一、腺病毒2型E1B55KD癌蛋白与hDaxx相互作用（论文文献综述）
伍超凡[1]（2020）在《DAXX抑制胃癌的干细胞特性及上皮-间充质转化的机制研究》文中进行了进一步梳理目的:DAXX（Death domain-associated protein）作为凋亡调节因子和转录调节因子,在人体的多种生理、病理反应中具有十分重要的功能。目前围绕DAXX调节细胞凋亡的报道已非常广泛,其中涉及的分子机制也已进行了十分深入的研究。近年来,人们发现DAXX在肿瘤的发生发展过程中同样具有调节功能,然而该分子在胃癌中的作用尚不明确。因此,本研究意在探索并揭示DAXX在胃癌发生、发展中所发挥的作用。方法:（1）我们利用Western blot检测了 DAXX在83对临床病人的胃癌组织和癌旁组织中的表达,然后根据病人的临床分期进行分类和统计,以此来探究DAXX的临床意义。（2）为检测DAXX对胃癌细胞的影响,我们选择了三株人胃癌细胞系:MKN45、N87和AGS,并对DAXX和肿瘤干细胞标志物CD44、CD24、OCT4的表达进行检测。除此之外,我们利用慢病毒在人胃癌细胞系中进行DAXX过表达或敲低,检测DAXX对CD44、CD24、OCT4表达量的影响。（3）我们在人胃癌细胞系中对DAXX进行过表达和敲低,并检测胃癌细胞迁移、侵袭能力的变化。同时检测DAXX对胃癌细胞上皮-间充质转化（EMT）的影响。（4）为探究DAXX通过何种方式影响胃癌细胞的EMT。我们检测了过表达和敲低DAXX后的胃癌细胞中SNAI、ZEB、GRHL2等EMT相关因子表达的变化;（5）我们利用IP、ChIP、免疫荧光等技术,进一步探究DAXX影响人胃癌细胞中EMT相关因子的分子机制。（6）我们对DAXX过表达和敲低后的胃癌细胞进行了裸鼠皮下的肿瘤异种移植实验、软琼脂集落形成实验以及化疗药物的耐药实验,以探究DAXX对胃癌细胞潜在致瘤性以及干细胞特征的影响。结果:（1）通过检测83对临床样本中DAXX的表达量,我们发现在不同分期的胃癌病人样本中,DAXX相对表达量存在显着差异,且从Ⅰ期至Ⅳ期呈下降趋势。（2）q-PCR结果显示,在人胃癌细胞系MKN45、N87和AGS中,DAXX的表达量与肿瘤干细胞标志物CD44、OCT4的表达量呈负相关。DAXX过表达可抑制CD44和OCT4的表达,同时促进CD24的表达,并使CD44high/CD24low细胞所占比例显着降低,而敲低则诱导相反的效应。（3）划痕愈合实验和Transwell的实验结果说明,DAXX过表达对胃癌细胞的迁移、侵袭能力具有抑制作用,同时抑制胃癌细胞的EMT。DAXX的敲低则对其具有促进作用。（4）在过表达或敲低DAXX的胃癌细胞中检测EMT相关因子,我们发现DAXX抑制SNAI等EMT促进因子的表达,对GRHL2等EMT抑制因子的表达具有促进作用。（5）DAXX可与HDAC1结合并形成复合物,将HDAC1迁移到细胞核,HDAC1在细胞核中通过降低组蛋白H3 K14位点的乙酰化水平,抑制SNAI3的转录,从而抑制胃癌细胞的EMT。（6）DAXX抑制胃癌细胞的集落形成能力,并使胃癌细胞对化疗药物更加敏感。裸鼠皮下成瘤实验显示,DAXX过表达抑制了 MKN45的在裸鼠皮下的成瘤能力;AGS在1×107个细胞的注射量下不具备成瘤能力,然而,在AGS细胞中对DAXX敲低后,可形成肉眼可见的肿瘤。结论:DAXX在晚期胃癌样本中的相对表达量下调,其在胃癌细胞的表达量与干细胞标志物呈负相关趋势。DAXX抑制胃癌细胞的迁移、侵袭能力、自我更新能力以及潜在致瘤能力,同时减少胃癌细胞对化疗药物的耐受。DAXX与HDAC1形成复合物,并将HDAC1迁移到细胞核,HDAC1在细胞核中通过对组蛋白H3K14位点去乙酰化,抑制SNAI3的转录,从而抑制胃癌细胞的EMT。综上所述,DAXX作为一种肿瘤抑制因子,抑制胃癌的潜在致瘤性和转移能力。
时培殿[2]（2020）在《E3泛素连接酶TRAIP调控先天性免疫的机制研究》文中研究表明泛素化修饰（Ubiquitination,UB）和小泛素样修饰（Small Ubiquitin-like Modifier,SUMO）是高度保守的蛋白翻译后修饰方式,可深度影响病毒在感染细胞内的增殖过程。肿瘤坏死因子受体相关因子（TRAF）互作蛋白（TRAIP）是RING型E3泛素连接酶,在天然免疫、DNA损伤与修复等途径中发挥重要功能。本研究以猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）感染细胞为模型,研究了宿主E3泛素连接酶TRAIP与PRRSV病毒蛋白的相互作用、病毒可通过调控宿主蛋白翻译后修饰,抑制先天性免疫信号通路,促进PRRSV增殖的机制。此外,通过生物质谱挖掘发现TRAIP泛素化修饰的底物蛋白DEx D/H-box家族RNA解旋酶39A（DDX39A）,明确了TRAIP对DDX39A泛素化修饰类型,TRAIP在调控DDX39A抑制天然免疫中发挥的作用,揭示了TRAIP在免疫生物学中的新机理。主要结果如下:（1）TRAIP对PRRSV增殖的影响及其互作病毒蛋白的筛选从PRRSV感染的3D4/21细胞转录组数据中筛选出发挥潜在重要作用的E3泛素连接酶TRAIP,进一步明确PRRSV感染上调TRAIP的表达。通过过表达及敲减实验证明TRAIP促进PRRSV增殖,抑制PRRSV诱导的I型干扰素产生。免疫荧光和免疫荧光结果分析表明TRAIP与PRRSV nsp1α亚基相互作用,TRAIP的LZ结构域与nsp1α的PCPα结构域是两者互作的关键结构域,碱基突变及功能分析发现TRAIP的LZ结构域K205是两者互作的关键位点。（2）PRRSV nsp1α影响TRAIP蛋白翻译后修饰和核质分布PRRSV nsp1α抑制TRAIP的K48多聚泛素化修饰和SUMO修饰。nsp1α抑制TRAIP（WT）多聚泛素化修饰,但对TRAIP（K205R）无影响,暗示nsp1α的抑制作用依赖于两者的互作。位点突变互作实验表明,nsp1α对TRAIP SUMO化修饰的抑制作用并不受两者结合位点突变的影响。TRAIP的双重蛋白翻译后修饰调节作用导致TRAIP细胞质富集。PRRSV nsp1α可以通过抑制TRAIP的SUMO化修饰影响TRAIP细胞核定位。另外,PRRSV nsp1α通过抑制TRAIP K48多聚泛素化修饰,阻滞TRAIP泛素蛋白酶体途径降解,维持TRAIP的丰度及稳定性。（3）PRRSV nsp1α协同TRAIP进一步抑制I型干扰素的产生先前研究表明TRAIP可以促进TBK1 K48多聚泛素化修饰负调控I型干扰素的产生,此外,nsp1α已被鉴定为IFN拮抗剂。本研究通过免疫荧光和免疫共沉淀实验发现nsp1α介导胞质中TRAIP的富集,并与TRAIP及TBK1形成三元复合物,进一步促进了TBK1 K48多聚泛素化和降解,从而拮抗TBK1-IRF3-IFN信号通路。nsp1α和TRAIP共表达较单独表达对IFN-β的抑制效应更为显着。（4）TRAIP-DDX39A负调控RNA病毒诱导的I型干扰素应答通过质谱挖掘TRAIP互作蛋白DDX39A,其是TRAIP K63位泛素化修饰底物蛋白。DDX39A可以与特定先天免疫相关因子（TRAF3、TRAF6、MAVS）的mRNA结合,促进这些抗病毒转录物的核滞留,下调其蛋白质表达,从而负调控I型干扰素的产生。通过仙台病毒（SeV）、水泡口炎病毒（VSV）的细胞感染模型进一步发现,这些RNA病毒感染可以通过上调TRAIP蛋白的表达,促进TRAIP靶向DDX39A的K63多聚泛素化修饰,促进DDX39A与TRAF3、TRAF6、MAVS mRNA结合,抑制其表达,进而抑制I型干扰素的产生。综上,PRRSV nsp1α对TRAIP的双重翻译后修饰调控可促进TRAIP在细胞质中的募集,导致TBK1 K48多聚泛素化上调和降解,从而拮抗TBK1-IRF3-IFN信号通路。我们的研究从病毒蛋白与宿主E3泛素酶TRAIP互作修饰调控角度提出PRRSV逃逸IFN信号通路促进PPRSV增殖的新模型,深化了对PRRSV逃逸宿主先天性免疫机理的认识。研究还发现,入核的TRAIP可介导DDX39A K63多聚泛素化,促进DDX39A与抗病毒转录物TRAF3、TRAF6和MAVS结合,阻滞相关mRNA的核输出和胞质中蛋白的表达,抑制IFN-β的产生。这进一步丰富了RNA病毒感染通过E3泛素连接酶TRAIP的表达调控逃逸宿主先天性免疫,促进病毒增殖的新途径。
杨春华[3]（2019）在《双调控并荷载SPAG9基因shRNA的溶瘤腺病毒联合多西他赛治疗前列腺癌的实验研究》文中研究说明第一部分构建双调控并荷载SPAG9基因shRNA的溶瘤腺病毒目的:构建双调控并荷载精子相关抗原9（sperm associated antigen 9,SPAG9）短发卡RNA（Short hairpin RNA,shRNA）的溶瘤腺病毒DD3-ZD55-SPAG9并验证调控SPAG9蛋白表达的效果。方法:1.将包含DD3基因启动子和SPAG9基因shRNA的载体质粒p DD3-ZD55-SPAG9shRNA与骨架质粒p BHGE3（含有腺病毒右臂序列）通过Lipofectamine TM2000共转染至HEK-293细胞内,包装成溶瘤腺病毒DD3-ZD55-SPAG9。2.琼脂糖电泳验证正确后大量扩增病毒,通过Cs Cl密度梯度离心法纯化,半数组织细胞感染剂量（Tissue culture infective dose,TCID50）法测定滴度。3.通过Western Blot检测DD3-ZD55-SPAG9对PC-3和DU145细胞SPAG9基因的沉默效果。结果:1.成功构建溶瘤腺病毒DD3-ZD55-SPAG9,经扩增纯化后,DD3-ZD55-SPAG9的病毒滴度为9.46×10^8 pfu/ml。2.Western Blot结果显示DD3-ZD55-SPAG9可以有效沉默PC-3和DU145细胞内SPAG9蛋白的表达,与对照组相比,差异存在统计学意义（P<0.05）。结论:成功构建溶瘤腺病毒DD3-ZD55-SPAG9,并可以有效沉默PC-3和DU145细胞内SPAG9基因的表达第二部分溶瘤腺病毒DD3-ZD55-SPAG9联合多西他赛体外治疗去势抵抗性前列腺癌目的:观察溶瘤腺病毒DD3-ZD55-SPAG9联合多西他赛（Docetaxel,DTX）在体外对去势抵抗性前列腺癌的治疗效果。方法:1.结晶紫染色和CCK-8观察各组对前列腺癌PC-3和DU145与正常前列腺细胞WPMY-1细胞的毒性作用和增殖抑制效果。2.划痕实验和Transwell侵袭实验检测各组对PC-3和DU145细胞迁移侵袭能力的抑制。3.Hoechst-33258染色实验检测各组PC-3和DU145细胞的凋亡。4.Western Blot实验检测PC-3和DU145细胞内SPAG9,侵袭和凋亡相关蛋白的表达。结果:1.结晶紫染色结果:各病毒治疗组对PC-3和DU145细胞的细胞毒性呈时间和滴度依赖性,DTX对PC-3和DU145细胞呈浓度和时间依赖性,各组处理48小时后,高浓度的DTX（>4ng/ml）,高滴度的ZD55-SPAG9（MOI>20）会对WPMY-1细胞产生毒性作用,而DD3-ZD55-SPAG9在MOI>50时才会对WPMY-1细胞产生毒性作用,提示DD3-ZD55-SPAG9较对照病毒具有更高的安全性。2.CCK-8结果:随病毒和药物作用时间的延长,对前列腺癌细胞的增殖抑制效果均逐渐增强,且随病毒滴度和药物浓度的升高,对细胞的增殖抑制效果也逐渐增强。感染48小时后,联合组对前列腺癌细胞的增殖抑制效果明显高于各单一治疗组。各处理组48小时后WPMY-1细胞增殖较对照组无明显差异。3.划痕实验结果:24小时后,在PC-3和DU145细胞内,各治疗组的划痕愈合面积百分比均低于PBS组,且联合组划痕愈合面积明显低于单一治疗组。4.Transwell实验结果:48小时后,在PC-3和DU145细胞内,各治疗组穿透小室膜的细胞数均低于PBS组,联合组穿透细胞数明显低于单一治疗组。5.Hoechst-33258染色结果:48小时后,各治疗组的细胞凋亡率均高于PBS组,且联合组细胞凋亡率明显高于单一组。6.Western Blot实验结果显示:各治疗组内SPAG9蛋白表达均低于PBS组,侵袭相关蛋白E-cadherin的表达均高于PBS组,Vimentin和MMP-2的表达均低于PBS组,凋亡相关蛋白caspase-3和caspase-8的表达均高于PBS组。联合组内SPAG9,Vimentin,MMP-2的表达量明显低于单治疗组,同时E-cadherin、caspase-3和caspase-8的表达量明显高于单治疗组。结论DD3-ZD55-SPAG9可以在体外有效抑制前列腺癌细胞的增殖和迁移侵袭能力,并可以有效诱导PC-3和DU145凋亡,效果略低于ZD55-SPAG9,但对WPMY-1细胞具有更高的安全性。对前列腺癌细胞侵袭能力的抑制作用,其机制之一可能是沉默SPAG9基因表达后,通过调控与上皮细胞间质化（Epithelial-mesenchymal transition,EMT）进程相关蛋白,上调E-cadherin,下调Vimentin,MMP-2的表达有关。对前列腺癌细胞凋亡诱导机制可能是通过促进caspase8与caspase3介导的内源性凋亡实现,联合使用多西他赛可起协同作用,增强DD3-ZD55-SPAG9的抗肿瘤效果。第三部分溶瘤腺病毒DD3-ZD55-SPAG9联合多西他赛治疗裸鼠移植瘤目的:观察溶瘤腺病毒DD3-ZD55-SPAG9联合多西他赛对裸鼠移植瘤的治疗效果。方法:1.建立前列腺癌PC-3细胞荷瘤鼠模型。监测不同处理组对移植瘤的生长的影响。苏木精-伊红染色法（Hematoxylin-eosin staining,HE）检测各组肿瘤的生长状况。2.原位末端缺口标记法（Td T-mediated d UTP nick end labeling,TUNEL）法检测各组移植瘤细胞的凋亡情况。3.免疫组化和Western Blot检测各组移植瘤细胞中的侵袭相关蛋白E-cadherin、Vimentin和MMP-2的表达情况。结果:1.成功构建裸鼠移植瘤,各治疗组肿瘤生长速度均低于对照组,HE结果显示各治疗组内均存在肿瘤细胞凋亡坏死,联合组更为明显。2.TUNEL结果显示各治疗组内均存在明显的肿瘤细胞凋亡,联合治疗组较单一治疗组凋亡现象更为明显。3.免疫组化和Western Blot结果显示各治疗组内SPAG9、Vimentin和MMP-2蛋白表达降低,E-cadherin蛋白表达增多,联合组对上述蛋白的表达调控更为显着。结论:DD3-ZD55-SPAG9可以有效抑制裸鼠移植瘤的生长,并促进移植瘤细胞凋亡,抑制SPAG9、Vimentin和MMP-2蛋白表达,促进E-cadherin蛋白表达。但效果略低于ZD55-SPAG9。联合使用多西他赛后可以获得较单一治疗更高的移植瘤治疗效果。
林翠[4]（2019）在《猪圆环病毒2型ORF4蛋白诱导凋亡机制研究》文中进行了进一步梳理猪圆环病毒2型（Porcine Circovirus2,PCV2）是最小的哺乳动物病毒,也是仔猪多系统衰竭综合征（PMWS）的主要病原。已有研究认为PCV2的致病性与多方面因素相关,其中病毒诱导凋亡是致病机制之一。ORF4作为与凋亡相关的病毒蛋白,其蛋白相关特性及其如何影响凋亡尚不明确。本研究通过观察ORF4的亚细胞定位、检测过表达ORF4或ORF4缺失突变体病毒对凋亡的影响以及寻找可能与ORF4相结合的细胞蛋白,旨在阐明ORF4潜在功能及其影响凋亡的机制。1.PCV2 ORF4蛋白潜在生物学特性研究虽然本实验室已通过Northern blot及间接免疫荧光试验（Indirect Immunofluorescence Assay,IFA）证实了 ORF4编码区及蛋白的存在,但仍然无法用免疫印迹（western blot,WB）检测到ORF4蛋白。对ORF4的生物学特性研究发现,细胞中瞬时表达的ORF4蛋白可被降解,加入蛋白酶体抑制剂MG132后降解速度减慢;ORF4稳转细胞系中只有在MG132存在的前提下,才能检测到ORF4蛋白的存在。这提示过表达的ORF4蛋白稳定性差,可通过蛋白酶体途径降解。ORF4的易降解特性同样也存在于病毒感染情况下,加入MG132后IFA检测的ORF4蛋白荧光数目显着增多。后续对检测方法的改善虽然仍无法用WB检测到病毒感染下ORF4蛋白,但也为ORF4的后续检测提供了参考数据。2.PCV2 ORF4蛋白亚细胞定位研究本研究利用CELLO v.2.5:subCELlular predictor等在线预测软件分析ORF4蛋白的亚细胞定位。随后,在PCV2感染及Flag-ORF4转染的细胞中,共聚焦观察。结果显示,瞬时转染细胞中ORF4与线粒体共定位,感染晚期ORF4在线粒体和胞核中均有分布。进一步研究过表达细胞系中ORF4蛋白定位,发现此时ORF4绝大部分弥散分布于胞核内。这提示ORF4蛋白具有线粒体与胞核双重定位特性。经软件分析ORF4蛋白序列中存在两个α-螺旋结构域,但不存在跨膜结构。根据预测所得的α-螺旋结构分布结果,构建一系列ORF4截短体分析出ORF4氨基端1-30aa呈点状分布于胞浆,与线粒体有共定位,该结果提示ORF4蛋白的氨基端包含24-30aa处α-螺旋的1-30aa氨基酸序列是其定位线粒体的关键区域。3.PCV2 0RF4蛋白功能分析为了分析ORF4蛋白功能,本研究将ORF4瞬时转染于293T、PK15及3D4/31三种细胞,检测总体凋亡指标,结果显示:caspase-3剪切体含量显着高于阴性对照。然而,在ORF4过表达细胞系中,无论是否加入MG132药物,caspase3切割量都没有明显改变。对瞬时表达ORF4激活的凋亡通路研究结果显示,在过表达ORF4细胞中,caspase9剪切体含量显着增多,胞浆中细胞色素c含量显着升高,但凋亡诱导因子AIF释放现象不明显。上述实验结果提示瞬时表达ORF4可诱导caspase依赖的线粒体凋亡。后续针对瞬时和稳定转染ORF4对凋亡激活的不同,揭示ORF4对凋亡的激活与其线粒体定位特性相关。随后,我们探索感染情况下ORF4在凋亡中所发挥的功能。利用本实验室保存wPCV2及ORF4缺失突变体病毒（m4PCV2）分别感染PK15细胞,72h后检测各项凋亡指标。结果显示,ORF4缺失毒感染细胞中,caspase3及caspase9剪切体含量、DNA片段化数目以及细胞色素c（cytc）释放量均显着降低,提示PCV2感染后可通过ORF4蛋白表达激活细胞内线粒体凋亡通路。综上所述,线粒体定位的ORF4蛋白可激活caspase依赖的线粒体凋亡。4.PCV2 ORF4蛋白诱导凋亡机制研究为了分析ORF4诱导线粒体凋亡机制,通过对ORF4与线粒体通透性转换孔径复合物蛋白腺嘌呤核苷酸转移酶III亚型（ANT3）及压力依赖性负离子通道I（VDAC1）,细胞色素c氧化酶VIIIA亚基进行免疫共沉淀试验,结果显示ORF4只与ANT3发生特异性结合;3D-SIM分析后进一步确定了 ORF4与ANT3的相互结合。Co-IP及GST-Pull down试验寻找与ANT3互作的ORF4具体区域,结果显示ORF4的1-30aa不仅是ORF4的线粒体定位序列,同样也是与ANT3结合的关键结构域。通过RNAi的方法对细胞内源性ANT3蛋白表达进行干扰,发现在ANT3敲降的细胞系中,不仅ORF4过表达导致的裂解的caspase3含量减弱;同样PCV2诱导的caspase3、9裂解程度以及释放到胞浆中的细胞色素c的含量也由于ANT3的敲降而显着降低。上述数据表明ANT3在ORF4过表达及PCV2感染诱导的线粒体凋亡中发挥着关键作用。
陈皓[5]（2017）在《间充质干细胞装载病毒复制受Tet-on调控的条件复制型腺病毒在乳腺癌荷瘤鼠模型中的治疗研究》文中进行了进一步梳理肿瘤是严重威胁人类健康的疾病之一。尽管传统治疗手段应用广泛,但因为缺乏肿瘤特异性,常会对正常细胞造成较大的毒副作用。经过基因工程改造的溶瘤腺病毒因其能够在肿瘤细胞中特异性扩增,故称为条件复制型腺病毒。尽管经过优化和改进的溶瘤腺病毒已经用于临床治疗,但依然存在一些缺点,如免疫原性高,肝脏毒性大,瘤内注射时病毒感染肿瘤的范围有限以及腺病毒复制的安全性问题等。克服上述溶瘤腺病毒缺点的一个方法是使用间充质干细胞来装载和投送腺病毒载体。间充质干细胞（Mesenchymal stem cells,MSCs）是一类非造血系统来源的成体多能干细胞,它可以从骨髓,脂肪组织,外周血,脐带血,骨,肌肉,软骨等多种组织中分离得到。在肿瘤基因治疗中,MSC因具有归巢性和免疫逃避等特点,常被用来作为投送治疗基因或者病毒载体的工具。当使用MSC作为溶瘤腺病毒的投送载体时,由于溶瘤腺病毒可以在MSC中进行复制,因此导致MSC的活力降低,如迁移与归巢的活力降低,最终影响MSC投送病毒的能力及基因治疗效果。所以使用MSC投送溶瘤腺病毒时,MSC的病毒装载量不能过大,需要与MSC的归巢活力保持平衡,即在不影响MSC迁移和归巢活力的情况下尽量增大病毒装载量,以获得最佳的基因治疗效果。构建一种病毒复制可以被调控的溶瘤腺病毒是解决这种平衡问题的关键。实施对溶瘤腺病毒复制的调控,可以控制病毒在MSC未到达肿瘤细胞之前不在细胞内复制,当MSC迁移到肿瘤组织后,再使病毒复制开启,这样可以在不影响MSC活力的情况下,获得最大的病毒装载量。该种方式可以精确控制病毒的释放,确保在MSC到达肿瘤组织之后释放病毒,进而避免病毒对正常组织和细胞的影响。使用MSC投送调控复制溶瘤腺病毒进行体内肿瘤治疗,可利用了 MSC的归巢和免疫逃避的优势,将病毒更加安全有效地投送至肿瘤组织区域,从而实现溶瘤腺病毒对肿瘤治疗安全性和有效性。实施对目的基因的表达调控,可以使人们对基因功能的研究和基于基因的疾病治疗变得更为细致精准。Tet调控系统因其安全有效被广泛地使用在基因功能研究和基因治疗领域。利用Tet调控系统调控溶瘤腺病毒在MSC中的复制,是控制腺病毒复制的一个有效策略。腺病毒的复制起始于病毒E1A基因的表达,若能使用Tet-on系统调控病毒E1A基因表达,就可以实现对MSC中溶瘤腺病毒复制的调控,该策略将对MSC装载溶瘤腺病毒的肿瘤基因治疗奠定重要基础。因此本研究基于以上的研究背景,从肿瘤治疗的安全性和有效性意义出发,构建一种病毒复制受Tet-on调控的条件复制型腺病毒,并在体外测试该病毒的基础上,评估其在乳腺癌动物模型体内的治疗效果。为了完成上述的目标,本课题进行了实验研究并取得了以下结果。（1）病毒复制受rtTA介导的转录激活型Tet-on调控的条件复制型腺病毒载体的构建与测试:本研究构建了 3种rtTA介导的Tet-on系统,并构建了使用此3种Tet-on系统调控病毒ElA基因表达的病毒载体,包装成病毒后在细胞内进行病毒的复制检测。研究结果显示,3种rtTA介导的Tet-on系统无法有效调控病毒复制。采用Luciferase报告基因对失控原因进行探索分析,结果显示,rtTA介导的激活型Tet-on系统调控病毒ElA基因表达时,会受到ElA基因自身蛋白产物及腺病毒的某种组份的干扰,导致病毒复制调控失效。研究证实激活型Tet-on系统控制病毒复制的策略可行性较差。（2）病毒复制受TetR-KRAB介导的转录抑制型Tet-on调控的条件复制型腺病毒载体的构建与测试:构建了 TetR-KRAB介导的转录抑制型Tet-on调控系统,及由该系统调控复制的条件复制型腺病毒载体,检测了病毒在细胞内的复制及hMSC装载病毒实验。研究结果显示,此类型Tet-on系统调控的条件复制型腺病毒在肿瘤细胞及hMSC内复制可以得到有效调控,关闭该病毒在hMSC中的复制,可以将hMSC对腺病毒装载量提升一个数量级。（3）hMSC装载病毒复制受TetR-KRAB介导的转录抑制型Tet-on调控的腺病毒在乳腺癌MDA-MB-231荷瘤模型中的治疗研究:使用上述有效的复制受TetR-KRAB介导的转录抑制型Tet-on调控的条件复制型腺病毒感染hMSC,利用hMSC投送该病毒对乳腺癌荷瘤裸鼠模型进行了体内治疗研究。研究结果显示,装载该病毒的hMSC可以有效抑制肿瘤生长,并且抑制效果受到Dox的精确调控。综上所述,本研究对不同类型的Tet-on系统调控腺病毒的复制进行了研究探索。提出了病毒复制受rtTA介导的激活型Tet-on系统调控的条件复制腺病毒复制失控的原因;首次构建了病毒复制受TetR-KRAB介导的转录抑制型Tet-on系统调控的条件复制型腺病毒载体,证实该病毒在肿瘤细胞及hMSC内复制可以得到有效调控,可以将hMSC对病毒装载量提升一个数量级;首次利用hMSC装载病毒复制受TetR-KRAB介导的转录抑制型Tet-on调控的条件复制型腺病毒对乳腺癌细胞荷瘤裸鼠模型进行了体内治疗,结果显示装载该病毒的hMSC可以有效抑制肿瘤生长,并且抑制效果受到Dox的精确调控。
刘越[6]（2013）在《人乳头瘤病毒16型E2蛋白与Daxx相互作用及作用的结构域》文中提出目的：研究人乳头瘤病毒16型（HPV16）E2蛋白与Daxx的相互作用，为进一步探讨两种蛋白质相互作用在HPV16致癌中的作用及其机制提供实验参考依据。方法：（1）用PRIMER5.0软件分别设计HPV16E2及其结构域基因片段（氨基酸1-201、202-365和249-365）特异性引物，并引入EcoRI、BamHI酶切位点，PCR扩增目的基因。分别用EcoRI和BamHI双酶切PCR产物和质粒pGADT7，纯化回收酶切产物，T4连接酶连接后，转化E.coli JM109，筛选阳性克隆。经酶切鉴定及DNA序列分析，构建酵母菌表达载体pGADT7/HPV16E2、pGADT7/HPV16E2TAD、pGADT7/HPV16E2H-DBD和pGADT7/HPV16E2DBD。（2）应用LiAc法，分别将诱饵质粒pGBKT7/Daxx与猎物质粒pGADT7和pGADT7/HPV16E2转化酵母菌AH109，涂布于SD/-Trp、SD/-Leu、SD/-His、SD/-Ade（单缺）固体培养基上，30℃培养2-4d，检测诱饵质粒和猎物质粒对酵母菌AH109的自激活作用。（3）将质粒分为7组，它们分别是A组（pGADT7+pGBKT7）、B组（pGADT7-T+pGBKT7-Lam）、C组（pGADT7-T+pGBKT7-p53）、 D组（pGBKT7/Daxx+pGADT7/HPV16E2）、E组（pGBKT7/Daxx+pGADT7/HPV16E2TAD）、F组（pGBKT7/Daxx+pGADT7/HPV16E2H-DBD）和G组（pGBKT7/Daxx+pGADT7/HPV16E2DBD）。将每组质粒共转化酵母菌AH109，转化菌分别接种于SD/-Trp-Leu固体培养基，30℃培养24d，待平板上长出菌落后，接种单个菌落于SD/-Trp-Leu-His和SD/-Trp-Leu-His-Ade平板上，30℃培养24d，观察酵母菌的生长情况，分析Daxx与HPV16E2相互作用及其氨基酸结构域。（4）将pcDNA3.1/Daxx用BamHI酶切，收获约2.2kb片段，连入载体pet28a相同位点，筛选阳性克隆，构建6His-Daxx融合蛋白原核细胞表达载体pet28a/Daxx。分别培养E.coli BL21（含pet28a/Daxx或pGEX6p-1/HPV16E2质粒），IPTG诱导表达目的产物6His-Daxx或GST-HPV16E2，Ni-NTA或GST纯化试验盒分别纯化目的蛋白，SDS-PAGE和Western blot分析和鉴定融合蛋白。（5）取6His-Daxx和GST-HPV16E2融合蛋白纯化产物各0.5μg混合，加入抗GST或抗His抗体及500μl裂解缓冲液，进行免疫共沉淀试验（COIP）和Western blot；培养Caski细胞48h，收集细胞裂解液，经蛋白质A/G琼脂糖处理后，收集上清液，进行COIP和Western blot；IP抗体为抗Daxx或抗HPV16E2抗体，Western blot抗体为抗HPV16E2或抗Daxx抗体。（6）培养Caski细胞，利用间接免疫荧光试验和图像软件观察并分析HPV16E2蛋白和Daxx在Caski细胞内分布与定位或共定位。结果：（1） DNA序列分析结果显示HPV16E2及其结构域基因片段均正确地连入pGADT7载体，即构建了酵母菌表达载体pGADT7/HPV16E2、pGADT7/HPV16E2TAD、pGADT7/HPV16E2H-DBD和pGADT7/HPV16E2DBD。（2）转化了诱饵质粒pGBKT7、pGBKT7/Daxx的酵母菌AH109，在SD/-Trp固体培养基上可见菌落生长，而在SD/-Leu、SD/-His、SD/-Ade未见菌落生长。转化了猎物质粒pGADT7、pGADT7/HPV16E2的酵母菌AH109，在SD/-Leu固体培养基上可见菌落生长，在SD/-Trp、SD/-His、SD/-Ade培养板上未见菌落生长，即诱饵质粒和猎物质粒均无自激活作用。（3）A～G组质粒转化的酵母菌在SD/-Trp-Leu平板上均可见菌落生长。在SD/-Trp-Leu-His和SD/-Trp-Leu-His-Ade平板上，只有C、D、E组转化菌生长，A、B、F、G组未见菌落生长。（4）酶切鉴定结果显示，Daxx正确地连入pet28a载体，即构建了Daxx原核表达载体pet28a/Daxx。在E.Coli BL21，IPTG诱导其表达了6His-Daxx融合蛋白。COIP和Westernblot结果显示，在约90kDa与70kDa有条带，即HPV16E2与Daxx在细胞外发生了结合反应。（5）利用Caski细胞裂解上清液，COIP和Western blot结果显示，在约80kDa与60kDa出现条带，即HPV16E2与Daxx在细胞内发生了结合反应。（6）在Caski细胞，表达红色信号的HPV16E2和表达绿色信号的Daxx主要分布于Caski细胞胞浆，少数分布于细胞核；当红色信号与绿色信号重叠时，出现黄色信号。结论：（1）载体pGADT7/HPV16E2、pGADT7/HPV16E2TAD、pGADT7/HPV16E2H-DBD和pGADT7/HPV16E2DBD能在酵母菌中表达相应的目的蛋白；pet28a/Daxx能在E.coliBL21中表达融合蛋白6His-Daxx。（2） HPV16E2蛋白能在细胞内外结合Daxx；HPV16E2通过N端结构域（TAD）与Daxx结合并发生相互作用。（3）HPV16E2蛋白与Daxx主要分布于Caski细胞胞浆，且共定位胞浆与胞核。
朴秉国[7]（2011）在《表达NDV HN基因重组腺病毒对BEL-7402细胞及转移模型的抑制作用》文中提出本研究对具有肿瘤特异性复制和肿瘤靶向性杀伤功能的重组腺病毒Ad-HP和Ad-HT的肝癌（BEL-7402）抑制作用进行了探讨。本研究首先利用MTT染色等方法,探讨了Ad-HT和Ad-HP对体外培养的人肝癌细胞BEL-7402的抑制作用。结果表明,Ad-HT和Ad-HP均可有效抑制BEL-7402细胞的增殖,且其作用在一定条件下呈现剂量和时间依赖关系。本研究利用台盼蓝染色、AO/EB染色、Annexin V染色和DAPI染色对Ad-HT和Ad-HP抑制BEL-7402细胞的方法进行了探讨。结果表明,Ad-HT和Ad-HP均可造成BEL-7402细胞的细胞膜通透性增加、细胞核凝聚、磷脂膜外翻。虽然不同检测方法所得到结果不尽相同,但仍可推断,Ad-HT和Ad-HP能够通过诱导细胞凋亡抑制BEL-7402肿瘤细胞的增殖。本研究利用流式细胞术、Western blot等方法探讨表达NDV HN基因重组腺病毒对细胞凋亡信号转导系统内线粒体膜电位、活性氧水平和Caspase酶活性等关键控制点信号分子的影响。实验结果表明,Ad-HP和Ad-HT均可不同程度的上调BEL-7402细胞Caspase酶活性和活性氧水平,并不同程度的降低BEL-7402细胞线粒体膜电位。可以推断,表达NDV HN基因重组腺病毒通过线粒体途径诱导BEL-7402细胞发生凋亡,从而体现其对BEL-7402细胞的抑制作用。本研究利用小鼠肝癌的肺转移和实体肿瘤模型探索了Ad-HP和Ad-HT在体内的抑瘤作用。结果表明,Ad-HP和Ad-HT具有减缓肿瘤组织生长速度、延长模型动物平均生存期和刺激免疫的作用。
董流昕[8]（2010）在《提高Ad41 E1B55K表达水平促进重组Ad41在293细胞的复制》文中认为人腺病毒F组含有2个成员,Ad40和Ad41,二者均能够引起婴幼儿腹泻。由于它们是天然的肠道病原,因此有改造为肠道靶向基因转移载体的潜力。但是Ad40和Ad41在体外难以培养,被称为难养腺病毒（fastidious adenoviruses）,这给载体改构造成困难。Ad40和Ad41难以培养的根本原因还没有阐明。体外培养条件下,病毒早期基因表达不充分,病毒基因组复制效率低,晚期基因表达水平低下,病毒装配和释放困难,难以培养可能是这些因素综合作用的结果。293细胞是Ad5 E1区转化的人胚肾细胞,组成性表达Ad5 E1区基因（包括E1A、E1B19K和E1B55K）。部分Ad41的分离株能够用293细胞进行传代（虽然子代病毒产量很低）,这可能是由于Ad41的E1基因表达水平低,而293细胞表达的Ad5 E1蛋白部分补偿了Ad41相应分子的功能。之所以说是部分补偿,而不是完全补偿,是因为E1B55K蛋白可能具有型别特异性,例如Ad5 E1B55K不能完全补偿Ad11p或Ad35 E1B55K的功能。我们前期的工作将Ad41 E1B55K基因转染293细胞,’筛选得到稳定表达Ad41 E1B55K的293E12细胞,结果显示293E12包装Ad41的能力较293细胞提高了约10倍,我们同时建立了E1区缺失的复制缺陷型Ad41载体系统,携带GFP报告基因的重组Ad41-GFP病毒能够在293E12细胞得到拯救和扩增。由于E1区是腺病毒感染细胞后首先表达的基因,E1蛋白为腺病毒复制营造适宜的细胞内环境,并调控腺病毒其他基因的表达,推测E1区表达水平低是Ad41体外难养的主要原因。本研究以293为模型细胞,重点考察了提高Ad41 E1B55K表达对Ad41复制的促进作用,并分析了可能的原因。1.提高包装细胞Ad41 E1B55K的表达,促进了重组病毒的复制293E12中Ad41 E1B55K基因由CMV启动子控制表达,为了进一步提高293细胞中Ad41 E1B55K表达水平,我们克隆了Ad41的三联体前导序列（tripartite leader sequence, TPL）。腺病毒晚期基因mRNA5’非翻译区都含有一段共有序列,这段序列起源于病毒基因组晚期基因的3个外显子,被称为三联体前导序列（tripartite leader sequence, TPL）, TPL有促进病毒晚期mRNA转运（由细胞核转移到胞浆）和翻译的功能。为了进一步提高包装细胞中Ad41 E1B55K的表达水平,我们在其mRNA5’非翻译区引入TPL。首先,进行Ad41 TPL克隆。Ad41-GFP感染293E12细胞,24h后提取细胞总RNA,逆转录为cDNA;利用巢式PCR方法,扩增晚期基因L1 52K mRNA5’端的部分序列,将其克隆到T载体,得到pMD-TPL质粒；测序,通过序列分析,获得Ad41 TPL序列信息。然后,设计引物,并在引物5’末端添加Hindlll的酶切位点,以pMD-TPL为模板,PCR扩增得到TPL序列,Hindlll酶切后插入到pcDNA3-E1B55K的巨细胞病毒启动子（CMVp）的下游,得到pcDNA3-TPL-E1B55K真核表达质粒。该质粒转染293细胞,G418筛选,获得20株G418抗性的单克隆细胞（293TE）；以等量重组病毒Ad41-GFP感染293TE细胞,以细胞中GFP数量的增多、荧光强度的提高为指标,初步评价293TE的病毒复制能力,获得3株病毒产量提高的单克隆细胞（293TE7,293TE12和293TE20）。最后,重点考察了293TE7单克隆细胞与293E12细胞病毒包装能力的差异。将Ad41 E1B55K基因克隆到原核表达载体pET30a（+）,以E.coli BL21（DE3）菌株表达的E1B55K蛋白免疫小鼠,制备抗血清,以该抗血清作为一抗,免疫荧光检测Ad41E1B55K的表达,结果显示293TE7细胞Ad41 E1B55K的表达明显高于293E12细胞。以线性化的腺病毒质粒pAd41-GFP转染293E12或293TE7细胞,滴度测定实验的结果表明,293TE7的病毒拯救能力约为293E12细胞的20倍；以等量Ad41-GFP重组病毒分别感染293E12和293TE7细胞,收集子代病毒并进行滴度测定,结果显示293TE7细胞的病毒产量较293E12细胞提高3-10倍。将Ad41-GFP感染293TE7细胞,收获的子代病毒再次感染293TE7细胞,如此进行重组病毒的连续传代,在传代6次后,利用Hirt法提取病毒基因组,选用多种限制性内切酶进行酶切鉴定,结果显示Ad41-GFP在293TE7细胞传代稳定。总之,我们克隆了Ad41 TPL序列,成功构建了Ad41 E1B55K真核表达载体,建立了Ad41 E1B55K稳定表达的293TE7细胞；TPL的引入提高了Ad41 E1B55K的表达水平,结果使293TE7的病毒拯救和包装能力较原包装细胞明显提高。2.Ad41 E1B55K表达促进病毒包装的可能机理病毒包装的物质基础和前提是病毒基因组的复制和结构蛋白的表达,我们观察了在293细胞表达Ad41 E1B55K对Ad41病毒基因组复制和结构蛋白表达的影响。等量Ad41-GFP感染293、293E12和293TE7细胞,Hirt法提取病毒基因组,琼脂糖凝胶电泳后,溴化乙啶（EB）染色观察,293E12和293TE7细胞病毒基因组的合成量相近,约为293细胞合成量的4倍。E1B55K蛋白的主要功能之一是促进病毒晚期mRNA的运输。病毒感染细胞后,我们利用荧光定量PCR分别检测细胞总RNA中或细胞浆RNA中病毒晚期mRNA表达水平,结果显示,12h、16h和24 h这些时间点中,细胞中总L2和L3区的mRNA的量,293E12细胞与293细胞大致相同,而细胞浆中,293E细胞L2和L3区mRNA的量均高于293细胞。我们又进一步观察了较高水平mRNA的转录和转运是否最终表现为病毒结构蛋白的较高表达。等量的Ad41-GFP分别感染293E和293细胞,Western blot检测结果表明,在内参基因beta-Actin表达量相近的情况下,293E细胞中V蛋白的表达量明显高于293细胞。这些结果表明,在293细胞表达Ad41 E1B55K,促进了Ad41病毒基因组的复制和病毒结构蛋白的表达,并最终提高了子代病毒的产量。3.Ad41载体系统的新探索293细胞中原有的Ad5 E1B55K不能完全替代Ad41 E1B55K的功能,在293细胞中表达Ad41 E1B55K有利于Ad41重组病毒的包装,这个研究结果促使我们尝试建立新的复制缺陷型Ad41载体系统,在新系统中,E1区的E1A和E1B19K基因被删除,而E1B55K基因保留,产生的重组病毒有可能在293细胞高效复制。在已经构建的Ad41载体系统的穿梭质粒pSh41-GFP中插入Ad41 E1B55K基因,得到新的穿梭质粒pSh41ElB-GFP,再将该穿梭质粒与骨架质粒在E. Coli BJ5183菌株中进行同源重组,得到的重组腺病毒质粒pAd41ElB-GFP, PmeⅠ线性化后经脂质体转染293细胞,荧光显微镜观察GFP和细胞数量的变化,以了解病毒复制情况。Ad41ElB-GFP病毒在293细胞中能够进行复制并传代,这表明Ad41 E1B55K基因能够影响病毒的复制,但得到病毒量很低,没有达到预想的实验结果,分析原因可能是由于控制Ad41 E1B55K的启动子启动效率低,E1B55K表达不充分。该研究方案正在改进中。总之,本研究主要观察了在293细胞表达Ad41 E1B55K与Ad41病毒复制的关系,发现表达Ad41 E1B55K能够提高病毒基因组的复制和结构蛋白的表达,从而提高病毒产量；如果提高Ad41 E1B55K表达水平,则能够进一步提高包装细胞的病毒包装效率；我们尝试了构建新的重组Ad4l载体系统,建立的293TE7细胞可以用于野生型或重组Ad41的包装,同时,本研究为Ad41载体系统的进一步改进奠定了基础。
陈苏芳[9]（2010）在《HPV16 E6蛋白与hDaxx在HeLa细胞共定位及对凋亡的影响》文中研究表明目的:分析人乳头瘤病毒16型（HPV16）E6蛋白与hDaxx在HeLa细胞中的分布与定位,探讨两蛋白高表达对TNF-α诱导HeLa细胞凋亡的影响,为进一步研究E6蛋白在HPV16致癌机制中的作用奠定实验基础。方法:（1）采用脂质体法分别瞬时转染重组质粒pDsRed-Monomer-C1/HPV16 E6或pEGFP-C1/hDaxx,Western blot检测DsRed-HPV16 E6和EGFP-hDaxx融合蛋白在HeLa细胞中的表达。（2）瞬时转染或共转染pDsRed-Monomer-C1/HPV16 E6与pEGFP-C1/hDaxx,激光共聚焦显微镜观察HPV16 E6蛋白与hDaxx在HeLa细胞中的分布,并分析共定位。（3） HPV16 E6与hDaxx真核细胞表达质粒瞬时共转染HeLa细胞,MTT法测定细胞增殖活性。（4）用Hoechst 33258染色细胞核,在荧光显微镜下观察细胞核形态,并对活细胞和凋亡细胞分别计数,计算凋亡率。分别将0μg、0.5μg、1.0μg、2.0μg pcDNA3.1（-）/hDaxx和2.0μg pcDNA3.1（-）/HPV16 E6瞬时共转染HeLa细胞,以空细胞组、pcDNA3.1（-）转染组和pcDNA3.1（-）/hDaxx转染组作为对照,TNF-α处理12h后分别收集各组细胞,经70%的乙醇4℃固定过夜,PI染色后,用流式细胞术检测凋亡。（5）按（4）法转染HeLa细胞,TNF-α处理细胞12h后,检测caspase-8与caspase-3的相对活性。结果:（1） Western-blot结果显示HPV16 E6和hDaxx重组质粒转染组均出现了免疫反应带,而空质粒转染组和HeLa细胞组未见免疫反应带。（2）在激光共聚焦显微镜下,DsRed-HPV16 E6融合蛋白所发的红色荧光主要分布于胞核,EGFP-hDaxx融合蛋白所发的绿色荧光仅分布于胞核;HPV16 E6和hDaxx共转染组,绿色荧光和红色荧光在胞浆较弱呈均匀分布,在胞核较强且集中分布在核膜附近,红色荧光同绿色荧光融合成黄色荧光。（3）与HPV16 E6转染组比较,HPV16 E6与hDaxx共转染时,细胞增殖活性降低,差异有统计学意义（P<0.05）。（4） TNF-α处理的各组细胞均可见胞核呈现深染、致密的颗粒块状荧光的凋亡细胞。pcDNA3.1（-）/E6转染组凋亡率低于pcDNA3.1（-）转染组,差异有统计学意义（P<0.05）;与E6转染组相比,共转染组凋亡率显着升高（ P<0.01 ）,且凋亡率随pcDNA3.1（-）/hDaxx转染量的增加而升高。（5）与空载体组相比,E6转染组caspase-8和caspase-3两种酶活性均显着降低（P<0.01）;与E6转染组相比,共转染组caspase-8和caspase-3相对活性随pcDNA3.1（-）/hDaxx转染量增加而升高;当hDaxx为2.0μg时,差异具有统计学意义（P<0.01）。结论:（1） DsRed-HPV16 E6与EGFP-hDaxx融合蛋白能在HeLa细胞内表达,HPV16 E6使部分hDaxx从细胞核转位至细胞浆,且两者发生共定位。（2） HPV16 E6蛋白抑制TNF-α诱导HeLa细胞凋亡;在表达HPV16 E6蛋白的HeLa细胞,hDaxx高表达通过剂量依赖方式促进TNF-α诱导凋亡。（3） HPV16 E6蛋白可抑制caspase-8与caspase-3的活性,hDaxx高表达下调该抑制作用。
张琴[10]（2010）在《HPV18 E2蛋白与hDaxx在细胞内的共定位及对凋亡的影响》文中进行了进一步梳理目的:分析人乳头瘤病毒18型（HPV18）E2蛋白与hDaxx在细胞内的分布与共定位,并初步研究两种蛋白质对凋亡的影响,为进一步探索E2蛋白在HPV 18致癌机制中的作用以及E2防治性疫苗的研制提供实验依据。方法:（1）将质粒pEGFP-C1/E2和pDsRed-Monomer-C1分别用EcoRI与BamHⅠ双酶切,前者回收小片段约1000bp酶切产物,后者回收酶切产物,T4连接酶连接后,转化E.coli JM109 ,筛选阳性克隆,构建Red-HPV18 E2融合蛋白表达载体pDsRed-Monomer-C1/E2。（2）将质粒pDsRed-Monomer-C1/E2转染HeLa细胞,利用倒置荧光显微镜观察HPV18 E2蛋白在真核细胞中的表达与定位,并通过Western-blot进一步检测其表达。（3）将质粒pDsRed-Monomer-C1/E2与pEGFP-C1/hDaxx共同转染HeLa细胞,利用激光共聚焦显微镜观察HPV18 E2蛋白与hDaxx的分布,并分析它们的共定位。（4）将0.5μg与1.0μg pcDNA3.1（-）/hDaxx质粒分别和2.0μg pcDNA3.1（-）/E2质粒瞬时共转染HeLa细胞,设pcDNA3.1（-）转染组和空细胞组作为对照。48h后,分别收集各组细胞,经75%乙醇4℃固定过夜,PI染色后,用流式细胞仪检测各组细胞凋亡率。（5）将0.5μg与1.0μg pcDNA3.1（-）/hDaxx质粒分别和2.0μg pcDNA3.1（-）/E2质粒瞬时共转染HeLa细胞,设pcDNA3.1（-）转染组和空细胞组作为对照,培养48h后,分别收集各组细胞,按Caspase-8试剂盒说明书操作,用酶标仪测定405nm波长下的吸光度（A值）,计算Caspase-8的相对活性。结果:（1）重组质粒经双酶切鉴定,得到目的小片段约1100bp,测序分析所克隆的目的片段与GenBank上公布的HPV18 E2（NC001562）基因序列一致,即构建了pDsRed-Monomer-C1/E2重组体。（2）真核表达载体pDsRed-Monomer-C1/E2能在HeLa细胞内表达DsRed-HPV18 E2融合蛋白,且主要分布于细胞浆与细胞核。（3）质粒pEGFP-C1/hDaxx转染的细胞,hDaxx定位细胞核;质粒pEGFP-C1/hDaxx和pDsRed-Monomer-C1/E2共转染细胞,hDaxx在细胞浆与细胞核均有,且绿色与红色荧光重叠为黄色荧光,即HPV18 E2蛋白与hDaxx发生共定位。（ 4 ） 2μg pcDNA3.1（-）/E2+1.0μg pcDNA3.1（-）/hDaxx组凋亡率明显高于2μg pcDNA3.1（-）/E2+ 0.5μg pcDNA3.1（-）/ hDaxx组,差异具有显着性（P<0.001）;且两组凋亡率都显着高于其他组,差异具有显着性（P<0.001）。pcDNA3.1（-）/E2组凋亡率明显高于pcDNA3.1（-）组及空细胞组,差异具有显着性（P<0.001）。（5）2μg pcDNA3.1（-）/E2+1.0μg pcDNA3.1（-）/hDaxx组Caspase-8的相对活性高于2μg pcDNA3.1（-）/E2+ 0.5μg pcDNA3.1（-）/ hDaxx组,差异有统计学意义（P<0.01）;且两组凋亡率都显着高于其他组,差异有统计学意义（P<0.01）。pcDNA3.1（-）/E2组Caspase-8的相对活性高于pcDNA3.1（-）/ hDaxx、pcDNA3.1（-）组及空细胞组,差异有统计学意义（P<0.01）。结论:（1）构建的pDsRed-Monomer-C1/E2真核表达载体能在HeLa细胞表达DsRed-HPV18 E2融合蛋白。（2）HPV18 E2蛋白与hDaxx共定位细胞浆与细胞核,且E2蛋白使部分hDaxx从细胞核转位至细胞浆。（3）HPV18 E2蛋白高表达可促进Caspase-8活化,引起HeLa细胞凋亡;hDaxx能提高该凋亡作用且存在剂量依赖关系。
二、腺病毒2型E1B55KD癌蛋白与hDaxx相互作用（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、腺病毒2型E1B55KD癌蛋白与hDaxx相互作用（论文提纲范文）
（1）DAXX抑制胃癌的干细胞特性及上皮-间充质转化的机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 一、引言 |
| 二、材料与方法 |
| 1、材料 |
| 1.1 细胞及其来源 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要抗体 |
| 1.4 主要耗材 |
| 1.5 主要仪器 |
| 2、方法 |
| 2.1 细胞培养 |
| 2.2 细胞总RNA提取 |
| 2.3 荧光定量PCR |
| 2.4 病毒的制备 |
| 2.5 蛋白免疫印迹实验(Western blot) |
| 2.6 软琼脂集落生成实验 |
| 2.7 细胞增殖实验 |
| 2.8 细胞凋亡检测 |
| 2.9 细胞免疫荧光 |
| 2.10 划痕实验 |
| 2.11 细胞迁移 |
| 2.12 细胞侵袭 |
| 2.13 免疫共沉淀 |
| 2.14 染色质免疫共沉淀(ChIP) |
| 2.15 流式细胞术 |
| 2.16 小鼠皮下成瘤实验 |
| 2.17 统计学分析 |
| 三、结果 |
| 1、DAXX在晚期胃癌中下调 |
| 2、DAXX的表达与肿瘤干细胞标志物呈负相关趋势 |
| 3、DAXX抑制胃癌细胞迁移、侵袭能力和上皮-间充质转化 |
| 4、DAXX影响EMT相关因子表达 |
| 5、DAXX可将HDAC1募集至细胞核 |
| 6、DAXX通过HDAC1抑制SNAI3的表达从而抑制EMT |
| 7、DAXX抑制胃癌细胞集落形成能力和耐药性 |
| 8、DAXX过表达抑制体内肿瘤的形成 |
| 四、讨论 |
| 五、结论 |
| 1、DAXX表达量与胃癌恶性程度呈负相关 |
| 2、DAXX抑制胃癌细胞的上皮-间充质转化(EMT) |
| 3、DAXX抑制胃癌干细胞 |
| 参考文献 |
| 综述 DAXX研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间本人出版或公开发表的论文 |
| 中英文缩写词表 |
| 致谢 |
（2）E3泛素连接酶TRAIP调控先天性免疫的机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第1章 文献综述 |
| 1.1 蛋白翻译后修饰(PTMs) |
| 1.1.1 PTMs的类型和功能 |
| 1.1.2 泛素化修饰(UB) |
| 1.1.3 E3 泛素连接酶(E3s) |
| 1.1.4 小泛素样修饰(SUMO) |
| 1.1.5 SUMO化过程与功能 |
| 1.2 病毒与泛素化和SUMO化系统 |
| 1.2.1 泛素—蛋白酶体系统(UPS) |
| 1.2.2 病毒与泛素蛋白酶体系统相互作用 |
| 1.2.3 病毒与宿主SUMO化系统相互作用 |
| 1.3 先天性免疫系统 |
| 1.3.1 Ⅰ型干扰素信号通路 |
| 1.3.2 泛素化修饰在Ⅰ型干扰素中的作用 |
| 1.3.3 SUMO化修饰在干扰素信号通路中的作用 |
| 1.4 PRRSV概述 |
| 1.4.1 PRRSV分子学特征 |
| 1.4.2 PRRSV对蛋白翻译后修饰系统的调控 |
| 1.4.3 PRRSV在Ⅰ型 IFN信号通路中的研究进展 |
| 1.5 E3 泛素连接酶TRAIP |
| 1.6 研究目的及意义 |
| 第2章 猪TRAIP基因克隆表达与多克隆抗体制备 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验材料 |
| 2.2.1 实验细胞、动物、载体、菌株、抗体与毒株 |
| 2.2.2 细胞分离与培养相关试剂 |
| 2.2.3 总RNA提取、反转录与分子克隆相关试剂 |
| 2.2.4 蛋白表达、纯化以及Western-blot相关试剂 |
| 2.2.5 ELISA检测相关试剂 |
| 2.2.6 荧光定量PCR相关试剂 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 细胞复苏与传代 |
| 2.3.2 细胞接毒 |
| 2.3.3 转录组测序和分析 |
| 2.3.4 荧光定量PCR(qRT-PCR) |
| 2.3.5 猪外周血细胞(PBMC)的分离 |
| 2.3.6 总RNA提取及cDNA合成 |
| 2.3.7 猪TRAIP基因克隆 |
| 2.3.8 猪TRAIP蛋白原核表达载体构建及抗体制备 |
| 2.3.9 真核表达载体构建 |
| 2.3.10 Western-blot |
| 2.3.11 流式细胞术分析 |
| 2.3.12 统计分析 |
| 2.4 实验结果 |
| 2.4.1 PRRSV感染3D4/21 细胞中TRAIP基因mRNA表达水平 |
| 2.4.2 猪TRAIP基因的克隆与序列分析 |
| 2.4.3 猪TRAIP基因表达载体的构建 |
| 2.4.4 猪TRAIP蛋白纯化及抗体制备 |
| 2.4.5 PRRSV感染对猪TRAIP蛋白表达水平的检测 |
| 2.5 讨论 |
| 2.5.1 猪TRAIP基因克隆与载体构建 |
| 2.5.2 TRAIP多克隆抗体的特异性评价 |
| 2.5.3 PRRSV调控TRAIP基因的表达 |
| 2.6 小结 |
| 第3章 TRAIP对 PRRSV增殖的调节及其互作病毒蛋白的筛选 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验材料 |
| 3.2.1 细胞、抗体、病毒 |
| 3.2.2 细胞转染相关试剂 |
| 3.2.3 干扰RNA(siTRAIP) |
| 3.2.4 免疫荧光 |
| 3.2.5 免疫沉淀(Immunoprecipitation,IP)相关试剂 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 细胞转染 |
| 3.3.2 siTRAIP干扰实验 |
| 3.3.3 TCID_(50)测定病毒滴度 |
| 3.3.4 免疫荧光 |
| 3.3.5 真核表达载体构建 |
| 3.3.6 Co-IP检测 |
| 3.3.7 截短体构建 |
| 3.3.8 共聚焦免疫荧光 |
| 3.4 实验结果 |
| 3.4.1 过表达TRAIP对 PRRSV病毒的影响 |
| 3.4.2 siTRAIP抑制PRRSV增殖 |
| 3.4.3 TRAIP抑制PRRSV诱导的I型干扰素信号通路 |
| 3.4.4 TRAIP与 nsp1α相互作用 |
| 3.4.5 TRAIP的 LZ结构域与nsp1α的 PCPα结构域相互作用 |
| 3.5 讨论 |
| 3.5.1 TRAIP对 PRRSV增殖的影响 |
| 3.5.2 TRAIP负调控先天性免疫IFN途径 |
| 3.5.3 TRAIP与 nsp1α相互作用 |
| 3.6 小结 |
| 第4章 TRAIP在 PRRSV诱导IFN-β产生中的作用机制 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验材料 |
| 4.2.1 抗体、质粒 |
| 4.2.2 核质分离试剂盒 |
| 4.2.3 荧光素酶报告系统试剂 |
| 4.2.4 SUMO化和泛素化评价相关试剂 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 SUMO或泛素化评价 |
| 4.3.2 突变体构建 |
| 4.3.3 细胞核和细胞质提取物的制备 |
| 4.3.4 荧光素酶活性报告基因系统 |
| 4.4 实验结果 |
| 4.4.1 Nsp1α抑制TRAIP的 SUMO化修饰 |
| 4.4.2 nsp1α对 TRAIP SUMO化调控不依赖于两者结合位点 |
| 4.4.3 PRRSV nsp1α抑制TRAIP K48 多聚泛素化 |
| 4.4.4 Nsp1α促进TRAIP的核输出 |
| 4.4.5 Nsp1α募集TRAIP促进靶向TBK1的K48 多聚泛素化 |
| 4.4.6 Nsp1α促进TRAIP介导先天免疫的抑制作用 |
| 4.5 讨论 |
| 4.5.1 PRRSV nsp1α调控TRAIP翻译后修饰 |
| 4.5.2 翻译后修饰调节TRAIP的核质分布 |
| 4.5.3 nsp1α协同TRAIP进一步抑制I型 IFN的产生 |
| 4.6 小结 |
| 第5章 TRAIP-DDX39A在Ⅰ型干扰素应答中的作用 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 实验材料 |
| 5.2.1 细胞与病毒 |
| 5.2.2 试剂与抗体 |
| 5.3 实验方法 |
| 5.3.1 载体构建和转染 |
| 5.3.2 病毒滴度测定 |
| 5.3.3 siRNA |
| 5.3.4 ELISA和 qRT-PCR |
| 5.3.5 RNA免疫沉淀(RIP) |
| 5.3.6 制备细胞核和细胞质蛋白提取物 |
| 5.3.7 细胞核和细胞质RNA的分离和RT-PCR |
| 5.3.8 共聚焦免疫荧光 |
| 5.3.9 萤光素酶测定 |
| 5.4 实验结果 |
| 5.4.1 质谱鉴定TRAIP互作蛋白 |
| 5.4.2 鉴定TRAIP为 DDX39A的 E3 泛素连接酶 |
| 5.4.3 DDX39A与先天性免疫相关的mRNA结合 |
| 5.4.4 DDX39A负调控I型干扰素产生 |
| 5.4.5 DDX39A促进RNA病毒增殖 |
| 5.4.6 DDX39A增加抗病毒转录物的核滞留并降低蛋白质表达 |
| 5.4.7 病毒感染增强DDX39A蛋白的泛素化修饰 |
| 5.4.8 DDX39A蛋白的泛素化修饰调控其与mRNA结合的能力 |
| 5.4.9 TRAIP促进DDX39A结合抗病毒转录物的能力 |
| 5.5 讨论 |
| 5.5.1 DDX39A是干扰素拮抗剂 |
| 5.5.2 TRAIP促进DDX39A与抗病毒转录物结合 |
| 5.6 小结 |
| 结论与展望 |
| 本文创新之处 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 发表论文和参加科研情况说明 |
| 致谢 |
（3）双调控并荷载SPAG9基因shRNA的溶瘤腺病毒联合多西他赛治疗前列腺癌的实验研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 参考文献 |
| 第一部分 构建双调控并荷载SPAG9 基因shRNA的溶瘤腺病毒 |
| 材料和方法 |
| 1.材料 |
| 1.1 细胞、质粒、培养基 |
| 1.2 主要试剂、材料 |
| 1.3 抗体 |
| 1.4 主要仪器 |
| 1.5 试剂的配制 |
| 2.方法 |
| 结果 |
| 1.成功构建溶瘤腺病毒DD3-ZD55-SPAG9 |
| 2.DD3-ZD55-SPAG9 的扩增、纯化与滴度测定 |
| 3.DD3-ZD55-SPAG9 抑制前列腺癌细胞内SPAG9 蛋白表达 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 溶瘤腺病毒DD3-ZD55-SPAG9 联合多西他赛体外治疗去势抵抗性前列腺癌 |
| 材料和方法 |
| 1.材料 |
| 1.1 细胞、培养基 |
| 1.2 主要试剂、材料 |
| 1.3 抗体 |
| 1.4 主要仪器 |
| 1.5 试剂的配制 |
| 2.方法 |
| 结果 |
| 1.结晶紫染色检测DD3-ZD55-SPAG9+DTX对细胞的毒性作用 |
| 2.溶瘤腺病毒ZD55-SPAG9 及多西他赛抑制前列腺癌细胞的生长 |
| 3.DD3-ZD55-SPAG9 联合DTX抑制前列腺癌细胞迁移能力 |
| 4.DD3-ZD55-SPAG9 联合DTX抑制前列腺癌细胞侵袭能力 |
| 5.DD3-ZD55-SPAG9 联合DTX促进前列腺癌细胞凋亡 |
| 6.DD3-ZD55-SPAG9 联合DTX下调SPAG9、Vimentin、MMP-2 蛋白,上调E-cadherin、caspase-8、casepase-3 蛋白的表达 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 第三部分 溶瘤腺病毒DD3-ZD55-SPAG9 联合多西他赛治疗裸鼠移植瘤 |
| 材料和方法 |
| 1.材料 |
| 2. 方法 |
| 结果 |
| 1.DD3-ZD55-SPAG9 联合DTX抑制裸鼠移植瘤生长 |
| 2. HE 染色 |
| 3.TUNEL凋亡试剂盒检测肿瘤凋亡 |
| 4.免疫组化法检测肿瘤组织中SPAG9 蛋白与EMT相关蛋白 |
| 5.Western Blot检测肿瘤组织内SPAG9和EMT相关蛋白表达情况 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 研究创新 |
| 存在的问题和改进方法 |
| 参考文献 |
| 综述(一) 溶瘤腺病毒介导的抗肿瘤治疗研究进展 |
| 参考文献 |
| 综述(二) 嵌合抗原受体 T 细胞免疫治疗前列腺癌现状及进展 |
| 参考文献 |
| 缩略词表 Abbreviation |
| 攻读学位期间参与发表的学术成果 |
| 致谢 |
（4）猪圆环病毒2型ORF4蛋白诱导凋亡机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 论文创新点 |
| 研究意义 |
| 技术路线 |
| 第一部分 文献综述 |
| 第一章 猪圆环病毒2型研究进展 |
| 1 猪圆环病毒发现与分型 |
| 2 猪圆环病毒基因组及病毒复制 |
| 3 病毒蛋白基因组编码产物及其功能 |
| 3.1 ORF1蛋白 |
| 3.2 ORF2蛋白 |
| 3.3 ORF3蛋白 |
| 3.4 ORF4蛋白 |
| 3.5 ORF5蛋白 |
| 4 PCV2介导凋亡的研究进展 |
| 第二章 细胞凋亡及病毒调节细胞凋亡研究进展 |
| 1 凋亡特征及凋亡检测 |
| 2 凋亡通路 |
| 2.1 内源性凋亡通路 |
| 2.1.1 内源凋亡的起始—线粒体膜通透性增强 |
| 2.1.2 内源性凋亡通路 |
| 2.2 外源性凋亡通路 |
| 2.3 凋亡调节因子 |
| 2.3.1 Bcl-2家族蛋白 |
| 2.3.2 1APs与抗lAPs蛋白 |
| 2.3.3 存活因子(survival factors) |
| 2.3.4 p53蛋白 |
| 2.3.5 Ser/Thr激酶 |
| 2.3.6 FLIPS |
| 2.3.7 NF-κB |
| 3 病毒与凋亡 |
| 3.1 病毒黏附、入胞及遗传物质释放对凋亡的调节作用 |
| 3.2 病毒蛋白对凋亡的调节 |
| 3.2.1 病毒蛋白抗凋亡机制 |
| 3.2.1.1 Bcl-2同源病毒蛋白(vBcl-2) |
| 3.2.1.2 病毒蛋白作用于Bcl-2家族 |
| 3.2.1.3 病毒FILPs蛋白 |
| 3.2.1.4 caspase抑制蛋白 |
| 3.2.1.5 病毒蛋白作用于死亡受体 |
| 3.2.2 病毒蛋白促凋亡机制 |
| 3.2.2.1 直接促进MMP |
| 3.2.2.2 间接促进MMP |
| 3.2.2.3 作用于外源性凋亡通路中的关键元件 |
| 第二部分 研究内容 |
| 第一章 ORF4蛋白的检测及生物学特性的研究 |
| 1. 材料 |
| 1.1 毒株、菌株及细胞 |
| 1.2 载体、试剂、抗体及仪器 |
| 2. 实验方法 |
| 2.1 ORF4相关质粒的构建 |
| 2.2 免疫印迹 |
| 2.3 间接免疫荧光试验 |
| 2.4 真核表达质粒的转染实验 |
| 2.5 药物处理试验 |
| 2.3.1 药物处理过表达ORF4细胞 |
| 2.3.2 药物处理病毒感染细胞 |
| 2.6 ORF4过表达细胞系构建及细胞系中ORF4蛋白检测 |
| 3. 结果 |
| 3.1 ORF4不稳定存在于细胞内,转染后易降解 |
| 3.2 瞬时表达ORF4蛋白由蛋白酶体途径降解 |
| 3.3 ORF4过表达细胞系中,ORF4蛋白也由蛋白酶体途径降解 |
| 3.4 PCV2感染细胞中,ORF4蛋白稳定性差由蛋白酶体途径降解 |
| 4. 讨论 |
| 第二章 ORF4蛋白亚细胞定位及其定位序列研究 |
| 1. 材料 |
| 1.1 病毒和细胞 |
| 1.2 载体,试剂,抗体及仪器 |
| 2. 实验方法 |
| 2.1 在线软件分析ORF4蛋白序列 |
| 2.2 带GFP标签的ORF4及ORF4缺失突变体的构建 |
| 2.3 SDS-PAGE及免疫印迹(WB)实验分析重组质粒蛋白表达 |
| 2.4 激光共聚焦显微镜对ORF4线粒体定位分析 |
| 2.5 胞浆胞核组分抽提 |
| 3. 结果 |
| 3.1 ORF4亚细胞定位预测 |
| 3.2 激光共聚焦分析瞬时表达ORF4蛋白定位 |
| 3.3 激光共聚焦分析稳定表达ORF4蛋白定位 |
| 3.4 激光共聚焦分析感染情况下ORF4蛋白定位 |
| 3.5 ORF4序列中α-螺旋及跨膜结构域的预测 |
| 3.6 ORF4线粒体定位序列(MTS)分析 |
| 4. 讨论 |
| 第三章 PCV2 ORF4诱导线粒体凋亡功能分析 |
| 1. 材料 |
| 1.1 毒株,菌株与细胞 |
| 1.2 载体,试剂,抗体及仪器 |
| 2. 实验方法 |
| 2.1 ORF4过表达和病毒接种 |
| 2.2 药物处理 |
| 2.3 凋亡指标caspase3,8,9的检测 |
| 2.4 TUNEL试验 |
| 2.5 线粒体及胞浆组分的抽提以及细胞色素c释放的检测 |
| 3. 结果 |
| 3.1 瞬时表达ORF4对不同细胞凋亡影响 |
| 3.2 ORF4稳定转染细胞系中,ORF4对凋亡影响 |
| 3.3 ORF4瞬时表达对caspase8和caspae9活性影响 |
| 3.4 不同细胞中,ORF4瞬时表达对细胞色素c及凋亡诱导因子释放影响 |
| 3.5 PCV2感染情况下,对caspase9切割影响 |
| 3.6 TUNEL试剂盒检测缺失毒及野毒对细胞凋亡影响 |
| 3.7 病毒感染对caspase3、8、9活性影响 |
| 3.8 病毒感染对细胞色素c释放的影响 |
| 3.9 ORF4对凋亡的诱导与其线粒体定位相关 |
| 4. 讨论 |
| 第四章 ORF4蛋白诱导线粒体凋亡的机制研究 |
| 1. 材料 |
| 1.1 毒株,菌株与细胞 |
| 1.2 载体,试剂,抗体及仪器 |
| 2. 实验方法 |
| 2.1 ORF4与ANT3互作研究 |
| 2.1.1 免疫共沉淀试验 |
| 2.1.1.1 真核表达质粒构建 |
| 2.1.1.2 免疫共沉淀(Co-IP) |
| 2.1.1.3 小分子蛋白电泳(Tricine SDS-PAGE) |
| 2.1.2 GST-pull down试验 |
| 2.1.2.1 原核蛋白表达 |
| 2.1.2.2 GST-pull down |
| 2.1.3 激光共聚焦试验与SIM |
| 2.2 ANT3沉默细胞系构建 |
| 2.2.1 猪源ANT3有效沉默片段的设计与筛选 |
| 2.2.2 慢病毒包装 |
| 2.2.3 慢病毒介导的ANT3干扰细胞系构建 |
| 2.3 ANT3干扰后,ORF4过表达对凋亡诱导及ORF4定位影响 |
| 2.3.1 ANT3干扰后,ORF4过表达对凋亡指标caspase3、8、9及PARP的影响 |
| 2.3.2 ANT3干扰后,对ORF4定位影响 |
| 2.4 ANT3干扰后对PCV2病毒诱导凋亡的影响 |
| 2.4.1 ANT3干扰后对PCV2病毒诱导的caspase3、9的裂解检测 |
| 2.4.2 ANT3干扰后对PCV2病毒诱导的细胞色素c释放检测 |
| 2.4.3 ANT3干扰后对PCV2病毒复制的影响 |
| 3 结果 |
| 3.1 ORF4蛋白与线粒体蛋白体外互作关系分析 |
| 3.2 ORF4与ANT3互作区域分析 |
| 3.3 成功构建沉默ANT3的PK15细胞系 |
| 3.4 干扰ANT3对ORF4瞬时表达诱导凋亡的影响 |
| 3.5 干扰ANT3对ORF4瞬时表达定位的影响 |
| 3.6 干扰ANT3对PCV2感染诱导的caspase3,9活性的影响 |
| 3.7 干扰ANT3对PCV2感染诱导的细胞色素c释放的影响 |
| 3.8 感染ANT3对PCV2病毒复制的影响 |
| 4. 讨论 |
| 全文总结 |
| 展望 |
| 参考文献 |
| 第三部分 附录 |
| 附录A 本文所涉及的引物及重组质粒 |
| 附录B 全文缩略语 |
| 附录C 常用缓冲液及配方 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
（5）间充质干细胞装载病毒复制受Tet-on调控的条件复制型腺病毒在乳腺癌荷瘤鼠模型中的治疗研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略词表 |
| 第1章 引言 |
| 1.1 腺病毒载体简介 |
| 1.1.1 腺病毒载体基本概况 |
| 1.1.2 条件复制型腺病毒在肿瘤治疗中的应用 |
| 1.1.3 条件复制型腺病毒在肿瘤治疗中的不足 |
| 1.2 间充质干细胞简介 |
| 1.2.1 间充质干细胞的研究现状 |
| 1.2.2 间充质干细胞作为肿瘤基因治疗载体的应用 |
| 1.2.3 间充质干细胞装载腺病毒用于体内治疗所存在的问题 |
| 1.3 基因表达调控系统简介 |
| 1.3.1 常用的基因表达调控系统的分类 |
| 1.3.2 四环素调控系统简介 |
| 1.3.3 四环素调控系统的应用 |
| 1.4 腺病毒复制调控的策略 |
| 1.4.1 条件复制型腺病毒载体的复制调控手段 |
| 1.4.2 四环素调控系统对溶瘤腺病毒的复制调控研究进展 |
| 1.5 课题研究意义 |
| 第2章 病毒复制受rtTA介导的转录激活型Tet-on系统调控的条件复制型腺病毒载体的构建及体外实验研究 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 菌株 |
| 2.1.2 细胞与病毒 |
| 2.1.3 载体和主要试剂 |
| 2.1.4 主要溶液配制 |
| 2.1.5 主要仪器设备 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 载体构建相关实验方法 |
| 2.2.2 构建病毒复制受rtTA介导的转录激活型Tet-on调控的条件复制型腺病毒穿梭载体 |
| 2.2.3 构建病毒复制受rtTA介导的转录激活型Tet-on调控的条件复制型腺病毒骨架载体 |
| 2.2.4 Luciferase报告基因载体构建 |
| 2.2.5 E1A基因表达载体的构建 |
| 2.2.6 腺病毒的包装和纯化 |
| 2.2.7 小鼠mMSC细胞的分离 |
| 2.2.8 腺病毒感染目的细胞 |
| 2.2.9 细胞基因组DNA提取 |
| 2.2.10 Real-Time PCR测定病毒基因组复制倍数 |
| 2.2.11 Luciferase活力检测 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 E1A D24与E1B-△55KD基因片段克隆结果鉴定 |
| 2.3.2 病毒复制受激活型Tet-on调控的腺病毒穿梭载体鉴定 |
| 2.3.3 病毒复制受激活型Tet-on调控的腺病毒载体的同源重组 |
| 2.3.4 三种激活型Tet-on调控载体的性能检测 |
| 2.3.5 腺病毒的包装与活力检测 |
| 2.3.6 荧光显微镜下观察感染腺病毒的细胞状态 |
| 2.3.7 感染腺病毒细胞的基因组提取 |
| 2.3.8 腺病毒基因组在不同细胞中的复制检测 |
| 2.3.9 E1基因对Tet调控系统的影响 |
| 2.4 分析与讨论 |
| 第3章 病毒复制受TetR-KRAB介导的转录抑制型Tet-on系统调控的条件复制型腺病毒的构建及体外实验研究 |
| 3.1 实验材料及试剂配制 |
| 3.1.1 菌株 |
| 3.1.2 载体及所用试剂 |
| 3.1.3 细胞株、病毒以及培养基 |
| 3.1.4 主要溶液配制 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 载体构建 |
| 3.2.2 病毒包装与活力检测 |
| 3.2.3 Luciferase活力检测 |
| 3.2.4 腺病毒对细胞的感染 |
| 3.2.5 细胞基因组的提取 |
| 3.2.6 Real-Time PCR测定病毒基因组复制倍数 |
| 3.2.7 MTT法检测腺病毒对肿瘤细胞的增殖抑制效果 |
| 3.2.8 Transwell实验检测间充质干细胞的迁移活力 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.0 TetR-KRAB介导的转录抑制型Tet-on调控的条件复制型腺病毒载体鉴定 |
| 3.3.1 转录抑制型和激活型Tet-on调控的条件复制型腺病毒载体在细胞内的本底表达比较 |
| 3.3.2 两种TetR-KRAB介导的转录抑制型Tet-on调控的条件复制型腺病毒的包装与活力检测 |
| 3.3.3 病毒复制受TetR-KRAB介导的转录抑制型Tet-on调控的条件复制型腺病毒在多种细胞中的复制检测 |
| 3.3.4 病毒复制受TetR-KRAB介导的转录抑制型Tet-on调控的条件复制型腺病毒对MDA-MB-231细胞的增殖抑制 |
| 3.3.5 装载腺病毒的MSC的迁移活力 |
| 3.4 分析与讨论 |
| 第4章 病毒复制受TetR-KRAB介导的转录抑制型Tet-on系统调控的条件复制型腺病毒在乳腺癌荷瘤模型中的实验治疗研究 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.1.1 实验动物 |
| 4.1.2 细胞系,病毒以及培养试剂 |
| 4.1.3 实验主要试剂及配制 |
| 4.1.4 实验主要仪器设备 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 MDA-MB-231-Luc细胞的荷瘤小鼠建立 |
| 4.2.2 活体成像系统观察肿瘤生长 |
| 4.2.3 hMSC装载腺病毒 |
| 4.2.4 荷瘤小鼠瘤内注射腺病毒或感染腺病毒的hMSC |
| 4.2.5 肿瘤石蜡切片制作 |
| 4.2.6 组织H&E染色 |
| 4.2.7 免疫组织化学染色 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.3.1 Luciferase反映肿瘤生长情况 |
| 4.3.2 H&E染色及免疫组化检测病毒对肿瘤的感染效果 |
| 4.3.3 小鼠肿瘤生长曲线 |
| 4.4 分析与讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 攻读博士期间科研成果 |
（6）人乳头瘤病毒16型E2蛋白与Daxx相互作用及作用的结构域（论文提纲范文）
| 主要英文缩略语索引 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 1 前言 |
| 2 实验材料 |
| 3 实验方法 |
| 4 实验结果 |
| 5 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 读研期间课题与论文 |
| 致谢 |
（7）表达NDV HN基因重组腺病毒对BEL-7402细胞及转移模型的抑制作用（论文提纲范文）
| 内容提要 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 绪论 |
| 第一篇 文献综述 |
| 第1章 肝细胞癌治疗方法的研究进展 |
| 1.1 概述 |
| 1.2 肝癌的流行病学 |
| 1.3 肝病的检查及鉴别诊断 |
| 1.4 肝癌的发病机理 |
| 1.5 局部治疗 |
| 1.6 手术疗法 |
| 1.7 当前肝癌的治疗手段 |
| 1.8 遗传图谱 |
| 1.9 肿瘤的基因治疗 |
| 1.10 展望 |
| 第2章 肝癌基因治疗的研究进展 |
| 2.1 概述 |
| 2.2 分子发病机制的概述 |
| 2.3 分子治疗肝细胞癌 |
| 2.4 特殊药物对HCC的治疗 |
| 2.5 基因治疗 |
| 2.6 HCC与JNK1的激活作用 |
| 2.7 血管内皮生成因子的作用 |
| 2.8 复制腺病毒靶向的肿瘤病毒疗法 |
| 2.9 肿瘤微环境调节 |
| 2.10 小结 |
| 第二篇 研究内容 |
| 第1章 Ad-HP和Ad-HT对BEL-7402细胞的抑制作用 |
| 1.1 材料与方法 |
| 1.2 结果 |
| 1.3 讨论 |
| 1.4 小结 |
| 第2章 Ad-HP和Ad-HT对BEL-7402细胞的抑制方式 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 第3章 Ad-HP和Ad-HT对信号分子的影响 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 第4章 Ad-HP和Ad-HT的体内抑瘤作用研究 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.2 结果 |
| 4.3 讨论 |
| 4.4 小结 |
| 结论 |
| 创新点 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
| 致谢 |
（8）提高Ad41 E1B55K表达水平促进重组Ad41在293细胞的复制（论文提纲范文）
| 英文缩略语表 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 第一部分 高表达AD41 E1B55K基因对于AD41复制的影响 |
| 1 实验仪器、材料和试剂 |
| 2 高表达AD41 E1B55K基因的细胞系的构建 |
| 3 实验结果 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 第二部分 AD41 E1B55K基因促进病毒包装机理的探索 |
| 1 实验仪器、材料和试剂 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 第三部分 AD41载体系统的新探索 |
| 1 实验仪器、材料和试剂 |
| 2 实验的基本方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 全文总结 |
| 论文综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（9）HPV16 E6蛋白与hDaxx在HeLa细胞共定位及对凋亡的影响（论文提纲范文）
| 主要英文缩略语索引 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 论文正文 |
| 1 前言 |
| 2 实验材料 |
| 3 实验方法及步骤 |
| 4 实验结果 |
| 5 讨论 |
| 6 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 综述 |
| 读硕期间课题与论文 |
| 致谢 |
（10）HPV18 E2蛋白与hDaxx在细胞内的共定位及对凋亡的影响（论文提纲范文）
| 主要英文缩写 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 论文正文 |
| 1 引言 |
| 2 实验材料 |
| 3 方法 |
| 4 结果 |
| 5 讨论 |
| 6 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 综述 |
| 发表及待发表论文 |
| 致谢 |
四、腺病毒2型E1B55KD癌蛋白与hDaxx相互作用（论文参考文献）
- [1]DAXX抑制胃癌的干细胞特性及上皮-间充质转化的机制研究[D]. 伍超凡. 苏州大学, 2020(06)
- [2]E3泛素连接酶TRAIP调控先天性免疫的机制研究[D]. 时培殿. 天津大学, 2020(01)
- [3]双调控并荷载SPAG9基因shRNA的溶瘤腺病毒联合多西他赛治疗前列腺癌的实验研究[D]. 杨春华. 苏州大学, 2019(06)
- [4]猪圆环病毒2型ORF4蛋白诱导凋亡机制研究[D]. 林翠. 浙江大学, 2019(01)
- [5]间充质干细胞装载病毒复制受Tet-on调控的条件复制型腺病毒在乳腺癌荷瘤鼠模型中的治疗研究[D]. 陈皓. 陕西师范大学, 2017(04)
- [6]人乳头瘤病毒16型E2蛋白与Daxx相互作用及作用的结构域[D]. 刘越. 南华大学, 2013(01)
- [7]表达NDV HN基因重组腺病毒对BEL-7402细胞及转移模型的抑制作用[D]. 朴秉国. 吉林大学, 2011(05)
- [8]提高Ad41 E1B55K表达水平促进重组Ad41在293细胞的复制[D]. 董流昕. 中国疾病预防控制中心, 2010(01)
- [9]HPV16 E6蛋白与hDaxx在HeLa细胞共定位及对凋亡的影响[D]. 陈苏芳. 南华大学, 2010(05)
- [10]HPV18 E2蛋白与hDaxx在细胞内的共定位及对凋亡的影响[D]. 张琴. 南华大学, 2010(05)