一、棉铃虫核型多角体病毒侵染机制的研究(论文文献综述)
申忠健,刘彦君,祝琳,田志强,刘孝明,刘小侠[1](2021)在《棉铃虫YTHDF1基因的表达模式及在核型多角体病毒侵染中的作用》文中研究表明为明确N6-甲基腺苷(N6-methyladenosine,m6A)修饰在棉铃虫核型多角体病毒(Helicoverpa armigera nucleopolyhedrovirus,HearNPV)侵染棉铃虫中的作用,根据基因组和转录组数据,对棉铃虫m6A结合蛋白基因YTHDF1(YTH domain-containing family protein 1)进行鉴定和分析,利用实时荧光定量PCR技术检测棉铃虫YTHDF1基因的时空表达模式、HearNPV处理后的表达变化情况以及RNA干扰效率,并调查该基因下调后对HearNPV复制及感染HearNPV棉铃虫死亡情况的影响。结果显示,棉铃虫YTHDF1基因开放阅读框全长为2 019 bp,编码672个氨基酸,含有1个保守的YTH结构域,其氨基酸序列与斜纹夜蛾Spodoptera litura同源物序列一致性达87.52%。YTHDF1基因在棉铃虫不同发育阶段均有表达,其中在进入5龄期24 h幼虫中的表达量最高,在2龄取食期幼虫中的表达量最低。YTHDF1基因的空间表达谱呈现一定的组织特异性,在幼虫血细胞和成虫头部的表达量最高。HearNPV侵染棉铃虫后YTHDF1基因上调表达,经RNA干扰使该基因下调后显着抑制了HearNPV多角体蛋白基因polyhedrin的表达并延迟了感染HearNPV棉铃虫的死亡时间。表明YTHDF1基因在HearNPV侵染棉铃虫的过程中发挥着重要作用。
李洁,李洁,于乾龙,郑桂玲,张彬,李长友[2](2021)在《鳞翅目昆虫抗病毒免疫反应的研究进展》文中指出鳞翅目昆虫种类繁多,对农业生产和人类生活产生重大影响,宿主昆虫与病毒相互关系的研究对于利用病毒杀虫剂进行害虫治理和益虫病毒性疾病的预防具有重要意义。因此,鳞翅目昆虫与病毒的互作研究显得尤为重要,宿主昆虫的免疫系统在抗病毒感染过程中发挥着关键作用,对病毒产生不同程度的免疫反应。本文综述了昆虫围食膜和中肠对病毒入侵的防御作用,病毒进入体腔后昆虫所产生的细胞免疫和体液免疫反应,以及RNAi、细胞的自噬与凋亡、Toll、Imd、JAK-STAT和STING信号通路等相关的抗病毒免疫途径,并对昆虫抗病毒免疫研究的制约因素和未来鳞翅目昆虫抗病毒免疫的研究重点进行了讨论,以期为害虫的生物防治和益虫疾病的防控提供理论依据。
黄博,朱梦瑶,丘霈珊,张若男,张文庆,余小强,卢玉珍[3](2021)在《核型多角体病毒侵染及其与宿主免疫系统互作的研究进展》文中研究表明核型多角体病毒(Nucleopolyhedrovirus, NPV)应用广泛,已被开发成微生物杀虫剂和用于重组蛋白表达等。NPV具有两种病毒颗粒:包埋型病毒粒子(occlusion-derived virus, ODV)和芽生型病毒粒子(budded virus, BV),两者的构成和组装存在差异。病毒包涵体在肠道中溶解后释放出ODV进行初级感染,子代核衣壳通过质膜出芽产生BV引发全身性的次级感染。病毒感染昆虫后能引发宿主的免疫反应,同时NPV病毒已进化出多种策略抑制或逃避宿主的免疫反应,如免疫信号通路、黑化和凋亡等过程。本文将总结鳞翅目特异性NPV与宿主的互作研究,着重介绍NPV的侵染机制、NPV与宿主免疫系统互作的研究进展。
樊江斌[4](2020)在《苹果蠹蛾颗粒体病毒CpGV的7个分离株的基因组结构与毒力差异机制研究》文中认为苹果蠹蛾颗粒体病毒(Cydia pomonella granulovirus,Cp GV)是一种对苹果蠹蛾(Cydia pomonella L.)幼虫具有专一性和高致病性的病原微生物。目前,Cp GV已经被开发成生物杀虫剂,应用在数十万公顷的苹果和梨等蔷薇科水果的种植生产中,是最成功的杆状病毒商业化产品之一。近年来,田间发现的三种抗Cp GV(I-III型)的苹果蠹蛾种群以及可以克服这三种抗性的Cp GV分离株,为研究杆状病毒宿主相互适应性提供了理想的模型。本论文旨在阐明中国西北地区收集的Cp GV分离株对敏感和抗性苹果蠹蛾种群的毒力差异,病毒基因组多态性。同时开展了苹果蠹蛾颗粒体病毒增效剂的研究。运用Illumina二代测序技术分析七个Cp GV分离株的种群结构,包括Cp GV-ZY、-JQ、-ALE、-KS1、-KS2、-ZY2和-WW,寻找这些新分离株基因型和生物学差异之间的关联性。研究所获主要结果如下:1.七个Cp GV对抗性苹果蠹蛾的生测结果表明Cp GV-JQ、-KS1和-ZY2可以克服I型抗性,感染幼虫的死亡时间明显延迟。新分离株遵循克服抗性的“pe38模型”,即缺少2×12 bp重复序列。尽管Cp GV-WW具有克服I型的特征,但是它不能高效杀死I型抗性苹果蠹蛾,却克服II型和III型抗性苹果蠹蛾。除了Cp GV-WW以外,其他Cp GV分离株生物测定结果与分离株的pe38重复序列结构之间的相关性与前人研究结论一致,即pe38基因是苹果蠹蛾Cp RR1中抗性靶标。2.根据Illumina二代测序数据,完成基因组组装和注释,系统发育分析。结果表明,尽管这些分离株采样地点相距甚远,但是它们的基因组高度保守且和已知Cp GV分离株有关联。基于系统发育树研究表明,除了已报道的五个基因组类群A,B,C,D和E,发现和命名了两个基因组类群F(Cp GV-JQ和-ZY2)和基因组类群G(Cp GV-ALE)。设定Cp GV-M为参考基因组,定量不同分离株基因组类群特异性单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphisms,SNPs)的组份,确定其遗传构成。共发现563个SNPs,其中新发现223个SNPs属于这七个Cp GV。Cp GV-WW在基因组构成上是高度同质的,属于基因组类群E。其他的六种分离株则是由至少两种基因组类群组成的混合物。其中Cp GV-ZY、-KS1和-KS2基因组构成非常相似,分别由不同比例的基因组类群A(Cp GV-M)和基因组类群E(Cp GV-WW)组成。3.室内和半田间生测结果表明,在病毒悬液中添加7mg/ml的氧化铁能够显着提高Cp GV在田间的活性和持久性,与未添加氧化铁处理相比较,初孵幼虫死亡率分别提高了53.88%和96.64%。说明添加低剂量氧化铁,增强了Cp GV对田间强日光、强紫外线的适应性,提高了该病毒在田间的活性和持久性,说明氧化铁有作为商业化Cp GV产品助剂的潜力,能提高Cp GV对苹果蠹蛾防治效果。4.喂食半致死剂量的Cp GV病毒后,研究敏感性和抗性苹果蠹蛾三龄幼虫热休克蛋白hsp70-1和hsp70-2转录水平变化。与未处理对照相比,在Cp S幼虫中Cp GV-M和-S感染引起hsp70-1和hsp70-2转录水平先增加,后降低。与对照比较,Cp GV-S感染引起Cp RR1幼虫hsp70-1和hsp70-2转录水平在侵染前期保持稳定,至第7天时转录水平增加了3倍多。对比hsp70s在Cp S和Cp RR1幼虫转录时相,发现Cp GV诱导hsp70s上调在Cp RR1幼虫中延迟了大约2天。当Cp GV在苹果蠹蛾幼虫体内成功建立侵染时,hsp70s转录水平上调。综上所述,七个Cp GV分离株对不同抗性苹果蠹蛾种群的毒力差异明显,其中高毒力分离株为Cp GV可持续防治苹果蠹蛾提供了病毒资源。根据基因组类群特异性SNP分布和频率计算未知分离株基因型组成和遗传多样性的方法可推广到其他(杆状)病毒。低剂量氧化铁可保护Cp GV免受紫外线伤害,具有发展成Cp GV助剂的潜力。热休克蛋白hsp70s与Cp GV在苹果蠹蛾幼虫体内成功建立侵染有关。理解杆状病毒种群结构和遗传适应性之间的关系,以及合理利用病毒保护剂提高田间防效,有助于改善当前Cp GV抗性治理和生物防治持续发展。
龙羽燕[5](2020)在《家蚕核型多角体病毒广西毒株gp64基因的遗传多态性及致病力相关性研究》文中提出家蚕核型多角体病毒(Bombyx mori nucleopolyhedrovirus,BmNPV)是引起家蚕血液型脓病的病原,每年都给养蚕业带来巨大的经济损失。BmNPV属于α杆状病毒属,在感染宿主时形成出芽型病毒粒子(Budded virion,BV)和包涵体衍生型病毒粒子(Occlusion-derived virion,ODV),GP64蛋白是BV特有的一种囊膜糖蛋白,是病毒入侵宿主细胞的关键因子,也是病毒出芽成熟及二次感染所必须的病毒组分。掌握GP64蛋白的结构和功能,了解BmNPV毒株的流行传播规律,才能为BmNPV致病性的进一步研究,以及家蚕血液型脓病的防治研究提供参考。为了掌握BmNPV gp64基因的遗传进化特点,探明BmNPV与致病性相关的分子机制,本研究对广西不同蚕区采集的28个BmNPV野毒株和一个实验室重组r BmNPV毒株的gp64基因进行克隆测序及序列分析,并测定多个毒株的LD50,结果如下:1、所测序的广西BmNPV毒株gp64基因的ORF共有1590 bp、1593 bp和1599 bp三种长度,分别编码529、530以及532个氨基酸残基,造成序列大小不一致的原因是出现核苷酸的缺失与插入突变,这些缺失或插入突变都位于GP64蛋白的N端信号肽序列中。2、对比BmNPV野毒株的LD50发现,gp64基因长度为1593 bp以及1599 bp的毒株LD50大小相近,但比gp64基因长度为1590 bp毒株的小,流行毒株的毒力存在差异,说明野外BmNPV群体具有多种基因型,保持着丰富的遗传多样性。3、相同蚕区同时期采集的BmNPV毒株,gp64基因核苷酸同源性在99.6%~100%之间,推导氨基酸同源性均为100%,说明在同一时期同一蚕区短期流行的BmNPV毒株变异程度较小;相同蚕区不同时期采集的BmNPV毒株,gp64基因核苷酸同源性在98.9%~99.7%之间,推导氨基酸同源性98.9%~100%之间,说明BmNPV毒株经过较长时间的流行,出现的变异程度较大。4、根据gp64基因构建的NJ遗传进化树显示,除T3株外的国外BmNPV参考株都独立位于CladeⅡ的一个亚群中,与所有国内BmNPV参考株明显不在一个大群,说明BmNPV的遗传进化具有地域特点。从2019年采集的16个广西BmNPV毒株的流行分布地域图可以看出病毒的流行分布集中性与分散性并存,说明广西蚕区BmNPV存在局部范围内和远距离之间的传播与流行。
王亚杰[6](2020)在《酪氨酸代谢通路在舞毒蛾感病后爬高行为中的作用研究》文中研究说明舞毒蛾核型多角体病毒(Lymantria dispar multiple nucleopolyhedrovirus,Ld MNPV))感染舞毒蛾幼虫后,能够引起感病舞毒蛾幼虫显着上爬行为(国外俗称树顶病)。这种生物学现象受到了很多专家学者的关注,但其机理尚不明确。本研究通过病毒、真菌、细菌三种病原分别侵染舞毒蛾,对其进行行为观察和转录组分析比较,研究病毒与其他病原物感染舞毒蛾后行为与基因表达差异。通过对感染病毒的舞毒蛾与非感病舞毒蛾在转录组数据上的差异进行分析,推测与能量代谢有关。并选取与能量代谢相关三羧酸循环通路的中的部分基因,利用ds RNA干扰其特定基因的表达,探讨二者对树顶病的影响。取得研究结果如下:1.病毒、真菌、细菌三种病原物处理的舞毒蛾幼虫,观察72h内的上爬高度,从中可以发现,感染病毒的幼虫上爬明显,与感染细菌和感染真菌的相比都有显着差异(P<0.05),与感染真菌的相比没有显着差异,但真菌组与细菌组无显着差异。2.转录组测序鉴定舞毒蛾感染病毒、细菌、真菌72h时体内的差异表达基因,得到了44994条Unigene。感染金黄色葡萄球菌的幼虫与感染Ld MNPV的相比,有308个基因上调表达,有263个基因下调表达。感染金龟子绿僵菌的幼虫与感染Ld MNPV的相比,有623个基因上调表达,413个基因下调表达。感染金龟子绿僵菌的幼虫与感染金黄色葡萄球菌的相比,有417个基因上调表达,177个基因下调表达。3.在两两比较时,KEGG富集分析表示Toll和IMD信号通路是最富集的通路。除此之外较为富集的通路有过氧化物酶体、戊糖和葡萄糖醛酸的相互转化和细胞色素P450的异生素代谢通路、溶酶体通路、丙酮酸代谢通路。4.感染病毒与感染细菌或真菌的幼虫相比,烟酸和烟酰胺代谢路、丙酮酸代谢通路、柠檬酸循环通路、氧化磷酸化通路、胆固醇代谢通路这些通路都与能量代谢相关,并且其中基因上调表达,说明了Ld MNPV诱导舞毒蛾产生上爬行为与能量代谢有相关性;而且神经方面相关的神经活性配体-受体相互作用通路中也有较多基因上调表达,也说明了Ld MNPV诱导舞毒蛾产生上爬行为与神经系统有相关性。5.选取舞毒蛾与能量代谢相关的酪氨酸代谢通路的中的基因hpd与gstz1来验证其感染病毒后上爬行为是否与能量代谢相关。饲喂干扰hpd与gstz1基因的ds RNA并不引起舞毒蛾的死亡,而且也不会提前或延迟舞毒蛾核型多角体病毒杀死舞毒蛾的时间。但饲喂干扰hpd基因的ds RNA的Ld MNPV感染后幼虫相比于只饲喂舞毒蛾核型多角体病毒的幼虫,其受感染幼虫爬高能力显着低于只饲喂病毒的幼虫。6.饲喂干扰gstz1基因的ds RNA的Ld MNPV感染后幼虫,相比于只饲喂舞毒蛾核型多角体病毒,gstz1基因被干扰幼虫爬高能力极显着低于对照。以上结果说明舞毒蛾幼虫受到病毒感染后出现上爬行为,与感染真菌和细菌后的行为差异明显,为病毒感染引起的特殊生物学现象。转录组学数据分析表明,舞毒蛾幼虫受病毒感染后其能量代谢与神经系统相关通路基因表达量显着高于受细菌或真菌感染组。研究进一步发现舞毒蛾能量代谢相关酪氨酸代谢通路的中hpd与gstz1基因与该上爬行为的产生具有一定的相关性。
刘鹏飞[7](2020)在《昆虫保幼激素和核型多角体病毒膜受体的筛选》文中提出1.昆虫保幼激素膜上介导受体的筛选保幼激素(juvenile hormone,JH)是一种倍半萜类激素,由位于昆虫脑后的咽侧体合成并分泌,主要调控昆虫蜕皮变态和生殖等。JH发挥功能依赖于其核受体Met(Methoprene-tolerant)介导的基因组转录途径和细胞膜依赖的非基因组信号转导通路。JH核基因组转录途径中,JH结合核受体Met并与Taiman(Tai)形成转录复合体调控下游基因转录,如:Cdc、Mcm、Kr-h1、Ago等,继而调控飞蝗(Locusta migratoria)卵黄发生。其中Kr-h1是JH通路早期响应基因,能够响应JH诱导并介导L.migratoria卵黄原蛋白(Vitellogenin,Vg)合成。近年研究表明,JH能够通过G蛋白偶联受体(G Protein-Coupled Receptors,GPCRs)和受体酪氨酸激酶(receptor protein tyrosine kinase,RTKs)触发非基因组信号转导通路,与核基因组转录途径协同调控JH响应基因转录,但是相关研究并不深入。据此,本论文以JH依赖性飞蝗卵黄发生为研究对象,虫体RNAi沉默GPCR和RTK后分析JH核基因组转录途径介导的下游Kr-h1、Vg A、Vg B基因转录以及JH触发的胞内第二信使系统,以期筛选出介导JH非基因组信号转导通路的膜上受体。运用RNAi、q RT-PCR方法,虫体沉默25个GPCR基因,2个RTK基因能够显着抑制JH上调表达的Kr-h1、Vg A和Vg B基因。这些基因包括:GPCR class A成员:NYR-1、adrenergic receptor-1、CCKR-1、oxytocin-1、oxytocin-2、NTSR-1、5-HTR-1、5-HTR-2、5-HTR-3和5-HTR-4;class B成员:PTHR-1、PTHR-2、PTHR-3、PTHR-4、Methuselah-like-1、Methuselah-like-2、Methuselah-like-3、Methuselah-like-4、Methuselah-like-5和ADHR-1;class D成员:p H regulator-1;class F成员:Frizzled-1、Frizzled-2、Frizzled-3;RTK家族成员:FGFR-like-1和FGFR-like-2。并对其功能进行了分类,推测FGFR-like-1和FGFR-like-2可能参与了Akt通路;adrenergic receptor-1,CCKR-1,5-HTR-1,5-HTR-2,5-HTR-3,5-HTR-4,PTHR-1,PTHR-2,PTHR-3,PTHR-4和ADHR-1可能参与c AMP-PKA信号通路;oxytocin-1,oxytocin-2,NYR-1和NTSR-1可能参与DAG-PKC通路。而Frizzled-1,Frizzled-2,Frizzled-3属于膜受体Fz,直接参与Wnt-β-caterin信号通路。其他基因类型与功能尚不明确。通过ELISA测定JH诱导胞内c AMP浓度结果显示,ds RNA注射沉默FGFR-like-1和FGFR-like-2能够显着抑制JH上调的胞内c AMP浓度,说明FGFR-like-1和FGFR-like-2能够介导JH触发的胞内c AMP第二信使通路。再以c AMP变化量为标准,用ELISA筛选出两个基因。本论文研究结果初步筛选出能够介导JH信号通路的25个GPCR基因和2个RTK基因,可以为进一步开展JH非基因组信号通路研究奠定基础,丰富JH信号通路调控昆虫生殖的研究进展。2.核型多角体病毒膜受体的筛选核型多角体病毒(Nucleopolyhedrovirus,NPV)属于杆状病毒,是一类具有囊膜包裹的双链环状DNA病毒,在自然界中以节肢动物作为专一性宿主进行感染和传播。杆状病毒不仅可以因为其特异性和对人体无害性而作为杀虫剂被广泛应用,在真核表达系统、基因治疗、以及基因工程疫苗等方面也都有重要的实际应用。NPV具有双相复制周期,会产生两种具有不同形态和不同功能的病毒粒子,即包涵体来源型病毒(Occlusion derived virus,ODV)和出芽型病毒(Budded virus,BV)。ODV包涵于多角体中,负责宿主个体之间的感染过程;BV由ODV产生,负责宿主体内各组织间的感染过程。感染过程从多角体进入宿主体内开始,多角体在宿主中肠碱性环境中释放ODV,ODV进入宿主上皮细胞,在细胞核进行病毒的转录和翻译,新生的BV粒子从基底膜出芽引起全身感染。在继发感染过程中,BV粒子的囊膜蛋白起到了至关重要的作用,由BV囊膜蛋白结合宿主细胞表面膜受体从而进入宿主细胞。这个囊膜蛋白在组Ⅰ核型多角体病毒中是GP64,而在组Ⅱ中是F蛋白。目前对于BV如何进入宿主细胞内一直存有疑问,与BV囊膜蛋白结合的膜受体也一直不明。C型凝集素是一类钙依赖性糖结合蛋白,其功能是作为模式识别受体识别非己成分,调节细胞的吞噬作用和粘连反应,增强细胞黑化作用和包囊作用,抑制或加速病毒在体内的增殖。在本实验组前期的工作中表明BV能够诱导棉铃虫C型凝集素(Helicoverpa armigera Lectin,Ha-lectin)的表达BV囊膜融合蛋白F(NPVF)与分泌性C型凝集素存在相互作用,我们推断棉铃虫细胞膜上可能存在特异的受体蛋白,能够与C型凝集素互作,通过招募C型凝集素,递呈BV到细胞表面受体,增强或抑制病毒粒子的内吞。综上所述,本论文通过棉柃虫(Helicoverpaarmigera)为研究对象,围绕BV囊膜蛋白与C型凝集素与宿主细胞膜受体三者之间的关系展开对核型多角体病毒膜受体的筛选工作。本论文使用的棉铃虫核型多角体病毒(Helicoverpa armigera nucleopolyhedrovirus,Ha NPV)属于组Ⅱ。本论文在本实验室早期对Ha-lectin与NPVF关系的研究的基础上,对其质谱结果进行了初期筛选,筛选出了疑似膜受体VHDLR。之后利用免疫荧光、Co-IP、Western blot、RNAi等细胞生物学、分子生物学和遗传学的方法,对VHDLR进行鉴定和分析。确定了VHDLR是与BV囊膜蛋白NPVF结合的宿主细胞表面膜受体。推测三者之间的作用机制为Ha-lectin在血淋巴组织中捕获BV病毒粒子,将其呈递到宿主细胞膜表面,使BV囊膜蛋白NPVF与宿主细胞膜受体VHDLR结合,从而使BV病粒子进入宿主细胞内。并且通过制备VHDLR各组分的表达载体,在H-O细胞系内验证了VHDLR各组分与Ha-lectin、NPVF的关系。确定NPVF是与VHDLR内的C Domain结合,Ha-lectin不与VHDLR结合。对于揭示杆状病毒进入宿主细胞的机制是全新的研究,也为接下来筛选组Ⅰ的GP64的膜受体的研究奠定了基础。
王承锐[8](2020)在《春尺蠖新病毒株的鉴定及其生物活性的研究》文中指出为了开发新型的生物杀虫剂,我们从自然死亡的春尺蠖幼虫分离到新病毒株。通过电镜观察,初步确认该新病毒株是一种质型多角体病毒,通过食料给毒法测定其对春尺蠖3龄幼虫和思茅松毛虫3龄幼虫的致死作用,并研究新病毒株与NPV(Nuclear polyhedrosis virus)之间的增效作用。结果如下:(1)新毒株病毒的包涵体为多角体,一个多角体内包埋多个粒病毒粒子。在形态上与其他CPV无明显差别,确定其为质型多角体病毒。命名为春尺蠖质型多角体病毒(Apocheima cinerarius cypovirus,ApciCPV)。(2)ApciCPV对春尺蠖3龄幼虫有很强的毒力,半致死浓度(LC50)为1.42×104 OBs/mL。当ApciNPV+ApciCPV复配剂感染春尺蠖3龄幼虫时,相比ApciNPV单剂,半致死时间(LT50)缩短0.5~10.9 d、最终致死率提高6.7%~43.3%。一定浓度的ApciCPV对ApciNPV有增强作用,并且这种增强作用与复配剂中ApciCPV的浓度成正比。(3)ApciCPV对思茅松毛虫3龄幼虫有很强的毒力,半致死浓度(LC50)为6.62×105 OBs/mL。当DekiNPV+ApciCPV复配剂感染思茅松毛虫3龄幼虫时,相比DekiNPV单剂,半致死时间(LT50)缩短0.5~20 d、最终致死率提高2.8%~66.2%。一定浓度的ApciCPV对DekiNPV有增强作用,并且这种增强作用与复配剂中ApciCPV的浓度成正比。(4)高浓度的ApciCPV与NPV之间存在增效作用,且与复配剂中ApciCPV的浓度成正比,当复配剂中NPV浓度的增加时,增效作用会逐渐减弱最后表现为相加作用;低浓度的ApciCPV与NPV之间则更多表现为相加作用和拮抗作用。
李红[9](2020)在《EoNPV基因组分析及对茶尺蠖两近缘种毒力差异研究》文中研究指明茶尺蠖核型多角体病毒(Ectropis obliqua nucleopolyhedrosis virus,EoNPV)是一种重要的病原类微生物,可以感染茶尺蠖幼虫致其死亡。茶园中的主要食叶性害虫有茶尺蠖和灰茶尺蠖两个近缘种,二者形态和食性相似,长期以来都被当做一个种研究。因此与茶尺蠖相关的研究结果可能与真实情况间存在差异,特别是以EoNPV作为生物农药防治茶园中的茶尺蠖和灰茶尺蠖时,不同种间的防治效果会存在差异。因此,本文利用三代Oxford Nanopore测序技术测定了茶尺蠖核型多角体病毒的全基因组序列,采用叶盘饲毒法比较了茶尺蠖病毒对茶尺蠖和灰茶尺蠖的LD50(median lethal dose;半致死剂量),明确EoNPV对茶尺蠖两近缘种的毒力差异,进而比较了前期课题筛选出的高效毒株(H-EoNPV)与现有(原始)毒株(EoNPV)对灰茶尺蠖的致死率和LD50的差异,为茶尺蠖两近缘种的田间科学防治提供依据。1.测定和分析了茶尺蠖核型多角体病毒的全基因序列。从测序结果看,EoNPV基因组全长为132,043 bp,其中G+C的占总含量的37.51%,对EoNPV基因组功能基因的预测结果显示,共预测到106个开放阅读框(ORF),基因组中ORFs区域的G+C含量为38.96%,与整体的G+C含量相近。目前共有78条基因完成注释。在EoNPV基因组中共测到3个同源重复区域(hrs1,hrs2,hrs3)。通过分析EoNPV的基因组可能有两个ORF为EoNPV所独有,目前尚未在其他的杆状病毒中找到同源序列。2.比较明确了茶尺蠖核型多角体病毒对3龄茶尺蠖和灰茶尺蠖幼虫的毒力差异。研究结果显示:(1)在相同剂量和时间条件下处理茶尺蠖幼虫的死亡率要高于灰茶尺蠖;(2)EoNPV对茶尺蠖的LD50和LT50(median lethal time;半致死时间)均小于对灰茶尺蠖的。EoNPV对灰茶尺蠖的LD50是对茶尺蠖的28.9倍,且在2×107(PIB/头)剂量处理时,EoNPV对灰茶尺蠖的LT50约为对茶尺蠖的2倍,在2×106(PIB/头)剂量处理下,EoNPV对灰茶尺蠖的LT50约为对茶尺蠖的1.35倍。上述结果表明,EoNPV对茶尺蠖的毒力高于灰茶尺蠖。3.比较了茶尺蠖病毒高效毒株(H-EoNPV)和原始毒株(EoNPV)对3龄灰茶尺蠖的毒力差异。研究结果显示:(1)茶尺蠖病毒高效毒株的毒力与原始毒株间的毒力存在差异。(2)H-EoNPV毒株对灰茶尺蠖的致死率高于EoNPV毒株。(3)EoNPV毒株饲喂灰茶尺蠖后的LD50和LT50均高于H-EoNPV毒株。EoNPV对灰茶尺蠖的LD50是茶尺蠖的3.1-25.8倍。上述结果表明,H-EoNPV毒株对灰茶尺蠖的毒力明显高于EoNPV毒株,H-EoNPV毒株对不同地理种群的灰茶尺蠖间的毒力也存在差异。
卫丽丽[10](2019)在《AcMNPV侵染宿主细胞的进程中Ac-PK2和BmK IT的功能和机制研究》文中研究说明苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(Autographa california multiple nuclear polyhedrosis virus,AcMNPV)是一种模式杆状病毒,也是微生物杀虫剂。Bm K IT是一种来源于东亚钳蝎的昆虫特异性毒素蛋白,本实验室前期构建了重组杆状病毒AcMNPV-BmK IT,并发现其可以在感染早期加速宿主细胞中P53蛋白的表达,上调凋亡抑制因子p35基因的转录表达,具有更高的细胞毒性和抗虫活性。为了明确AcMNPV-BmK IT侵染宿主细胞后具体的作用机制,我们通过转录组学的方法分析了AcMNPV-BmK IT的侵染对Sf9细胞基因转录水平的影响。转录组数据的分析结果显示病毒侵染会对宿主细胞的翻译过程产生影响,因为杆状病毒侵染会激活宿主细胞中一系列的抗病毒反应,其中包括降低总蛋白的合成来抑制病毒的增殖。简而言之,病毒侵染后宿主细胞会激活eIF2α激酶来磷酸化eIF2α,抑制蛋白质翻译的起始过程,降低总蛋白的合成来抵抗病毒侵染。而AcMNPV表达的Ac-PK2蛋白可以抑制eIF2α激酶的激活,营救翻译起始。为了明确过表达Ac-PK2蛋白是否会提高AcMNPV的杀虫活性及其作用机制,本研究中我们构建了重组病毒AcMNPV-PK2-EGFP/RFP,并进行了深入的研究。在此基础上,探讨了过表达Ac-PK2蛋白的重组病毒与AcMNPV-BmK IT共侵染后抗虫活性是否具有协同效应。本研究分为四部分:第一部分转录组测序筛选AcMNPV-BmK IT侵染后Sf9细胞中的差异表达基因为分析AcMNPV-BmK IT的抗虫机制,了解AcMNPV-BmK IT侵染对Sf9细胞转录水平的影响,我们在AcMNPV和AcMNPV-BmK IT侵染72 h后提取了Sf9细胞的RNA并进行反转录,通过Solexa测序进行了转录水平的分析。三个处理组中共鉴定出61269个转录本,其中在对照组control(C)的Sf9细胞中检测到54189个转录本,在AcMNPV(AT)侵染的Sf9细胞中检测到57979个转录本,在AcMNPV-BmK IT(ABT)侵染的Sf9细胞中检测到56575个转录本。对分析到的蛋白质序列进行KOG功能分类预测,共有7711个蛋白被注释上26种KOG分类。对蛋白进行KEGG注释,其中有4874个蛋白共注释上4211个KO,2853个基因共注释上339个pathway。总共鉴定出957个差异表达基因:第一组(ABT相对AT,ABT V.S.AT)中共分析到38个表达上调的基因,135个表达下调的基因;第二组(ABT相对C,ABT V.S.C)中共分析到129个表达上调的基因,84个表达下调的基因;在最后一组(AT相对于C,AT V.S.C)中,分析到459个表达上调的基因,112个表达下调的基因。我们从这些差异表达基因中选取了11个基因进行了qPCR验证,qPCR的结果与转录组测序的结果基本一致。差异表达基因的KEGG、GO功能分析的结果显示AcMNPV和AcMNPV-BmK IT对宿主细胞中DNA复制、蛋白质翻译等细胞过程相关的基因表达有影响。文献调研发现,宿主细胞可以通过降低总蛋白合成来抵抗病毒侵染,而AcMNPV表达的Ac-PK2蛋白可以营救蛋白翻译,那么过表达Ac-PK2蛋白是否可以提高AcMNPV的细胞毒力和抗虫活性,我们进行了进一步的研究。第二部分AcMNPV-PK2-EGFP对宿主细胞能量代谢和子代病毒产量的影响首先,利用Bac-to-Bac昆虫杆状病毒重组表达系统构建了过表达Ac-PK2蛋白的重组病毒AcMNPV-PK2-EGFP。用5 MOI的重组病毒AcMNPV-PK2-EGFP侵染Sf9细胞,荧光显微镜观察与Western blot分析结果表明,PK2-EGFP融合蛋白表达量从24 h开始随着侵染时间的延长而逐渐增加,并在72 h达到最高水平。相较于野生型病毒AcMNPV处理组,重组病毒AcMNPV-PK2-EGFP侵染48 h后Sf9细胞内eIF2α磷酸化逐渐减少。葡萄糖消耗的检测结果发现,AcMNPV-PK2-EGFP处理组能量消耗增加,葡萄糖的消耗速率在36、48、60 h显着高于野生型病毒处理组,分别是野生型病毒处理组的1.11倍、1.2倍、1.34倍。AcMNPV-PK2-EGFP处理组培养液中乳酸积累从48 h开始显着低于野生型病毒处理组,但与未处理组无明显差异。细胞内的ATP含量在病毒侵染后48、60、72 h,即Ac-PK2蛋白开始过表达之后有一个显着的增加,分别是野生型病毒处理组的1.12倍、1.09倍、1.10倍。AcMNPV-PK2-EGFP处理组己糖激酶(hexokinase,HK)的活性在48、60 h显着高于未处理组,分别是未处理组的1.21倍、1.16倍。噬斑实验的结果显示AcMNPV-PK2-EGFP处理组在病毒侵染后48、72 h,子代病毒的产量显着高于野生型病毒处理组,缺失ac-pk2基因的重组病毒侵染会导致子代病毒的产量降低。这些结果表明重组病毒AcMNPV-PK2-EGFP的侵染可以对宿主细胞能量代谢产生影响,为子代病毒的复制产生提供更有利的环境。既然重组病毒AcMNPV-PK2-EGFP可以增加子代病毒的产量,那么AcMNPV-PK2-EGFP的侵染是否会加速宿主细胞的凋亡,我们进行了进一步的研究。第三部分AcMNPV-PK2-RFP加速宿主细胞凋亡的机制分析流式细胞术分析结果显示,重组病毒AcMNPV-PK2-EGFP侵染Sf9细胞48、72h后,细胞凋亡比例显着高于野生型病毒处理组。为研究AcMNPV-PK2-EGFP加速宿主细胞凋亡的机制,本节中我们构建了带红色荧光蛋白的过表达Ac-PK2的重组病毒AcMNPV-PK2-RFP。ROS活性检测结果显示AcMNPV-PK2-RFP处理组Sf9细胞中活性氧的水平在48、72 h显着高于野生型病毒处理组。线粒体膜电位检测发现AcMNPV-PK2-RFP处理组在病毒侵染后24、48、72 h细胞内绿色荧光的强度均高于野生型病毒处理组,说明AcMNPV-PK2-RFP处理组线粒体膜电位低于野生型病毒处理组。Western blot的结果表明AcMNPV-PK2-RFP处理组SfP53蛋白的表达在病毒侵染后48、60、72 h均显着高于野生型病毒处理组,是野生型病毒处理组的1.16倍、1.39倍、1.79倍。接着,我们通过Western blot检测了细胞色素c在线粒体和胞质的分布情况,结果显示两种病毒处理组均会影响细胞色素c的释放,相较于野生型病毒处理组而言,AcMNPV-PK2-RFP的处理组线粒体中的细胞色素c明显减少,细胞色素c的释放提前,从24 h开始逐渐增加。根据以上结果,我们推测AcMNPV和AcMNPV-PK2-RFP侵染Sf9细胞后通过刺激线粒体凋亡信号通路加速宿主细胞的凋亡,因为过表达Ac-PK2蛋白的重组病毒可以增加子代病毒的产量,新产生的子代病毒会对细胞进行二次侵染,从而加速了AcMNPV-PK2-RFP处理组线粒体凋亡途径的激活。第四部分AcMNPV-PK2-EGFP的抗虫活性及侵染甜菜夜蛾幼虫的机制分析前面两部分的实验结果表明,过表达Ac-PK2蛋白的重组病毒AcMNPVP-PK2-EGFP/RFP可以调控宿主细胞能量代谢,帮助子代病毒复制,加速宿主细胞的凋亡。那么重组病毒AcMNPVP-PK2-EGFP是否具有更高的抗虫活性?我们进行了虫体水平的实验。qPCR的结果显示重组病毒AcMNPV-PK2-EGFP侵染后可以上调Ac-pk2基因在中肠组织和神经索组织的表达,AcMNPV-PK2-EGFP与AcMNPV-BmK IT共侵染后,可以增加BmK IT在中肠组织和神经索组织的表达,并且在病毒侵染的早期,解毒相关基因sod、p450、cat的表达也会受到影响。Western blot的结果显示AcMNPV处理组和AcMNPV-BmK IT+AcMNPV处理组,eIF2α的磷酸化随着侵染时间逐渐增加,AcMNPV-PK2-EGFP处理组eIF2α的磷酸化在病毒侵染后4h达到最大值,8至12 h逐渐减少。AcMNPV-PK2-EGFP+AcMNPV-BmK IT处理组,eIF2α的磷酸化在病毒侵染后8 h达到最大值,12 h开始减少,说明相较于野生型病毒,过表达Ac-PK2蛋白的重组病毒的侵染可以减少甜菜夜蛾幼虫中肠组织eIF2a的磷酸化,有利于子代病毒的复制。同时,我们观察到各病毒处理组P53蛋白在病毒侵染1 h后开始表达,病毒侵染4、8、12 h后AcMNPV-BmK IT+AcMNPV-PK2-EGFP处理组P53蛋白的表达显着高于AcMNPV、AcMNPV-PK2-EGFP、AcMNPV-BmK IT+AcMNPV病毒处理组,说明重组病毒AcMNPV-PK2-EGFP和AcMNPV-BmK IT共处理可以加速甜菜夜蛾幼虫中肠组织细胞的凋亡。酚氧化酶活性检测的结果显示,AcMNPV-BmK IT+AcMNPV-PK2-EGFP处理组酚氧化酶活性在4 h达到最大值,分别是AcMNPV、AcMNPV-PK2-EGFP、AcMNPV-BmK IT+AcMNPV处理组4 h的1.58倍、1.25倍、1.18倍。我们统计了对照组及病毒处理组甜菜夜蛾幼虫的平均体重、致死率、蛹化率、羽化率,四个处理组甜菜夜蛾幼虫的死亡率分别为54.78%、76.6%、83.3%、90%,对应的蛹化率分别为33.3%、26.67%、20%、16.67%,羽化率分别为20%、16.67%、13.3%、10%。可以看到,相较于AcMNPV处理组,AcMNPV-PK2-EGFP处理组的幼虫致死率显着增高,蛹化率、羽化率降低,说明AcMNPV-PK2-EGFP具有更高的抗虫活性。相较于AcMNPV+AcMNPV-BmK IT处理组,AcMNPV-PK2-EGFP+AcMNPV-BmK IT处理组甜菜夜蛾幼虫的羽化时间推迟,蛹化率和羽化率均降低,最终的致死率显着提高。综合上述结果,AcMNPV-PK2-EGFP相较于野生型病毒而言具有较高的抗虫活性,AcMNPV-PK2-EGFP和AcMNPV-Bm K IT共处理会使得抗虫活性进一步升高。这部分的结果在虫体水平上解析了重组杆状病毒AcMNPV-PK2-EGFP、AcMNPV-BmK IT经口服感染后通过影响解毒相关基因(sod、p450、cat)的表达、酚氧化酶的活性,调控中肠组织eIF2α的磷酸化以及凋亡相关蛋白P53的表达来增加宿主昆虫的死亡率,明确了重组病毒AcMNPV-PK2-EGFP和AcMNPV-BmK IT抗虫活性存在协同效应。综上所述,本研究通过转录组学的方法分析了AcMNPV-Bm K IT侵染对Sf9细胞转录水平的影响,鉴定了900多个差异表达基因,并进行了qPCR验证。我们构建了过表达Ac-PK2蛋白的重组病毒AcMNPV-PK2-EGFP/RFP,在细胞水平上分析了AcMNPV侵染宿主过程中过表达Ac-PK2蛋白对宿主细胞能量代谢和子代病毒产量的影响,明确了重组病毒AcMNPV-PK2-EGFP通过影响线粒体凋亡信号通路加速宿主细胞凋亡的机制,并且在虫体水平上分析了重组病毒AcMNPV-PK2-EGFP的抗虫活性及作用机制,明确了AcMNPV-PK2-EGFP与AcMNPV-Bm K IT共侵染可以增强AcMNPV-BmK IT的抗虫活性。本研究为杆状病毒的抗虫机制研究及应用提供了实验依据,对科学防治鳞翅目害虫具有重要意义。
二、棉铃虫核型多角体病毒侵染机制的研究(论文开题报告)
(1)论文研究背景及目的
此处内容要求:
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景,再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题,并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例:
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
(2)本文研究方法
调查法:该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法:用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法:通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法:通过调查文献来获得资料,从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法:依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法:对研究对象进行“质”的方面的研究,这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法:通过具体的数字,使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法:运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法:这是社会科学用来分析社会现象的一种方法,从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法:通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、棉铃虫核型多角体病毒侵染机制的研究(论文提纲范文)
(1)棉铃虫YTHDF1基因的表达模式及在核型多角体病毒侵染中的作用(论文提纲范文)
1 材料与方法 |
1.1 材料 |
1.2 方法 |
1.2.1 棉铃虫YTHDF1基因的鉴定与序列分析 |
1.2.2 棉铃虫YTHDF1基因的时空表达谱分析 |
1.2.3 Hear NPV侵染棉铃虫后YTHDF1基因表达测定 |
1.2.4 YTHDF1基因对Hear NPV侵染棉铃虫的作用分析 |
1.3 数据分析 |
2 结果与分析 |
2.1 棉铃虫YTHDF1基因序列分析 |
2.2 YTHDF1基因在棉铃虫不同发育阶段的表达 |
2.3 YTHDF1基因在棉铃虫幼虫和成虫组织内的表达 |
2.4 Hear NPV侵染对YTHDF1基因表达的影响 |
2.5 RNA干扰YTHDF1基因对Hear NPV侵染的影响 |
3 讨论 |
(2)鳞翅目昆虫抗病毒免疫反应的研究进展(论文提纲范文)
1 昆虫对病毒入侵的防御 |
1.1 围食膜的防御作用 |
1.2 中肠的防御作用 |
2 昆虫的细胞免疫和体液免疫 |
3 鳞翅目昆虫的抗病毒免疫途径 |
3.1 RNAi途径 |
3.2 细胞的自噬及凋亡途径 |
3.3 免疫信号转导通路 |
3.3.1 Toll信号通路 |
3.3.2 Imd信号通路 |
3.3.3 JAK-STAT信号通路 |
3.3.4 STING信号通路 |
3.3.5 其它免疫通路和基因 |
4 鳞翅目昆虫抗病毒免疫研究的制约因素 |
5 结语与展望 |
(3)核型多角体病毒侵染及其与宿主免疫系统互作的研究进展(论文提纲范文)
1 核型多角体病毒生活史 |
2 核型多角体病毒侵染特征 |
2.1 包涵体溶解与ODV释放 |
2.2 ODV与中肠细胞 |
2.3 BV感染宿主细胞 |
2.4 BV从宿主细胞中释放 |
2.5 ODV的组装 |
3 NPV与昆虫免疫 |
3.1 NPV侵染与免疫信号通路 |
3.2 昆虫血淋巴与NPV的免疫互作 |
3.3 NPV和宿主凋亡的发生 |
4 NPV与宿主的其他互作过程 |
5 总结与展望 |
(4)苹果蠹蛾颗粒体病毒CpGV的7个分离株的基因组结构与毒力差异机制研究(论文提纲范文)
摘要 |
ABSTRACT |
第一章 文献综述 |
1.1 苹果蠹蛾的发生与分布 |
1.2 苹果蠹蛾的生物防治方法 |
1.3 苹果蠹蛾颗粒体病毒分类状地位和组织病理学 |
1.4 苹果蠹蛾颗粒病田间应用 |
1.5 苹果蠹蛾颗粒体病毒的田间抗性发生 |
1.6 Illumina第二代测序在杆状病毒中的应用 |
1.7 CpGV紫外线保护剂 |
1.8.热休克蛋白70 |
1.9 .研究依据、目的和意义 |
第二章 七个苹果蠹蛾颗粒体病毒的毒力差异和多样性 |
2.2 引言 |
2.3 材料与方法 |
2.3.1 待试昆虫 |
2.3.2 病毒扩繁 |
2.3.3 毒力测定 |
2.3.4 Cp GV分离株中pe38 基因序列比较 |
2.4 结果 |
2.4.1 CpGV分离株的毒力差异 |
2.4.2 Pe38基因PCR产物分析 |
2.4.3 多重序列比对pe38基因扩增片段 |
2.5 讨论 |
第三章 七个苹果蠹蛾颗粒体病毒的遗传构成 |
3.2 引言 |
3.3 材料和方法 |
3.3.1 CpGV分离株及扩繁 |
3.3.2 基因组测序和组装 |
3.3.3 系统发育分析 |
3.3.4 单核苷酸多态性分析 |
3.4 结果和讨论 |
3.4.1 基因组组装和系统发育 |
3.4.2 基因组注释和比较 |
3.4.3 Pe38基因重复序列多态性 |
3.4.4 SNP分类和Cp GV分离株基因组组成 |
第四章 苹果蠹蛾颗粒体病毒紫外线保护剂的研究 |
4.2 引言 |
4.3 材料与方法 |
4.3.1 供试虫源、Cp GV-ZY及氧化铁 |
4.3.2 试验方法 |
4.3.2.1 氧化铁对苹果蠹蛾幼虫死亡率影响 |
4.3.2.2 不同浓度氧化铁混合Cp GV-ZY后进行UVB照射处理 |
4.3.2.3 不同浓度氧化铁混合Cp GV-ZY后进行自然光处理 |
4.3.3 数据分析 |
4.4 结果与分析 |
4.4.1 氧化铁对苹果蠹蛾幼虫死亡率影响 |
4.4.2 不同浓度氧化铁对Cp GV-ZY免受UVB辐射损害的效果 |
4.4.3 不同浓度氧化铁对Cp GV-ZY免受强日照辐射损害的效果 |
4.5 讨论 |
第五章 感染不同Cp GVs的苹果蠹蛾hsp70s转录水平差异 |
5.2 引言 |
5.3 材料与方法 |
5.3.1 昆虫与病毒 |
5.3.2 半致死剂量(LD50)测定 |
5.3.3 收集RT-PCR的样品 |
5.3.4 测定苹果蠹蛾热休克蛋白转录水平 |
5.4 结果 |
5.4.1 半致死剂量(LD50) |
5.4.2 定量热休克蛋白70转录水平 |
5.5 讨论 |
第六章 结论和讨论 |
附录 |
参考文献 |
致谢 |
个人简历 |
(5)家蚕核型多角体病毒广西毒株gp64基因的遗传多态性及致病力相关性研究(论文提纲范文)
摘要 |
ABSTRACT |
1 前言 |
1.1 杆状病毒的分类 |
1.2 杆状病毒的感染复制 |
1.3 杆状病毒的基因组成与表达 |
1.4 家蚕核型多角体病毒 |
1.4.1 家蚕血液型脓病 |
1.4.2 家蚕围食膜防御屏障 |
1.4.3 家蚕抗BmNPV相关蛋白和基因 |
1.4.4 BmNPV囊膜糖蛋白GP64的结构和功能 |
1.5 杆状病毒的应用 |
1.6 本研究的目的和意义 |
2 材料与方法 |
2.1 材料 |
2.1.1 BmNPV毒株和实验动物 |
2.1.2 仪器 |
2.1.3 试剂(盒)商品 |
2.1.4 基础试剂配制 |
2.1.5 引物设计 |
2.2 方法 |
2.2.1 BmNPV多角体的纯化 |
2.2.2 BmNPV基因组DNA提取 |
2.2.3 PCR扩增gp64基因 |
2.2.4 PCR扩增产物电泳 |
2.2.5 目的片段的纯化回收 |
2.2.6 感受态细胞制备 |
2.2.7 目的基因克隆 |
2.2.8 重组质粒提取 |
2.2.9 重组质粒鉴定 |
2.2.10 目的基因测序与序列拼接 |
2.2.11 序列比对和进化树分析 |
2.2.12 19年毒株流行分布图 |
2.2.13 BmNPV毒株的LD_(50)测定 |
3 结果与分析 |
3.1 PCR扩增目的片段 |
3.2 重组质粒双酶切鉴定 |
3.3 基因ORF测序长度 |
3.4 gp64基因ORF序列同源性比较 |
3.5 gp64基因的遗传进化树 |
3.6 广西BmNPV毒株的流行分布 |
3.7 BmNPV gp64 基因ORF单核苷酸多态性分析 |
3.8 密码子偏好性分析 |
3.9 选择压力分析 |
3.10 LD_(50)测定结果 |
4 讨论与结论 |
4.1 讨论 |
4.2 结论 |
参考文献 |
附录1:本研究测序的广西BmNPV毒株gp64基因核苷酸序列比对 |
附录2:本研究测序的广西BmNPV毒株gp64基因推导氨基酸序列比对 |
致谢 |
攻读硕士学位期间发表的论文 |
(6)酪氨酸代谢通路在舞毒蛾感病后爬高行为中的作用研究(论文提纲范文)
摘要 |
ABSTRACT |
第一章 文献综述 |
1.1 寄生物调控寄主行为的研究 |
1.2 杆状病毒简介 |
1.3 RNAi概述 |
1.3.1 简介 |
1.3.2 RNAi作用机制 |
1.4 舞毒蛾简介 |
1.5 杆状病毒诱导昆虫上爬行为的研究进展 |
1.6 研究的目的和意义 |
第二章 感染不同病原舞毒蛾幼虫行为差异与转录组比较分析 |
2.1 实验材料与方法 |
2.1.1 舞毒蛾的饲养 |
2.1.2 病毒、真菌和细菌 |
2.1.3 不同病原物感染舞毒蛾以及行为观察的方法 |
2.1.4 RNA提取与建库测序 |
2.1.5 生物信息分析流程 |
2.1.6 转录组测序质量评估 |
2.1.7 差异表达基因聚类分析、火山图分析 |
2.1.8 差异表达基因GO富集分析 |
2.1.9 差异表达基因的KEGG分类注释和富集分析 |
2.1.10 荧光定量PCR验证转录组测序数据 |
2.2 结果 |
2.2.1 行为观察实验 |
2.2.2 测序质控总览 |
2.2.3 差异表达基因聚类分析、火山图分析 |
2.2.4 差异表达基因GO富集分析 |
2.2.5 KEGG分类注释和富集分析 |
2.2.6 荧光定量PCR验证转录组测序数据 |
2.3 讨论 |
第三章 hpd和 gstz1 基因与Ld MNPV调控的舞毒蛾上爬行为相关性的研究 |
3.1 实验材料与方法 |
3.1.1 舞毒蛾的饲养 |
3.1.2 病毒、质粒与菌株 |
3.1.3 生化试剂 |
3.1.4 实验所用引物 |
3.1.5 舞毒蛾总RNA提取 |
3.1.6 cDNA第一条链的合成 |
3.1.7 聚合酶链式反应 |
3.1.8 凝胶电泳分析 |
3.1.9 目的片段回收 |
3.1.10 目的片段与载体连接 |
3.1.11 感受态细胞的制备 |
3.1.12 质粒的转化 |
3.1.13 蓝白斑检测 |
3.1.14 重组质粒的筛选与鉴定 |
3.1.15 碱裂解法提取质粒 |
3.1.16 限制性内切酶反应 |
3.1.17 dsRNA的诱导表达 |
3.1.18 dsRNA的提取 |
3.1.19 dsRNA的纯化与鉴定 |
3.1.20 Ld MNPV病毒悬液的制备 |
3.1.21 上爬行为实验 |
3.1.22 目的基因表达量的荧光定量PCR检测 |
3.1.23 统计分析 |
3.2 实验结果 |
3.2.1 L4440-hpd与 L4440-gstz1 质粒表达载体的构建 |
3.2.2 HT115-L4440-hpd与 HT115-L4440-gstz1 表达菌株的构建 |
3.2.3 dsRNA的表达鉴定 |
3.2.4 目的基因的干扰效果 |
3.2.5 喂食dsRNA对死亡率的影响 |
3.2.6 喂食dsRNA对死亡幼虫在爬高能力的影响 |
3.3 讨论 |
第四章 结论与讨论 |
4.1 结论 |
4.2 讨论 |
参考文献 |
附录 常用溶液试剂配制方法 |
致谢 |
个人简介 |
(7)昆虫保幼激素和核型多角体病毒膜受体的筛选(论文提纲范文)
摘要 |
ABSTRACT |
第一章 筛选和鉴定飞蝗JH的膜上受体 |
1.引言 |
1.1 保幼激素信号通路与昆虫发育调控 |
1.1.1 保幼激素 |
1.1.2 保幼激素核信号通路 |
1.1.3 保幼激素非基因组信号通路 |
1.2 G蛋白偶联受体和受体酪氨酸激酶 |
1.3 研究意义与研究方法 |
2.材料与方法 |
2.1 昆虫 |
2.2 昆虫的解剖 |
2.3 实验试剂 |
2.4 主要实验仪器 |
2.5 引物设计与合成 |
2.6 总RNA的提取 |
2.7 mRNA反转录 |
2.8 双链RNA的合成与纯化 |
2.9 飞蝗内源JH剥夺与JHA处理 |
2.10 RNA干扰 |
2.11 Real-time qPCR |
2.12 cAMP ELISA检测 |
3.结果 |
3.1 激素诱导条件优化 |
3.2 候选基因的筛选过程 |
3.3 cAMP检测结果 |
4.讨论 |
5.结论 |
第二章 筛选和鉴定棉铃虫HaNPV的膜受体 |
1.引言 |
1.1 棉铃虫核型多角体病毒 |
1.2 C型凝集素对棉铃虫核型多角体病毒的影响 |
1.3 研究意义与研究内容 |
2.材料与方法 |
2.1 实验对象 |
2.2 菌株 |
2.3 细胞 |
2.4 实验试剂及配置方法 |
2.5 主要试验仪器 |
2.6 引物设计与合成 |
2.7 棉铃虫总RNA提取 |
2.8 cDNA的合成 |
2.9 基因扩增 |
2.10 凝胶电泳检测 |
2.11 使用PCR产物回收试剂盒回收目的片段 |
2.12 pET-32a质粒与PCR回收产物的双酶切 |
2.13 载体pET-32a质粒与目的基因的体外连接 |
2.14 转化感受态大肠杆菌细胞 |
2.15 菌落PCR |
2.16 质粒提取与双酶切检验 |
2.17 重新转化到表达感受态细胞并挑选成功转化菌体 |
2.18 少量重组蛋白诱导表达与蛋白检测 |
2.19 大量重组蛋白诱导表达,不可溶蛋白过柱与蛋白检测 |
2.20 层析 |
2.21 多克隆抗体制备 |
2.22 Western-blotting |
2.23 免疫细胞化学 |
2.24 免疫共沉淀 |
2.25 双链合成及RNA干扰实验 |
2.26 Real-time qPCR |
2.27 Anti-VHDLR封闭实验 |
3.结果 |
3.1 重组蛋白的表达与纯化和多克隆抗体的制备 |
3.2 检测BV感染对VHDLR表达的影响 |
3.3 VHDLR抗体封闭对BV感染的影响 |
3.4 VHDLR、Ha-lectin与 NPVF共定位 |
3.5 VHDLR、Ha-lectin与 NPVF的互作 |
4.讨论 |
5.结论 |
参考文献 |
致谢 |
(8)春尺蠖新病毒株的鉴定及其生物活性的研究(论文提纲范文)
摘要 |
Abstract |
缩略语表 |
1 引言 |
1.1 质型多角体病毒 |
1.1.1 质型多角体病毒的分类 |
1.1.2 质型多角体病毒的结构及生化特性 |
1.1.3 质型多角体的寄主域/交叉感染 |
1.1.4 质型多角体的侵染与发生 |
1.1.5 质型多角体病毒对昆虫的影响 |
1.1.6 质型多角体病毒与病原体的相互作用 |
1.1.7 质型多角体病毒的应用 |
1.2 春尺蠖及春尺蠖核型多角体病毒 |
1.3 思茅松毛虫及思茅松毛虫核型多角体病毒 |
1.4 研究目的与意义 |
1.5 研究内容 |
1.6 技术路线 |
2 材料与方法 |
2.1 材料 |
2.1.1 供试昆虫 |
2.1.2 供试病毒 |
2.1.3 仪器与设备 |
2.1.4 试剂及溶液配制 |
2.2 方法 |
2.2.1 春尺蠖质型多角体病毒(ApciCPV)新病毒株鉴定 |
2.2.2 ApciCPV对春尺蠖的毒力测定 |
2.2.3 复配剂(ApciNPV+ApciCPV)的毒力测定 |
2.2.4 ApciCPV对思茅松毛虫的毒力测定 |
2.2.5 复配剂(DekiNPV+ApciCPV)的毒力测定 |
3 结果与分析 |
3.1 春尺蠖新病毒株的鉴定 |
3.1.1 春尺蠖新病毒株的光学显微镜观察 |
3.1.2 春尺蠖新病毒株的鉴定 |
3.2 ApciCPV对春尺蠖的生物活性 |
3.2.1 ApciCPV对春尺蠖3龄幼虫的致死作用 |
3.2.2 ApciCPV感染春尺蠖3龄幼虫的死亡率与时间的关系 |
3.3 ApciCPV与ApciNPV的复配后的增效作用 |
3.3.1 复配剂(ApciNPV+ApciCPV)对春尺蠖3龄幼虫的毒力 |
3.3.2 复配剂(ApciNPV+ApciCPV)感染春尺蠖3龄幼虫的死亡率与时间的关系 |
3.3.3 复配剂(ApciNPV+ApciCPV)对春尺蠖3龄幼虫的致死中时间 |
3.3.4 ApciCPV与ApciNPV对春尺蠖3龄幼虫的互作分析 |
3.4 ApciCPV对思茅松毛虫的生物活性 |
3.4.1 ApciCPV对思茅松毛虫3龄幼虫的致死作用 |
3.4.2 ApciCPV感染思茅松毛虫3龄幼虫的死亡率与时间的关系 |
3.5 ApciCPV与DekiNPV的复配后的增效作用 |
3.5.1 复配剂(DekiNPV+ApciCPV)对思茅松毛虫3龄幼虫的毒力 |
3.5.2 复配剂(DekiNPV+ApciCPV)感染思茅松毛虫3龄幼虫的死亡率与时间的关系 |
3.5.3 复配剂(DekiNPV+ApciCPV)对春尺蠖3龄幼虫的致死中时间 |
3.5.4 ApciCPV与DekiNPV对思茅松毛虫3龄幼虫的互作分析 |
4 结论与讨论 |
4.1 结论 |
4.2 讨论 |
4.2.1 ApciCPV的寄主域 |
4.2.2 ApciCPV对核型多角体病毒的增效作用 |
致谢 |
参考文献 |
作者简介 |
(9)EoNPV基因组分析及对茶尺蠖两近缘种毒力差异研究(论文提纲范文)
摘要 |
abstract |
主要符号对照表 |
第一章 绪论 |
1.1 杆状病毒的研究概况 |
1.1.1 昆虫病毒 |
1.1.2 杆状病毒的应用 |
1.1.3 杆状病毒基因组的研究进展 |
1.2 茶树害虫病毒的研究进展 |
1.2.1 茶树害虫病毒的种类与现状 |
1.2.2 茶尺蠖核型多角体病毒的研究与应用 |
1.3 茶尺蠖两近缘种的发生与防治 |
1.3.1 近缘种昆虫的区分方法 |
1.3.2 茶尺蠖两近缘种的研究进展 |
1.3.3 茶尺蠖两近缘种的危害与防治进展 |
1.4 研究目的与内容 |
1.4.1 研究目的与意义 |
1.4.2 研究内容 |
1.4.3 研究技术路线 |
第二章 EoNPV全基因组序列与分析 |
2.1 材料与方法 |
2.1.1 供试病毒 |
2.1.2 EoNPV病毒DNA的提取 |
2.1.3 基因组数据的分析方法 |
2.2 结果与分析 |
2.2.1 EoNPV的全基因组信息 |
2.2.2 EoNPV的结构基因 |
2.2.3 转录特异性基因 |
2.2.4 DNA复制和修饰基因 |
2.2.5 同源重复区域 |
2.2.6 EoNPV在杆状病毒中的进化 |
2.3 讨论 |
第三章 EoNPV对茶尺蠖两近缘种的毒力差异 |
3.1 材料与方法 |
3.1.1 供试虫源与病毒 |
3.1.2 毒力测定试验方法 |
3.1.3 毒力测定试验数据统计与分析 |
3.2 结果与分析 |
3.2.1 茶尺蠖两近缘种感染EoNPV后的死亡动态 |
3.2.2 EoNPV对茶尺蠖两近缘种的LD_(50)和LT_(50) |
3.3 讨论 |
第四章 EoNPV及其高毒力毒株对灰茶尺蠖的毒力研究 |
4.1 材料与方法 |
4.1.1 供试虫源与病毒 |
4.1.2 毒力测定试验方法 |
4.1.3 毒力测定试验数据统计与分析 |
4.2 结果与分析 |
4.2.1 灰茶尺蠖(YQ)感染EoNPV两毒株后的死亡动态 |
4.2.2 灰茶尺蠖(GX)感染EoNPV两毒株后的死亡动态 |
4.2.3 EoNPV两毒株对灰茶尺蠖的LD_(50)和LT_(50) |
4.3 讨论 |
第五章 结论 |
5.1 结论 |
5.1.1 茶尺蠖核型多角体病毒的基因组信息 |
5.1.2 EoNPV对茶尺蠖两近缘种的毒力差异 |
5.1.3 高效毒株H-EoNPV及原始毒株EoNPV对灰茶尺蠖的毒力差异 |
5.2 展望 |
参考文献 |
附录A |
附录B |
致谢 |
作者简历 |
(10)AcMNPV侵染宿主细胞的进程中Ac-PK2和BmK IT的功能和机制研究(论文提纲范文)
中文摘要 |
ABSTRACT |
第一章 文献综述 |
1 杆状病毒 |
1.1 杆状病毒概述 |
1.2 杆状病毒的生活史 |
1.3 杆状病毒的分类 |
1.4 昆虫杆状病毒表达载体系统 |
1.5 昆虫杆状病毒作为生物杀虫剂的应用 |
2 重组杆状病毒研究进展 |
2.1 重组杆状病毒的构建策略 |
2.2 重组蝎昆虫毒素杆状病毒的研究进展 |
2.3 重组杆状病毒的安全性 |
3 杆状病毒与宿主细胞的互作分析 |
3.1 杆状病毒的siRNA抑制因子 |
3.2 宿主细胞的凋亡和杆状病毒的凋亡抑制因子 |
3.3 宿主细胞降低蛋白质合成和杆状病毒营救蛋白质翻译 |
3.4 宿主细胞中抗病毒相关信号通路 |
4 昆虫免疫的研究进展 |
4.1 昆虫免疫概述 |
4.2 昆虫的抗病毒免疫 |
5 杆状病毒侵染对宿主细胞能量代谢的影响 |
5.1 昆虫细胞能量代谢 |
5.2 杆状病毒侵染对昆虫细胞能量代谢的影响 |
6 杆状病毒pk2 基因的研究进展 |
6.1 ac-pk2 基因 |
6.2 杆状病毒pk2 基因同源性分析 |
6.3 杆状病毒PK2 蛋白的结构和功能 |
7 论文设计思路 |
7.1 研究内容及创新意义 |
7.2 实验技术流程 |
第二章 转录组测序筛选AcMNPV-Bm K IT侵染后Sf9 细胞中的差异表达基因 |
1 引言 |
2 实验材料 |
2.1 细胞株和病毒株 |
2.2 主要实验试剂 |
2.3 主要仪器设备 |
3 实验方法 |
3.1 Sf9 细胞的培养 |
3.2 蚀斑检测 |
3.3 细胞处理 |
3.4 RNA提取和反转录 |
3.5 Solexa转录组测序 |
3.6 qPCR实验 |
4 实验结果 |
4.1 Solexa测序和原始数据质量预处理 |
4.2 De novo拼接和CDS预测 |
4.3 Unigene与公共数据库比较 |
4.4 Unigene的 KOG、GO、KEGG注释 |
4.5 表达基因的丰度分析 |
4.6 差异表达基因分析 |
4.7 qPCR验证差异表达基因 |
5 讨论 |
第三章 重组杆状病毒AcMNPV-PK2-EGFP可以提高宿主细胞蛋白质合成并影响能量代谢 |
1 引言 |
2 实验材料 |
2.1 菌株和质粒 |
2.2 细胞株和病毒株 |
2.3 主要实验试剂 |
2.4 主要仪器设备 |
3 实验方法 |
3.1 重组中间载体的构建 |
3.1.1 重组中间载体pFB-D-PK2-EGFP的构建 |
3.1.2 重组中间载体pFB-D-Renilla-RFP的构建 |
3.2 重组杆粒Bacmid-PK2-EGFP和 Bacmid-Renilla-RFP的获得 |
3.3 重组病毒AcMNPV-PK2-EGFP和 AcMNPV-Renilla-RFP的获得 |
3.4 qPCR检测Sf9细胞中ac-pk2基因转录表达的变化 |
3.5 Western blot检测Sf9 细胞中磷酸化e IF2α的变化 |
3.6 外源蛋白海肾荧光素酶活性检测 |
3.7 总蛋白含量的检测 |
3.8 葡萄糖消耗速率的检测 |
3.9 上清中乳酸含量的检测 |
3.10 细胞内ATP含量检测 |
3.11 己糖激酶HK的活性检测 |
3.12 缺失型病毒的构建及子代病毒产量的检测 |
4 实验结果 |
4.1 获得重组病毒AcMNPV-PK2-EGFP |
4.2 获得重组病毒AcMNPV-Renilla-RFP |
4.3 重组病毒AcMNPV-PK2-EGFP可在宿主细胞内过表达Ac-PK2 |
4.4 过表达Ac-PK2 蛋白可抑制Sf9 细胞中e IF2α的磷酸化 |
4.5 重组病毒AcMNPV-PK2-EGFP侵染对蛋白质翻译的影响 |
4.6 重组病毒AcMNPV-PK2-EGFP侵染对Sf9 细胞能量代谢的影响 |
4.7 重组病毒AcMNPV-PK2-EGFP侵染宿主细胞可促进子代病毒增殖 |
5 讨论 |
第四章 重组病毒AcMNPV-PK2-RFP通过影响线粒体途径促进宿主细胞的凋亡 |
1 引言 |
2 实验材料 |
2.1 菌株和质粒 |
2.2 细胞株和病毒株 |
2.3 主要实验试剂 |
2.4 主要仪器设备 |
3 实验方法 |
3.1 构建重组病毒AcMNPV-PK2-RFP |
3.1.1 重组中间载体的构建 |
3.1.2 获得重组病毒AcMNPV-PK2-RFP |
3.2 蚀斑实验检测病毒滴度 |
3.3 流式细胞术检测细胞凋亡 |
3.4 细胞内活性氧ROS水平检测 |
3.5 Western blot检测P53蛋白表达量的变化 |
3.6 胞质和线粒体分离 |
3.7 Western blot检测细胞色素c在胞质和线粒体的分布 |
3.8 线粒体膜电位(MMP)检测 |
4 实验结果 |
4.1 获得重组病毒AcMNPV-PK2-RFP |
4.2 重组病毒AcMNPV-PK2-EGFP侵染可加速宿主细胞凋亡进程 |
4.3 重组病毒AcMNPV-PK2-RFP的侵染对Sf9细胞内ROS水平的影响 |
4.4 重组病毒AcMNPV-PK2-RFP侵染后Sf9细胞中线粒体膜电位(MMP)的分析 |
4.5 重组病毒AcMNPV-PK2-RFP的侵染对细胞色素c在胞质和线粒体的分布的影响 |
4.6 重组病毒AcMNPV-PK2-RFP的侵染对SfP53 蛋白表达的影响 |
5 讨论 |
第五章 重组病毒AcMNPV-PK2-EGFP对甜菜夜蛾幼虫的抗虫活性和机制分析 |
1 引言 |
2 实验材料 |
2.1 病毒和幼虫 |
2.2 主要实验试剂 |
2.3 主要仪器设备 |
3 实验方法 |
3.1 甜菜夜蛾幼虫的饲养及感染 |
3.2 qPCR检测ac-pk2在被感染的甜菜夜蛾幼虫中肠组织、表皮组织和神经索组织的表达 |
3.3 qPCR检测重组病毒AcMNPV/AcMNPV-PK2-EGFP与AcMNPV-BmK IT共处理,BmKIT在甜菜夜蛾幼虫中肠组织、表皮组织和神经索组织的表达 |
3.4 qPCR检测解毒相关基因在被感染的甜菜夜蛾幼虫中肠组织的表达 |
3.5 酶标仪检测病毒侵染的甜菜夜蛾幼虫体内酚氧化酶的活性 |
3.6 Western blot分析病毒侵染的甜菜夜蛾幼虫中肠组织中凋亡相关蛋白P53的表达 |
3.7 Western blot分析病毒侵染的甜菜夜蛾幼虫中肠组织中eIF2a磷酸化的情况 |
3.8 统计对照组和病毒处理组甜菜夜蛾幼虫的平均体重,死亡率,蛹化率,羽化率 |
4 实验结果 |
4.1 ac-pk2 在病毒侵染的甜菜夜蛾幼虫中肠、表皮、神经索组织的转录表达情况 |
4.2 BmK IT在AcMNPV-PK2-EGFP和AcMNPV-Bm KIT共侵染的甜菜夜蛾幼虫中肠、表皮、神经索组织转录水平的表达情况 |
4.3 解毒相关基因p450、sod、cat在病毒侵染的甜菜夜蛾幼虫中肠组织的表达情况 |
4.4 重组病毒的侵染对甜菜夜蛾幼虫体内酚氧化酶活性的影响 |
4.5 重组病毒的侵染对甜菜夜蛾幼虫中肠组织P53蛋白表达的影响 |
4.6 重组病毒的侵染对甜菜夜蛾幼虫中肠组织eIF2α磷酸化的影响 |
4.7 重组病毒的侵染对甜菜夜蛾幼虫平均体重,致死率,蛹化率,羽化率的影响 |
5 讨论 |
总结与展望 |
参考文献 |
英文缩略语表 |
攻读学位期间取得的研究成果 |
致谢 |
个人简介及联系方式 |
四、棉铃虫核型多角体病毒侵染机制的研究(论文参考文献)
- [1]棉铃虫YTHDF1基因的表达模式及在核型多角体病毒侵染中的作用[J]. 申忠健,刘彦君,祝琳,田志强,刘孝明,刘小侠. 植物保护学报, 2021(05)
- [2]鳞翅目昆虫抗病毒免疫反应的研究进展[J]. 李洁,李洁,于乾龙,郑桂玲,张彬,李长友. 环境昆虫学报, 2021(05)
- [3]核型多角体病毒侵染及其与宿主免疫系统互作的研究进展[J]. 黄博,朱梦瑶,丘霈珊,张若男,张文庆,余小强,卢玉珍. 环境昆虫学报, 2021(02)
- [4]苹果蠹蛾颗粒体病毒CpGV的7个分离株的基因组结构与毒力差异机制研究[D]. 樊江斌. 西北农林科技大学, 2020
- [5]家蚕核型多角体病毒广西毒株gp64基因的遗传多态性及致病力相关性研究[D]. 龙羽燕. 广西大学, 2020(07)
- [6]酪氨酸代谢通路在舞毒蛾感病后爬高行为中的作用研究[D]. 王亚杰. 西北农林科技大学, 2020(03)
- [7]昆虫保幼激素和核型多角体病毒膜受体的筛选[D]. 刘鹏飞. 河南大学, 2020(02)
- [8]春尺蠖新病毒株的鉴定及其生物活性的研究[D]. 王承锐. 内蒙古农业大学, 2020(02)
- [9]EoNPV基因组分析及对茶尺蠖两近缘种毒力差异研究[D]. 李红. 中国农业科学院, 2020
- [10]AcMNPV侵染宿主细胞的进程中Ac-PK2和BmK IT的功能和机制研究[D]. 卫丽丽. 山西大学, 2019(01)