（GPC）的方法测定壳聚糖的分子量。以Xylidine Tonceau 2R （C.I. Acid Red 26）为指示剂的比色滴定法测定氨基百分含量。以增强型绿色荧光蛋白（EGFP）质粒、β-半乳糖酐酶（β-Galactosidase）、TGF-β1质粒等作为目的基因,通过分子自组装的方法制备载基因纳米壳聚糖微粒。以透射电镜（TEM）和原子力显微镜（AFM）观察微粒的形态,以激光粒径分析仪测定其粒径和表面的Zeta电位,行DNaseⅠ酶切保护实验研究壳聚糖对质粒DNA的保护作用,行MTT试验研究纳米微粒对细胞的毒性作用。对体外培养的关节软骨细胞进行转染,评估该系统体外转染软骨细胞的效果;切取软骨组织薄片体外行组织培养,评价该系统对软骨组织体外转染的效果;在兔膝关节上复制关节软骨缺损的模型,用该系统携带生长因子基因对软骨缺损的动物模型进行转染,观察其促进软骨修复的效果,同时观察该目的基因表达的时空及丰度特征等指标。在体内转染的同时,对其安全性进行评估。另外,采用ICR小鼠建立磨损微粒诱导的骨溶解的动物模型,采用该系统给药,观察其在假体无菌性松动应用方面的效果。采用DBA1小鼠建立II型胶原诱导的类风湿关节炎模型,同样采用该系统给药,观察其抗类风湿方面的效果。结果随着与NaNO2反应时间增加,从GPC测定中得到的壳聚糖的分子量从145kD降到了18kD。相应地,通过比色滴定得到的各种壳聚糖的-NH2百分含量也从71%降低到了51%。壳聚糖可以和GFP质粒相互作用形成带有表面正电荷的纳米微粒,TEM和AFM观察到的纳米微粒的形状是近似球形的,大小较均一,表面光滑,粒径在70nm左右。该系统能在很大程度上保护质粒DNA不受DNaseⅠ的降解,对细胞的毒性小。体外对培养的软骨细胞的定性和定量转染均显示该系统有良好的转染特性;对体外培养的软骨组织转染结果与细胞转染结果相近;在体内时应用,LMWC/ TGF-β1基因纳米复合物可以提高目的基因的转移效率和延长相应蛋白的表达时程,目的基因表达的时程和分布特征良好,在软骨缺损动物模型的应用中取得了良好的治疗效果。该系统携带靶向TNF-α的ASO进行基因传递用于干预微粒诱导的骨溶解模型时,可抑制小鼠颅骨局部植入Co-Cr-Mo合金后TNF-α的mRNA的转录上调,与此同时TNF-α的蛋白定量测定也相应的下降,对应的破骨细胞数量,TRAP定量结果,以及骨吸收陷窝的数量,均有所下降。而且这种改变在再次给予了TNF-α后可以逆转。该系统携带靶向TNF-α的ASO进行基因传递用于干预II型胶原诱导的类风湿关节炎模型时,可以抑制造模小鼠的体重下降,明显缓解小鼠后足垫和前足腕部的肿胀,X线结果和功能学观察也表明该系统对类风湿关节炎具有明显的抑制作用。结论高分子量（HMWC）降解而成的低分子量壳聚糖（LMWC）具有很好的溶解性,对细胞基本无毒,在生理环境下可以有效结合质粒DNA和反义核酸药物,形成稳定存在的纳米复合物颗粒。基于LMWC的纳米核酸药物传输系统对软骨细胞在体内外均有良好的转染效率。在体外能够保护目的DNA并延长其作用时间,在体内则对软骨缺损区域表现出一定的被动靶向性,更易于在缺损附近进行转染。使用该系统携带TGF-β1质粒应用于兔关节软骨缺损模型,能够有效地表达治疗因子,促进软骨修复。使用该系统携带抗TNF-α的反义核酸（ASO）,应用于假体无菌性松动的动物模型中,可以有效地抑制小鼠模型中由微粒诱导的骨溶解。使用该系统携带抗TNF-α的反义核酸（ASO）,应用于鸡胶原诱导的类风湿关节炎（RA）模型,可以有效地缓解RA的病情,抑制病情的发展。载基因低分子量壳聚糖纳米微粒能够有效地输送目的DNA,是一个很有潜力的纳米局部传输系统（Nanometer Local Delivery System, NLDS）。
欧阳德群[9]（2008）在《氨基硅烷化Fe3O4磁性纳米载体介导野生型p53基因治疗肝癌的实验研究》文中指出近年来,随着基因转移技术的日趋成熟,肝癌的基因治疗成为生物科学和临床医学的研究热点之一。基因治疗的载体,以及载体相关的免疫反应、细胞毒性与安全性问题是限制基因治疗发展和临床应用的瓶颈。目前基因治疗的研究和临床应用中常用的病毒载体和非病毒载体都存在无法克服的局限性。纳米粒基因转运载体是近年发展起来的一种新型的非病毒基因转运载体。它是将DNA、RNA等基因治疗分子包裹在纳米颗粒之中或吸附在其表面,同时也在颗粒表面耦联特异性的靶向分子,如特异性配体、单克隆抗体等,通过靶向分子与细胞表面特异性受体结合,在细胞摄取作用下进入胞内,实现安全有效的靶向性基因治疗。纳米粒材料的选择是成功进行纳米基因转运和治疗的关键。所选择的材料必须具有生物适应性和可降解型的,或者易于从体内排泄,而不产生有害的降解产物,且无免疫原性的物质,不会引起机体的免疫排斥反应。高分子生物降解材料制备的纳米颗粒具有稳定、无毒、无抗原性、生物相容性好、对所转运基因的表达有控释作用及对基因有保护作用等优点,是良好的纳米基因转运载体材料。研究证实,纳米粒与DNA的连接多通过静电吸引作用来完成。DNA的磷酸骨架所带的负电荷只能与表面带正电性的载体结合。因此,需要利用生物活性分子对纳米颗粒的表面进行改性,使其表面携带阳离子物质,以起到防止纳米颗粒团聚,并有利于结合DNA分子的作用。本研究中结果显示,以氨基硅烷化Fe3O4纳米颗粒作为基因转运载体所形成的氨基硅烷化Fe3O4纳米粒/DNA复合物,能保护所携带的DNA免受核酸酶的降解和超声剪切作用。同时,本研究发现,在较低浓度下Fe3O4纳米颗粒与氨基硅烷化Fe3O4纳米颗粒对肝癌（HepG2）细胞无明显的细胞毒性,只在高浓度下才会表现出一定的细胞毒性作用。在体外基因转运中,该纳米颗粒可有效转运pEGFP-C1报道基因表达质粒进入HepG2细胞,其转运效率为39%,略高于相同条件下脂质体的转染效率,但无统计学差异（*P＞0.05,N=10）。在外加磁场的条件下氨基硅烷化Fe3O4磁性纳米粒的转染效率明显增强。在此基础之上,本研究以氨基硅烷化Fe3O4磁性纳米粒作为基因转运载体,以重组人真核细胞表达质粒pcDNA3.1（+）-p53作为治疗基因,对HepG2细胞的荷瘤小鼠模型进行以氨基硅烷化Fe3O4磁性纳米粒作为基因转运载体在体内转运重组人真核细胞表达质粒pcDNA3.1（+）-p53的转染,利用RT-PCR、Western blot等方法检测HepG2细胞中转染入的外源野生型p53的表达情况,结果发现,在HepG2细胞中成功导入了外源野生型p53基因,并能表达p53蛋白。本实验结合局部热疗研究基因治疗与局部热疗的协同效应及对荷瘤小鼠的肿瘤抑制情况,设计了对照组、局部热疗组、氨基硅烷化Fe3O4纳米粒作转导pcDNA3.1（+）-p53基因治疗组和联合治疗组4个实验组,结果显示,热疗和野生型p53基因治疗都能抑制荷肝癌裸鼠转移瘤的生长。热疗和野生型p53基因联合应用可达到较好的协同作用,比单一的热疗或基因治疗能更好的抑制肝癌转移瘤的生长。联合治疗组、基因治疗组、热疗治疗组的抑瘤率分别为84.07%,59.43%,47.19%。
陈记稷[10]（2007）在《阳离子修饰的PEG化聚乳酸纳米基因载体的实验研究》文中提出近年来，随着基因转移技术的日趋成熟，基因治疗成为生物科学和临床医学的研究热点之一。基因治疗的载体问题，以及载体相关的免疫反应、细胞毒性与安全性问题是限制基因治疗发展和临床应用的瓶颈。目前基因治疗的研究和临床应用中常用的载体分为病毒载体和非病毒载体，各个载体均有各自的优缺点，病毒载体主要的潜在缺点包括：①致病可能性；②免疫原性；③大规模生产的困难性，而非病毒导入系统正受到更多的关注，它的主要的优点包括安全，容易大规模生产等，主要缺点是不能获得较高水平的基因导入和表达。纳米粒基因转运体是近年发展起来的一种新型的非病毒基因转运载体。它是将DNA、RNA等基因治疗分子包裹在纳米颗粒之中或吸附在其表面，同时也在颗粒表面耦联特异性的靶向分子，如特异性配体、单克隆抗体等，通过靶向分子与细胞表面特异性受体结合，在细胞摄取作用下进入胞内，实现安全有效的靶向性基因治疗。纳米粒材料的选择是成功进行纳米基因转运和治疗的关键。所选择的材料必须是生物可降解型或者易于从体内排泄，而不产生有害的降解产物，且无免疫原性，不引起机体的免疫排斥反应。高分子生物降解材料制备的纳米颗粒具有稳定、无毒、无抗原性、生物相容性好、对所转运基因的表达有缓释作用及对基因有保护作用等优点，是良好的纳米基因转运载体材料。研究证实，纳米粒与DNA的连接多通过静电吸引作用来完成。DNA的磷酸骨架所带的负电荷只能与表面带正电性的载体结合。因此，需要利用生物活性分子对纳米颗粒的表面进行改性，使其表面携带阳离子物质，起到防止颗粒团聚，并有利于结合DNA分子的作用。目的：构建一种理想的纳米基因载体转运系统，使其能有效的保护转运基因不被核酶降解，并具备较高的基因转染效率、有效的输送基因至靶位点以及良好的生物相容性。方法：在本研究中，基于我们的前期工作，首次创新性的选择单甲氧基聚乙二醇-聚乳酸（MePEG-PLA）和壳聚糖（chitosan，CS）通过透析过滤法来制备MePEG-PLA-CS纳米粒作为基因转运载体，并用正交实验设计方法安排实验，优选制备工艺条件。使用AFM（原子力显微镜）和Zetasizer（Marlven，粒径分析仪）来检测MePEG-PLA-CS纳米粒和MePEG-PLA-CS／DNA复合物的Zeta电位以及粒径分布。我们通过静电吸附作用将MePEG-PLA-CS纳米粒和带正电荷的DNA的结合在一起形成MePEG-PLA-CS／DNA复合物，通过分光光度计法来检测MePEG-PLA-CS／DNA复合物中DNA的浓度，从而计算DNA的结合效率。通过凝胶阻滞实验和DNaseI消化实验来检测该基因载体转运系统对DNA的保护能力。采用MTT法研究MePEG-PLA-CS纳米粒对人肝癌细胞（HepG2）及正常肝细胞（L-02）的影响。使用MePEG-PLA-CS携带pEGFP-C1（绿色荧光蛋白质粒）pDNA作为报导基因转染COS7细胞来评价体外转染效率，其中商业化脂质体（Lipofectamine2000，Invitrogen）作为阳性对照而裸DNA作为阴性对照。进一步的，构建BALB／C瘤鼠模型，采用MePEG-PLA-CS纳米粒载报告质粒绿色荧光蛋白（EGFP）研究体内基因转染的能力。结果：通过正交实验，我们得到了制备MePEG-PLA-CS NP的最优条件，AFM和粒径分析仪证明该纳米粒表面平滑完整，分散良好，无粘附团聚现，其表面电位为正，该纳米基因载体转运系统DNA结合效率（DNA loading efficiency）为91％±4.5％。MePEG-PLA-CS纳米粒由于表面带正电荷而获得结合带负电DNA的能力。同时，实验也证实，MePEG-PLA-CS纳米颗粒／DNA复合物能保护所携带的DNA免受核酸酶的降解。本研究发现，MePEG-PLA-CS纳米颗粒对正常的肝细胞（L-02）在一定的剂量范围内无细胞毒性，只在高浓度下才会表现出一定的细胞毒性作用。在体外基因转运中，该纳米颗粒可有效转运EGFP（绿色荧光蛋白）报道基因表达质粒进入COS7细胞，其转运效率达40％，强于相同条件下脂质体的转染效率。在体内基因转染实验中，由MePEG-PLA-CS纳米粒处理过的裸鼠一组，在肿瘤组织中EGFP基因表达最高，这证实了MePEG-PLA-CS纳米粒借助PEG能够在循环系统中长期滞留而不被网状内皮系统捕获，通过EPR（选择性滞留效应）效应富集到肿瘤组织中，从而具有靶向治疗肿瘤的能力。结论：采用透析过滤法，优化工艺条件，成功制备粒径较小、分布均匀的聚MePEG-PLA-CS纳米颗粒。使该纳米颗粒表面带正电荷从而结合质粒DNA，组装成MePEG-PLA-CS纳米颗粒基因转运体系。通过体内外基因转染及保护DNA等试验，证实该转运体系可保护所携带DNA免受核酸酶的降解，并且是一种低毒高效的纳米基因载体，我们的研究为应用纳米粒来实现肿瘤的基因治疗奠定了良好的科学基础。
二、一种新型的非病毒基因转运载体——纳米粒基因转运体（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、一种新型的非病毒基因转运载体——纳米粒基因转运体（论文提纲范文）
（1）新型核酸纳米载体的设计及在肿瘤细胞成像和药物递送中的应用研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号与缩写 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 癌症的诊断与治疗 |
| 1.1.1 癌症的诊断 |
| 1.1.2 癌症的治疗 |
| 1.1.3 癌症的诊疗一体化 |
| 1.2 经典的核酸结构单元用于设计纳米载体 |
| 1.2.1 核酸适配体 |
| 1.2.2 脱氧核酶 |
| 1.2.3 分子信标 |
| 1.2.4 双链探针 |
| 1.3 金纳米颗粒 |
| 1.3.1 金纳米颗粒的理化性质 |
| 1.3.2 金纳米颗粒分布、代谢性质和毒理研究 |
| 1.3.3 金纳米颗粒在癌症诊疗中的应用研究 |
| 1.4 核酸纳米载体在癌症诊断和治疗中的研究进展 |
| 1.4.1 具有荧光特性的核酸纳米探针用于肿瘤细胞成像 |
| 1.4.2 核酸纳米载体在药物递送中的研究 |
| 1.4.3 基于核酸纳米载体的癌症诊疗一体化研究 |
| 1.5 本论文解决的科学问题及研究内容 |
| 参考文献 |
| 第二章 内源性刺激响应核靶向的纳米载体用于细胞内mRNA成像及药物递送 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验部分 |
| 2.2.1 试剂和仪器 |
| 2.2.2 凝胶电泳实验 |
| 2.2.3 金纳米颗粒(AuNPs)的合成及AuNP-mRS-DSs的制备 |
| 2.2.4 金纳米颗粒表面mRS-DS的修饰量考察 |
| 2.2.5 特异性考察 |
| 2.2.6 杂交实验 |
| 2.2.7 细胞系及细胞培养 |
| 2.2.8 细胞内荧光成像实验 |
| 2.2.9 qRT-PCR对MRP1 mRNA进行分析 |
| 2.2.10 细胞摄取 |
| 2.2.11 阿霉素插入实验 |
| 2.2.12 细胞存活率考察 |
| 2.2.13 统计学分析 |
| 2.3 结果与讨论 |
| 2.3.1 DNA序列设计的可行性验证 |
| 2.3.2 AuNP-mRS-DSs的表征 |
| 2.3.3 金纳米颗粒表面mRS-DS的修饰量及AuNP-mRS-DSs的特异性考察 |
| 2.3.4 AuNP-mRS-DSs的选择性考察 |
| 2.3.5 细胞内荧光成像 |
| 2.3.6 细胞摄取 |
| 2.3.7 纳米载体的载药量考察 |
| 2.3.8 细胞存活率考察 |
| 2.4 结论 |
| 参考文献 |
| 第三章 多功能分子信标修饰的金纳米颗粒作为纳米载体用于活细胞内耐药相关mRNA的协同抑制及原位成像 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验部分 |
| 3.2.1 试剂和仪器 |
| 3.2.2 凝胶电泳实验 |
| 3.2.3 金纳米颗粒(AuNPs)的合成及MBs-AuNP的制备 |
| 3.2.4 金纳米颗粒表面分子信标的修饰量考察 |
| 3.2.5 可行性与稳定性实验 |
| 3.2.6 细胞系及细胞培养 |
| 3.2.7 细胞内荧光成像 |
| 3.2.8 MDR1 mRNA、MRP1 mRNA和BCRP mRNA的相对表达水平分析 |
| 3.2.9 Western blotting实验 |
| 3.2.10 阿霉素插入实验 |
| 3.2.11 细胞毒性实验 |
| 3.2.12 统计学分析 |
| 3.3 结果与讨论 |
| 3.3.1 DNA序列设计的可行性验证 |
| 3.3.2 MBs-AuNP的表征 |
| 3.3.3 金纳米颗粒表面分子信标的修饰量考察 |
| 3.3.4 可行性及稳定性考察 |
| 3.3.5 细胞内荧光成像 |
| 3.3.6 MBs-AuNP对细胞内耐药相关mRNA和蛋白水平的影响 |
| 3.3.7 纳米载体的载药量考察 |
| 3.3.8 细胞存活率实验 |
| 3.4 结论 |
| 参考文献 |
| 第四章 端粒酶特异性的DNAzyme驱动的DNA walker作为纳米载体用于活细胞内端粒酶活性分析及药物递送 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验部分 |
| 4.2.1 试剂和仪器 |
| 4.2.2 凝胶电泳实验 |
| 4.2.3 金纳米颗粒(AuNPs)的制备 |
| 4.2.4 tsDNA-AuNP的制备及其表面底物发卡修饰量的考察 |
| 4.2.5 细胞培养及HeLa细胞提取液的制备 |
| 4.2.6 HeLa细胞提取液中端粒酶活性检测 |
| 4.2.7 tsDNA-AuNP的稳定性考察 |
| 4.2.8 细胞内端粒酶活性的成像分析 |
| 4.2.9 TERT mRNA的相对表达水平分析 |
| 4.2.10 端粒酶抑制剂的筛选 |
| 4.2.11 阿霉素插入实验 |
| 4.3 结果与讨论 |
| 4.3.1 DNA序列设计的可行性验证 |
| 4.3.2 tsDNA-AuNP的表征 |
| 4.3.3 tsDNA-AuNP的可行性和稳定性考察 |
| 4.3.4 行走链与底物发卡修饰比例的考察 |
| 4.3.5 tsDNA-AuNP检测性能的考察 |
| 4.3.6 细胞内端粒酶活性分析的条件优化 |
| 4.3.7 不同细胞内端粒酶活性分析 |
| 4.3.8 端粒酶抑制剂的筛选 |
| 4.3.9 纳米载体的载药量考察 |
| 4.4 结论 |
| 参考文献 |
| 第五章 结论与展望 |
| 5.1 结论 |
| 5.2 展望 |
| 致谢 |
| 博士期间发表论文 |
| 附录 |
| 附件 |
（2）中药多糖为载体的基因传递及其诱导细胞重编程研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 引言 |
| 第一章 综述 |
| 1 肝病的概述及研究进展 |
| 2 细胞疗法应用于肝病治疗研究进展 |
| 2.1 原代肝细胞 |
| 2.2 肝祖细胞 |
| 2.3 干细胞 |
| 2.4 谱系重编程 |
| 2.4.1 病毒型基因载体介导的谱系重编程 |
| 2.4.2 非病毒型基因载体介导的谱系重编程 |
| 2.4.3 存在的问题和局限性 |
| 3 天然多糖作为新型非病毒基因载体研究进展和展望 |
| 4 本论文的研究意义与内容 |
| 4.1 研究对象与意义 |
| 4.2 研究思路与内容 |
| 第二章 中药多糖的提取、分离、纯化及结构解析 |
| 1 仪器与试剂 |
| 1.1 主要仪器 |
| 1.2 主要试剂 |
| 2 实验与方法 |
| 2.1 当归药材的预处理 |
| 2.2 当归粗多糖的提取 |
| 2.3 当归多糖的纯化 |
| 2.3.1 粗多糖除蛋白 |
| 2.3.2 柱层析法 |
| 2.4 当归多糖的结构解析 |
| 2.4.1 分子量测定 |
| 2.4.2 糖醛酸含量测定 |
| 2.4.3 刚果红实验 |
| 2.4.4 单糖组成 |
| 3 结果与讨论 |
| 3.1 当归多糖的纯化 |
| 3.1.1 粗多糖除蛋白 |
| 3.1.2 柱层析法 |
| 3.2 当归多糖的结构解析 |
| 3.2.1 分子量测定 |
| 3.2.2 糖醛酸含量测定 |
| 3.2.3 刚果红实验 |
| 3.2.4 单糖组成 |
| 4 本章小结 |
| 第三章 中药多糖的阳离子化修饰及表征 |
| 1 仪器与试剂 |
| 1.1 主要仪器 |
| 1.2 主要试剂 |
| 2 实验与方法 |
| 2.1 当归多糖的阳离子化修饰 |
| 2.2 阳离子化当归多糖(ASP-PEI)的表征 |
| 2.2.1 Zeta电位测定 |
| 2.2.2 元素分析 |
| 2.2.3 伯氨基含量测定 |
| 2.2.4 傅立叶红外光谱(FT-IR)分析 |
| 2.2.5 核磁共振(NMR)分析 |
| 3 结果与讨论 |
| 3.1 Zeta电位测定 |
| 3.2 元素分析 |
| 3.3 伯氨基含量测定 |
| 3.4 傅立叶红外光谱(FT-IR)分析 |
| 3.5 核磁共振(NMR)分析 |
| 4 本章小结 |
| 第四章 cASP-pHNF1A自组装纳米粒的制备、表征及细胞转导效率研究 |
| 1 仪器与试剂 |
| 1.1 主要仪器 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要溶液 |
| 2 实验与方法 |
| 2.1 cASP-pHNF1A自组装纳米粒的制备 |
| 2.1.1 质粒DNA的制备 |
| 2.1.2 质粒DNA的鉴定 |
| 2.1.3 cASP-pHNF1A自组装纳米粒的制备 |
| 2.1.4 cASP-pHNF1A自组装纳米粒携带基因能力的测定 |
| 2.2 cASP-pHNF1A自组装纳米粒的表征 |
| 2.2.1 Zeta电位测定 |
| 2.2.2 粒径测定 |
| 2.2.3 形态观察 |
| 2.2.4 细胞毒性 |
| 2.3 cASP-pHNF1A自组装纳米粒细胞转导效率的研究 |
| 2.3.1 cASP-pHNF1A自组装纳米粒细胞转导效率的定性分析 |
| 2.3.2 cASP-pHNF1A自组装纳米粒细胞转导效率的定量分析 |
| 3 结果与讨论 |
| 3.1 cASP-pHNF1A自组装纳米粒的制备 |
| 3.1.1 质粒DNA的鉴定 |
| 3.1.2 cASP-pHNF1A自组装纳米粒携带基因能力的测定 |
| 3.2 cASP-pHNF1A自组装纳米粒的表征 |
| 3.2.1 Zeta电位测定 |
| 3.2.2 粒径测定 |
| 3.2.3 形态观察 |
| 3.2.4 细胞毒性 |
| 3.3 cASP-pHNF1A自组装纳米粒细胞转导效率的研究 |
| 3.3.1 cASP-pHNF1A自组装纳米粒细胞转导效率的定性分析 |
| 3.3.2 cASP-pHNF1A自组装纳米粒细胞转导效率的定量分析 |
| 4 本章小结 |
| 第五章 cASP-pHNF1A自组装纳米粒介导的体细胞重编程研究 |
| 1 仪器与试剂 |
| 1.1 主要仪器 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要溶液 |
| 2 实验与方法 |
| 2.1 人源包皮成纤维细胞(HFFs)的分离与培养 |
| 2.1.1 HFFs细胞的原代培养 |
| 2.1.2 HFFs细胞的传代培养 |
| 2.1.3 HFFs细胞的冻存与复苏 |
| 2.2 HFFs细胞重编程为诱导的人源肝细胞(ihHeps) |
| 2.3 ihHeps的鉴定 |
| 2.3.1 细胞形态变化 |
| 2.3.2 免疫荧光反应 |
| 2.3.3 蛋白免疫印记(Western Blotting) |
| 2.3.4 实时荧光定量PCR |
| 2.3.5 吲哚菁绿(ICG)的摄取和分泌 |
| 2.3.6 糖原的储存 |
| 2.3.7 低密度脂蛋白(LDL)的摄取 |
| 3 结果与讨论 |
| 3.1 人源包皮成纤维细胞(HFFs)的分离与培养 |
| 3.2 HFFs细胞重编程为人源肝细胞(ihHeps) |
| 3.3 ihHeps的鉴定 |
| 3.3.1 免疫荧光反应 |
| 3.3.2 蛋白免疫印迹(Western Blotting) |
| 3.3.3 实时荧光定量PCR |
| 3.3.4 吲哚菁绿(ICG)的摄取和分泌 |
| 3.3.5 糖原的储存 |
| 3.3.6 低密度脂蛋白(LDL)的摄取 |
| 4 本章小结 |
| 全文总结与创新点 |
| 一 全文总结 |
| 1 中药多糖的提取、分离、纯化及结构解析 |
| 2 中药多糖的阳离子化修饰及表征 |
| 3 cASP-pHNF1A自组装纳米粒的制备、表征及细胞转导效率研究 |
| 4 cASP-pHNF1A自组装纳米粒介导的体细胞重编程研究 |
| 二 创新点 |
| 三 展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读硕士期间已发表或完成的论文 |
（3）碳量子点介导纳米基因传递与U251干细胞诱导分化研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 引言 |
| 第一章 综述 |
| 1.1 脑胶质瘤研究进展 |
| 1.1.1 前言 |
| 1.1.2 研究进展 |
| 1.1.3 治疗手段 |
| 1.1.4.展望 |
| 1.2 碳量子点（Carbon quantum dots，CDs）的研究进展 |
| 1.2.1 前言 |
| 1.2.2 CDs制备方法及其分类 |
| 1.2.3 CDs在药物传递系统中的应用 |
| 1.2.4 量子点在基因传递系统中的研究进展 |
| 1.2.5 展望 |
| 第二章 CDs的制备、工艺优化与表征 |
| 2.1 主要仪器与试剂 |
| 2.1.1 主要试剂 |
| 2.1.2 主要仪器 |
| 2.1.3 实验细胞 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 CDs的制备与工艺优化 |
| 2.2.2 最佳CDs处方考察及表征 |
| 2.3 结果与讨论 |
| 2.3.1 荧光颜色 |
| 2.3.2 DNA电泳考察 |
| 2.3.3 EGFP蛋白表达考察 |
| 2.3.4 电位考察 |
| 2.3.5 粒径考察 |
| 2.3.6 TEM考察 |
| 2.3.7 IR考察 |
| 2.3.8 细胞毒性考察 |
| 2.3.9 转染效率考察 |
| 2.4 本章小结 |
| 第三章 CDs介导的U251干细胞体外诱导分化研究 |
| 3.1 主要试剂与仪器 |
| 3.1.1 主要试剂 |
| 3.1.2 主要仪器 |
| 3.2 实验与方法 |
| 3.2.1 U251干细胞的分离与鉴定 |
| 3.2.2 DNA-CDs的摄入机理研究 |
| 3.2.3 神经转录因子最佳组合筛选考察 |
| 3.2.4 CDs介导的U251干细胞神经分化研究 |
| 3.3 结果与讨论 |
| 3.3.1 肿瘤干细胞流式鉴定 |
| 3.3.2 细胞摄入机理考察 |
| 3.3.3 IF筛选最佳基因组合 |
| 3.3.4 细胞转染形态变化 |
| 3.3.5 IF考察U251干细胞转染分化效能 |
| 3.3.6 QT-qPCR检测因子表达水平 |
| 3.3.7 WB检测U251干细胞转染分化效能 |
| 3.4 本章小结 |
| 第四章 CDs介导的体内U251干细胞神经分化研究 |
| 4.1 主要试剂与仪器 |
| 4.1.1 主要试剂 |
| 4.1.2 主要仪器 |
| 4.1.3 实验动物 |
| 4.2 实验与方法 |
| 4.2.1 U251原位移植 |
| 4.2.2 疗效评价 |
| 4.3 结果与讨论 |
| 4.3.1 裸鼠体重及生存率情况 |
| 4.3.2 HE染色考察 |
| 4.3.3 免疫组化结果 |
| 4.3.4 肿瘤体积变化情况 |
| 4.3.5 基因芯片实验结果 |
| 4.4 本章小结 |
| 第五章 机制研究 |
| 5.1 主要试剂与仪器 |
| 5.1.1 主要试剂 |
| 5.1.2 主要仪器 |
| 5.2 实验与方法 |
| 5.2.1 Notch通路研究 |
| 5.2.2 Wnt通路研究 |
| 5.3 结果与讨论 |
| 5.3.1 QT-qPCR检测Notch通路相关因子 |
| 5.3.2 免疫组化检测Wnt通路 |
| 5.4 本章小结 |
| 全文总结与创新点 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 在学期间发表的学术论文及其他科研成果 |
（4）UTMD联合纳米粒介导TGFβ1和TIMP1稳定动脉粥样硬化易损斑块的实验研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 英汉缩略语名词对照 |
| 前言 |
| 参考文献 |
| 第一章 腺病毒过表达载体的构建与功能验证 |
| 第一部分 腺病毒过表达载体的构建 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.3 结果 |
| 第二部分 重组腺病毒的功能鉴定 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.3 结果 |
| 1.4 统计学方法分析 |
| 1.5 讨论 |
| 1.6 结论 |
| 参考文献 |
| 第二章 UTMD联合纳米粒促进载TGFβ1-TIMP1质粒转染巨噬细胞的实验研究 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.3 结果 |
| 2.4 统计学方法分析 |
| 2.5 讨论 |
| 2.6 结论 |
| 参考文献 |
| 第三章 UTMD联合纳米粒促进载TGFβ1-TIMP1质粒转染动脉粥样硬化易损斑块的实验研究 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.3 结果 |
| 3.4 统计学方法分析 |
| 3.5 讨论 |
| 3.6 结论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 文献综述 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 攻读博士学位期间发表学术论文及科研成果 |
| 致谢 |
（5）RVG29修饰脑靶向纳米药物递释系统的研究（论文提纲范文）
| 目录 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一章 RVG29多肽的脑靶向性评价 |
| 1 仪器和材料 |
| 1.1 材料和试剂 |
| 1.2 仪器 |
| 1.3 细胞株 |
| 1.4 实验动物 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 PAMAM-PEG-RVG29的合成 |
| 2.2 PAMAM-PEG-RVG29的合成验证 |
| 2.2.1 ~1H-NMR |
| 2.2.2 巯基反应效率的测定 |
| 2.3 PAMAM-PEG-RVG29/DNA纳米粒的制备与表征 |
| 2.3.1 PAMAM-PEG-RVG29/DNA纳米粒的制备 |
| 2.3.2 PAMAM-PEG-RVG29/DNA纳米粒的粒径测定 |
| 2.3.3 PAMAM-PEG-RVG29/DNA纳米粒的电泳实验 |
| 2.4 BCECs对PAMAM-PEG-RVG29/DNA摄取情况考察 |
| 2.4.1 BCECs培养 |
| 2.4.2 BCECs对PAMAM-PEG-RVG29/DNA摄取及其机制考察 |
| 2.5 PAMAM-PEG-RVG29/DNA纳米粒在细胞内的定位考察 |
| 2.6 PAMAM-PEG-RVG29/DNA纳米粒跨体外BBB模型转运 |
| 2.6.1 体外BBB模型的建立 |
| 2.6.2 ~14C-蔗糖渗透系数的测定 |
| 2.6.3 PAMAM-PEG-RVG29/DNA纳米粒跨BCECs单层转运实验 |
| 2.7 活体成像分析PAMAM-PEG-RVG29/DNA纳米粒的分布 |
| 2.8 PAMAM-PEG-RVG29/DNA纳米粒在小鼠脑内表达评价 |
| 2.8.1 PAMAM-PEG-RVG29/DNA纳米粒在小鼠脑内表达分布的定型评价 |
| 2.8.2 PAMAM-PEG-RVG29/DNA纳米粒在小鼠体内表达分布的定量评价 |
| 2.9 数据分析 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 PAMAM-PEG-RVG29的合成验证 |
| 3.2 PAMAM-PEG-RVG29/DNA纳米粒的表征 |
| 3.3 BCECs对PAMAM-PEG-RVG29/DNA纳米粒的摄取及机制探索 |
| 3.4 PAMAM-PEG-RVG29/DNA纳米粒摄取后的细胞内定位 |
| 3.5 PAMAM-PEG-RVG29/DNA纳米粒跨BCECs单层转运 |
| 3.6 PAMAM-PEG-RVG29/DNA纳米粒的体内分布 |
| 3.7 PAMAM-PEG-RVG29/DNA纳米粒在脑内表达的定性考察 |
| 3.8 PAMAM-PEG-RVG29/DNA纳米粒在体内表达的定量考察 |
| 4 讨论 |
| 4.1 RVG29修饰的载基因纳米粒的体外靶向性研究 |
| 4.2 PAMAM-PEG-RVG29/DNA纳米粒的体内靶向性研究 |
| 5 小结 |
| 第二章 RVG29修饰脑靶向纳米器件用于帕金森病的早期凋亡诊断 |
| 1 仪器和材料 |
| 1.1 材料和试剂 |
| 1.2 仪器 |
| 1.3 细胞株 |
| 1.4 实验动物 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 DGLs-RVG29-FRET纳米器件的合成 |
| 2.2 DGLs-RVG29-FRET纳米器件的表征 |
| 2.3 DGLs-RVG29-FRET纳米器件的稳定性考察 |
| 2.4 DGLs-RVG29-FRET纳米器件的细胞毒性考察 |
| 2.5 DGLs-RVG29-FRET纳米器件跨BCECs单层转运实验 |
| 2.6 体外caspase-3激活模型的建立 |
| 2.7 利用DGLs-RVG29-FRET纳米器件进行激活型caspase-3的体外检测 |
| 2.8 DGLs-RVG29-FRET纳米器件的离体组织分布 |
| 2.9 体内caspase-3激活模型的建立 |
| 2.10 DGLs-RVG29-FRET纳米器件应用于活体caspase-3成像 |
| 2.11 DGLs-RVG29-FRET纳米器件在脑部分布与定位 |
| 2.12 数据分析 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 DGLs-RVG29-FRET纳米器件的合成表征 |
| 3.2 DGLs-RVG29-FRET纳米器件的稳定性考察 |
| 3.3 DGLs-RVG29-FRET纳米器件的安全性考察 |
| 3.4 DGLs-RVG29-FRET纳米器件跨BCECs单层转运 |
| 3.5 体外caspase-3激活模型的建立 |
| 3.6 DGLs-RVG29-FRET纳米器件应用于细胞内的激活型caspase-3检测 |
| 3.7 DGLs-RVG29-FRET纳米器件的离体组织分布 |
| 3.8 体内caspase-3激活模型的建立 |
| 3.9 DGLs-RVG29-FRET纳米器件应用于脑内的激活型caspase-3检测 |
| 3.10 DGLs-RVG29-FRET纳米器件在脑部分布与定位 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第三章 RVG29修饰脑靶向纳米基因递释系统的构建和表征 |
| 1 仪器和材料 |
| 1.1 材料和试剂 |
| 1.2 仪器 |
| 1.3 细胞株 |
| 1.4 实验动物 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 DGLs-PEG-RVG29的合成 |
| 2.2 DGLs-PEG-RVG29的合成验证 |
| 2.2.1 ~1H-NMR |
| 2.2.2 巯基反应效率的测定 |
| 2.3 DGLs-PEG-RVG29/DNA纳米粒的制备与表征 |
| 2.3.1 DGLs-PEG-RVG29/DNA纳米粒的制备 |
| 2.3.2 DGLs-PEG-RVG29/DNA纳米粒的粒径表征 |
| 2.3.3 DGLs-PEG-RVG29/DNA纳米粒的电泳实验 |
| 2.4 DGLs-PEG-RVG29/DNA纳米粒跨BCECs单层转运实验 |
| 2.5 DGLs-PEG-RVG29/DNA纳米粒细胞毒性考察 |
| 2.6 活体成像分析DGLs-PEG-RVG29/DNA纳米粒的分布 |
| 2.7 DGLs-PEG-RVG29/DNA纳米粒在脑内的分布 |
| 2.8 数据分析 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 DGLs-PEG-RVG29的合成验证 |
| 3.2 DGLs-PEG-RVG29/DNA纳米粒的表征 |
| 3.3 DGLs-PEG-RVG29/DNA纳米粒跨BCECs单层转运 |
| 3.4 DGLs-PEG-RVG29/DNA纳米粒的安全性考察 |
| 3.5 DGLs-PEG-RVG29/DNA纳米粒的体内分布 |
| 3.6 DGLs-PEG-RVG29/DNA纳米粒的在脑内的分布 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第四章 RVG29修饰脑靶向纳米基因递释系统用于帕金森病的治疗 |
| 1 仪器和材料 |
| 1.1 材料和试剂 |
| 1.2 仪器 |
| 1.3 细胞株 |
| 1.4 实验动物 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 DGLs-PEG-RVG29的合成 |
| 2.2 DGLs-PEG-RVG29/DNA纳米粒的制备 |
| 2.3 Caspase-3 shRNA编码质粒的筛选 |
| 2.4 鱼藤酮诱导的帕金森病大鼠模型以及给药方案 |
| 2.5 实时定量RT-PCR分析caspase-3 mRNA水平 |
| 2.6 Western blot检测激活型caspase-3水平 |
| 2.7 免疫荧光分析激活型caspase-3 |
| 2.8 黑质中酪氨酸羟化酶TH-免疫组化分析 |
| 2.9 体视学计数 |
| 2.10 行为学评价(Open-field test旷场实验) |
| 2.11 体内凋亡检测TUNEL分析 |
| 2.12 ELISA测定脑组织中TNF-α水平 |
| 2.13 Griess Assay测定脑组织中NO含量 |
| 2.14 数据分析 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 Caspase-3 shRNA编码质粒的筛选结果 |
| 3.2 RT-PCR测定Caspase-3 mRNA水平结果 |
| 3.3 激活型caspase-3蛋白水平Westernblot分析结果 |
| 3.4 激活型caspase-3的免疫荧光分析结果 |
| 3.5 大鼠体重变化 |
| 3.6 行为学评价结果 |
| 3.7 TH免疫组化评价结果 |
| 3.8 TUNEL检测脑组织中凋亡情况 |
| 3.9 TNF-α水平测定 |
| 3.10 NO水平测定 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第五章 RVG29修饰脑靶向纳米基因-多肽递释系统用于阿尔茨海默病的治疗 |
| 1 仪器和材料 |
| 1.1 材料和试剂 |
| 1.2 仪器 |
| 1.3 细胞株 |
| 1.4 实验动物 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 DGLs-PEG-RVG29-D-peptide的合成 |
| 2.2 DGLs-PEG-RVG29-D-peptide的合成验证 |
| 2.2.1 ~1H-NMR |
| 2.2.2 巯基反应效率的测定 |
| 2.3 DGLs-PEG-RVG29-D-peptide/DNA纳米粒的制备 |
| 2.4 DGLs-PEG-RVG29-D-peptide/DNA纳米粒的表征 |
| 2.5 BACE1-AS shRNA编码质粒的构建 |
| 2.6 DGLs-PEG-RVG29-D-peptide/DNA纳米粒跨BCECs单层转运实验 |
| 2.7 SH-SY5Y细胞对DGLs-PEG-RVG29-D-peptide/DNA纳米粒的摄取考察 |
| 2.8 活体成像分析DGLs-PEG-RVG29/DNA纳米粒的分布 |
| 2.9 给药方案 |
| 2.10 实时定量RT-PCR分析BACE1 mRNA和BACE1-AS水平 |
| 2.11 Western blot检测BACEI蛋白水平 |
| 2.12 BACE1在脑中的免疫荧光染色 |
| 2.13 Aβ淀粉样斑块的硫磺素-S染色 |
| 2.14 磷酸化的tau蛋白(p-tau)免疫荧光染色 |
| 2.15 Morris水迷宫行为学评价 |
| 2.16 数据分析 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 DGLs-PEG-RVG29-D-peptide的合成验证 |
| 3.2 DGLs-PEG-RVG29-D-peptide/DNA纳米粒的表征 |
| 3.3 DGLs-PEG-RVG29-D-peptide/DNA纳米粒跨BCECs单层转运 |
| 3.4 DGLs-PEG-RVG29-D-peptide/DNA纳米粒的细胞摄取结果 |
| 3.5 DGLs-PEG-RVG29-D-peptide/DNA纳米粒的体内分布 |
| 3.6 脑内海马区域BACE1 mRNA和BACE1-AS水平测定结果 |
| 3.7 脑内海马区域BACE1蛋白水平Western blot分析结果 |
| 3.8 脑内海马区域的BACE1免疫荧光分析结果 |
| 3.9 Aβ淀粉样斑块的硫磺素-S染色结果 |
| 3.10 磷酸化的tau蛋白免疫荧光染色结果 |
| 3.11 Morris水迷宫行为学评价结果 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 全文总结 |
| 创新性 |
| 中英文缩写对照 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 论文 |
| 专利 |
| 致谢 |
（6）新型无机纳米载体的构建及其药物/基因的高效传递研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 纳米载体在药物/基因传递中的应用研究进展 |
| 1 纳米缓控释药物传递体系研究 |
| 1.1 纳米药物载体的概况 |
| 1.2 制备纳米粒的方法 |
| 1.3 纳米药物载体的优势 |
| 1.4 载药纳米粒在缓控释给药系统中的应用 |
| 1.5 展望 |
| 2 纳米制剂用于基因治疗 |
| 2.1 基因治疗的概述 |
| 2.2 理想基因转运载体的特征 |
| 2.3 基因载体的研究概况 |
| 2.3.1 病毒载体系统 |
| 2.3.2 非病毒载体系统 |
| 2.4 纳米基因载体系统 |
| 2.5 纳米材料的选择 |
| 2.6 展望 |
| 3 组织工程软骨种子细胞的定向诱导分化 |
| 3.1 组织工程概述 |
| 3.2 种子细胞定向诱导分化成软骨方法 |
| 3.3 展望 |
| 第二章 新型多孔二氧化硅纳米粒在药物传递中的应用研究 |
| 1 水溶性药物72h高效长效新制剂的研制 |
| 1.1 3d-SLBM的制备及体外质量评价 |
| 1.1.1 实验材料 |
| 1.1.2 实验方法 |
| 1.1.3 实验结果 |
| 1.2 3d-SLBM的犬体内药动学评价 |
| 1.2.1 实验材料 |
| 1.2.2 实验方法 |
| 1.2.3 实验结果 |
| 1.3 3d-SLBM的药效学评价 |
| 1.3.1 实验材料 |
| 1.3.2 实验方法 |
| 1.3.3 实验结果 |
| 2 难溶性药物72h高效长效新制剂的研制 |
| 2.1 3d-SLB的制备及药动学研究 |
| 2.1.1 实验材料 |
| 2.1.2 实验方法 |
| 2.1.3 实验结果 |
| 2.2 3d-SLB的药效评价 |
| 2.2.1 实验材料 |
| 2.2.2 实验方法 |
| 2.2.3 实验结果 |
| 3 小结 |
| 第三章 载基因纳米粒的制备及其基因传递的应用研究 |
| 1 DNA-磷酸钙纳米粒的制备及其干细胞中的传递研究 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.1.1 主要试剂 |
| 1.1.2 主要仪器 |
| 1.1.3 主要试剂的配制 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.2.1 质粒DNA制备与纯化 |
| 1.2.2 酶切鉴定 |
| 1.2.3 DNA-磷酸钙纳米粒的制备 |
| 1.2.4 细胞培养 |
| 1.2.5 纳米粒与质粒的结合 |
| 1.2.6 二维纳米基因传递系统的研究 |
| 1.2.7 毒性评价 |
| 1.2.8 干细胞细胞转染 |
| 1.3 实验结果 |
| 1.3.1 质粒提取结果 |
| 1.3.2 酶切实验结果 |
| 1.3.3 DNA-磷酸钙纳米粒的分离纯化 |
| 1.3.4 DNA-磷酸钙纳米粒的表征 |
| 1.3.5 干细胞培养时首次换液时间的确定 |
| 1.3.6 二维纳米基因传递系统的研究 |
| 1.3.7 MTT结果 |
| 1.3.8 DNA-磷酸钙纳米粒纳米粒转染干细胞结果 |
| 2 多糖修饰DNA-磷酸钙纳米粒的的制备及其干细胞中的传递研究 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 主要试剂 |
| 2.1.2 仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 多糖修饰的DNA-磷酸钙纳米粒的制备 |
| 2.2.2 多糖修饰的DNA-磷酸钙纳米粒的表征 |
| 2.2.3 细胞转染 |
| 2.2.4 统计学处理 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 制备流程 |
| 2.3.2 多糖修饰的DNA-磷酸钙纳米粒形态观察 |
| 2.3.3 ELISA测定各组TGF-β1表达水平 |
| 3 钙离子化多孔二氧化硅纳米粒的的制备及其性能评价 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 主要试剂 |
| 3.1.2 仪器 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 钙离子化DNA-PSNs的制备 |
| 3.2.2 钙离子化DNA-PSNs的表征 |
| 3.2.3 质粒结合实验 |
| 3.2.4 干细胞转染 |
| 3.3 结果与讨论 |
| 4 小结 |
| 第四章 三维纳米基因传递系统的构建及其在干细胞诱导分化中的应用研究 |
| 1 三维纳米基因传递系统的构建及其性能评价 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.1.1 主要试剂 |
| 1.1.2 主要仪器 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.2.1 3D-NGDS的构建 |
| 1.2.2 3D-NGDS的质量评价 |
| 1.3 实验结果 |
| 1.3.1 三种不同方法制备的支架比较 |
| 1.3.2 3D-NGDS的表征 |
| 2 3D-NGDS的基因转运研究 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 主要试剂 |
| 2.1.2 主要仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 DNA-磷酸钙纳米粒在支架中的转染 |
| 2.2.2 3D-NGDS的基因转运研究 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 3D-NGDS中干细胞的转染 |
| 2.3.2 3D-NGDS的基因转运研究 |
| 2.3.3 ECM黏附性能与基因转染效率之间的关系研究 |
| 2.3.4 3D-NGDS对DNA的缓释作用研究 |
| 2.3.5 3D-NGDS对软骨再生的促进作用研究 |
| 3 二维与三维纳米基因传递系统性能比较 |
| 3.1 转染效率的比较研究 |
| 3.2 对软骨的再生作用 |
| 4 小结 |
| 第五章 全文总结 |
| 一、研究工作总结 |
| 二、本文的主要创新点 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 发表论文及专利 |
（7）磁性纳米基因载体介导Mcl-1特异性shRNA治疗肝细胞癌的实验研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略词表 |
| 第一部分 肝癌组织中Mcl-1抗凋亡蛋白的表达及意义 |
| 一、前言 |
| 二、材料与方法 |
| 2.1 研究对象 |
| 2.2 仪器与试剂 |
| 2.3 免疫组织化学 |
| 2.4 结果判定 |
| 2.5 统计学分析 |
| 三、结果 |
| 3.1 光镜下观察 |
| 3.2 免疫组织化学结果 |
| 四、讨论 |
| 第二部分 靶向MCl-1的shRNA重组质粒载体的构建及评价 |
| 一、前言 |
| 二、材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.2 实验方法 |
| 三、结果 |
| 3.1 psiRNA-hH1neo重组质粒酶切电泳鉴定 |
| 3.2 psiRNA质粒的浓度和纯度测定 |
| 3.3 不同的shRNA对Mcl-1 mRNA的抑制率 |
| 四、讨论 |
| 第三部分 生物磁性纳米基因载体的制备和及其与质粒DNA的连接 |
| 一、前言 |
| 二、材料与方法 |
| 2.1 试剂及仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 三、实验结果 |
| 3.1 制备产物Fe_3O_4纳米粒子形貌表征 |
| 3.2 PLL修饰Fe_3O_4纳米粒子与DNA的结合效率测定结果 |
| 3.3 PLL修饰Fe_3O_4纳米粒子对DNA的保护实验结果 |
| 3.4 PLL修饰Fe_3O_4纳米粒基因转运体系的细胞毒性实验(MTT) |
| 3.5 普鲁士蓝染色结果 |
| 四 讨论 |
| 第四部分 磁性纳米介导的Mcl-1 shRNA体内外治疗肝细胞癌的实验研究 |
| 一、前言 |
| 二、材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 实验方法 |
| 三、结果 |
| 3.1 RT-PCR检测Mcl-1 mRNA抑制情况 |
| 3.2 Western blot检测Mcl-1蛋白 |
| 3.3 不同组细胞生长曲线的绘制 |
| 3.4 流式细胞仪检测各组HepG2细胞周期 |
| 3.5 裸鼠肝癌移植瘤动物模型 |
| 四、讨论 |
| 参考文献 |
| 综述·一 |
| 参考文献 |
| 综述·二 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 研究成果 |
（8）新型纳米DNA转运体系的构建及其在软骨损伤治疗等方面的应用研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略词表 |
| 第一部分 概述 |
| 一、纳米医学与基因治疗 |
| 1. 纳米医学的定义 |
| 2. 纳米医学的应用 |
| 3. 基因治疗 |
| 4. 纳米医学在基因治疗领域内的应用 |
| 5. 壳聚糖作为DNA载体的研究进展 |
| 二、研究背景 |
| 三、研究目的、意义、思路、步骤及内容 |
| 1、研究目的 |
| 2、研究意义 |
| 3、基本思路 |
| 4、研究步骤及内容 |
| 参考文献 |
| 第二部分 纳米基因转移系统的制备和表征 |
| 一、实验方法 |
| 1. 实验材料 |
| 2.LMWC的制备及FITC的标记 |
| 3.LMWC分子量和氨基百分含量的测定 |
| 4. 质粒的扩增和纯化 |
| 5.DNA纳米微粒的复合制备 |
| 6.DNA纳米微粒的形态学观察 |
| 7.DNA纳米微粒的平均粒径和Zeta电位的测定 |
| 8. 酶切保护试验 |
| 二、主要实验结果 |
| 1.LMWC的制备及FITC的标记 |
| 2.LMWC分子量和氨基百分含量的测定 |
| 3. 质粒的扩增和纯化 |
| 4.DNA纳米微粒的表观特征 |
| 5. 酶切保护试验结果 |
| 参考文献 |
| 第三部分 兔关节软骨细胞的分离培养与冻存复苏 |
| 一、实验方法 |
| 1. 实验材料 |
| 2. 软骨细胞的分离获取 |
| 3. 软骨细胞的原代及传代培养 |
| 4. 关节软骨细胞的冻存与复苏 |
| 5. 细胞计数法绘制细胞增殖曲线 |
| 6. 软骨细胞的GAGs组织化学染色 |
| 二、主要实验结果 |
| 1. 软骨细胞的分离获取 |
| 2. 倒置显微镜观察 |
| 3. 细胞增殖曲线 |
| 4. 细胞组织化学染色结果 |
| 参考文献 |
| 第四部分 载基因低分子量壳聚糖纳米微粒体外转染特性研究 |
| 一、实验方法 |
| 1. 实验材料 |
| 2. 体外报告基因转染软骨细胞试验 |
| 3. 体外报告基因转染软骨组织块试验 |
| 4. 体外对软骨细胞的细胞毒性试验 |
| 二、主要实验结果 |
| 1. 体外报告基因转染软骨细胞试验的结果 |
| 2. 体外报告基因转染软骨组织块试验的结果 |
| 3. 体外对软骨细胞的细胞毒性试验的结果 |
| 参考文献 |
| 第五部分 载基因低分子量壳聚糖纳米微粒体内转染特性研究 |
| 一、实验方法 |
| 1. 实验材料 |
| 2. 全层软骨缺损的动物模型 |
| 3. 体内报告基因转染软骨细胞试验 |
| 4. 安全性评价 |
| 5. 体内生长因子基因转染软骨细胞试验 |
| 二、主要实验结果 |
| 1. 动物模型一般情况 |
| 2. 体内报告基因转染软骨细胞结果 |
| 3. 安全性评价 |
| 4. 体内生长因子基因转染软骨细胞的结果 |
| 参考文献 |
| 第六部分 新型纳米非病毒基因转运系统治疗软骨缺损的研究 |
| 一、实验方法 |
| 1. 实验材料 |
| 2. 体内动物模型转染修复软骨缺损的实验 |
| 二、主要实验结果 |
| 1. 动物模型一般情况 |
| 2. 体内动物模型转染转染治疗软骨缺损的结果 |
| 参考文献 |
| 第七部分 纳米DNA传输系统在假体无菌性松动模型中的应用 |
| 一、实验方法 |
| 1. 实验材料 |
| 2. 载ASO纳米复合物颗粒的制备 |
| 3.Co-Cr-Mo 合金粉末处理 |
| 4. 磨损微粒诱导的骨溶解动物模型的建立 |
| 5. 实验分组与给药 |
| 6. 载ASO的纳米微粒原位转染抑制骨溶解的研究 |
| 二、主要实验结果 |
| 1. 动物模型一般情况 |
| 2. 复合物对TNF-α表达的抑制作用 |
| 3. 破骨细胞TRAP染色和TRAP定量 |
| 4. 骨吸收陷窝的观察和积分 |
| 5.TNF-α再次给予实验 |
| 参考文献 |
| 第八部分 纳米DNA传输系统在类风湿关节炎模型中的应用 |
| 一、实验方法 |
| 1. 实验材料 |
| 2. 载ASO纳米复合物颗粒的制备 |
| 3. 类风湿关节炎解动物模型的建立 |
| 4. 实验分组与给药 |
| 5. 载ASO的纳米微粒原位转染治疗类风湿关节炎的研究 |
| 二、主要实验结果 |
| 1. 动物模型一般情况 |
| 2. 纳米DNA传输系统在类风湿关节炎中的应用 |
| 参考文献 |
| 第九部分 讨论 |
| 一、新型纳米非病毒基因转运系统治疗软骨缺损的研究 |
| 1. 软骨的损伤与修复 |
| 2. 软骨缺损的动物模型 |
| 3.TGF-β1 与软骨修复 |
| 4. 基因治疗与软骨修复 |
| 5. 降解后的壳聚糖作为基因载体 |
| 6. 针对关节软骨和关节内环境的考量 |
| 二、纳米DNA传输系统在假体无菌性松动模型中的应用 |
| 1.TNF-α与假体松动 |
| 2. 抗TNF-α治疗与假体松动 |
| 3. 抗TNF-α的ASO |
| 4. 抗TNF-α的ASO 抑制微粒诱导的骨溶解 |
| 三、纳米DNA传输系统在类风湿关节炎模型中的初步应用 |
| 1.TNF-α与RA |
| 2. 抗TNF-α的生物制剂与RA的治疗 |
| 3. 抗TNF-α治疗的安全性与有效性 |
| 4. 抗TNF-α的ASO 治疗RA |
| 参考文献 |
| 文献综述一 |
| 参考文献 |
| 文献综述二 |
| 参考文献 |
| 文献综述三 |
| 参考文献 |
| 文献综述四 |
| 参考文献 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
| 致谢 |
（9）氨基硅烷化Fe3O4磁性纳米载体介导野生型p53基因治疗肝癌的实验研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 目录 |
| 英文缩写注解 |
| 第一部分 pcDNA3.1(+)-p53质粒的提取及鉴定 |
| 一、前言 |
| 二、材料与方法 |
| 三、实验结果 |
| 1.质粒pcDNA3.1(+)-p53的酶切鉴定 |
| 2.质粒pcDNA3.1(+)-p53基因序列测定 |
| 3.质粒pEGFP-C1的酶切鉴定 |
| 4.紫外分光光度计测定质粒的纯度和含量 |
| 四、讨论 |
| 五、结论 |
| 第二部分 超顺磁性Fe_3O_4磁性纳米粒的制备及表征 |
| 一、前言 |
| 二、材料与方法 |
| 三、实验结果 |
| 1.制备产物Fe_3O_4纳米粒子形貌表征 |
| 2.制备产物Fe_3O_4纳米粒子透射电镜TEM分析 |
| 3.制备产物Fe_3O_4纳米粒子晶体分析 |
| 4.制备产物Fe_3O_4纳米粒子Zeta电位分析 |
| 5.不同干燥温度对产物结构和性能的影响 |
| 四、讨论 |
| 五、结论 |
| 第三部分 Fe_3O_4磁性纳米粒的氨基硅烷化修饰及与质粒DNA的连接 |
| 一、前言 |
| 二、材料与方法 |
| 三、实验结果 |
| 1.氨基硅烷化Fe_3O_4纳米粒子的表征结果 |
| 2.氨基硅烷化Fe_3O_4纳米粒子与DNA的结合效率测定结果 |
| 3.氨基硅烷化Fe_3O_4纳米粒子对DNA的保护实验结果 |
| 4.氨基硅烷化Fe_3O_4纳米粒基因转运体系的细胞毒性实验(MTT) |
| 四、讨论 |
| 五、结论 |
| 第四部分 氨基硅烷化Fe_3O_4磁性纳米介导的pcDNA3.1(+)-p53对人肝癌HepG2细胞的体外转染实验 |
| 一、前言 |
| 二、材料与方法 |
| 三、实验结果 |
| 1.氨基硅烷化Fe_3O_4磁性纳米粒介导pEGFP-C1质粒体外转染HepG2细胞实验 |
| 2.外加磁场对氨基硅烷化Fe_3O_4磁性纳米粒基因转导的影响 |
| 3.HepG2细胞体外转染目的治疗基因pcDNA3.1(+)-p53后RT-PCR检测结果 |
| 4.Western blot法检测各组细胞中p53蛋白的表达情况 |
| 5.p53基因对HepG2细胞生长速度的影响 |
| 6.p53基因对HepG2细胞集落形成的影响 |
| 7.流式细胞仪检测凋亡 |
| 四、讨论 |
| 五、结论 |
| 第五部分 氨基硅烷化Fe_3O_4磁性纳米介导的pcDNA3.1(+)-p53基因体内转染实验及结合热疗对裸鼠肝癌模型治疗的观测 |
| 一、前言 |
| 二、材料与方法 |
| 三、实验结果 |
| 1.裸鼠肝癌HepG2移植瘤模型的建立 |
| 2.局部热疗联合瘤内注射氨基硅烷化Fe_3O_4纳米粒-p53基因复合物治疗裸鼠肝癌HepG2移植瘤的疗效观察 |
| 3.肿瘤组织HE染色 |
| 4.氨基硅烷化Fe_3O_4纳米粒介导p53基因治疗组透射电镜观察图 |
| 5.各实验组VEGF表达的比较 |
| 6.各实验组CD34的表达及MVD的结果比较 |
| 7.VEGF与MVD的相关性分析 |
| 四、讨论 |
| 五、结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间主要的研究成果 |
（10）阳离子修饰的PEG化聚乳酸纳米基因载体的实验研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 英文缩写注解 |
| 前言 |
| 第一章 阳离子修饰的PEG化聚乳酸纳米粒(MePEG-PLA-CS)的制备及其与质粒DNA的连接 |
| 一、材料与方法 |
| 二、实验结果 |
| 1. 阳离子修饰的PEG 化聚乳酸纳米粒(MePEG-PLA-CS) 的制备及形态粒径的观察检测 |
| 2. 阳离子修饰的PEG 化聚乳酸纳米粒(MePEG-PLA-CS) 在不同pH值下的Zeta电位 |
| 三、讨论 |
| 四、结论 |
| 第二章 阳离子修饰的PEG化聚乳酸纳米粒(MePEG-PLA-CS)基因载体的性质以及体内外转染效率 |
| 一、材料与方法 |
| 二、实验结果 |
| 1.DNA凝胶电泳实验 |
| 2.MePEG-PLA-CS NP转运体系的体外基因转染效率及细胞毒性分析 |
| 3.MePEG-PLA-CS NP转运体系的体内基因转染效率分析 |
| 4.内基因转染 |
| 三、讨论 |
| 四、结论 |
| 总结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间主要的研究成果 |
四、一种新型的非病毒基因转运载体——纳米粒基因转运体（论文参考文献）
- [1]新型核酸纳米载体的设计及在肿瘤细胞成像和药物递送中的应用研究[D]. 刘晓亭. 山东大学, 2020(08)
- [2]中药多糖为载体的基因传递及其诱导细胞重编程研究[D]. 马萍. 江苏大学, 2020(02)
- [3]碳量子点介导纳米基因传递与U251干细胞诱导分化研究[D]. 王建萍. 江苏大学, 2019(03)
- [4]UTMD联合纳米粒介导TGFβ1和TIMP1稳定动脉粥样硬化易损斑块的实验研究[D]. 苏一巾. 南京医科大学, 2016(05)
- [5]RVG29修饰脑靶向纳米药物递释系统的研究[D]. 刘洋. 复旦大学, 2013(03)
- [6]新型无机纳米载体的构建及其药物/基因的高效传递研究[D]. 曹霞. 江苏大学, 2011(06)
- [7]磁性纳米基因载体介导Mcl-1特异性shRNA治疗肝细胞癌的实验研究[D]. 曹兴. 中南大学, 2010(02)
- [8]新型纳米DNA转运体系的构建及其在软骨损伤治疗等方面的应用研究[D]. 王瑞. 第二军医大学, 2009(10)
- [9]氨基硅烷化Fe3O4磁性纳米载体介导野生型p53基因治疗肝癌的实验研究[D]. 欧阳德群. 中南大学, 2008(02)
- [10]阳离子修饰的PEG化聚乳酸纳米基因载体的实验研究[D]. 陈记稷. 中南大学, 2007(06)