一、农杆菌介导的白菜遗传转化影响因子研究进展（论文文献综述）
赵晓登[1]（2021）在《苜蓿HD-Zip转录因子基因Mfhb-1对烟草和小麦的遗传转化及抗旱性研究》文中认为苜蓿Mfhb-1基因是在苜蓿体细胞胚胎发生初期通过扣除杂交而获得的,属于同源异域型-亮氨酸拉链蛋白（Homeodomain-leuzine zipper protein,HD-Zip）Ⅰ类转录因子基因。目前常见的转录因子（Transcription factor）是指能够与基因某些顺式作用元件结合,进而在转录水平对植物进行生物调节的特定蛋白。前人研究结果表明,同源异型-亮氨酸拉链（HD-Zip）蛋白是高等植物特有的一类转录因子,主要参与植物对逆境胁迫的应答反应、胚胎发育的调控以及光形态建成等植物生理进程。为探明Mfhb-1基因在植物逆境胁迫下的生物调控功能,本研究利用农杆菌介导法将苜蓿Mfhb-1基因分别转入了NC89野生型烟草和矮抗58小麦,对转基因烟草和小麦进行分子生物学鉴定,并在干旱胁迫条件下测定烟草的SOD和POD活性、MDA含量、叶绿素含量等生理生化指标,主要研究结果如下:（1）利用根癌农杆菌介导法完成Mfhb-1基因对烟草的遗传转化,通过侵染、共培养、脱菌、筛选等过程获得转基因烟草植株,并对遗传转化过程中烟草的抗性愈伤组织进行数量统计,确定了农杆菌介导法对烟草遗传转化的最适条件:侵染液OD600值为0.61,侵染时间为20 min。（2）对T2代转苜蓿Mfhb-1基因烟草进行筛选,以Hyg外源喷雾和PCR检测结合的方式获得了10株T3代纯合转Mfhb-1基因烟草株系。（3）对获得的T3代纯合烟草进行RNA提取并进行反转录,对反转录生成的c DNA进行RT-PCR检测,结果显示,转基因烟草植株和阳性质粒DNA均能扩增出200 bp长度目的条带,说明Mfhb-1基因在烟草中已经表达。（4）对转入苜蓿Mfhb-1基因的烟草植株进行不同时间的干旱胁迫,再进行干旱胁迫下烟草植株的表观形态观测以及多项生理指标测定,结果显示:（1）正常生长条件下,两种类型烟草的表观形态无明显差异,随着干旱胁迫时间的持续,野生型烟草植株呈现出较大的负面影响变化,包括叶片变黄、叶片卷曲度改变、茎干干枯等,转Mfhb-1基因烟草植株表观形态改变与野生型植株相似,但改变程度远不及野生型烟草,20 d干旱胁迫条件下,仍呈现较好的生长态势。（2）转Mfhb-1基因烟草的SOD活性在正常以及干旱胁迫下均显着高于野生型烟草,干旱胁迫20 d时活性最高;正常生长条件下,两种类型烟草的POD活性无显着差异,但在干旱胁迫条件下,转基因烟草POD活性提高量显着高于野生型烟草,干旱胁迫20 d时,其活性提高37.11%。（3）野生型及转Mfhb-1基因烟草植株含水率在正常生长条件下无显着差异,均在80%以上;干旱胁迫15 d条件下,两种类型烟草的含水率均有所下降,但此时两者的含水率差别较小,无显着差异;干旱胁迫20 d时,两者含水率持续下降,且转基因烟草在此时的含水率显着高于NC89野生型烟草;与烟草含水率相反,两种类型烟草的MDA含量在正常生长条件下无显着差异,处于同一水平含量,但干旱胁迫时间为15 d时,转基因烟草MDA含量已显着低于野生型烟草。（4）转基因烟草的可溶性糖和pro含量在正常生长条件下与野生型烟草无显着差异,但可溶性蛋白含量显着高于野生型烟草;干旱胁迫15 d条件下,转Mfhb-1基因烟草的Pro、可溶性糖、可溶性蛋白含量均显着高于野生型烟草,且pro含量差异性最大;干旱胁迫20 d时,转基因烟草的可溶性蛋白及可溶性糖含量显着高于NC89野生型烟草,但两者pro含量无明显差异。（5）处于正常生长条件下时,两种类型烟草的叶绿素含量无显着差异,均处于一个正常水平;干旱胁迫时间达到15 d时,两者的叶绿素含量均明显下降,且转基因烟草的叶绿素含量显着高于NC89野生型烟草;随着干旱胁迫时间的延长,两种类型烟草的含量持续下降,而转基因烟草叶绿素含量一直高于野生型烟草。（6）这些研究结果表明,无逆境胁迫条件存在的情况下,Mfhb-1转录因子不会对植物的生长生理状态产生影响,外源干旱胁迫出现后,Mfhb-1转录因子能够提高植物的保护酶类的活性,同时以增加渗透调节物质含量的形式增强细胞渗透势来提高细胞吸水性,从而减缓植株含水率的降低,暗示着Mfhb-1基因的表达可能受到外源干旱胁迫条件的诱导。（5）通过根癌农杆菌介导法和抽真空法相结合的形式对小麦进行Mfhb-1基因遗传转化,利用潮霉素对小麦萌发以及生长期间进行初步筛选,初步筛选出对Hyg具有抗性的小麦植株,再对筛选出的小麦进行PCR检测,琼脂凝胶电泳结果显示,转基因小麦植株以及大肠杆菌质粒DNA均出现了1300 bp长度的清晰条带,可以进一步确认Mfhb-1基因已成功转入小麦中去。（6）对经PCR鉴定为阳性的小麦植株进行数量统计,结合对小麦进行遗传转化时的不同条件,得出小麦遗传转化成功率最高时,侵染液OD600值为0.41,真空状态持续时间为30 s时,转化成功率为2.4%。综上所述,本研究初步明确了Mfhb-1基因的抗旱功能,通过对转基因烟草的多个生理指标测定发现,与野生型烟草植株相比,导入Mfhb-1基因的烟草在正常和不同干旱胁迫时间的情况下,SOD、POD、MDA含量、Pro含量等生理指标均有不同程度的变化,变化情况均指向抗旱性增强,为进一步研究HD-Zip转录因子的功能以及作用机理提供了理论依据和实验支撑。此外,通过以抽真空法作为辅助手段的根癌农杆菌介导法成功将苜蓿Mfhb-1基因导入了小麦中去,为进一步研究单子叶植物的转基因技术提供参考。
刘旭垚[2]（2020）在《适合抗根肿病研究的大白菜遗传转化体系的构建》文中认为大白菜（Brassica rapa L.ssp.pekinensis）属于十字花科芸薹属芸薹种的蔬菜作物,由于其含有丰富的营养物质如:粗纤维、蛋白质、多种矿物质以及多种维生素,得以在中国乃至亚洲广受欢迎与喜爱。因此,大白菜在中国乃至亚洲都有广泛的种植面积和供需市场,是我国最受国民喜爱的蔬菜之一。但大白菜却深受根肿病的侵害,严重影响了大白菜的产量。随着抗病相关基因陆续被挖掘,大多数抗根肿病基因的功能还没被验证,究其原因主要是受限于大白菜抗根肿病相关基因研究的遗传转化体系尚未建立完全。大白菜的遗传转化体系的建立已有一些报道,但由于基因型对大白菜遗传转化影响较大,不同大白菜品种其遗传转化效率都不尽相同,本文重点筛选了大白菜根肿病抗/感材料,并对其中再生能力较强的材料进行了遗传转化体系优化的系统研究,获得了较为稳定的转化效率较高的大白菜遗传转化体系,为后续抗病基因的功能验证提供了重要的技术支持。得到如下结果:1.为进行遗传转化体系的基因型筛选,我们调查了九个对根肿病有不同抗性的大白菜品种的再生能力,结果发现,易感根肿病品种‘SN157’的离体再生分化率最高,达到89.2%。2.为探索高效的大白菜离体再生体系,我们以‘SN157’为试材,探索了带柄子叶和下胚轴两种外植体类型、以3-7 d大的无菌幼苗筛选植物苗龄、并分别以0、0.25、0.5、0.75、1.0 mg/L等不同配比的NAA与TDZ组合优化了外源激素浓度。结果表明:以5 d苗龄的带柄子叶大白菜品种‘SN157’为外植体,添加外源激素NAA 0.5 mg/L+TDZ 0.5mg/L的培养基,为较佳的大白菜离体再生体系,植物材料大白菜‘SN157’的不定芽分化率达到了45%以上。3.在优化的大白菜离体再生体系的基础上,对遗传转化体系进行探讨。分别以OD600=0.5、0.8、1.2筛选用于侵染植物材料外植体的农杆菌菌液浓度,结果发现:OD600=0.5的农杆菌菌液浓度时污染率低,而不定芽诱导率较高,约为74.23%;以OD600=0.5的农杆菌菌液侵染带柄子叶后,用含有0、100、200、300、400、500 mg/L不同特美汀（Tim）抗生素的培养基进行培养,筛选合适的抗生素的浓度。结果发现,200 mg/L的特美汀（Tim）也表现出较高的抗性,不定芽率也最高,约为71.33%。4.综上所述,较佳的大白菜遗传转化体系为:以大白菜品种‘SN157’为植物材料,不经过预培养阶段,5 d苗龄的带柄子叶为外植体,使用OD600=0.5的农杆菌菌液侵染外植体,再转入200 mg/L抗生素特美汀浓度的分化培养基进行分化培养。经过继代培养得到足够大的植株时,进行生根培养。以上有利条件的筛选,提高了以农杆菌为介导的大白菜遗传转化体系建立的效率,并得到了重复试验的验证。5.对得到的转基因植株进行PCR检测、GFP检测和q RT-PCR检测,均得到转基因阳性验证,表明成功建立了高效稳定的大白菜遗传转化体系并成功获得了转基因植株,平均转化率约为2.13%。
王欢[3]（2020）在《羽衣甘蓝粉色叶基因的功能分析》文中认为羽衣甘蓝（Brassica oleracea var.acephala）属十字花科芸薹属,是甘蓝种的变种。作为观叶植物,其叶色鲜艳美丽,叶形皱缩特殊,且因具有较强的耐寒性,在晚秋、冬季及早春应用广泛,具有较强的观赏价值和经济价值。花青素（anthocyanin）是水溶性类黄酮色素,存在于液泡中使植物呈现粉、红、紫等颜色。本研究以羽衣甘蓝为主要试材,利用定量PCR和半定量RT-PCR对叶色相关基因BoDFR、BoMYB2进行表达量分析,同时将过表达BoDFR基因载体转化羽衣甘蓝和拟南芥,沉默表达BoDFR基因载体转化羽衣甘蓝,以期探明控制羽衣甘蓝花青素生物合成的关键基因及其功能。并开发设计了功能标记,为羽衣甘蓝分子标记辅助育种体系的建立提供参考。本研究的主要结果如下:1.选取五种红色、三种白色心叶羽衣甘蓝,红色、绿色心叶白菜,红色、绿色心叶油菜,红色、绿色心叶甘蓝,红色、绿色心叶菜薹,红色、绿色心叶花椰菜,对BoDFR和BoMYB2基因的表达量进行分析,我们发现:在羽衣甘蓝、油菜、白菜中,红色心叶材料中BoDFR的表达量明显高于白/绿色心叶材料中BoDFR的表达量,而BoMYB2表达量在红色心叶和白/绿色心叶材料中无明显规律性差异,推测BoDFR可能是控制羽衣甘蓝、油菜、白菜红色心叶表型的关键基因;而在菜薹、花椰菜、甘蓝中,红色心叶材料中BoDFR和BoMYB2的表达量均高于白/绿色心叶材料中BoDFR和BoMYB2的表达量,推测BoDFR是控制菜薹、花椰菜、甘蓝红色叶表型的关键基因,BoMYB2是主要的调节因子。2.将过表达BoDFR基因载体经农杆菌介导的子叶转化法转入白色羽衣甘蓝‘1631’和‘D10’,共得到27株卡那抗性植株,PCR鉴定18株为阳性;将过表达BoDFR基因载体经农杆菌介导的花序浸染法转入野生型拟南芥,共得到T2代转基因拟南芥9株,PCR鉴定均为阳性,花青素含量较野生型明显提高。3.将沉默表达BoDFR基因载体经TRV介导的VIGS（virus-induced gene silencing）技术转入羽衣甘蓝?0835?、?千宝菜?、?红钻油菜?叶片中。结果显示,沉默BoDFR基因后,沉默组叶片红色明显变淡,叶片中能检测到TRV病毒分子;在?0835?、?红钻油菜?、?千宝菜?中,BoDFR基因表达量明显下降,分别为对照组的11.7%、22.3%、26.0%,花青素含量分别是对照组的27.3%、11.5%、20.3%。4.根据红色、白色心叶羽衣甘蓝BoDFR基因序列差异,设计了两对显性标记DFR1（红色序列特有）、DFR2（白色序列特有）和一组共显性标记DFR3,并在八种红色、四种白色心叶羽衣甘蓝中进行验证,结果发现:显性引物DFR1可以区分八种红色心叶和三种白色心叶羽衣甘蓝,鉴定率91.7%;显性引物DFR2可以区分八种红色心叶和四种白色心叶羽衣甘蓝,鉴定率100%;共显性引物DFR3可以区分八种红色心叶和四种白色心叶羽衣甘蓝,鉴定率100%。
曾繁丽[4]（2020）在《农杆菌介导乌菜花药非组织培养遗传转化体系的建立》文中研究说明乌菜（Brassica campestris L.ssp.Chinensis）是十字花科芸薹属白菜亚种的变种之一,属于二年生草本植物,从宋元时期便已经广泛栽培。因其富含维生素C,被称为维生素菜。作为江淮流域最主要的叶菜品种之一,乌菜在我国大部分地区均有栽培,特别是安徽、江苏、上海等地,是调剂“冬缺”和“春淡”的理想蔬菜。近年来,人们主要利用传统育种方法,如杂种优势育种等方法来提高乌菜的品质及产量,由于传统育种方法周期长、效率低、育种目标不定向等缺点,限制了育种工作的发展。随着现代生物技术的快速发展,转基因技术取得了很大的进步,农杆菌介导法是植物遗传转化中最常用的方法之一,具有简单方便、费用低、周期短等特点,可以弥补传统育种的不足,加快新品种开发。但是,采用组织培养获得再生植株途径,进行植物遗传转化,不仅工作量大,而且遗传转化效率低。采用农杆菌介导花药非组织培养进行遗传转化,不仅操作简单,而且可以避免植物愈伤组织培养过程,从而节省大量时间,为作物的定向遗传改良提供了有效快速的方法。本试验采用乌菜WS-1材料为试材,进行农杆菌介导遗传转化,研究分析影响花药遗传转化的因素,建立农杆菌介导花药非组织培养遗传转化体系,并分析其遗传转化细胞生物学机理。主要研究成果:1.以WS-1为试材,优化了共培养基（CCM）中BAP、As和Silwet的浓度,共培养基p H值、暗培养时间、花蕾大小与处理方式以及农杆菌接种方法等影响遗传转化的因素,建立了农杆菌介导乌菜花药非组织培养遗传转化体系:将农杆菌悬浮在CCM中(MS+2.0 mg?L-1 BAP+40 mg?L-1 As+0.03%Silwet+0.5 g?L-1 MES+5%sucrose,p H5.8;OD650=0.3),选择3-5 mm大小的花蕾并剖除萼片和花瓣,采用液滴接种法接种,并进行2 d暗培养,应用优化后的程序,瞬时表达频率91.59%。之后正常培养植株即可获得转基因种子。2.利用GUS组织化学染色法,对农杆菌侵染乌菜花蕾组织进行显微观察,分析农杆菌介导乌菜花药非组织培养遗传转化的细胞生物学机理。研究结果表明,农杆菌遗传转化乌菜花蕾组织,是通过雄配子（花粉）,而非雌配子（胚珠）介导的。
李海艳[5]（2019）在《大白菜遗传转化和CRISPR/Cas9基因编辑体系的建立》文中认为大白菜（Brassica rapa L.ssp.Pekinensis）在农作物领域中属于常见的经济型农产品,尤其在中国、日本和韩国等亚洲地区被大面积耕种。随着基因工程技术的发展,农杆菌介导的遗传转化体系和基因编辑技术近年来不断地应用于大白菜育种过程中,加快了大白菜育种进程,同时改良了大白菜性状,为大白菜遗传育种研究奠定了实验基础。本研究建立了稳定高效的大白菜遗传转化体系,并将CRISPR/Cas9系统成功地应用于大白菜基因编辑。（1）试验材料选择大白菜‘C-24’自交系,构建大白菜孤基因BraA1000785超表达载体,通过农杆菌介导法,筛选农杆菌感受态、农杆菌菌液浓度、乙酰丁香酮浓度（AS）、外植体侵染时间和超声辅助处理等影响因素。由此建立了大白菜遗传转化体系,转化体系如下:农杆菌感受态:GV3101,菌液OD600=0.5,侵染培养基（DM）添加AS浓度为20 mg·L-1,外植体菌液侵染过程15 min且无需超声处理,共培养培养基（MC）添加AS浓度为20 mg·L-1（共培养暗处理48h）,外植体在筛选培养基（MS）中诱导抗性愈伤组织和抗性芽分化。获得的抗性苗首先利用潮霉素引物进行PCR检测,再通过GUS染色进一步鉴定,确定目的片段已成功导入大白菜‘C-24’基因组中,阳性株系通过荧光定量PCR（qPCR）分析BraA1000785基因在大白菜叶片中的表达水平。最终该体系经重复试验验证,平均转化效率为10.83%。（2）本研究在大白菜遗传转化体系的基础上进一步建立了大白菜CRISPR/Cas9基因编辑体系,以大白菜孤基因BraSca000221为靶基因,在T0代抗性植株中基因编辑效率为72%,均为杂合突变体。T0代株系经自交获得28株T1代突变体,其中纯合编辑植株占35.7%,杂合编辑植株占64.3%。以上研究结果表明,通过大白菜遗传转化体系,可以利用CRISPR/Cas9系统对大白菜基因组进行单靶点编辑。
石柳柳[6]（2019）在《甘蓝型油菜角果长和粒重主效QTL qSLWA9的克隆与功能分析》文中指出甘蓝型油菜（Brassica napus L.）是世界上植物油的第二大来源,提高其产量一直是油菜育种的重要目标。角果是一个十分重要的生理和生殖器官。油菜籽粒产量的三个构成因子——单位面积有效角果数、每角果粒数和粒重都与角果的生长发育密切相关。角果长和粒重是影响籽粒产量的数量性状,由多个QTL位点基因控制。目前,对角果长和粒重的研究仍集中在QTL定位的工作上,成功克隆到的基因还很少。在前期研究中,本实验室利用亲本S1（长角果、大粒）和S2（短角果、小粒）衍生出的重组自交系群体在A9染色体上定位到一个控制角果长和粒重的主效QTL qSLWA9。在一个残余杂合系后代中,得到了该QTL的近等基因系。本研究中,我们实现了qSLWA9的精细定位并通过图位克隆分离了该主效QTL基因BnaA9.CYP78A9,分析了BnaA9.CYP78A9的表达模式和进化来源,初步研究了基因的功能。主要研究结果如下:1.qSLWA9的精细定位。我们利用近等基因系NIL（S1）（长角果、大粒）和NIL（S2）（短角果、小粒）杂交得到的NIL-F2分离群体用于精细定位。通过分析9,737株NIL-F2单株的基因型和表型,最终将qSLWA9限定在分子标记SL5和SL15之间,对应白菜Chiifu-401-42参考基因组的A9染色体上约89-kb的物理距离,对应甘蓝型油菜测序品种ZS11的A9染色体约86-kb的物理距离,标记SL5位于甘蓝型油菜测序品种Darmoar-bzh的A9random scaffold1826上,SL15则位于A9染色体上。区段内含13个注释基因。2.qSLWA9的候选基因预测。根据白菜和油菜基因组的注释信息,对定位区段内的基因进行了表达和序列分析。结果发现,BnaA09g55530D在S1中的表达水平显着高于S2中的,BnaA09g55520D在S1基因组中缺失,预测这两个基因是候选基因。3.qSLWA9的比较测序与克隆。S1和S2中BnaA09g55530D的比较测序表明,双亲中BnaA09g55530D的编码区序列无差异,起始密码子上游3.9-kb区段内存在4个碱基的差异。在S1中,BnaA09g55530D起始密码子上游3.9-kb处插入一个3.7-kb的DNA片段,却丢失了一个包含基因BnaA09g55520D的12.3-kb的片段。油菜的遗传转化实验表明,3.7-kb片段的插入引起了角果皮BnaA09g55530D表达量的升高,导致了长角果和大粒。BnaA09g55530D是拟南芥AT3G61880（CYP78A9）的直系同源基因,命名为BnaA9.CYP78A9。4.BnaA9.CYP78A9的表达模式和蛋白亚细胞定位。BnaA9.CYP78A9在甘蓝型油菜的子叶、根、茎、叶片、花蕾、角果皮和种子各组织中广泛表达,但在角果皮组织中表达水平最高。在角果生长发育的各阶段,S1中BnaA9.CYP78A9的表达水平都显着高于S2的。BnaA9.CYP78A9蛋白定位在细胞膜上。5.插入BnaA9.CYP78A9上游区的3.7-kb片段分析。序列分析发现,插入BnaA9.CYP78A9上游调控区的3.7-kb片段是一个不完整的CACTA-like转座子。该转座子右端是典型的含保守’CACTA’基序的末端重复序列（TGTTTCTTGTAGTG）,但左端保守序列缺失,片段内含转座酶基因。此3.7-kb片段一系列5’端截短的序列驱动minimal 35S GUS报告基因转化拟南芥的染色及GUS酶活的定量实验表明,该3.7-kb转座子发挥着增强子的作用,并且含有两个增强子作用的功能元件,位置分别位于-4.58～-4.12 kb和-4.12～-3.92 kb间,且后者的增强效果弱于前者。6.插入BnaA9.CYP78A9上游区的3.7-kb片段的起源。根据亲本间基因BnaA9.CYP78A9的比较测序结果,我们开发了鉴定3.7-kb CACTA-like转座子是否存在的特异性标记,利用此标记分析了245份油菜材料的基因型,在25份中国来源的材料中检测到此CACTA-like转座子。此外,含有此转座子的油菜都表现为长角果和大粒。利用此标记对174份中国白菜进行基因型分析,鉴定出3份含CACTA-like转座子插入的白菜,其角果长度显着大于不含CACTA-like转座子插入的白菜材料。以上结果表明,插入BnaA9.CYP78A9上游区的3.7-kb CACTA-like转座子来源于中国的白菜,且是在白菜和甘蓝形成异源四倍体的油菜之前就存在白菜中了。7.BnaA9.CYP78A9的功能研究。通过油菜角果的动态生长及BnaA9.CYP78A9的表达水平,发现长角果材料中的BnaA9.CYP78A9的表达量更高,角果生长速率更快且持续伸长时间延长。扫描电镜观察亲本角果皮细胞表明,角果长度的差异主要是由角果皮细胞长度的差异决定。BnaA9.CYP78A9高表达的转基因互补株系的阳性株和长角果S1中的IAA含量都高于短角果的阴性株和S2的,表明BnaA9.CYP78A9通过影响生长素的含量来调控角果的伸长。
胡蝶[7]（2019）在《农杆菌介导的白菜类作物转基因体系建立及WRKYⅡa转录因子蛋白互作验证》文中提出Rapid-cycling Brassica rapa（RCBr）是一类株型矮小、连续光照条件下生命周期约为40天的白菜类植物,被大量用于生物学教学,但关于其遗传转化的成功案例仍未见报道。由于蘸花法被广泛用于转基因拟南芥的获得,真空渗透法可用于进行‘四九菜心’的遗传转化,本研究对三种不同生长时期的RCBr进行了农杆菌介导的真空渗透或蘸花处理,结果均获得了 GFP阳性植株,总计转化率为0.1%（1株每1000颗T1种子）。此外,还对转化株进行了 PCR和Southern印迹杂交实验的验证。RCBr遗传转化系统的成功建立,将促进新的生物学教学工具的发展和对白菜类植物的基础生物学研究。WRKY转录因子是植物中最大的转录因子家族之一,在植物病害防御反应中发挥了重要作用。根据拟南芥WRKY Ⅱa转录因子氨基酸序列和已有的白菜WRKY基因家族分析结果,对不结球白菜WRKY Ⅱa转录因子进行克隆,结果发现共有六个基因,将新发现的两条序列分别命名为BcWRKY98和BcWRKY104。通过进化树分析发现,BcWRKY1、BcWRKY18 和 BcWRKY60 与 AtWRKY18 同源,BcWRKY40、BcWRKY98和BcWRKY104与AtWRKY40同源。霜霉病菌侵染实验发现,在抗病品种‘苏州青’中,WRKY Ⅱa转录因子的相对表达量在48hpi上升、72hpi下降。因此,了解WRKY Ⅱa转录因子的功能有助于不结球白菜抗病育种的发展。通过酵母双杂交实验发现,不结球白菜WRKY Ⅱa转录因子间存在复杂的互作关系。以BcWRKY1为诱饵进行酵母双杂交文库筛选发现,部分候选蛋白参与植株信号转导和逆境响应。考虑到蛋白功能冗余的问题,构建了靶标为一个或多个WRKY Ⅱa基因的CRISPR/Cas9载体,并进行了白菜转化。尽管在获得的转基因白菜中靶标基因位点没有发生突变事件,但转基因植株仍表现出异于野生型材料的表型,因此说明转基因白菜中发生了 T-DNA插入突变。以具有异常表型的转基因白菜DNA为模板,使用TAIL-PCR分别对T-DNA左、右侧翼序列进行扩增并测序,发现在FPsc转基因材料IIaG-1中,基因Brara.F03841的3’端为T-DNA的一个插入位点。
吕天琦[8]（2019）在《白菜C2H2型锌指蛋白基因家族的进化及DAZ3在转录水平调控花粉发育的研究》文中认为花粉发育是被子植物生殖发育的重要环节,花粉的育性直接关系到植株能否进行授粉受精进而产生下一代,这对于十字花科蔬菜等农作物的产量及种子的品质至关重要。花粉的发育涉及到一系列复杂的基因调控过程,众多的转录因子在其中发挥着重要的调控功能。C2H2型锌指蛋白组成了最大的核酸结合类群,通过其锌指结构域能够与DNA、RNA或蛋白结合,进而参与到多样的生物过程。在花发育过程中,C2H2型锌指蛋白能够作为组蛋白甲基转移酶或去甲基化酶参与开花诱导过程,通过影响细胞增殖并受激素调控等多种形式作用于花器官模型特征基因的转录调控。然而,关于C2H2型锌指蛋白参与花发育后期的成熟过程尤其是花粉发育过程中的转录调控鲜有报道。对C2H2型锌指蛋白在花粉发育过程中的功能和转录调控研究,将为认识该家族基因在此领域中的调控机制提供新的知识,对于探究被子植物的生殖发育具有重要意义。本文以白菜（Brassicacampestris subsp.chinensis（syn.Brassicarapasubsp.chinensis））为材料,对白菜C2H2型锌指蛋白基因家族进行鉴定、进化和表达分析,为研究C2H2型锌指蛋白在花粉发育过程中的功能提供数据基础。随后重点对BrDAZ3的表达进行分析,并通过RNA干涉技术、CRISPR CAS9技术和过表达技术研究BrDAZ3在白菜花粉发育过程中的功能;并以模式植物拟南芥为材料,对BrDAZ3的拟南芥直系同源基因AtDAZ3的T-DNA插入突变体进行鉴定,分析AtDAZ3的突变对花粉发育的影响;使用农杆菌介导的浸花转化法对AtDAZ3基因突变的表型进行恢复,确认突变体的表型是由AtDAZ3单基因引起的;结合过表达技术,分析AtDAZ3在拟南芥花粉发育过程中的作用;并通过酵母单杂交、酵母双杂交、双分子荧光互补以及双荧光素酶实验分析DAZ3在花粉发育过程中的转录调控。取得的主要结果与结论如下:（1）对白菜C2H2型锌指蛋白基因家族进行鉴定,得到243个该家族基因。根据锌指结构域的数目,锌指间的间隔,以及是否含有QALGGH结构域,将白菜C2H2型锌指蛋白分为5种不同的类型;通过基因结构、蛋白结构域和进化树分析,将该基因家族分为1～X个亚族。值得关注的是,Ⅱ、Ⅳ和Ⅸ这三个亚族的多数成员以及X亚族的两个成员,在其C端含有EAR抑制结构域。通过染色体定位、基因复制和共线性分析,发现白菜C2H2型锌指蛋白基因家族的扩张主要来源于片段重复和串联重复。通过计算直系和旁系同源基因之间的Ka,Ks和Ka/Ks值来分析复制后基因分化的选择类型和机制,结果显示,白菜的旁系同源是在与拟南芥基因组分离后经历全基因组三倍化事件产生的,且白菜的C2H2型锌指蛋白与拟南芥的C2H2型锌指蛋白相比在进化的过程中有较低的选择压力和进化速率。此外对白菜C2H2型锌指蛋白基因在根、茎、叶、花和角果以及萼片、花瓣、雄蕊和雌蕊中的表达进行分析,筛选在雄蕊中特异或高表达的基因,并分析其在花粉母细胞时期、四分体时期、单核花粉时期、双核花粉时期和三核花粉时期的表达,筛选出至少20个潜在的花粉发育相关的C2H2型锌指蛋白基因。并通过共表达网络分析,探究C2H2型锌指蛋白基因在花发育过程中的调控网络。（2）克隆得到BrDAZ3的CDS和基因全长,根据氨基酸序列推断其编码的是一个D类型的C2H2型锌指蛋白,且在C端含有两个EAR抑制结构域。分析BrDAZ3的时空表达模式,通过RT-PCR和qPCR检测其在各个组织和器官中的表达水平,发现BrDAZ3在雄蕊中特异高表达;检测其在不同花蕾发育时期的表达,发现BrDAZ3在单核小孢子时期开始表达,在随后的发育时期表达逐渐增加,直至三核花粉时期表达最高,且能够在花粉管中持续表达,即BrDAZ3属于花粉发育过程中的“晚期”基因。通过亚细胞定位分析,发现BrDAZ3是定位在细胞质和细胞核的蛋白,表明其能够参与核蛋白的转录调控,同时也能够参与细胞质中重要的生化代谢活动。（3）利用RNA干涉、CRISPR CAS9技术和过表达技术分析BrDAZ3的功能,发现BrDAZ3表达的异常影响花粉壁和花粉管的发育。BrDAZ3的异常表达不影响营养生长,但导致约一半的花粉自单核时期开始细胞质发生异常降解,并在随后的发育过程中逐渐加剧,最终导致花粉粒皱缩坍塌,且无内壁的形成,同时异常的花粉粒自坍塌处外壁的基粒棒形状异常呈球形。BrDAZ3的异常表达还能够影响花粉管的体外萌发,BrDAZ3表达的下调导致约一半的花粉不能萌发,部分萌发的花粉形状异常,花粉的细胞质向外异常突出导致花粉粒被撑破而分为两瓣,且萌发的花粉管顶端卷曲;而BrDAZ3表达的上调则引起部分花粉管的顶端膨大呈泡状。这些异常的花粉在雌蕊中的萌发受阻,最终导致自交授粉后大部分胚珠不能受精,产生的角果变短,且部分没有种子,结籽率降低。（4）AtDAZ3具有与BrDAZ3相似的保守结构域和表达模式。AtDAZ3编码的也是一个D类型的C2H2型锌指蛋白。分析AtDAZ3的时空表达模式,结果显示,AtDAZ3在花中高表达,且在花发育的第11时期即单核花粉时期开始表达,随着发育历程表达逐渐增加,在第14时期的成熟花粉中表达最高,并持续在花粉管中表达,即与BrDAZ3的表达相似。分析AtDAZ3的亚细胞定位,发现其定位在细胞质和细胞核中。（5）突变体atdaz3的叶片变窄,花器官较小且花粉发育异常。对atdaz3的营养生长进行观察,发现叶片的长宽与野生型相比显着增加,且叶片的表皮细胞变大,靠近上表皮的栅栏组织细胞形状异常、细胞间隙变大,海绵组织的细胞排列紊乱。花器官的萼片、花瓣、雄蕊和雌蕊的宽度或长度均显着或极显着低于对照。AtDAZ3的突变导致花粉自单核时期细胞质开始降解,最终导致内壁无法形成,花粉粒皱缩坍塌,且自坍塌处外壁的基粒棒形状异常呈球形。突变体的花粉体内萌发受阻,导致自交授粉后大部分胚珠不能受精,结籽率降低。AtDAZ3能够完全恢复突变体atdaz3的表型。AtDAZ3表达的上调不影响营养生长和花器官的发育,产生的花粉部分自单核时期开始细胞质异常降解,最终形成皱缩坍塌的小孢子,但这种异常并不影响最终的结籽率。（6）BrDAZ3和AtDAZ3在花粉发育过程中具有相同的转录调控途径。BrDUO1a,而不是BrDUO1b能够直接激活BrDAZ3的转录;AtDUO1能够直接激活AtDAZ3的转录,其中DAZ3启动子上的MYB结合位点是转录激活必须的。BrDAZ3和AtDAZ3的C端的EAR抑制结构域能够与BrTPL/TPR和AtTPL/TPR的N端的CTLH结构域互作,彼此形成复合物。此外,在白菜和拟南芥中,DAZ3和TPL分别能够与HDA6和HDA19互作。检测参与花粉内壁、外壁和花粉管发育相关基因在atdaz3中的表达,结果显示一系列参与内壁物质合成、外壁孢粉素合成基因的表达异常,花粉管发育过程中细胞壁的形成和修饰、细胞信号传导和细胞转运等相关基因的表达发生变化;检测细胞增殖、细胞循环和细胞分裂相关基因在atdaz3中的表达也存在异常。因此得出的转录调控模型为,DAZ3能够被DUO1直接激活调控,DAZ3与TPL、HDA6和HDA19形成共抑制因子抑制下游基因的转录,从而参与花粉壁和花粉管的发育。
柳婷婷[9]（2018）在《白菜和甘蓝PMEI基因家族成员的比较与PMEI1和PMEI85的功能鉴定》文中进行了进一步梳理果胶是植物初生细胞壁的主要成分,同时也是花粉壁和花粉管壁的主要成分。果胶在维持细胞结构的完整性、细胞之间的连接以及防御反应的调控等方面发挥着重要作用。果胶的合成和降解需要一系列酶的参与。果胶甲酯酶（pectin methylesterases,PMEs）是第一类对果胶发生催化作用的酶,其活性受到果胶甲酯酶抑制子（pectin methylesterase inhibitors,PMEIs）的调控。PMEI家族成员众多。目前,已在多个物种中鉴定出PMEI基因,并证实其参与植物生长发育的多个过程,例如下胚轴伸长、花粉发育和花粉管生长、种子萌发、果实成熟以及各种胁迫响应等。在进化过程中,由于全基因组复制和串联复制等事件的发生,会产生许多重复PMEI基因。此外,全基因组复制事件后通常伴随着会引起大量基因丢失的二倍化事件,导致重复PMEI基因命运的改变。前人已对多个物种的PMEI基因家族成员的进化机制和表达特征进行了一定程度的分析。然而,PMEI基因家族成员在进化过程中的扩张模式,重复PMEI基因的表达特征,PMEI基因家族成员的保留和丢失机制,以及直系同源PMEI基因的比较和功能鉴定等方面尚不甚明了。在本论文中,我们以芸薹属物种白菜（Brassica campestris L.subsp.chinensis Makino,syn.B.rapa subsp.chinensis）和甘蓝（B.oleracea）为实验材料,结合已公布的全基因组测序数据,对白菜和甘蓝PMEI基因家族成员的进化和表达模式进行了深入分析。此外,还对白菜和甘蓝PMEI基因家族的扩张模式、保留率和同源基因间的表达差异,以及PMEI基因家族成员在三个亚基因组上的分布情况进行了比较。为了进一步了解PMEI基因在花粉发育过程中的潜在功能,对白菜中的两个花粉特异表达基因BcPMEI1（基因ID:Bra013821）和BcPMEI85（基因ID:Bra017515）,以及甘蓝中的一个花粉特异表达基因BoPMEI1（基因ID:Bol039450）进行了深入研究。获得的主要结果和结论如下:（l）在白菜全基因组中,鉴定出100个PMEI基因家族成员。染色体定位分析结果显示,96个PMEI基因无规则地排列在10白菜条染色体上,剩下的4个基因分别位于scaffold000164、scaffold000215、scaffold000257和scaffold000305上。检测出9组串联重复基因,它们共包含20个PMEI成员。对其与拟南芥的PMEI基因进行共线性分析,发现80对共线性直系同源基因。这些结果说明,全基因组三倍化和串联复制是白菜PMEI基因家族扩张的主要来源。在进化过程中,白菜PMEI基因的保留率为52%,符合“基因平衡理论”。其在LF亚基因组上的保留率（60%）显着高于其在MF1（50%）和MF2（42%）亚基因组上的保留率,这个现象与白菜全基因组在三个亚基因组上的基因保留情况一致,可以用“二步法理论”解释。对同源PMEI基因对的非同义替换率、同义替换率以及二者之间的比值进行分析,结果显示,白菜PMEI家族在进化过程中主要经历了纯化选择。通过qRT-PCR以及转录组数据分析,发现10个白菜PMEI基因成熟花粉粒中有高且特异的表达水平。分析白菜PMEI基因家族成员的启动子序列,发现许多与激素处理和胁迫响应相关的顺式作用元件。（2）与白菜一样,PMEI基因在甘蓝中也是一个很大的基因家族,共鉴定出95个甘蓝PMEI基因家族成员。染色体定位分析结果显示,79个甘蓝PMEI成员无规则排列在9条染色体上,其余16个成员不能被明确定位到染色体上,它们位于scaffold上。检测出10组串联重复基因,它们共包含21个PMEI成员。共线性分析结果显示,甘蓝和拟南芥的基因组间共存在77对直系同源PMEI基因。上述结果说明,甘蓝PMEI基因家族扩张的主要来源与白菜一样,都是全基因组三倍化和串联复制事件。在进化过程中,甘蓝PMEI基因的保留率稍低于白菜PMEI基因的保留率,但仍然高达50%;其在LF亚基因组上的保留率（60%）显着高于其在MF亚基因组上的保留率;但与白菜不同的是,甘蓝PMEI基因在MF1亚基因组上的的保留率（42%）低于其在MF2亚基因组上的保留率（47%）。非同义替换率和同义替换率分析结果显示,在进化过程中,与白菜PMEI成员所经历的的选择类型一致,甘蓝PMEI家族成员主要也是经历了纯化选择,且分歧时间与全基因组三倍化事件的发生时间相近。qRT-PCR分析结果显示,PMEI基因与甘蓝生长发育过程密切相关,其中5个基因在成熟雄蕊中有高且特异的表达水平。此外,在甘蓝PMEI基因家族成员的启动子区域,鉴定出许多与激素处理和胁迫响应相关的顺式作用元件。（3）基于BRAD的基因组信息,从白菜和甘蓝中分别克隆得到了BcPMEI1 和BoPMEI1的DNA序列和CDS全长。分析结果表明,BcPMEI1和BoPMEI1均含有2个外显子,1个内含子。二者所编码的氨基酸序列具有很高的相似性。信号肽预测和亚细胞定位实验结果表明,BcPMEI1和BoPMEI1是定位于质膜和细胞壁的分泌蛋白。通过qRT-PCR分析,发现BcPMEI1和BoPEI1和均在成熟雄蕊中有很高的表达水平,但它们表达模式存在差异。（4）经BcPMEI1的过表达分析,发现转基因拟南芥植株约50%的花粉无活力、塌陷皱缩、体积变小,角果短、结籽数量少。半薄切片和超薄切片透射电镜观察结果表明,畸形花粉自单核时期出现异常,花粉内壁不能正常形成,内含物和细胞核最终完全降解。以上结果说明BcPMEI1可能通过调控花粉内壁形成过程中的果胶代谢过程,影响花粉发育。对启动子序列进行分析,结果显示,BcPMEI1和BoPEI1和的启动子序列相似性为84.35%,均含有花粉特异的基序和经典的顺式调控元件。启动子-GUS分析结果表明,BcPMEI1和BoPMEI1启动子驱动的GUS信号皆主要出现在成熟花药和花粉中。（5）基于BRAD的白菜基因组信息,通过克隆得到BcPMEI85的DNA序列和CDS全长。该基因没有内含子。亚细胞定位实验以及信号肽和跨膜结构域预测结果表明,BcPMEI85是一个定位于质膜和细胞壁的分泌蛋白。BcPMEI85的启动子区域含有花粉特异的基序以及多个与激素处理和胁迫响应相关的顺式作用元件。通过启动子-GUS分析,发现BcPMEI85启动子驱动的GUS信号主要在成熟的花药和花粉中表达。qRT-PCR分析结果显示,BcPMEI85在花粉发育晚期的雄蕊中有高且特异的表达水平。At5G46940是BcPMEI85的同源基因。拟南芥芯片数据分析结果表明,At5G46940主要在成熟雄蕊和花粉中表达。通过反义RNA技术抑制BcPMEI85的表达后,与对照植株相比,转基因植株的花器官形态、花粉形态和花粉活力并未出现异常,表明可能存在其它的PMEI基因与BcPMEI85的功能冗余。
石文慧[10]（2017）在《油菜高效再生体系的建立及草甘膦抗性基因EPSPs和BnGRF2的遗传转化》文中研究指明油菜属十字花科（Cruciferae）芸薹属（Brassica）,是我国重要的油料作物之一。随着国际竞争日趋激烈,我国油菜生产还面临许多挑战,高含油率油菜种植资源尤为稀缺。长调节因子生（growth-regulating factor,GRF）作为一种转录因子对植物生长发育起着重要的调节作用。已有研究证明,油菜生长调节因子BnGRF2可提高转化的拟南芥种子含油量,同时增加粒重,但BnGRF2调控油菜的研究尚未见报道。此外,杂草危害是限制油菜产业发展的因子之一,伴随着我国农村劳动力的日益紧缺,靠人工除草已不能满足油菜生产的需求,并且增加了生产成本。因此,本研究通过转基因手段将BnGRF2和草甘膦抗性基因EPSPs应用于油菜,对于确定BnGRF2在油菜种子发育和油脂合成中的作用、双价基因对油菜生长的影响具有一定的理论意义,也为同时获得提高种子含油量和具有除草剂抗性的新型油菜种质资源奠定了基础。本文以甘蓝型油菜品种“青杂5号”恢复系“1831R”（简称QZ-1831R）和白菜型油菜品种H165的下胚轴和叶片为研究对象,设置不同浓度的6-BA和2,4-D,6-BA和GA3的正交试验,从中选择出适于甘蓝型油菜和白菜型油菜下胚轴与叶片诱导愈伤和芽再生培养基。在此基础上,以8个品种（系）为试验材料,研究不同基因型对再生体系的影响。以筛选出的较优4种基因型为研究对象,设计5个NAA/IAA的浓度梯度,选择适于甘蓝型和白菜型油菜生根的NAA/IAA浓度。此外,本研究在农杆菌介导法的基础上,探究不同时间处理的超声波法和不同真空渗透压力真空渗透法对转化的影响。同时,本研究使用了最适于转化过程中脱除农杆菌的不同浓度梯度的四种抗生素（羧苄青霉素（Carb）、阿莫西林（Cav）、头孢霉素（Cef）、特美汀（Tim））。取得的主要结果如下:1.油菜高频再生体系影响要素的探究（1）最适于QZ-1831R下胚轴和叶片的愈伤诱导培养基中6-BA的浓度为2 mg·L-1,2,4-D的浓度为0.5 mg·L-1;最适于H165下胚轴和叶片的愈伤诱导中6-BA的浓度为2 mg·L-1,2,4-D的浓度为1.0 mg·L-1。最佳的芽再生培养基中6-BA的浓度均为4 mg·L-1,GA3均的浓度为1.5 mg·L-1。因此,可在甘蓝型油菜的愈伤诱导培养基中加入2 mg·L-1 6-BA,0.5 mg·L-12,4-D;在白菜型油菜的愈伤诱导培养基中加入2 mg·L-1 6-BA,1.5 mg·L-1 2,4-D;在芽再生培养基中可加入4 mg·L-1 6-BA,1.5 mg·L-1 GA3。（2）不同的基因型对植株再生的影响不一。下胚轴愈伤诱导率由高到底依次为QZ-1831R>H165>LY-C20>QZ-482R>GZ-3219R>H403-3>H403-2;叶片愈伤诱导率依次为GZ-3219R>H403-3>QZ-1831R≥QZ-482R>LY-C20≥H165>H403-2。芽再生中,甘蓝型油菜品种的下胚轴及叶片的芽再生率均高于白菜型。表明基因型对油菜再生能力有很大影响,同时甘蓝型油菜中表现最好的为QZ-1831R和GZ-3219R,白菜型油菜中表现最好的为H165和H403-3。（3）最适于QZ-1831R、GZ-3219R的最优生根培养基为1/2MS+0.2 mg·L-1 NAA(0.4mg·L-1 IAA);H165、H403-3的最优生根培养基为1/2MS+0.5 mg·L-1（NAA/IAA）。说明甘蓝型油菜较白菜型油菜易生根。2.农杆菌介导的遗传转化及分子检测（1）对农杆菌介导和超声波或真空渗透转化法以及抗生素脱菌效果进行了研究,结果表明超声波处理15 s为宜;真空渗透压力为0.05 Mpa,时间为2 min时,下胚轴及叶片的转化效率明显优于其它处理;抗生素浓度在500-600 mg·L-1下,均可有效抑制农杆菌的生长,抗生素浓度低于500 mg·L-1时,Carb抑菌效果最好,但是芽再生阶段300 mg·L-1的Cav处理下芽再生能力最强。（2）经草甘膦抗性筛选及PCR初步检测,甘蓝型油菜中QZ-1831R的下胚轴和叶片转化率最高,分别为4.83%、4.98%;白菜型油菜品种中H403-2的下胚轴及叶片转化率最高,分别为4.4%、4.2%。（3）对转基因油菜T1代植株进行qRT-PCR检测分析,结果表明:除QZ-1831R外,其余6个品种中BnGRF2表达量显着高于对照植株。研究BnGRF2对7个转基因品种含油量和千粒重的影响,发现除QZ-1831R外,甘蓝型品种GZ-3219R、QZ-482R、LY-C20,白菜型品种H165、H403-2、H403-3的含油量和千粒重显着高于WT。
二、农杆菌介导的白菜遗传转化影响因子研究进展（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、农杆菌介导的白菜遗传转化影响因子研究进展（论文提纲范文）
（1）苜蓿HD-Zip转录因子基因Mfhb-1对烟草和小麦的遗传转化及抗旱性研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略词中英文对照表 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 植物抗旱性研究进展 |
| 1.1.1 干旱胁迫对植物的影响 |
| 1.1.2 植物对干旱胁迫的响应 |
| 1.2 植物转录因子研究进展 |
| 1.2.1 植物转录因子的结构 |
| 1.2.2 植物转录因子的分类 |
| 1.2.3 植物转录因子的生物学功能 |
| 1.3 植物HD-Zip转录因子研究进展 |
| 1.3.1 植物HD-Zip转录因子的结构及分类 |
| 1.3.2 植物HD-Zip转录因子的生物调控功能 |
| 1.3.3 影响植物HD-Zip转录因子基因表达的因素 |
| 1.3.4 苜蓿HD-Zip类转录因子Mfhb-1 |
| 1.4 植物遗传转化方法研究进展 |
| 1.4.1 农杆菌介导法 |
| 1.4.2 花粉管通道法 |
| 1.4.3 基因枪介导法 |
| 1.5 前期研究基础 |
| 1.6 本课题研究目标及意义 |
| 1.6.1 研究目标 |
| 1.6.2 研究意义 |
| 1.7 技术路线 |
| 第二章 苜蓿HD-Zip转录因子基因Mfhb-1 对烟草的遗传转化及分子生物学检测 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 植物材料 |
| 2.1.2 根癌农杆菌工程菌及质粒 |
| 2.1.3 试剂与仪器 |
| 2.1.4 培养基 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 烟草外植体准备 |
| 2.2.2 根癌农杆菌活化培养及侵染液制备 |
| 2.2.3 侵染及共培养 |
| 2.2.4 脱菌培养 |
| 2.2.5 筛选培养 |
| 2.2.6 生根培养 |
| 2.2.7 转基因烟草的分子检测及T_3代纯合筛选 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 烟草Mfhb-1基因遗传转化再生结果及分析 |
| 2.3.2 根癌农杆菌最适侵染时间及浓度确定 |
| 2.3.3 T_3代纯合转Mfhb-1 基因烟草PCR电泳结果及分析 |
| 2.3.4 RNA提取质量检测 |
| 2.3.5 T_3代纯合转Mfhb-1 基因烟草RT-PCR电泳结果及分析 |
| 2.4 讨论 |
| 2.4.1 烟草组织培养及筛选过程的优化 |
| 2.4.2 烟草遗传转化体系优化 |
| 2.4.3 植物叶片RNA的提取优化 |
| 第三章 干旱胁迫下转Mfhb-1基因T_3代纯合烟草的的表观观测及生理指标测定 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 植物材料 |
| 3.1.2 试剂与仪器 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 烟草植株干旱胁迫 |
| 3.2.2 烟草表观形态观测 |
| 3.2.3 抗氧化保护酶SOD和 POD活性测定 |
| 3.2.4 渗透调节物质Pro、可溶性糖、可溶性蛋白含量测定 |
| 3.2.5 含水率及MDA含量测定 |
| 3.2.6 叶绿素含量测定 |
| 3.2.7 数据处理 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 干旱胁迫下T_3纯合转Mfhb-1基因烟草形态变化 |
| 3.3.2 干旱胁迫下T_3代纯合转Mfhb-1 基因烟草保护酶SOD和 POD活性测定结果及分析。 |
| 3.3.3 干旱胁迫下T_3代纯合转Mfhb-1 基因烟草渗透调节物质Pro、可溶性糖、可溶性蛋白含量测定结果及分析 |
| 3.3.4 干旱胁迫下T_3代纯合转Mfhb-1 基因烟草含水率及MDA含量测定结果及分析 |
| 3.3.5 干旱胁迫下T_3代纯合转Mfhb-1基因烟草叶绿素含量测定结果及分析 |
| 3.4 讨论 |
| 3.4.1 干旱胁迫条件下,Mfhb-1基因转入对烟草表观形态的影响 |
| 3.4.2 干旱胁迫条件下,Mfhb-1基因转入对烟草保护酶活性及渗透调节物质的影响 |
| 3.4.3 干旱胁迫条件下,Mfhb-1 基因转入对烟草MDA、叶绿素及含水率的影响 |
| 第四章 HD-Zip类转录因子Mfhb-1 基因对小麦的遗传转化及分子生物学检测 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.1.1 植物材料 |
| 4.1.2 工程菌及质粒 |
| 4.1.3 实验试剂 |
| 4.1.4 培养基 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 试剂配制 |
| 4.2.2 植物材料准备 |
| 4.2.3 工程菌制备及侵染液的制备 |
| 4.2.4 真空辅助遗传转化 |
| 4.2.5 共培养 |
| 4.2.6 筛选培养 |
| 4.2.7 春化及移植 |
| 4.2.8 转基因烟草的PCR检测及数量统计 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 小麦Mfhb-1基因遗传转化结果及分析 |
| 4.3.2 转Mfhb-1 基因小麦的PCR电泳结果及分析 |
| 4.3.3 小麦遗传转化最适条件确定 |
| 4.4 讨论 |
| 4.4.1 小麦遗传转化体系的确定 |
| 4.4.2 根癌农杆菌介导下小麦遗传转化体系的优化 |
| 第五章 全文讨论及结论 |
| 5.1 Mfhb-1基因烟草转化植株的再生及分子生物学检测 |
| 5.2 根癌农杆菌介导法最适转化条件研究 |
| 5.3 干旱胁迫下Mfhb-1转录因子对烟草表观形态影响 |
| 5.4 T_3代转Mfhb-1基因烟草抗旱性鉴定 |
| 5.5 Mfhb-1转录因子影响植物抗旱性的可能机理 |
| 5.6 下一步研究工作设想 |
| 参考文献 |
| 附录 A |
| 致谢 |
| 攻读学位期间取得的研究成果 |
（2）适合抗根肿病研究的大白菜遗传转化体系的构建（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略词 |
| 1 前言 |
| 1.1 大白菜抗根肿病研究进展 |
| 1.2 芸薹属植物基因工程技术的研究进展 |
| 1.2.1 芸薹属植物转基因的方法和原理 |
| 1.2.2 芸薹属植物转基因的研究进展 |
| 1.3 芸薹属作物再生体系的研究进展 |
| 1.3.1 再生体系的研究进展 |
| 1.3.2 芸薹属植物离体组织再生的影响因素 |
| 1.4 芸薹属植物的遗传转化的研究进展 |
| 1.4.1 芸薹属植物的遗传转化的意义 |
| 1.4.2 芸薹属植物遗传转化的影响因素 |
| 1.5 大白菜转基因体系的研究现状 |
| 1.6 本研究的目的及意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 试验材料 |
| 2.1.1 植物材料 |
| 2.1.2 试剂 |
| 2.2 无菌苗的培养 |
| 2.3 大白菜离体再生体系 |
| 2.3.1 基因型的筛选 |
| 2.3.2 外植体类型的筛选 |
| 2.3.3 苗龄的筛选 |
| 2.3.4 外源激素浓度的筛选 |
| 2.4 p BWA(V)BS-Bra003466-gfp载体构建 |
| 2.5 大白菜离体再生体系 |
| 2.5.1 农杆菌菌液浓度 |
| 2.5.2 农杆菌菌液的制备 |
| 2.5.3 农杆菌菌液的活化 |
| 2.5.4 侵染用农杆菌菌液的制备 |
| 2.5.5 抗生素浓度的筛选 |
| 2.6 大白菜遗传转化体系建立流程 |
| 2.7 转基因植株的鉴定 |
| 2.7.1 PCR检测 |
| 2.7.2 荧光标记GFP鉴定 |
| 2.7.3 荧光定量q RT-PCR检测 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 大白菜离体再生体系的构建 |
| 3.1.1 基因型对大白菜离体再生体系的影响 |
| 3.1.2 外植体类型对大白菜离体再生体系的影响 |
| 3.1.3 外植体的苗龄对大白菜离体再生体系的影响 |
| 3.1.4 外源激素浓度的筛选 |
| 3.2 目标基因的载体构建 |
| 3.3 大白菜遗传转化体系的构建 |
| 3.3.1 农杆菌菌液浓度 |
| 3.3.2 抗生素的浓度筛选 |
| 3.3.3 优化的大白菜遗传转化流程 |
| 3.4 遗传转化体系的重复性试验 |
| 3.5 转基因植株的鉴定 |
| 3.5.1 PCR检测 |
| 3.5.2 荧光标记GFP观察 |
| 3.5.3 荧光定量q RT-PCR检测 |
| 4 讨论 |
| 4.1 再生体系的影响因素之植物材料的基因型 |
| 4.2 植物材料的外植体类型对再生体系的影响 |
| 4.3 苗龄对大白菜再生体系的影响 |
| 4.4 外源激素浓度组合对再生体系的影响 |
| 4.5 农杆菌菌液浓度对大白菜遗传转化的影响 |
| 4.6 抗生素浓度对大白菜遗传转化的影响 |
| 5 结论 |
| 5.1 大白菜离体再生体系的优化 |
| 5.2 建立稳定高效的大白菜遗传转化体系 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（3）羽衣甘蓝粉色叶基因的功能分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 前言 |
| 1.1 植物花青素合成途径 |
| 1.2 花青素合成相关的结构基因和转录因子 |
| 1.2.1 结构基因对花青素合成的影响 |
| 1.2.2 转录因子对花青素合成的影响 |
| 1.3 植物遗传转化方法 |
| 1.3.1 农杆菌介导法 |
| 1.3.2 影响芸薹属植物根癌农杆菌转化效率的因素 |
| 1.4 VIGS技术 |
| 1.4.1 VIGS的分子机制 |
| 1.4.2 VIGS技术在探究植物基因功能中的应用 |
| 1.4.3 VIGS技术的影响因素 |
| 1.5 本研究的目的意义与技术路线 |
| 1.5.1 本研究的目的与意义 |
| 1.5.2 本研究的技术路线 |
| 第二章 羽衣甘蓝粉色叶相关基因表达分析 |
| 2.1 试验材料 |
| 2.1.1 植物材料 |
| 2.1.2 试验试剂 |
| 2.1.3 试验仪器 |
| 2.2 试验方法 |
| 2.2.1 试剂盒法提取总RNA |
| 2.2.2 琼脂糖凝胶电泳检测RNA质量检测 |
| 2.2.3 试剂盒法反转录cDNA |
| 2.2.4 半定量RT-PCR |
| 2.2.5 定量PCR分析 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 RNA提取质量检测 |
| 2.3.2 羽衣甘蓝中BoDFR、BoMYB2表达量分析 |
| 2.3.3 芸薹属近缘蔬菜中BoDFR、BoMYB2表达量分析 |
| 2.4 讨论 |
| 第三章 BoDFR基因在羽衣甘蓝中过量表达 |
| 3.1 试验材料 |
| 3.1.1 植物材料 |
| 3.1.2 试验试剂 |
| 3.1.3 试验仪器 |
| 3.1.4 遗传转化培养基配制 |
| 3.2 试验方法 |
| 3.2.1 农杆菌的转化 |
| 3.2.2 农杆菌活化及侵染液的制备 |
| 3.2.3 羽衣甘蓝播种 |
| 3.2.4 羽衣甘蓝遗传转化 |
| 3.2.5 转基因羽衣甘蓝PCR检测 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 pCAMBIA1301-DFR农杆菌转化及鉴定 |
| 3.3.2 抗性植株的获得 |
| 3.3.3 转基因植株的鉴定 |
| 3.4 讨论 |
| 第四章 BoDFR基因在拟南芥中过量表达 |
| 4.1 试验材料 |
| 4.1.1 植物材料 |
| 4.1.2 试验试剂 |
| 4.1.3 试验仪器 |
| 4.1.4 培养基配制 |
| 4.2 试验方法 |
| 4.2.1 拟南芥的准备 |
| 4.2.2 花序浸染法转化拟南芥 |
| 4.2.3 卡那霉素筛选浓度的确定 |
| 4.2.4 转基因拟南芥的鉴定与分析 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 转基因拟南芥卡那霉素筛选浓度的确定 |
| 4.3.3 转基因拟南芥的获得 |
| 4.3.4 转基因拟南芥PCR检测 |
| 4.3.5 转基因拟南芥花青素含量测定 |
| 4.4 讨论 |
| 第五章 BoDFR基因在羽衣甘蓝中瞬时沉默 |
| 5.1 试验材料 |
| 5.1.1 植物材料 |
| 5.1.2 试验试剂 |
| 5.1.3 试验仪器 |
| 5.2 试验方法 |
| 5.2.1 农杆菌活化及侵染液的制备 |
| 5.2.2 VIGS注射转化 |
| 5.2.3 沉默结果检测 |
| 5.3 结果与分析 |
| 5.3.1 沉默后表型观察 |
| 5.3.2 沉默后植株的病毒分子检测 |
| 5.3.3 沉默后BoDFR基因的表达情况 |
| 5.3.4 沉默前后花青素含量测定 |
| 5.4 讨论 |
| 第六章 羽衣甘蓝BoDFR基因分子标记开发 |
| 6.1 试验材料 |
| 6.1.1 植物材料 |
| 6.1.2 试验试剂 |
| 6.1.3 试验仪器 |
| 6.2 试验方法 |
| 6.2.1 BoDFR基因功能标记的开发 |
| 6.2.2 羽衣甘蓝叶片DNA的提取 |
| 6.2.3 PCR反应体系及条件 |
| 6.3 结果与分析 |
| 6.3.1 显性标记在羽衣甘蓝红白品种中的应用 |
| 6.3.2 共显性标记在羽衣甘蓝红白品种中的应用 |
| 6.4 讨论 |
| 第七章 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的论文 |
（4）农杆菌介导乌菜花药非组织培养遗传转化体系的建立（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 1 文献综述 |
| 1.1 植物转基因技术 |
| 1.1.1 转基因技术的原理 |
| 1.1.2 转基因技术的方法 |
| 1.2 农杆菌介导的植物转基因方法研究 |
| 1.2.1 转化机理 |
| 1.2.2 影响遗传转化的因素 |
| 1.2.3 转基因植株的检测方法 |
| 1.3 乌菜育种技术研究进展 |
| 1.3.1 乌菜概述 |
| 1.3.2 育种技术相关研究 |
| 1.4 本研究的主要内容 |
| 1.5 本研究的目的及意义 |
| 1.6 实验技术路线图 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 试验材料 |
| 2.1.1 植物材料 |
| 2.1.2 菌株和载体 |
| 2.1.3 试剂 |
| 2.1.4 主要仪器设备 |
| 2.1.5 主要培养基的配置 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 花药发育观察 |
| 2.2.2 农杆菌感受态制备 |
| 2.2.3 表达载体转化农杆菌 |
| 2.2.4 遗传转化影响因素优化 |
| 2.2.5 农杆菌侵染与暗培养 |
| 2.2.6 GUS化学组织染色分析 |
| 2.2.7 转基因植株鉴定 |
| 2.2.8 数据分析与统计 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 花药发育的细胞学观察分析 |
| 3.2 遗传转化影响因素分析 |
| 3.2.1 BAP浓度对花蕾瞬时转化率的影响 |
| 3.2.2 乙酰丁香酮(As)浓度对花蕾瞬时转化率的影响 |
| 3.2.3 Silwet浓度对花蕾瞬时转化率的影响 |
| 3.2.4 共培养基pH对花蕾瞬时转化率的影响 |
| 3.2.5 花蕾大小对花蕾瞬时转化率的影响 |
| 3.2.6 花蕾处理方式对花蕾瞬时转化率的影响 |
| 3.2.7 农杆菌接种方式对花蕾瞬时转化率的影响 |
| 3.2.8 暗培养天数对花蕾瞬时转化率的影响 |
| 3.3 农杆菌介导乌菜花蕾最优遗传转化体系的建立 |
| 3.4 GUS组织化学染色分析 |
| 3.5 转基因植株筛选与鉴定 |
| 3.5.1 转基因植株筛选 |
| 3.5.2 PCR检测 |
| 3.5.3 GUS组织化学染色鉴定 |
| 4 讨论 |
| 4.1 花药发育对遗传转化的影响 |
| 4.2 乌菜遗传转化体系的建立 |
| 4.3 农杆菌侵染乌菜花蕾机理的分析 |
| 5 结论 |
| 5.1 建立了农杆菌介导乌菜花药遗传转化体系 |
| 5.2 明确了农杆菌侵染乌菜花蕾细胞生物学机理 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（5）大白菜遗传转化和CRISPR/Cas9基因编辑体系的建立（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 植物基因工程技术 |
| 1.1.1 植物基因工程技术的研究进展 |
| 1.1.2 植物基因工程技术的应用 |
| 1.2 芸薹属植物离体培养的研究 |
| 1.2.1 芸薹属植物离体再生体系的研究进展 |
| 1.2.2 芸薹属植物离体再生的影响因素 |
| 1.3 农杆菌介导芸薹属植物遗传转化的研究 |
| 1.3.1 农杆菌介导法的转化机理 |
| 1.3.2 影响农杆菌介导芸薹属作物遗传转化的因素 |
| 1.4 基因组编辑技术研究进展 |
| 1.4.1 CRISPR/Cas系统的发现与结构 |
| 1.4.2 CRISPR/Cas9的作用机理 |
| 1.4.3 CRISPR/Cas9系统在植物中的应用 |
| 1.5 本研究的主要内容 |
| 1.6 本研究的目的及意义 |
| 第二章 大白菜遗传转化体系的建立 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 试验材料 |
| 2.1.2 BraA1000785基因克隆 |
| 2.1.3 BraA1000785超表达载体的构建 |
| 2.1.4 大肠杆菌的制备 |
| 2.1.5 农杆菌的制备 |
| 2.1.6 大白菜遗传转化体系的流程 |
| 2.1.7 影响大白菜遗传转化的因素及统计分析 |
| 2.1.8 大白菜转基因植株的检测方法 |
| 2.1.9 大白菜遗传转化体系重复性试验 |
| 2.2 结果与分析 |
| 2.2.1 BraA1000785基因序列分析 |
| 2.2.2 BraA1000785超表达载体的构建 |
| 2.2.3 农杆菌阳性克隆鉴定 |
| 2.2.4 农杆菌菌株对大白菜遗传转化效率的影响 |
| 2.2.5 农杆菌菌液浓度对大白菜遗传转化效率的影响 |
| 2.2.6 乙酰丁香酮浓度对大白菜遗传转化效率的影响 |
| 2.2.7 外植体侵染时间对大白菜遗传转化效率的影响 |
| 2.2.8 超声辅助处理对大白菜遗传转化效率的影响 |
| 2.2.9 大白菜转基因植株的验证 |
| 2.2.10 大白菜遗传转化体系的稳定性 |
| 2.3 讨论 |
| 2.3.1 农杆菌对遗传转化的影响 |
| 2.3.2 酚类物质对遗传转化的影响 |
| 2.3.3 超声辅助处理对遗传转化的影响 |
| 2.3.4 转基因植株的检测 |
| 2.4 小结 |
| 第三章 大白菜CRISPR/Cas9基因编辑体系的建立 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 试验材料 |
| 3.1.2 菌种及载体 |
| 3.1.3 BraSca000221基因的生物信息学分析及获得 |
| 3.1.4 gRNA的设计 |
| 3.1.5 CRISPR/Cas9载体的构建 |
| 3.1.6 农杆菌介导的遗传转化 |
| 3.1.7 转基因植株的检测 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.2.1 BraSca000221序列分析 |
| 3.2.2 BraSca000221基因的靶点gRNA |
| 3.2.3 T0代转基因植株的获得 |
| 3.2.4 CRISPR/Cas9编辑效果检测 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（6）甘蓝型油菜角果长和粒重主效QTL qSLWA9的克隆与功能分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略语表 |
| 1 文献综述 |
| 1.1 研究问题的由来 |
| 1.1.1 甘蓝型油菜产量研究的重要性 |
| 1.1.2 甘蓝型油菜产量研究的复杂性 |
| 1.1.3 甘蓝型油菜角果相关性状的QTL定位与克隆 |
| 1.2 植物器官大小的研究进展 |
| 1.2.1 植物器官大小的分子调控机理研究 |
| 1.2.2 植物器官大小的调控途径研究 |
| 1.2.3 控制作物果实和籽粒大小的QTL基因研究 |
| 1.3 甘蓝型油菜角果长和粒重的研究进展 |
| 1.3.1 甘蓝型油菜角果长的研究进展 |
| 1.3.2 甘蓝型油菜粒重的研究进展 |
| 1.3.3 甘蓝型油菜长角果在育种实践中的应用 |
| 1.4 植物P450家族基因研究进展 |
| 1.4.1 P450基因的概述 |
| 1.4.2 植物P450基因的研究进展 |
| 1.4.3 植物CYP78A亚家族基因研究进展 |
| 1.5 本研究的目的与意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 实验材料的种植与管理 |
| 2.3 技术路线 |
| 2.4 qSLWA9的精细定位 |
| 2.4.1 分离群体的种植与表型考察 |
| 2.4.2 DNA提取、PCR扩增和聚丙烯酰胺凝胶电泳 |
| 2.4.3 标记的开发 |
| 2.4.3.1 SSR标记的开发 |
| 2.4.3.2 InDel标记的开发 |
| 2.4.4 交换单株的筛选与确定 |
| 2.5 候选基因的预测 |
| 2.5.1 定位区间内基因的RT-PCR分析 |
| 2.5.1.1 材料的取样 |
| 2.5.1.2 RNA的提取及cDNA的合成 |
| 2.5.1.3 基因特异引物的开发 |
| 2.5.1.4 RT-PCR |
| 2.5.2 定位区间内基因的序列分析 |
| 2.5.3 拟南芥的遗传转化 |
| 2.5.3.1 超表达载体的构建 |
| 2.5.3.2 转化方法及阳性株的筛选 |
| 2.6 目标基因的确定 |
| 2.6.1 候选基因的比较测序 |
| 2.6.2 BAC文库的筛选及引物开发 |
| 2.6.3 油菜转基因载体构建 |
| 2.6.3.1 BnaA09g55520D超表达载体构建 |
| 2.6.3.2 BnaA09g55530D等位启动子表达载体构建 |
| 2.6.3.3 BnaA09g55530D互补启动子表达载体构建 |
| 2.6.4 农杆菌介导的甘蓝型油菜的遗传转化 |
| 2.6.5 转基因植株的PCR检测和表型考察 |
| 2.6.6 互补测验T_1代植株的qRT-PCR分析 |
| 2.6.7 qSLWA9的敲除验证 |
| 2.6.7.1 双靶点CRISPR/Cas9敲除载体的构建与转化 |
| 2.6.7.2 转基因植株的检测 |
| 2.7 qSLWA9的表达模式 |
| 2.7.1 启动子分析载体构建 |
| 2.7.2 GUS染色 |
| 2.8 亚细胞定位 |
| 2.9 插入qSLWA9上游3.7-kb片段分析 |
| 2.9.1 利用双荧光素酶报告系统的启动子活性分析 |
| 2.9.2 利用minimal35S驱动GUS系统的启动子活性分析 |
| 2.9.2.1 插入的3.7-kb片段系列缺失mini35S-GUS载体构建 |
| 2.9.2.2 GUS蛋白活性的定量检测 |
| 2.10 qSLWA9的功能初探 |
| 2.10.1 角果生长曲线的绘制 |
| 2.10.2 扫描电镜观察角果皮细胞 |
| 2.10.3 转录组测序(RNA-seq)分析 |
| 2.10.4 生长素含量的测定 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 qSLWA9的精细定位 |
| 3.2 qSLWA9候选基因的预测 |
| 3.2.1 qSLWA9区间的基因 |
| 3.2.2 qSLWA9区间基因RT-PCR分析 |
| 3.2.3 qSLWA9区间基因CDS序列分析 |
| 3.2.4 候选基因的预测 |
| 3.3 qSLWA9目的基因的确定 |
| 3.3.1 BnaA09g55520D和BnaA09g55530D的比较测序 |
| 3.3.2 BnaA09g55520D和BnaA09g55530D的遗传转化 |
| 3.3.2.1 BnaA09g55520D超表达载体构建与转化 |
| 3.3.2.2 BnaA09g55530D等位及互补启动子的表达载体构建与转化 |
| 3.3.3 qSLWA9的敲除验证 |
| 3.4 qSLWA9的表达分析 |
| 3.4.1 qSLWA9的qRT-PCR分析 |
| 3.4.2 qSLWA9的GUS染色分析 |
| 3.5 qSLWA9的亚细胞定位 |
| 3.6 插入qSLWA9上游的3.7-kb片段分析 |
| 3.6.1 插入的3.7-kb增强了qSLWA9的表达水平 |
| 3.6.2 插入的3.7-kb片段含有增强子作用的元件 |
| 3.6.2.1 插入的3.7-kb片段驱动mini35S-GUS的表达 |
| 3.6.2.2 3 .7-kb片段5’端系列缺失驱动mini35S-GUS的表达 |
| 3.6.2.3 GUS蛋白活性的定量检测 |
| 3.7 插入的3.7-kb片段与油菜长角果和大粒紧密相关 |
| 3.8 插入的3.7-kb片段的来源分析 |
| 3.9 qSLWA9的功能初探 |
| 3.9.1 角果生长曲线的绘制 |
| 3.9.2 扫描电镜观察角果皮细胞 |
| 3.9.3 转录组测序分析 |
| 3.9.4 无籽果实现象 |
| 3.9.5 生长素含量的测定 |
| 4 讨论 |
| 4.1 甘蓝型油菜的图位克隆 |
| 4.2 qSLWA9的功能探讨 |
| 4.3 qSLWA9的表达调控 |
| 4.3.1 qSLWA9的表达影响了油菜角果长和粒重表型 |
| 4.3.2 插入的CACTA-like转座子影响了qSLWA9的表达 |
| 4.4 CACTA-like片段的来源 |
| 4.5 qSLWA9在油菜育种中的应用 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 附录Ⅰ 本研究中所用引物 |
| 附录Ⅱ 本研究中所用245份油菜材料 |
| 附录Ⅲ 本研究中所用174份白菜材料 |
| 附录Ⅳ 在读期间研究成果 |
| 致谢 |
（7）农杆菌介导的白菜类作物转基因体系建立及WRKYⅡa转录因子蛋白互作验证（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略词表 |
| 前言 |
| 第一章 文献综述 |
| 1. 芸薹属植物遗传转化研究进展 |
| 1.1. 间接转化 |
| 1.2. 直接转化 |
| 2. WRKY转录因子研究进展 |
| 2.1. WRKY转录因子在植物生物胁迫中的作用 |
| 2.2. WRKY转录因子在植物非生物胁迫中的作用 |
| 3. CRISPR/Cas9系统在植物领域中的应用 |
| 3.1. CRISPR/Cas9系统的工作原理 |
| 3.2. CRISPR/Cas9系统的应用 |
| 参考文献 |
| 第二章 Rapid-cycling Brassica rapa转基因体系建立 |
| 引言 |
| 1. 材料与方法 |
| 1.1. 材料及生长条件 |
| 1.2. 卡那霉素敏感性测试 |
| 1.3. GFP筛选 |
| 1.4. 农杆菌转化 |
| 1.5. 由农杆菌介导的组织培养 |
| 1.6. RCBr花蕾解剖 |
| 1.7. 由农杆菌介导的真空渗透法和蘸花法 |
| 1.8. 转基因植株检测 |
| 1.8.1. DNA提取 |
| 1.8.2. PCR检测 |
| 1.8.3. Southern印迹杂交 |
| 2. 结果与分析 |
| 2.1. 筛选标记选择 |
| 2.2. 利用由农杆菌介导的组织培养转化RCBr |
| 2.3. 利用由农杆菌介导的真空渗透法或蘸花法转化RCBr |
| 2.3.1. 花蕾解剖 |
| 2.3.2. 真空渗透法或蘸花法处理 |
| 2.3.3. 转化株验证 |
| 3. 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三章 不结球白菜WRKY Ⅱa转录因子基因克隆及蛋白互作验证 |
| 引言 |
| 1. 材料与方法 |
| 1.1. 材料 |
| 1.2. 霜霉病菌接种 |
| 1.2.1. 材料准备 |
| 1.2.2. 接种液制备及接种 |
| 1.3. RNA提取 |
| 1.4. 基因克隆 |
| 1.5. 生物信息学分析 |
| 1.6. 实时定量PCR |
| 1.7. 酵母双杂交 |
| 1.7.1. 载体构建 |
| 1.7.2. 酵母感受态制备及转化 |
| 2. 结果与分析 |
| 2.1. WRKY Ⅱa转录因子克隆 |
| 2.2. WRKY Ⅱa转录因子对霜霉病菌侵染的响应模式 |
| 2.3. WRKY Ⅱa转录因子间的互作关系 |
| 2.4. 酵母双杂交文库筛选 |
| 3. 讨论 |
| 参考文献 |
| 第四章 转基因白菜CRISPR/Cas9基因编辑事件及T-DNA侧翼序列分析 |
| 引言 |
| 1. 材料与方法 |
| 1.1. 材料 |
| 1.2. CRISPR/Cas9载体构建 |
| 1.2.1. 引导序列选择 |
| 1.2.2. Gibson Assembly~?构建CRISPR/Cas载体 |
| 1.3. 白菜的遗传转化 |
| 1.4. CRISPR/Cas9靶标位点突变事件检测 |
| 1.5. 短热击处理 |
| 1.6. 转基因白菜表型记录 |
| 1.7. TAIL-PCR |
| 1.8. 测序结果分析 |
| 1.9. 特异性PCR检测 |
| 2. 结果与分析 |
| 2.1. 白菜遗传转化 |
| 2.2. CRISPR/Cas9靶标位点突变事件检测 |
| 2.3. ‘四九菜心’转化株的异常表型 |
| 2.4. ‘四九菜心’转化株的T-DNA侧翼序列扩增及序列分析 |
| 2.5. FPsc转化株的异常表型 |
| 2.6. FPsc转化株的T-DNA侧翼序列扩增及序列分析 |
| 2.7. FPsc转化株的特异性PCR检测 |
| 3. 讨论 |
| 参考文献 |
| 结论 |
| 创新点 |
| 论文发表情况 |
| 致谢 |
（8）白菜C2H2型锌指蛋白基因家族的进化及DAZ3在转录水平调控花粉发育的研究（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 缩略词 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 1 文献综述:C2H2型锌指蛋白基因家族的进化与其在花发育中的作用 |
| 1.1 植物中的C2H2型锌指蛋白 |
| 1.1.1 C2H2型锌指蛋白的结构 |
| 1.1.2 C2H2型锌指蛋白的分类 |
| 1.2 C2H2型锌指蛋白家族的基因组进化 |
| 1.2.1 植物C2H2型锌指蛋白基因家族的研究进展 |
| 1.2.2 白菜基因组研究进展 |
| 1.3 C2H2型锌指蛋白在花发育中的作用 |
| 1.3.1 C2H2型锌指蛋白在开花诱导中的作用 |
| 1.3.1.1 C2H2型锌指蛋白参与FLC位点的组蛋白修饰 |
| 1.3.1.2 C2H2型锌指蛋白参与开花诱导的调控通路 |
| 1.3.2 C2H2型锌指蛋白在花器官建构中的作用 |
| 1.3.2.1 参与花器官发育的C2H2型锌指蛋白的表达和功能 |
| 1.3.2.2 参与花器官发育的C2H2型锌指蛋白的调控 |
| 1.3.3 C2H2型锌指蛋白在花器官成熟中的作用 |
| 1.3.3.1 C2H2型锌指蛋白参与雄蕊的发育 |
| 1.3.3.2 C2H2型锌指蛋白参与雌蕊的发育 |
| 1.4 花粉的发育 |
| 1.4.1 花粉粒的发育 |
| 1.4.2 花粉壁的发育 |
| 1.4.2.1 花粉壁的形成 |
| 1.4.2.2 花粉壁发育的相关研究 |
| 1.4.3 花粉管的生长 |
| 1.4.3.1 花粉和柱头的粘附 |
| 1.4.3.2 花粉的水合 |
| 1.4.3.3 花粉管的萌发 |
| 1.4.4 花粉管发育的相关研究 |
| 2 白菜C2H2型锌指蛋白基因家族的鉴定与表达分析 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 植物材料 |
| 2.1.2 实验试剂 |
| 2.1.3 白菜C2H2型锌指蛋白基因的鉴定 |
| 2.1.4 白菜C2H2型锌指蛋白基因结构、保守域和进化分析 |
| 2.1.5 白菜C2H2型锌指蛋白基因的染色体定位、基因复制和共线性分析 |
| 2.1.6 白菜和拟南芥C2H2型锌指蛋白基因的分子进化率 |
| 2.1.7 白菜C2H2型锌指蛋白基因的GO注释 |
| 2.1.8 白菜C2H2型锌指蛋白基因的表达分析 |
| 2.1.8.1 DNA的快速提取 |
| 2.1.8.2 总RNA的提取 |
| 2.1.8.3 qPCR分析 |
| 2.1.9 启动子-GUS融合表达载体的构建和农杆菌转化 |
| 2.1.9.1 启动子片段的克隆 |
| 2.1.9.2 启动子片段与目的载体的连接 |
| 2.1.9.3 融合载体转化农杆菌 |
| 2.1.10 启动子表达的分析 |
| 2.1.10.1 启动子-GUS融合表达载体对拟南芥的遗传转化 |
| 2.1.10.2 阳性植株的筛选 |
| 2.1.10.3 植株组织的GUS染色观察 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 白菜C2H2型锌指蛋白基因的鉴定 |
| 2.2.2 白菜C2H2型锌指蛋白的分类 |
| 2.2.3 白菜C2H2型锌指蛋白基因的结构、结构域和进化树分析 |
| 2.2.4 白菜C2H2型锌指蛋白基因的染色体定位、基因复制和共线性分析 |
| 2.2.5 白菜和拟南芥C2H2型锌指蛋白基因的进化模式分析 |
| 2.2.6 白菜C2H2型锌指蛋白的GO分析 |
| 2.2.7 白菜C2H2型锌指蛋白基因在各组织和器官中的表达分析 |
| 2.2.8 白菜C2H2型锌指蛋白基因在花粉发育中的表达模式 |
| 2.3 讨论 |
| 2.3.1 白菜C2H2型锌指蛋白基因复杂的分子进化和多样的结构 |
| 2.3.2 白菜C2H2型锌指蛋白在花发育中的潜在角色 |
| 3 白菜C2H2型锌指蛋白基因BrDAZ3的表达分析 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 植物材料 |
| 3.1.2 实验试剂 |
| 3.1.3 白菜核不育两用系'Bcajh97-01A/B'的人工授粉与取材 |
| 3.1.4 DNA、总RNA的提取、cDNA的合成 |
| 3.1.5 BrDAZ3序列的扩增和特征分析 |
| 3.1.6 BrDAZ3的时空表达分析 |
| 3.1.7 BrDAZ3的启动子表达分析 |
| 3.1.7.1 BrDAZ3的启动子融合表达载体的拟南芥转基因T_3代纯合植株筛选 |
| 3.1.7.2 T_3代纯合植株的组织GUS染色 |
| 3.1.7.3 T_3代纯合植株的花粉体外萌发与GUS染色 |
| 3.1.8 BrDAZ3的亚细胞定位分析 |
| 3.1.8.1 序列片段的分离 |
| 3.1.8.2 载体的构建及农杆菌转化 |
| 3.1.8.3 农杆菌介导的烟草表皮细胞的瞬时转化 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 BrDAZ3的序列特征 |
| 3.2.2 BrDAZ3在雄蕊中特异表达 |
| 3.2.2.1 RT-PCR和qPCR分析BrDAZ3在花粉发育的后期特异表达 |
| 3.2.2.2 BrDAZ3的启动子在拟南芥单核花粉时期的花粉中开始持续表达 |
| 3.2.3 BrDAZ3定位在细胞质和细胞核中 |
| 3.2.3.1 成功构建BrDAZ3亚细胞定位载体 |
| 3.2.3.2 BrDAZ3亚细胞定位融合载体在烟草中的瞬时表达 |
| 3.3 讨论 |
| 3.3.1 BrDAZ3编码了一个定位在细胞质和细胞核的C2H2型锌指蛋白 |
| 3.3.2 BrDAZ3是白菜花粉发育后期并在授粉受精过程持续表达的基因 |
| 4 白菜C2H2型锌指蛋白基因BrDAZ3的生物学功能分析 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 植物材料 |
| 4.1.2 实验试剂 |
| 4.1.3 DNA、总RNA的提取、cDNA的合成 |
| 4.1.4 BrDAZ3 RNA干涉表达载体的构建 |
| 4.1.4.1 正义和反义片段的分离 |
| 4.1.4.2 构建RNA干涉载体并进行农杆菌转化 |
| 4.1.5 BrDAZ3过表达载体的构建 |
| 4.1.5.1 过表达片段的分离 |
| 4.1.5.2 构建过表达载体并进行农杆菌转化 |
| 4.1.6 BrDAZ3的CRISPR CAS9敲除载体构建 |
| 4.1.6.1 设计BrDAZ3的靶序列 |
| 4.1.6.2 构建BrDAZ3的CRISPR Cas9敲除载体 |
| 4.1.7 BrDAZ3的RNA干涉、过表达和CRISPR Cas9载体的遗传转化 |
| 4.1.7.1 培养基的配置 |
| 4.1.7.2 播种培养 |
| 4.1.7.3 预培养 |
| 4.1.7.4 共培养 |
| 4.1.7.5 分化培养 |
| 4.1.7.6 继代培养和生根培养 |
| 4.1.7.7 炼苗和移栽 |
| 4.1.8 BrDAZ3的RNA干涉、过表达和CRISPR Cas9转基因植株的分子检测 |
| 4.1.8.1 转基因植株的DNA和总RNA提取 |
| 4.1.8.2 转基因植株的PCR检测 |
| 4.1.8.3 转基因植株的qPCR检测 |
| 4.1.9 BrDAZ3的RNA干涉和过表达转基因植株的形态和细胞学观察 |
| 4.1.9.1 转基因植株的形态观察 |
| 4.1.9.2 转基因植株的花粉活力观察 |
| 4.1.9.3 花粉形态扫描电镜和花粉发育透射电镜观察 |
| 4.1.9.4 花粉体外萌发试验 |
| 4.1.9.5 花粉在雌蕊中的生长实验 |
| 4.1.9.6 结籽率的统计 |
| 4.2 结果 |
| 4.2.1 BrDAZ3的RNA干涉植株的获得与验证 |
| 4.2.1.1 成功构建BrDAZ3的RNA干涉载体 |
| 4.2.1.2 BrDAZ3的RNA干涉植株的获得及分子检测 |
| 4.2.2 BrDAZ3的过表达植株的获得与验证 |
| 4.2.2.1 成功构建BrDAZ3的过表达载体 |
| 4.2.2.2 BrDAZ3的过表达植株的获得及分子检测 |
| 4.2.3 BrDAZ3的CRISPR Cas9敲除植株的获得与验证 |
| 4.2.3.1 成功获得BrDAZ3的CRISPR Cas9敲除载体 |
| 4.2.3.2 成功获得BrDAZ3的CRISPR Cas9敲除转基因植株并进行分子检测 |
| 4.2.4 BrDAZ3的抑制影响白菜的花粉发育 |
| 4.2.4.1 BrDAZ3的抑制不影响白菜的营养生长和花器官形态 |
| 4.2.4.2 BrDAZ3的抑制引起白菜的花粉畸形 |
| 4.2.4.3 BrDAZ3的抑制引起白菜花粉的细胞质降解且外壁异常 |
| 4.2.4.4 BrDAZ3的抑制引起白菜的花粉管萌发异常、结籽率降低 |
| 4.2.5 BrDAZ3的过表达影响白菜的花粉发育 |
| 4.2.5.1 BrDAZ3的过表达不影响白菜的营养生长和花器官形态 |
| 4.2.5.2 过表达BrDAZ3的花粉畸形且败育 |
| 4.2.5.3 过表达BrDAZ3的花粉细胞质自单核期开始降解且外壁异常 |
| 4.2.5.4 BrDAZ3的过表达引起白菜的花粉管萌发异常、结籽率降低 |
| 4.3 讨论 |
| 4.3.1 BrDAZ3基因的表达异常影响花粉壁的发育 |
| 4.3.2 BrDAZ3在花粉管发育的过程中有重要作用 |
| 5 拟南芥C2H2型锌指蛋白基因AtDAZ3的表达分析 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.1 植物材料 |
| 5.1.2 实验试剂 |
| 5.1.3 DNA、总RNA的提取、cDNA的合成 |
| 5.1.4 AtDAZ3序列的扩增和特征分析 |
| 5.1.5 AtDAZ3的时空表达分析 |
| 5.1.6 AtDAZ3的启动子表达分析 |
| 5.1.6.1 AtDAZ3的启动子片段的分离 |
| 5.1.6.2 AtDAZ3的启动子融合表达载体的构建 |
| 5.1.6.3 AtDAZ3的启动子融合表达载体对拟南芥的遗传转化及阳性植株的筛选 |
| 5.1.6.4 组织GUS染色及花粉体外萌发染色观察 |
| 5.1.7 AtDAZ3的亚细胞定位分析 |
| 5.1.7.1 序列片段的分离 |
| 5.1.7.2 载体的构建及农杆菌转化 |
| 5.1.7.3 农杆菌介导的烟草表皮细胞的瞬时转化 |
| 5.2 结果 |
| 5.2.1 AtDAZ3序列的扩增和特征分析 |
| 5.2.2 AtDAZ3在成熟花粉时期表达最高 |
| 5.2.3 AtDAZ3的启动子表达分析 |
| 5.2.3.1 成功构建AtDAZ3的启动子融合表达载体 |
| 5.2.3.2 AtDAZ3的启动子在拟南芥的单核花粉时期开始持续表达 |
| 5.2.4 AtDAZ3定位在细胞质和细胞核中 |
| 5.2.4.1 成功构建AtDAZ3亚细胞定位载体 |
| 5.2.4.2 AtDAZ3亚细胞定位融合载体在烟草中的瞬时表达 |
| 5.3 讨论 |
| 5.3.1 AtDAZ3编码了一个定位在细胞质和细胞核的C2H2型锌指蛋白 |
| 5.3.2 AtDAZ3是拟南芥花粉发育后期并在授粉受精过程持续表达的基因 |
| 6 拟南芥C2H2型锌指蛋白基因AtDAZ3的生物学功能分析 |
| 6.1 材料与方法 |
| 6.1.1 植物材料 |
| 6.1.2 实验试剂 |
| 6.1.3 AtDAZ3 T-DNA插入突变体的鉴定 |
| 6.1.3.1 纯合突变体的筛选 |
| 6.1.3.2 AtDAZ3在纯合突变体中的表达量检测 |
| 6.1.4 AtDAZ3 T-DNA插入突变体的表型观察 |
| 6.1.4.1 突变体的形态观察 |
| 6.1.4.2 突变体花粉的活力观察 |
| 6.1.4.3 花粉形态扫描电镜和花粉发育透射电镜观察 |
| 6.1.4.4 花粉在雌蕊中的生长实验 |
| 6.1.4.5 结籽率的统计 |
| 6.1.5 AtDAZ3特异启动子的过表达载体构建 |
| 6.1.5.1 启动子片段和基因序列片段扩增 |
| 6.1.5.2 构建特异启动子的过表达载体并转化农杆菌 |
| 6.1.6 AtDAZ3 T-DNA插入突变体的表型恢复 |
| 6.1.6.1 特异启动子的过表达载体对突变体的遗传转化 |
| 6.1.6.2 阳性植株的筛选 |
| 6.1.6.3 转化植株的形态观察 |
| 6.1.6.4 转化植株的花粉活力观察 |
| 6.1.6.5 转化植株的花粉形态扫描电镜观察 |
| 6.1.7 特异启动子的过表达载体对野生型拟南芥的遗传转化 |
| 6.1.7.1 获得过表达转化植株 |
| 6.1.7.2 过表达转化植株的形态观察 |
| 6.1.7.3 过表达转化植株的花粉活力观察 |
| 6.1.7.4 过表达转化植株的花粉形态扫描电镜和透射电镜观察 |
| 6.1.7.5 过表达转化植株的花粉在雌蕊中的生长实验 |
| 6.1.7.6 结籽率的统计 |
| 6.2 结果 |
| 6.2.1 AtDAZ3的纯合基因型突变体的获得及分子检测 |
| 6.2.1.1 筛选得到T-DNA插入纯合突变体 |
| 6.2.1.2 AtDAZ3在突变体中的表达分析 |
| 6.2.2 AtDAZ3的缺失表达影响营养生长和生殖生长 |
| 6.2.2.1 AtDAZ3的缺失表达影响叶片发育 |
| 6.2.2.2 AtDAZ3的缺失表达导致花器官变小 |
| 6.2.2.3 AtDAZ3的缺失表达影响花粉发育 |
| 6.2.3 AtDAZ3能够恢复突变体atdaz3的表型 |
| 6.2.4 AtDAZ3的过表达影响拟南芥的花粉发育 |
| 6.2.4.1 成功获得AtDAZ3的过表达转基因植株并进行分子检测 |
| 6.2.4.2 AtDAZ3的过表达不影响拟南芥的营养生长和花器官形态 |
| 6.2.4.3 AtDAZ3的过表达引起拟南芥的花粉畸形 |
| 6.2.4.4 AtDAZ3的过表达引起拟南芥花粉的细胞质异常降解 |
| 6.2.4.5 AtDAZ3的过表达引起拟南芥花粉的体内萌发受阻 |
| 6.3 讨论 |
| 6.3.1 AtDAZ3通过影响细胞形态参与叶片的发育和花器官的发育 |
| 6.3.2 AtDAZ3在花粉壁的发育和花粉管生长过程中扮演重要角色 |
| 7 DAZ3在花粉发育过程中的转录调控研究 |
| 7.1 材料与方法 |
| 7.1.1 植物材料 |
| 7.1.2 实验试剂 |
| 7.1.3 酵母单杂交检测BrDUO1a、BrDUO1b、AtDUO1蛋白分别与BrDAZ3、AtDAZ3启动子的互作及作用位点 |
| 7.1.3.1 载体的构建 |
| 7.1.3.2 线性化载体质粒转化Y1H感受态细胞 |
| 7.1.3.3 启动子片段的自激活检测 |
| 7.1.3.4 启动子片段与目的蛋白的互作检测 |
| 7.1.4 双荧光素酶实验 |
| 7.1.5 酵母双杂交检测BrDAZ3、AtDAZ3与AtTPL/TPR、BrTPLTPR的互作及作用位点 |
| 7.1.5.1 载体的构建 |
| 7.1.5.2 载体质粒转化AH109感受态细胞 |
| 7.1.5.3 BrDAZ3和AtDAZ3的自激活检测 |
| 7.1.5.4 互作检测 |
| 7.1.6 BrDAZ3、AtDAZ3、BrTPL/TPR和AtTPL/TPR的亚细胞定位分析 |
| 7.1.6.1 载体的构建及农杆菌的转化 |
| 7.1.6.2 农杆菌介导的烟草表皮细胞的瞬时转化 |
| 7.1.7 双分子荧光互补实验 |
| 7.1.7.1 载体的构建 |
| 7.1.7.2 载体质粒转化C58C1农杆菌感受态细胞 |
| 7.1.7.3 农杆菌介导的烟草表皮细胞的瞬时转化 |
| 7.1.8 AtDAZ3可能下游基因的检测 |
| 7.2 结果 |
| 7.2.1 AtDU01、BrDUOla能够直接激活AtDAZ3、BrDAZ3的表达 |
| 7.2.1.1 酵母单杂交检测AtDUO1、BrDUO1与A1DAZ3BrDAZ3之间的互作 |
| 7.2.1.2 双荧光素酶检测AtDUO1、BrDUO1与AtDAZ3BrDAZ3之间的互作 |
| 7.2.2 AtTPL/TPR、BrTPL/TPR能够与AtDAZ3、BrDAZ3互作 |
| 7.2.2.1 酵母双杂交检测蛋白的互作 |
| 7.2.2.2 亚细胞定位分析 |
| 7.2.2.3 双分子荧光互补实验检测蛋白互作 |
| 7.2.3 AtDAZ3/BrDAZ3、AtTPL/BrTPL分别与AtHDA6/BrHDA6AtHDA19/BrHDA19的互作 |
| 7.2.4 AtDAZ3可能下游基因的定量检测 |
| 7.3 讨论 |
| 7.3.1 DAZ3能够被DUO1直接激活转录 |
| 7.3.2 DAZ3的EAR结构域能够与TPL/TPR的N端的CTLH结构域互作 |
| 7.3.3 DAZ3广泛参与花粉内壁、外壁和花粉管发育的转录调控 |
| 7.3.4 AtDAZ3参与细胞循环和细胞分裂的调控 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附表 |
| 在读期间发表论文 |
（9）白菜和甘蓝PMEI基因家族成员的比较与PMEI1和PMEI85的功能鉴定（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 缩略词 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 1 文献综述:花粉发育与PMEI基因的研究进展 |
| 1.1 花粉发育 |
| 1.1.1 花粉发育过程 |
| 1.1.2 花粉壁的发育 |
| 1.1.2.1 成熟花粉壁的结构和组成成分 |
| 1.1.2.2 花粉壁发育过程 |
| 1.1.2.3 花粉壁发育相关基因 |
| 1.1.3 花粉管的发育 |
| 1.1.3.1 花粉粘附和水合 |
| 1.1.3.2 花粉萌发和花粉管生长 |
| 1.2 植物细胞壁果胶的研究进展 |
| 1.2.1 果胶的作用和应用 |
| 1.2.2 果胶的结构 |
| 1.2.3 果胶的含量和分布 |
| 1.2.4 果胶的合成 |
| 1.2.4.1 果胶的合成部位 |
| 1.2.4.2 果胶的合成机制 |
| 1.2.4.3 果胶合成相关的酶 |
| 1.2.5 果胶的降解 |
| 1.2.5.1 果胶降解相关酶 |
| 1.2.5.2 果胶降解相关基因 |
| 1.3 果胶甲酯酶抑制子的研究进展 |
| 1.3.1 PMEI的出现和调控 |
| 1.3.2 PMEI的结构 |
| 1.3.3 PMEI与PME的相互作用 |
| 1.3.4 PMEI的功能 |
| 1.3.4.1 PMEI与种子 |
| 1.3.4.2 PMEI与植株生长 |
| 1.3.4.3 PMEI与器官形成 |
| 1.3.4.4 PMEI与果实发育 |
| 1.3.4.5 PMEI与胁迫响应 |
| 1.4 基因复制和保留机制 |
| 1.4.1 基因复制的方式 |
| 1.4.2 重复基因的命运分化 |
| 1.4.3 重复基因的偏向性保留机制 |
| 2 白菜PMEI基因家族成员的结构、进化和表达分析 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 植物材料 |
| 2.1.2 主要实验试剂 |
| 2.1.3 白菜核不育两用系'Bcajh97-01A/B'的人工授粉 |
| 2.1.4 植物基因组DNA、总RNA的提取与cDNA的合成 |
| 2.1.4.1 植物基因组DNA的精细提取 |
| 2.1.4.2 植物基因组DNA的粗提取 |
| 2.1.4.3 总RNA的提取 |
| 2.1.4.4 cDNA的合成 |
| 2.1.5 大肠杆菌DH5α感受态的制备与遗传转化 |
| 2.1.5.1 大肠杆菌DH5α感受态细胞的制备 |
| 2.1.5.2 大肠杆菌DH5α感受态细胞的遗传转化 |
| 2.1.6 根癌农杆菌GV3101感受态细胞的制备与遗传转化 |
| 2.1.6.1 根癌农杆菌GV3101感受态细胞的制备 |
| 2.1.6.2 根癌农杆菌GV3101感受态细胞的遗传转化 |
| 2.1.7 白菜PMEI基因家族成员的鉴定 |
| 2.1.8 系统发生、基因结构和物理化学性质分析 |
| 2.1.9 利用根癌农杆菌介导的烟草表皮细胞瞬时表达体系观察基因亚细胞定位情况 |
| 2.1.9.1 亚细胞定位载体的构建 |
| 2.1.9.2 利用农杆菌介导的烟草表皮细胞瞬时表达体系观察基因亚细胞定位情况 |
| 2.1.10 保守基序和启动子分析 |
| 2.1.11 启动子-GUS报告系统分析 |
| 2.1.11.1 启动子表达载体的构建 |
| 2.1.11.2 启动子表达载体对拟南芥的遗传转化 |
| 2.1.11.3 启动子表达载体转化拟南芥阳性植株的筛选与观察 |
| 2.1.12 染色体定位、共线性、保留率和进化分析 |
| 2.1.13 白菜PMEI基因家族成员的表达分析 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 白菜PMEI基因家族100个成员分布在10条染色体上 |
| 2.2.2 白菜PMEI家族成员基因结构和系统发生分析 |
| 2.2.3 亚细胞定位分析 |
| 2.2.4 白菜PMEI基因家族成员的保留率和共线性分析 |
| 2.2.5 白菜PMEI基因家族成员的进化分析 |
| 2.2.6 白菜PMEI基因家族成员的表达及启动子-GUS分析 |
| 2.2.7 白菜PMEI基因在花粉发育过程中的表达分析 |
| 2.2.8 白菜PMEI基因家族成员的启动子序列分析 |
| 2.2.9 微阵列数据分析 |
| 2.3 讨论 |
| 2.3.1 WGT和TD是白菜PMEI家族扩张的主要来源 |
| 2.3.2 白菜PMEI家族的高保留率符合基因平衡理论 |
| 2.3.3 白菜PMEI基因家族成员在进化过程中主要经历了纯化选择 |
| 2.3.4 白菜PMEI基因家族成员可能参与花粉发育过程 |
| 2.3.5 白菜PMEI家族成员与激素调控和逆境响应密切相关 |
| 3 甘蓝PMEI基因家族成员的结构、进化和表达分析及与白菜PMEI基因家族成员的比较 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 植物材料 |
| 3.1.2 主要实验试剂 |
| 3.1.3 植物总RNA的提取与cDNA的合成 |
| 3.1.4 甘蓝PMEI基因家族成员的鉴定 |
| 3.1.5 系统发生、基因结构和物理化学性质分析 |
| 3.1.6 利用根癌农杆菌介导的烟草表皮细胞瞬时表达体系观察基因亚细胞定位情况 |
| 3.1.6.1 亚细胞定位载体的构建 |
| 3.1.6.2 利用根癌农杆菌介导的烟草表皮细胞瞬时表达体系观察基因亚细胞定位情况 |
| 3.1.7 保守基序和启动子分析 |
| 3.1.8 染色体定位、共线性、保留率和进化分析 |
| 3.1.9 甘蓝PMEI基因家族成员的表达分析 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 甘蓝PMEI基因家族95个成员分布在9条染色体上 |
| 3.2.2 甘蓝PMEI基因家族成员系统发生和基因结构分析 |
| 3.2.3 亚细胞定位分析 |
| 3.2.4 甘蓝PMEI基因家族成员的保留率和共线性分析 |
| 3.2.5 甘蓝PMEI基因家族的进化分析 |
| 3.2.6 甘蓝PMEI基因家族成员的表达分析 |
| 3.2.7 甘蓝PMEI基因在雄蕊发育中的表达分析 |
| 3.2.8 甘蓝PMEI基因家族成员的启动子序列分析 |
| 3.2.9 甘蓝和白菜PMEI基因家族成员的比较 |
| 3.2.9.1 甘蓝和白菜共线性PMEI基因家族成员分析 |
| 3.2.9.2 甘蓝和白菜PMEI基因家族成员的结构比较 |
| 3.2.9.3 甘蓝和白菜PMEI基因家族成员的保留率比较 |
| 3.2.9.4 甘蓝和白菜同源PMEI基因对的表达模式分析 |
| 3.3 讨论 |
| 3.3.1 甘蓝和白菜PMEI基因家族有着相似的扩张模式 |
| 3.3.2 甘蓝和白菜PMEI基因家族成员的保留和丢失存在差异 |
| 3.3.3 甘蓝和白菜PMEI基因家族部分成员发生新功能化、亚功能化和无功能化 |
| 4 白菜和甘蓝的PMEI1序列与表达的比较 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 植物材料 |
| 4.1.2 主要实验试剂 |
| 4.1.3 白菜核不育两用系‘Bcajh9 7-01A/B’的人工授粉 |
| 4.1.4 DNA、总RNA的提取与cDNA的合成 |
| 4.1.5 CDS和DNA全长的克隆 |
| 4.1.6 核苷酸序列分析 |
| 4.1.7 亚细胞定位分析 |
| 4.1.7.1 亚细胞定位载体的构建 |
| 4.1.7.2 利用根癌农杆菌介导的烟草表皮细胞瞬时表达体系观察基因亚细胞定位情况 |
| 4.1.8 qRT-PCR分析 |
| 4.2 结果 |
| 4.2.1 成功获得BcPMEI1和BoPMEI1的CDS和DNA全长 |
| 4.2.2 BcPMEI1初BoPMEI1的序列高度同源 |
| 4.2.3 BcPMEI1和BoPMEI1定位于质膜和细胞壁 |
| 4.2.4 BcPMEI1和BoPMEI1在成熟雄蕊中特异表达 |
| 4.3 讨论 |
| 4.3.1 BcPMEI1和BoPMEI1在表达上产生了一定的分化 |
| 4.3.2 BcPMEI1和BoPMEI1均为定位于质膜和细胞壁的分泌蛋白 |
| 4.3.3 BcPMEI1和BoPMEI1均为花粉发育“晚期”相关基因 |
| 5 白菜花粉发育相关PMEI基因BcPMEI1的过表达与启动子功能鉴定 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.1 植物材料 |
| 5.1.2 主要实验试剂 |
| 5.1.3 DNA和总RNA的提取、cDNA的合成 |
| 5.1.4 过表达载体的构建及对拟南芥的遗传转化 |
| 5.1.5 转基因植株的分子检测 |
| 5.1.5.1 基因组DNA、总RNA的提取和cDNA的合成 |
| 5.1.5.2 过表达转基因植株的PCR检测 |
| 5.1.5.3 过表达转基因植株的qRT-PCR检测 |
| 5.1.6 过表达转基因植株的形态学与细胞学观察 |
| 5.1.6.1 过表达转基因植株的形态学观察 |
| 5.1.6.2 过表达转基因植株花粉的染色观察 |
| 5.1.6.3 过表达转基因植株花粉的扫描观察 |
| 5.1.6.4 过表达转基因植株花粉的体内萌发 |
| 5.1.6.5 过表达转基因植株花粉的半薄切片与超薄切片观察 |
| 5.1.7 启动子-GUS报告系统分析 |
| 5.1.7.1 启动子表达载体的构建 |
| 5.1.7.2 启动子表达载体对拟南芥的遗传转化 |
| 5.1.7.3 启动子表达载体转化拟南芥阳性植株筛选与观察 |
| 5.2 结果 |
| 5.2.1 BcPMEI1过表达载体成功导入拟南芥植株 |
| 5.2.2 BcPMEI1在BcPMEI1~(OE)扼植株花序中的表达量上调 |
| 5.2.3 BcPMEI1~(OE)的部分花粉败育 |
| 5.2.3.1 BcPMEI1~(OE)的角果短、结籽率降低 |
| 5.2.3.2 BcPMEI1~(OE)的部分花粉皱缩畸形 |
| 5.2.3.3 BcPMEI1~(OE)的花粉管萌发率降低 |
| 5.2.4 BcPMEI1~(OE)花粉内壁发育异常 |
| 5.2.5 BcPMEI1和BoPMEI1启动子启动GUS报告基因在成熟花粉中特异表达 |
| 5.2.6 启动子区域的顺式调控元件分析 |
| 5.3 讨论 |
| 5.3.1 BcPMEI1通过影响花粉内壁的形成而调控花粉发育 |
| 5.3.2 BcPMEI1和BoPMEI1启动子具有在花粉发育晚期启动基因表达的功能 |
| 6 白菜花粉发育相关PMEI基因BcPMEI85的克隆与表达分析 |
| 6.1 材料与方法 |
| 6.1.1 植物材料 |
| 6.1.2 主要实验试剂 |
| 6.1.3 白菜核不育两用系‘Bcajh97-01A/B’的人工授粉 |
| 6.1.4 DNA、总RNA的提取与cDNA的合成 |
| 6.1.5 CDS和DNA全长的克隆 |
| 6.1.6 核苷酸序列分析 |
| 6.1.7 亚细胞定位分析 |
| 6.1.7.1 亚细胞定位载体的构建 |
| 6.1.7.2 利用根癌农杆菌介导的烟草表皮细胞瞬时表达体系观察基因亚细胞定位情况 |
| 6.1.8 qRT-PCR分析 |
| 6.2 结果 |
| 6.2.1 成功获得BcPMEI85的CDS和DNA全长 |
| 6.2.2 BcPMEI85定位于质膜和细胞壁 |
| 6.2.3 BcPMEI85在成熟花粉中特异表达 |
| 6.3 讨论 |
| 6.3.1 BcPMEI85是花粉发育的“晚期”基因 |
| 6.3.2 BcPMEI85表达模式在进化过程中保守 |
| 6.3.3 BcPMEI85可能影响花粉壁构建过程 |
| 7 白菜花粉发育相关PMEI基因BcPMEI85的功能鉴定与启动子分析 |
| 7.1 材料与方法 |
| 7.1.1 植物材料 |
| 7.1.2 主要实验试剂 |
| 7.1.3 DNA、总RNA的提取与cDNA的合成 |
| 7.1.4 反义表达载体的构建 |
| 7.1.4.1 反义基因片段的分离 |
| 7.1.4.2 反义表达载体的构建 |
| 7.1.5 反义表达载体对菜心的遗传转化 |
| 7.1.5.1 培养基的配制 |
| 7.1.5.2 播种培养 |
| 7.1.5.3 预培养 |
| 7.1.5.4 共培养 |
| 7.1.5.5 分化培养 |
| 7.1.5.6 继代培养及生根培养 |
| 7.1.5.7 移栽 |
| 7.1.6 转反义基因植株的分子生物学检测 |
| 7.1.6.1 转反义基因植株基因组DNA、总RNA的提取和cDNA的合成 |
| 7.1.6.2 转反义基因植株的PCR检测 |
| 7.1.6.3 转反义基因植株的qRT-PCR检测 |
| 7.1.7 转反义基因植株的形态学与细胞学观察 |
| 7.1.7.1 转反义基因植株的形态学观察 |
| 7.1.7.2 转反义基因植株的花粉染色观察 |
| 7.1.7.3 转反义基因植株的花粉形态扫描观察 |
| 7.1.7.4 转反义基因植株的花粉体外萌发 |
| 7.1.7.5 花粉在雌蕊中的生长观察 |
| 7.1.8 启动子-GUS报告系统分析 |
| 7.1.8.1 启动子表达载体的构建 |
| 7.1.8.2 启动子表达载体对拟南芥的遗传转化 |
| 7.1.8.3 启动子表达载体转化拟南芥阳性植株筛选与观察 |
| 7.2 结果 |
| 7.2.1 反义BcPMEI85表达载体成功导入菜心植株 |
| 7.2.1.1 获得反义BcPMEI85表达载体转化菜心植株 |
| 7.2.1.2 PCR验证反义BcPMEI85表达载体成功导入菜心植株 |
| 7.2.1.3 在bcpmei85的花序中BcPMEI85的表达受到抑制 |
| 7.2.2 bcpmei85的花器官形态、花粉发育和花粉管生长正常 |
| 7.2.2.1 bcpmei85的花器官形态正常 |
| 7.2.2.2 bcpmei85的花粉活力、花粉萌发和花粉形态正常 |
| 7.2.2.3 bcpmei85的花粉管生长正常 |
| 7.2.3 BcPMEI85启动子启动GUS报告基因在成熟花粉中特异表达 |
| 7.2.4 BcPMEI85启动子区域的顺式调控元件分析 |
| 7.3 讨论 |
| 7.3.1 可能存在其他PMI家族成员与BcPMEI85的功能冗余 |
| 7.3.2 BcPMEI85可能与激素调控或逆境响应有关 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附表 |
| 在读期间发表的论文 |
（10）油菜高效再生体系的建立及草甘膦抗性基因EPSPs和BnGRF2的遗传转化（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Summary |
| 缩略词表 |
| 第一章 文献综述 |
| 1 引言 |
| 2 油菜高频再生体系的研究进展 |
| 2.1 植物基因型、外植体类型及不同配比的外源植物激素对再生体系的影响 |
| 2.2 植物组织再生体系中出现的问题 |
| 3 油菜遗传转化的研究 |
| 3.1 油菜遗传转化方法 |
| 3.2 农杆菌介导的遗传转化 |
| 4 油菜生长调节因子BnGRF2的研究 |
| 4.1 植物GRF转录因子研究进展 |
| 4.2 BnGRF2对油菜油分含量得研究进展 |
| 5 草甘膦性质及作用机理 |
| 5.1 草甘膦性质 |
| 5.2 草甘膦的作用机理 |
| 5.3 抗除草剂转基因研究进展 |
| 6 油菜转基因安全研究 |
| 7 本研究的目的与意义 |
| 8 技术路线 |
| 第二章 油菜高效再生体系的建立 |
| 2.1 试验材料 |
| 2.1.1 植物材料与药品 |
| 2.1.2 主要仪器设备 |
| 2.2 试验方法 |
| 2.2.1 外植体的制备 |
| 2.2.2 基本MS培养基组成 |
| 2.2.3 植物激素对不同外植体的愈伤诱导的影响 |
| 2.2.4 植物激素对诱导不同外植体芽再生的影响 |
| 2.2.5 不同基因型对下胚轴与叶片的愈伤诱导及芽再生的影响 |
| 2.2.6 不同浓度的IAA和NAA对再生芽生根的影响 |
| 2.2.7 再生植株的生根、炼苗和移栽 |
| 2.2.8 数据分析 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 不同浓度和配比的植物激素对下胚轴与叶片愈伤诱导的影响 |
| 2.3.2 不同浓度和配比的植物激素对诱导下胚轴与叶片的芽再生的影响 |
| 2.3.3 不同基因型对下胚轴和叶片的愈伤诱导及芽再生的影响 |
| 2.3.4 不同浓度的IAA和NAA对再生芽生根的影响 |
| 2.4 讨论 |
| 第三章 油菜草甘膦抗性基因EPSPs和BnGRF2遗传转化的研究 |
| 3.1 试验材料 |
| 3.1.1 植物材料与药品 |
| 3.1.2 主要仪器设备 |
| 3.1.3 培养基 |
| 3.1.4 抗生素 |
| 3.2 试验方法 |
| 3.2.1 植物表达载体的初步鉴定 |
| 3.2.2 含双价植物表达载体pCEGRF的农杆菌菌株的获得与鉴定 |
| 3.2.3 农杆菌介导的遗传转化 |
| 3.2.4 草甘膦抗性筛选及转EPSPs基因油菜的分子分析 |
| 3.2.5 油菜生长调节因子BnGRF2的表达分析 |
| 3.2.6 数据处理与分析 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 植物表达载体的初步鉴定 |
| 3.3.2 双价植物表达载体pCEGRF的菌液PCR鉴定 |
| 3.3.3 不同影响因子对转化的研究 |
| 3.3.4 四种抗生素浓度的筛选及剂量的优化 |
| 3.3.5 草甘膦抗性筛选转及转EPSPs油菜的分子鉴定 |
| 3.3.6 油菜生长调节因子BnGRF2的表达分析 |
| 3.4 讨论与结论 |
| 3.4.1 抗生素的选择与剂量的优化 |
| 3.4.2 BnGRF2对油菜油分含量的影响 |
| 第四章 总结 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 导师简介 |
| 作者简介 |
| 附录1 抗生素和激素等配制与保存 |
四、农杆菌介导的白菜遗传转化影响因子研究进展（论文参考文献）
- [1]苜蓿HD-Zip转录因子基因Mfhb-1对烟草和小麦的遗传转化及抗旱性研究[D]. 赵晓登. 河南科技学院, 2021(07)
- [2]适合抗根肿病研究的大白菜遗传转化体系的构建[D]. 刘旭垚. 沈阳农业大学, 2020(05)
- [3]羽衣甘蓝粉色叶基因的功能分析[D]. 王欢. 沈阳农业大学, 2020(08)
- [4]农杆菌介导乌菜花药非组织培养遗传转化体系的建立[D]. 曾繁丽. 安徽农业大学, 2020(04)
- [5]大白菜遗传转化和CRISPR/Cas9基因编辑体系的建立[D]. 李海艳. 沈阳农业大学, 2019(02)
- [6]甘蓝型油菜角果长和粒重主效QTL qSLWA9的克隆与功能分析[D]. 石柳柳. 华中农业大学, 2019
- [7]农杆菌介导的白菜类作物转基因体系建立及WRKYⅡa转录因子蛋白互作验证[D]. 胡蝶. 南京农业大学, 2019(08)
- [8]白菜C2H2型锌指蛋白基因家族的进化及DAZ3在转录水平调控花粉发育的研究[D]. 吕天琦. 浙江大学, 2019(01)
- [9]白菜和甘蓝PMEI基因家族成员的比较与PMEI1和PMEI85的功能鉴定[D]. 柳婷婷. 浙江大学, 2018(01)
- [10]油菜高效再生体系的建立及草甘膦抗性基因EPSPs和BnGRF2的遗传转化[D]. 石文慧. 甘肃农业大学, 2017(02)