一、鼻咽癌中TSG101基因的突变研究(论文文献综述)
熊家超[1](2021)在《长链非编码RNA FOXP4-AS1在尤文肉瘤及其肿瘤微环境中的功能机制研究》文中进行了进一步梳理研究背景:尤文肉瘤(ES),是一种源自骨髓的原发性高度恶性骨肿瘤,主要发生于儿童和青少年,发病率为1/150万,并且15岁人群的发病率最高。尤文肉瘤可发生于身体任何部位,但最常见的发病部位是骨盆和长骨近端。该疾病恶性程度高,病程短,预后较差,5年生存率为70%至80%;30%病人在诊断时伴有明显转移,转移性肿瘤患者5年生存率仅为30%。目前,对尤文肉瘤的治疗方式包括单纯的手术、放疗、化疗,但效果均不理想。因此了解ES的发生、发展机制将有助于寻找新的早期诊断及治疗方式,提高生存率及降低复发率,解决治疗ES的关键科学问题。LncRNA是一种长度超过200个核苷酸的非编码RNA,,参与生理发育和疾病发生的关键生物学过程。研究表明,LncRNA的表达失调在细胞的恶性转化中具有重要作用,包括维持细胞生长和增殖、促进转移和侵袭、诱导血管生成和抑制细胞凋亡等。它们与肿瘤的发生、发展和预后密切相关。LncRNAs在亚细胞分布上也是多样化的,在不同的亚细胞位置具有不同的生物学功能。在细胞核中作为分子支架,辅助选择性剪接,调节染色体结构;在细胞质中,调节翻译,促进或抑制mRNA降解,吸附miRNA(作为竞争性内源RNA,ceRNA)。因此,研究lncRNAs的表达与功能将有助于了解ES的发病机制、诊断、治疗与预后。肿瘤微环境(Tumor micro-environment,TME)是指肿瘤细胞存在的周围微环境,包括周围的血管、免疫细胞、成纤维细胞、骨髓源性炎性细胞、细胞外基质、各种细胞因子和趋化因子构成等成分,是一个复杂的综合系统。研究发现,lncRNA不仅在肿瘤细胞内发挥重要作用,同时还可被细胞外囊泡包裹,递送至TME中参与细胞间的信息传递,影响TME构成,进而调控肿瘤的发生、发展。因此,研究lncRNA在ES肿瘤微环境中的功能,对寻找ES新的诊断与治疗方式具有重要意义。综上所述,本研究欲从肿瘤细胞内和肿瘤微环境两方面对lncRNA在ES发生、发展中的功能机制进行研究。研究目的:本研究旨在寻找新的ES预后lncRNA标志物,研究lncRNA在ES中的功能作用及其对肿瘤微环境的影响。研究分为以下五部分:1、长链非编码RNA FOXP4-AS1的筛选和临床意义研究;2、FOXP4-AS1对尤文肉瘤细胞系增殖、迁移、侵袭功能的影响;3、生物信息学分析FOXP4-AS1在尤文肉瘤中的潜在作用机制;4、FOXP4-AS1通过miR-298/TMPO途径调控尤文肉瘤增殖、迁移、侵袭能力的研究;5、FOXP4-AS1在尤文肉瘤肿瘤微环境中的功能研究;上述研究成果有助于明确预后lncRNA在ES中的功能与机制,在帮助预测肿瘤预后方面具有极好的临床相关性和价值,可为ES的诊断、治疗及临床转化提供新的思路。第一部分长链非编码RNAFOXP4-AS1的筛选和临床意义研究研究方法:1、通过Lasso-Cox回归筛选尤文肉瘤预后相关lncRNA;2、Kaplan-Meier生存分析筛选差异表达的预后lncRNA;3、通过GEO、TCGA、GTEx数据和RT-qPCR分析FOXP4-AS1在尤文肉瘤和33种肿瘤中的表达。研究结果:1、FOXP4-AS1是尤文肉瘤患者的不良预后因子;2、FOXP4-AS1在尤文肉瘤组织及细胞系中表达显着升高;3、FOXP4-AS1在多种恶性肿瘤中表达升高。第二部分FOXP4-AS1对尤文肉瘤细胞系增殖、迁移、侵袭功能的影响研究方法:1、通过CCK-8实验检测敲低或过表达FOXP4-AS1对尤文肉瘤细胞增殖功能的影响;2、Transwell迁移、侵袭实验检测敲低或过表达FOXP4-AS1对尤文肉瘤细胞迁移、侵袭的影响;3、敲低或过表达FOXP4-AS1后,通过裸鼠皮下成瘤实验检测尤文肉瘤细胞增殖、体内成瘤能力的变化。研究结果:FOXP4-AS1可促进尤文肉瘤细胞增殖、迁移、侵袭能力,促进尤文肉瘤发生、发展。第三部分生物信息学分析FOXP4-AS1在尤文肉瘤中的潜在作用机制研究方法:1、筛选FOXP4-AS1显着相关性基因,使用GO、Hallmark通路富集分析和蛋白互作网络分析筛选FOXP4-AS1显着相关的功能、通路;2、GSVA、GSEA联合筛选FOXP4-AS1相关的信号通路;3、通过细胞核质分离实验Ago2-IP实验分析分析FOXP4-AS1的亚细胞定位和潜在分子功能;4、构建FOXP4-AS1的ceRNA网络,联合信号通路富集分析,筛选显着相关通路中的核心基因,确定FOXP4-AS1下游靶基因。研究结果:1、尤文肉瘤细胞中FOXP4-AS1主要定位于细胞质,具备“ceRNA”功能。2、FOXP4-AS1可能通过吸附miR-298调控TMPO表达,进而影响尤文肉瘤功能表第四部分FOXP4-AS1通过miR-298/TMPO途径调控尤文肉瘤增殖、迁移、侵袭能力的研究研究方法:1、双荧光报告基因实验验证miR-298与FOXP4-AS1、TMPO的结合位点2、在低表达FOXP4-AS1的稳转细胞系中,分别转染miR-298 mimics、miR-298-inhibitor,通过CCK-8、Transwell迁移和侵袭实验检测尤文肉瘤细胞增殖、迁移、侵袭能力变化;3、在尤文肉瘤细胞中分别转染 miR-298 mimics、miR-298 mimics+pcDNA-TMPO,并通过 RT-qPCR、western blot检测TMPO 的表达,最后通过CCK-8、Transwell迁移和侵袭实验检测尤文肉瘤细胞增殖、迁移、侵袭能力变化研究结果:FOXP4-AS1可通过吸附miR-298调节TMPO表达,进而促进尤文肉瘤增殖、迁移、侵袭能力。第五部分FOXP4-AS1在尤文肉瘤肿瘤微环境中的功能研究研究方法:1、通过CIBERSORT方法分析FOXP4-AS1与尤文肉瘤肿瘤微环境中22种免疫细胞浸润水平的关系;2、通过THP-1细胞构建M0、M1、M2三种巨噬细胞,检测FOXP4-AS1的表达3、在M0型巨噬细胞中分别敲低和过表达FOXP4-AS1,随后使用IL-4/IL-13诱导M0向M2型极化,24小时后检测M1、M2型细胞标志物,评估细胞极化情况。4、检测FOXP4-AS1在细胞外囊泡中的表达,并通过PKH26囊泡标记实验,检测巨噬细胞吞噬细胞外囊泡情况5、在尤文肉瘤中过表达FOXP4-AS1,随后提取细胞外囊泡与M0型巨噬细胞共培养,48小时后通过RT-qPCR检测M2型巨噬细胞标志物水平。研究结果:FOXP4-AS1可被尤文肉瘤来源细胞外囊泡递送至肿瘤相关巨噬细胞,诱导巨噬细胞M2型极化。研究结论:1、FOXP4-AS1是尤文肉瘤的不良预后生物标志物;2、FOXP4-AS1可促进尤文肉瘤增殖、迁移、侵袭过程;3、FOXP4-AS1可通过竞争性吸附miR-298,上调TMPO表达,促进尤文肉瘤发生、发展;4、FOXP4-AS1可通过细胞外囊泡递送至肿瘤相关巨噬细胞中,诱导M2型巨噬细胞极化。
尤学武[2](2021)在《TGF-B1诱导后外泌体MIR-663B促进宫颈癌转移和上皮-间质转化的机制研究》文中提出研究背景及目的宫颈癌(Cervival Cancer,CC)是导致全球妇女死亡的第四大癌症。尽管宫颈癌的筛查检测和新的治疗策略不断得到推广,但是其发病率和死亡率在广大发展中国家仍然呈现出逐年增高的趋势。目前,探索宫颈癌发病相关的分子机制并施行精准治疗成为广大教授学者研究的焦点并为宫颈癌提供了新的研究思路。转化生长因子-β1(Tumor growth factor-β1,TGF-β1)属于TGF-β超家族中新发现的多功能调节肽,广泛参与细胞生长,分化,增殖和运动的调节过程,及人类癌症的细胞信号转导。TGF-β1在体内稳态和癌症早期阶段具有抑制生长和抗炎功能,而在肿瘤晚期阶段,异常的TGF-β活化会促进肿瘤侵袭性生长特征和转移扩散。先前的研究报道了 TGF-β1通路可以调节microRNA(miRNA)的表达并影响多种肿瘤的发生发展,但其在宫颈癌中的作用尚存争议。外泌体的本质是一类由脂质双分子层构成的细胞外囊泡(Extracellular vesicles,EVs),直径范围30-150nm,可以将蛋白质、脂质、miRNA和DNA在内的多种功能性生物分子转运到新的靶细胞中以介导细胞间信号转导。癌症来源的外泌体包含多种致癌信息,通过调节肿瘤微环境(Tumormicroenvironment,TME)的构建进而促进肿瘤的发生和发展。miRNA是一类广泛存在的与细胞分化,生物学发育和疾病发生的调控有关的内源性非编码RNA(Non-coding RNA,ncRNA),癌症来源的外泌体通过转运多种miRNA影响肿瘤细胞的增殖,迁移,侵袭和凋亡等生物学功能。基于以上理论基础,本课题探讨了 TGF-β1对宫颈癌细胞系外泌体miRNA表达谱的影响,明确了 TGF-β1诱导后的宫颈癌外泌体中miR-663b表达升高,进而对miR-663b促进宫颈癌细胞转移和上皮-间质转化(Epithelial-mesenchymal transition,EMT)的机制进行了深入研究。研究方法1.采用超速离心法从细胞培养液中分离提取外泌体;使用透射电子显微镜(Transmission electron microscope,TEM)、纳米粒径追踪技术(Nanoparticle tracking analysis,NTA)和Western Blot对分离得到的外泌体进行鉴定;2.采用深度RNA测序技术(RNA sequencing,RNA-seq)鉴定TGF-β1诱导后宫颈癌细胞系外泌体中miRNA表达谱的改变,采用实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-time Quantitative Polymerase Chain Reaction,qPCR)在 HeLa 和 CaSki 外泌体中进行鉴定,最终筛选出miR-663b在TGF-β1诱导后的宫颈癌细胞系外泌体中表达升高;3.外泌体/肿瘤细胞共培养后,通过伤口愈合实验和Transwell测定法验证外泌体miR-663b对宫颈癌细胞迁移侵袭和增殖功能的影响;4.通过双荧光素酶实验和Western Blot寻找miR-663b的下游靶基因,筛选得到目的基因甘露糖苷乙酰氨基葡萄糖氨基转移酶3(Mannoside acetylglucosaminyltransferase 3,MGAT3);5.通过伤口愈合实验和Transwell测定法验证MGAT3对宫颈癌细胞侵袭迁移功能的影响;通过Western Blot技术检测MGAT3对EMT信号通路关键分子表达的影响;6.通过小干扰技术和质粒转染技术进行挽救实验,进一步验证miR-663b和MGAT3对宫颈癌细胞迁移功能的影响。研究结果1.外泌体鉴定:首先通过TEM检测到外泌体典型的杯状形态和30-150 nm的大小范围,通过Western Blot证实了外泌体的阳性标志物(CD63,TSG101,HSP70和GAPDH)的表达,通过NTA证明分离出的外泌体的浓度和大小范围符合先前的研究报道。2.选择miR-663b进行后续研究:深度RNA测序(RNA-seq)显示TGF-β1诱导后宫颈癌细胞系外泌体中48个miRNA分子表达升高,选择前10个miRNAs在HeLa和CaSki外泌体中进行qPCR验证,miR-663b在HeLa和CaSki细胞的外泌体中选择性富集了 4倍和3倍。3.外泌体miR-663b促进宫颈癌细胞迁移和侵袭功能:PKH67外泌体标记技术显示外泌体在孵育后可以进入HeLa细胞,TGF-β1处理组的外泌体显着增强了HeLa和CaSki细胞的迁移和侵袭功能,使用慢病毒敲低miR-663b后,HeLa和CaSki细胞的迁移和侵袭功能则得到部分恢复。4.MGAT3是miR-663b的下游靶基因:接下来,我们使用生物信息学工具在MGAT3 3’端非翻译区(3’-untranslated regions,3’-UTR)和 miR-663b 之间鉴定出了特定碱基结合位点并通过双荧光素酶实验在293T细胞中验证了这一结果。采用小干扰技术直接转染HeLa和CaSki细胞后,研究结果显示miR-663b mimics降低了 HeLa和CaSki细胞中MGAT3蛋白的表达,而miR-663b inhibitor则促进了 MGAT3蛋白的表达。5.MGAT3参与外泌体miR-663b促进的宫颈癌转移:载体介导的MGAT3基因过表达后,伤口愈合实验和Transwell实验显示miR-663b显着促进了 HeLa和CaSki细胞的迁移侵袭功能,而与pcDNA3.1-MGAT3共转染则可以部分恢复miR-663b引起的这种作用,证明外泌体miR-663b通过抑制MGAT3的表达来促进宫颈癌细胞的转移能力。6.MGAT3通过EMT通路抑制宫颈癌的转移能力:Western Blot显示,HeLa和CaSki 细胞转染 pcDNA3.1-MGAT3 后,E-cadherin(E-cad)的表达增加,而N-cadherin(N-cad)和 β-catenin 的表达减少。相反,转染 miR-663b mimics 后,N-cad和β-catenin的表达增加,而E-cad的表达减少。HeLa和CaSki细胞与miR-663b-KD组的外泌体共培养后引起,MGAT3和E-cad的表达显着降低,而与miR-663b组的外泌体共培养则引起MGAT3和E-cad的表达升高。结论1.首次应用深度RNA测序(RNA-seq)技术鉴定TGF-β1诱导后宫颈癌细胞系外泌体中的miRNA表达谱,筛选出miR-663b是TGF-β1诱导后宫颈癌细胞系外泌体中升高的miRNA分子。2.阐明了 miR-663b直接靶向MGAT3,通过抑制MGAT3的表达进而促进宫颈癌细胞系的侵袭迁移功能。3.阐明了 TGF-β1/miR-663b/MGAT3轴促进宫颈癌的转移和上皮-间质转化的机制。本研究的创新性1.使用深度RNA测序技术鉴定出TGF-β1诱导前后宫颈癌HeLa细胞系外泌体中的miRNA表达谱;2.明确了miR-663b在TGF-β1诱导后的宫颈癌HeLa和CaSki细胞系外泌体中表达升高;3.明确了MGAT3是miR-663b的下游靶基因;4.探讨了TGF-M/miR-663b/MGAT3轴影响宫颈癌转移功能和EMT信号通路的分子机制。
石园园[3](2020)在《PTEN缺失通过损害溶酶体功能增加外泌体分泌进而促进胆管癌转移》文中研究说明研究背景和目的胆管癌是起源于胆道上皮系统的恶性肿瘤。虽然胆管癌的整体发病率较低,但我国和东南亚国家是胆管癌的高发地区,且发病率呈现逐年上升趋势。胆管癌具有恶性程度高、临床预后差的特点,多数患者确诊时已经发生转移,且术后极易复发。因此,关于胆管癌的病因和复发转移的机制研究,对胆管癌的诊疗具有非常重要的意义。PTEN(Phosphatase and tensin homologue deleted on chromosome 10)是1997年发现的一种抑癌基因,其中文名为人第10号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源的基因。随着研究的深入,人们发现PTEN在前列腺癌、膀胱癌和肺癌等多种肿瘤中存在突变、缺失或表达减少的情况。PTEN表达的改变可以通过负向调控PI3K-AKT-m TOR信号通路,从而在肿瘤的发生进展过程中起到重要作用。本研究对PTEN在胆管癌中的作用进行初步探索时已经发现,胆管癌中存在较高比例的PTEN突变或缺失情况,且PTEN表达与胆管癌的复发转移密切相关。外泌体是由多种细胞产生的直径在30到150纳米的细胞外囊泡,可通过输送蛋白质、脂质、多糖和核酸分子等物质介导细胞间的通讯。据报道,肿瘤细胞来源的外泌体在胶质母细胞瘤、乳腺癌、白血病、鼻咽癌和胰腺癌等多种肿瘤的进展过程中起到重要作用。外泌体能够通过上调多种血管生成相关基因表达,促进肿瘤微环境中血管内皮细胞的增殖、转移和出芽。高侵袭性肿瘤细胞来源的外泌体可以介导靶细胞的上皮间质转化过程。此外,外泌体还能通过长距离的信号转导,介导转移前生态位的形成,进而促进播散肿瘤细胞的定植和存活。目前,关于肿瘤细胞来源的外泌体在胆管癌进展和转移中的作用及机制尚不清楚,重要肿瘤驱动基因对该生物学过程的精细调控也少见报道。而我们发现,抑癌基因PTEN缺失的促肿瘤转移功能与肿瘤细胞来源外泌体的生物学特性高度重合,这促使我们思考两者之间的可能关联。明确PTEN表达与胆管癌细胞外泌体分泌的关系,以及它们在胆管癌转移中的作用,将具有十分重要的科学价值。外泌体的生成源于细胞内吞途径,细胞的溶酶体功能与外泌体的分泌密切相关。已有文献报道,AKT和m TOR分子可以通过调节Mi T-TFE基因影响溶酶体的新生和功能。PTEN作为PI3K-AKT-m TORC1上游的信号分子,是否也能对溶酶体的功能产生重要调节作用,以及该作用是否能够影响外泌体的分泌,目前尚无相关研究。明确这一问题,将帮助我们更好地解释PTEN影响胆管癌复发转移的原因和机制。本课题将基于PTEN在胆管癌中的表达情况,建立PTEN差异表达的胆管癌细胞,深入探究PTEN对胆管癌细胞的溶酶体功能和外泌体分泌的影响,并通过体外细胞和动物体内实验,进一步明确其在胆管癌转移过程中的作用及具体机制,为胆管癌的诊疗提供新的思路。研究方法1、回顾性分析胆管癌临床样本中PTEN表达水平对胆管癌临床预后和复发转移的影响。2、应用慢病毒、腺病毒感染或质粒、干扰RNA转染的方法建立PTEN差异表达的胆管癌细胞,包括PTEN过表达、PTEN干扰、PTEN敲除及对照细胞。3、Transwell细胞迁移实验、平板克隆形成实验、软琼脂克隆形成实验和成球实验测定PTEN差异表达对胆管癌细胞生物学行为的影响。4、建立经尾静脉肺转移和经脾肝转移小鼠模型,体内验证PTEN差异表达对胆管癌转移的影响。5、超速离心法提取PTEN差异表达胆管癌细胞的外泌体,通过电镜、NTA检测、Western-blot实验检测PTEN差异表达对外泌体分泌的影响。6、检测PTEN差异表达胆管癌细胞分泌的外泌体对胆管癌细胞迁移、平板克隆形成的影响。7、回顾性分析胆管癌临床样本中外泌体特异性标志蛋白CD63与PTEN表达的相关性,以及CD63表达与胆管癌复发转移的关联。8、免疫荧光技术检测PTEN差异表达细胞中CD63和HGS的表达,明确PTEN对细胞中MVB数量的影响。9、电子显微镜观察PTEN敲除和对照胆管癌细胞中多囊泡体(Multivesicular Body,MVB)和管腔内小泡(Intraluminal vesicle,ILV)的结构和数量。10、Lysosensor和Lysotracker染色检测PTEN差异表达胆管癌细胞中溶酶体的数量和功能。11、Western-blot和RT-PCR实验检测PTEN差异表达细胞中组织蛋白酶成分的表达变化。12、探针法检测PTEN差异表达胆管癌细胞中溶酶体的p H值。13、RT-PCR检测PTEN差异表达胆管癌细胞中V-ATPase各组分表达的变化。14、免疫荧光技术检测PTEN差异表达胆管癌细胞中转录因子EB(Transcription factor EB,TFEB)的亚细胞定位情况。研究结果1、PTEN在胆管癌中存在一定比例的突变缺失,PTEN缺失的胆管癌患者临床预后较差;PTEN缺失与胆管癌的复发转移密切相关。2、降低PTEN表达促进胆管癌细胞的迁移、侵袭、克隆形成和自我更新。3、PTEN敲除促进胆管癌细胞的体内转移。4、降低PTEN表达促进胆管癌细胞的外泌体分泌,增加胆管癌细胞中MVB的数量。5、PTEN低表达胆管癌细胞来源的外泌体更能促进胆管癌细胞的生长、迁移。6、抑制溶酶体的功能可以增加细胞中MVB的数量,促进外泌体的释放。7、PTEN通过自身蛋白磷酸酶活性对TFEB进行去磷酸化,从而介导TFEB的核转位,促进溶酶体的新生和功能。8、PTEN通过介导V-ATPase组分ATP6V1A的表达上调,促进溶酶体的酸化。9、PTEN缺失可以通过抑制溶酶体功能,阻碍MVB在溶酶体中的降解代谢,促使其与质膜融合增加外泌体的释放,进而促进肿瘤细胞的转移。结论本研究发现在收集到的108例胆管癌样本中,有将近一半存在PTEN的突变或缺失,表现为PTEN的低水平表达;PTEN低表达与胆管癌的恶性进展和复发转移密切相关,并且能够预示胆管癌患者的不良预后;PTEN的表达降低不仅可以通过抑制TFEB的核转位,影响溶酶体的新生,还能通过下调V-ATPase组分,特别是ATP6V1A的表达,损害溶酶体的酸化功能;溶酶体的数目减少和功能受损能够通过抑制MVB在溶酶体中的降解代谢,促使其与质膜融合发生外排,增加外泌体的分泌,从而促进胆管癌细胞的存活、迁移和转移过程。总之,本研究通过深入探讨PTEN表达、溶酶体功能和外泌体分泌三者之间的关联,首次系统性地阐述了PTEN调节胆管癌转移的确切机制,为胆管癌的诊疗提供了新的理论依据。
赵沁丽[4](2020)在《喉鳞癌血清外泌体差异miRNAs筛选及miR-941功能研究》文中认为背景:喉鳞状细胞癌(喉鳞癌)是头颈部最常见的恶性肿瘤之一,在包括山西省在内的中国北方地区高发。经过几十年的努力,喉鳞癌的治疗方式有了长足进展,但5年生存率却无明显提升。喉部解剖位置隐匿,喉鳞癌早期症状不典型,早期诊断不及时,极大地影响了患者的治疗效果和预后。目前,喉鳞癌的诊断主要依靠内窥镜下组织病理学检查,而侵入性的检测方式影响了该项检查的普及及动态评估。因此,在临床上亟待开发一种快速、微创、高灵敏度的诊断方法及有效可靠的生物学标志物。外泌体是活细胞主动分泌的直径为30-150 nm的膜性囊泡,含有亲本细胞来源的蛋白质、脂质和核酸,可被释放到外周循环血液中。血液是临床上常用的、微创且易于重复获取的样本。MicroRNAs(miRNAs)是真核生物体内广泛存在的非编码小RNA,通常在肿瘤中异常表达,作为肿瘤抑制因子或癌基因在肿瘤的发生发展过程中发挥重要调控作用。循环血液中外泌体miRNAs已经在多数肿瘤中被报道可作为潜在的肿瘤标志物,用于肿瘤筛检、病程监测、疗效观察及预后评估等各环节。外周血外泌体miRNAs因外部有膜的包被,可逃避血液中核酸酶的消化,更为稳定,同时不易受到细胞外环境的影响,研究结果更为可靠;而且,外泌体内miRNAs的成分和丰度与总体血液中相比是有差异的,依赖于母体细胞,更能反映母体细胞的功能状态;另外,外泌体内有些miRNAs是富集的,有利于低丰度miRNAs的检出。在喉癌领域,相关的研究很少,我们尚未检索到喉鳞癌外周血外泌体miRNA表达谱的有关报道。本研究拟在高通量测序基础上,建立喉鳞癌血清外泌体miRNA表达谱,鉴定出有意义的血清外泌体miRNA,评估其在喉鳞癌诊断中的应用价值,并探究其在喉鳞癌恶性进程中的生物学功能,为喉鳞癌诊断标志物及治疗新靶点的发现提供参考依据。目的:建立喉鳞癌血清外泌体miRNA表达谱,筛选差异表达的miRNAs,评估血清外泌体miRNAs对喉鳞癌诊断的监测价值,探究关键miRNA在喉鳞癌恶性进展中的生物学功能。方法:1、血清外泌体提取方法评估收集3例喉鳞癌患者血清,分别采用超高速离心法(UC)、ExoQuick试剂法(EQ)、8%PEG单次沉淀(PEG1)及8%PEG+5%PEG两次沉淀法(PEG2)提取这3例患者的血清外泌体。从提取到的外泌体的形态、粒径、浓度、标志蛋白表达及miRNA表达谱这几个方面来评估这四种方法的优劣。(1)运用透射电镜(TEM)观察外泌体形态与大小;纳米颗粒跟踪仪(NTA)检测粒径及浓度;Western Blot(WB)检测外泌体标志蛋白表达情况。(2)提取外泌体RNA,通过高通量RNA测序获得这四种方法提取到的血清外泌体miRNA表达谱,进行彼此间相关性分析。2、喉鳞癌患者血清外泌体差异miRNAs筛选用ExoQuick试剂提取6例喉鳞癌患者和6例健康对照者血清外泌体。(1)等体积血清提取外泌体后,采用蛋白阵列印迹法分析外泌体相关蛋白表达情况,并用TEM和NTA检测比较两组样本间血清外泌体分泌水平。(2)提取这12例实验对象血清外泌体RNA,进行高通量RNA测序,筛选两组间差异表达的miRNAs,采用miRanda、PITA和RNAhybrid软件预测它们的靶基因,对这些靶基因进行GO和KEGG富集分析。3、喉鳞癌患者和健康对照者血清外泌体内参基因筛选(1)从我们的测序数据和文献报道中选择候选参考基因。从测序数据中选择表达稳定、变异系数小、表达水平适中的miRNAs作为候选参考miRNAs。筛选标准:首先,排除在两组间表达水平有显着差异(P<0.05)的miRNAs,或者TPM值<1的miRNAs;其次,计算每个miRNA在两组中的平均TPM值,排除两组间平均TPM值之比值<0.75或>1.3的miRNAs;最后,计算每个miRNA在所有样本中总的变异系数,将变异系数按从小到大进行排序,选择平均TPM值>50的miRNAs作为候选内参基因。此外,查阅文献后,U6和miR-16-5p也纳入到候选内参基因中。(2)候选内参基因在另一组独立样本中进行qRT-PCR检测,用GeNorm、BestKeeper、NormFinder、Delta Ct和RefFinder等5种算法对候选基因的表达稳定性进行评估。4、差异miRNAs人群验证及受试者工作特征(ROC)曲线分析(1)从测序数据中选择在喉鳞癌患者血清外泌体中上调表达且表达量高(TPM值≥50)的9个miRNAs,在另外50名喉鳞癌患者及25名健康对照者中进行qRT-PCR验证。(2)ROC曲线分析miR-941和miR-27a-5p的诊断效能。(3)分析喉鳞癌组织测序数据中miR-941的表达状况。(4)分析血清外泌体miR-941与喉鳞癌患者病理参数的相关性。(5)分析YM500v3数据库中头颈部鳞状细胞癌及其他多种肿瘤中miR-941的表达状况。5、miR-941对喉鳞癌细胞系功能影响(1)qRT-PCR法检测人喉鳞癌细胞系FD-LSC-1、Tu 686及正常口腔角质细胞系HOK的细胞内和细胞外miR-941表达水平。(2)使用脂质体Lipofectamine 3000分别将miR-941模拟物(mimics)和miR-941拮抗物(inhibitor)转染至喉鳞癌细胞FD-LSC-1和Tu 686中,同时设立mimics NC组和inhibitor NC组作为对照组,采用qRT-PCR检测转染效率。(3)通过CCK8细胞增殖实验和Transwell侵袭实验分析转染miR-941 mimics和inhibitor后FD-LSC-1和Tu 686喉鳞癌细胞的增殖和侵袭能力的变化。结果:1、血清外泌体提取方法评估(1)TEM示四种方法提取到的外泌体都具有典型的杯口状或凹面圆盘状结构;NTA示EQ法获得的最富集囊泡粒径小于150nm,其他三种方法所获得的囊泡峰值粒径大于150nm,其中UC和PEG2法提取的囊泡显示出多个粒径峰,还分离到很多直径大于300nm的颗粒;NTA示EQ法所获得的外泌体浓度最高,其后依次为PEG1、PEG2和UC;WB显示四种方法富集到的外泌体都阳性表达蛋白CD63、CD81和TSG101,但是相同的蛋白上样量,EQ、PEG1法提取的外泌体中这三种蛋白表达量较UC、PEG2法高。(2)高通量RNA测序显示UC、EQ、PEG1、PEG2四法提取到的血清外泌体中检出的miRNAs各有571、1094、1079、896种,对这些miRNAs的表达量进行Pearson相关性分析,彼此间相关系数在0.90以上,相关性很强。2、喉鳞癌患者血清外泌体差异miRNAs筛选(1)蛋白阵列印迹法显示喉鳞癌患者和健康对照者的血清外泌体表达CD81、CD63、Alix、FLOT1、ICAM1、EpCAM、ANXA5和TSG101等外泌体相关蛋白,但不表达细胞污染标志蛋白GM130;TEM下,同等大小视野中喉鳞癌患者血清外泌体数量多;NTA示喉鳞癌患者血清中的外泌体浓度较健康对照者显着增高(P<0.05)。(2)Agilent 2100及微量电泳芯片显示两组样本RNA是以小RNA种类为主,无细胞RNA那样的18S rRNA和28S rRNA片段分布峰。(3)高通量RNA测序后,两组共获得1608个成熟体miRNAs,其中1496个是已知的miRNAs,112个是软件预测的新miRNAs。以|log2fold change|≥0.5且P<0.05作为差异筛选标准,75个miRNAs的表达水平在两组间是有显着差异的,其中,在喉鳞癌患者中34个miRNAs表达上调,41个miRNAs下调表达。对这些差异miRNAs的靶基因进行GO和KEGG富集分析,GO分析显示这些靶基因主要参与了单有机体进程、定位、细胞成分组织或生物发生、分子功能、结合等生物学途径或功能,KEGG分析显示这些靶基因主要参与MAPK、Ras和FAK等肿瘤相关信号通路。3、喉鳞癌患者和健康对照者血清外泌体内参基因筛选测序数据中共有8个miRNAs入选为候选内参miRNAs,分别是miR-30a-5p、miR-532-5p、miR-181a-5p、miR-425-5p、miR-363-3p、miR-424-3p、miR-181b-5p和miR-181a-2-3p,结合U6和miR-16-5p,这10个候选内参基因经过qRT-PCR验证后,五种算法对它们的表达稳定性进行评估排名,最终miR-30a-5p、miR-532-5p和U6被选用于最佳内参基因组合。4、差异miRNAs人群验证及ROC分析(1)喉鳞癌患者组与健康对照者组间表达水平差异有统计学意义的血清外泌体miRNAs是miR-941(P<0.001)和miR-27a-5p(P<0.01),这两者表达趋势与测序数据一致,在喉鳞癌患者中是高表达的。剩余7个miRNA在两组间差异无统计学意义。(2)血清外泌体miR-941预测喉鳞癌的的ROC曲线下面积(AUC)是0.797(P<0.001),95%可信区间为0.676-0.918;miR-27a-5p的AUC值是0.672,诊断效能低,未予以进一步研究。以血清外泌体miR-941的表达水平ΔCt值取5.139为诊断点,对喉鳞癌预测的灵敏度和特异度分别为82%和72%,约登指数最大,为0.54;当取ΔCt界值为5.381时,诊断灵敏度和特异度分别为92%和60%,约登指数为0.52。(3)课题组前期对57例喉鳞癌患者的术后癌组织及其配对癌旁组织进行了转录组测序,miR-941在喉鳞癌肿瘤组织中的表达水平是癌旁组织的2.1倍,差异有统计学意义(P<0.001)。(4)检索公共数据库Ym500v3,在456例头颈鳞癌肿瘤组织和43例正常样本组织中,miR-941在肿瘤组织中的表达是正常组织中的2.38倍(P=0.0014);同时,miR-941在肺鳞状细胞癌、食管癌、宫颈鳞状细胞癌、皮肤黑色素瘤、肝癌和乳腺癌等多数肿瘤的癌组织中表达水平比正常组织中高。(5)血清外泌体miR-941表达水平在喉鳞癌患者中的声门上型者高于声门型者,T3+T4期者高于T1+T2期者,颈淋巴结转移者高于无转移者,Ⅲ+Ⅳ期者高于Ⅰ+Ⅱ期者,病理中、低分化者高于高分化者(P>0.05)。尽管差异无统计学意义,但仍可发现miR-941表达与喉鳞癌的疾病进展和恶性程度是有一定关联的。公共数据库Kaplan-Meier plotter中头颈鳞癌测序数据的生存分析结果表明,miR-941的高表达与头颈鳞癌患者的不良预后显着相关(P=0.0016)。5、miR-941对喉鳞癌细胞系功能影响(1)FD-LSC-1和Tu 686细胞中miR-941的表达量分别是HOK细胞中的5.51(P<0.01)倍和2.11倍(P<0.01),FD-LSC-1和Tu 686细胞上清外泌体中miR-941的表达量分别是HOK细胞外泌体中的2.20倍(P<0.05)和5.46倍(P<0.01)。(2)CCK8增殖实验中,过表达miR-941后,miR-941 mimics组细胞生长速度显着快于mimics NC组(P<0.01),表明FD-LSC-1和Tu 686细胞增殖能力增强;反之,转染miR-941抑制剂后细胞增殖能力随之降低。(3)Transwell侵袭实验中,过表达miR-941后,miR-941 mimics组穿膜细胞数显着多于mimics NC组(P<0.01),表明FD-LSC-1和Tu 686细胞侵袭能力增强;反之,转染miR-941抑制剂后细胞侵袭能力随之降低。结论:1、ExoQuick试剂法是一种高产量、高效率且省时的血清外泌体提取方法。2、喉鳞癌患者血清中外泌体分泌水平高于健康对照者。两组间血清外泌体miRNAs表达水平有显着差异,差异miRNAs的靶基因主要参与肿瘤相关信号通路。3、miR-30a-5p、miR-532-5p和U6是喉鳞癌患者和健康对照者血清外泌体的最佳内参基因组合。4、血清外泌体miR-941可作为喉鳞癌诊断的潜在肿瘤标志物,也是潜在的喉鳞癌治疗靶标。5、miR-941在喉鳞癌的恶性进展过程中起着促癌基因的作用。
孙国欣[5](2020)在《雌二醇通过MAPK信号通路对甲状腺乳头状癌细胞增殖迁移的影响》文中认为目的观察17β-雌二醇是否通过MAPK信号通路对甲状腺乳头状癌细胞TPC-1增殖迁移产生影响。方法规范培养人甲状腺乳头状癌细胞TPC-1,在细胞状态较好的时候更换无内源性雌激素的培养基,加入含有10-4M~10-9M不同浓度的17β-雌二醇培养基培养24h、48h、72h、96h,通过CCK-8实验检测各组细胞的光密度值(optical density,OD值)观察细胞的增殖情况,根据OD值确定雌激素的最佳有效浓度及处理时间;将用无内源性雌激素的培养基预处理过的人甲状腺乳头状癌细胞分为4组:空白对照组、雌激素组、抑制剂组、雌激素加抑制剂组。通过CCK-8实验检测各组细胞光密度值(optical density,OD值)观察细胞增殖情况;通过划痕实验检测各组细胞的迁移能力;通过蛋白质印迹法检测MAPK信号通路下游蛋白Erk1/2活性。结果1预处理后的人甲状腺乳头状癌细胞更换不同浓度17β-雌二醇的培养基,利用CCK-8实验检测各组细胞的OD值,确定10-7M的17β-雌二醇在处理96h时细胞增殖效果最佳,后续实验均选用此浓度处理;2 CCK-8实验结果显示,在处理96h时雌激素组OD值(1.015±0.026)明显高于空白对照组(0.9170±0.028)及雌激素加抑制剂组(0.942±0.057),差异有统计学意义(P<0.05),说明17β-雌二醇可以促进甲状腺乳头状癌细胞的增殖,且该作用能够被MAPK信号通路抑制剂所阻断。3划痕实验结果显示,24h时雌激素组细胞迁移率(0.871±0.015)明显大于空白对照组(0.640±0.041)及雌激素加抑制剂组(0.569±0.021),差异有统计学意义(P<0.05),说明17β-雌二醇可以促进甲状腺乳头状癌细胞的迁移,且该作用能够被MAPK信号通路抑制剂所阻断。4蛋白质印迹法结果显示,相较于空白对照组(0.490±0.026),在处理96h时雌激素组p-Erk1/2蛋白的表达(0.893±0.025)明显升高,且差异有统计学意义(P<0.05),说明17β-雌二醇可以激活MAPK信号通路下游的Erk1/2蛋白。结论雌激素通过激活MAPK信号通路增强人甲状腺乳头状癌细胞TPC-1的增殖迁移能力,使用MAPK抑制剂能抑制雌激素的作用。因此,靶向雌激素/MAPK可能为甲状腺乳头状癌治疗提供新的途径。图4幅;表3个;参124篇。
邓涵[6](2020)在《口腔鳞癌外泌体miR-141-3p促进NF向CAF转化的作用及其机制研究》文中提出【研究目的】1.探索口腔鳞癌外泌体在NF向CAF转化中是否具有促进作用;2.筛选口腔鳞癌外泌体中可能促进NF向CAF转化的miRNA;3.初步探讨miR-141-3p对NF向CAF转化的促进作用及其机制。【研究方法】1.提取口腔鳞癌细胞系CAL-27、HSC-3、SCC-4及人口腔粘膜正常上皮细胞系HGEC培养上清内外泌体,并采用透射电镜、粒径分析、WB进行鉴定;收集口腔鳞癌的肿瘤组织及癌旁正常组织,分别提取CAF及NF,采用免疫荧光染色、q PCR、WB进行鉴定;以CAF为对照,将梯度蛋白浓度肿瘤外泌体作用于对应NF,WB检测NF蛋白表达改变情况。2.将CAL-27、HSC-3、SCC-4及HGEC外泌体进行miRNA高通量测序,并结合数据库对结果进行分析,筛选得到可能促进NF向CAF转化的miR-141-3p及靶基因PTEN。3.以miR-141-3p的模拟物(mimics)、抑制剂(inhibitor)及空白对照(NC)转染NF,免疫荧光染色、q PCR、WB检测NF表型及形态改变。划痕实验、transwell细胞迁移实验验证miR-141-3p对NF细胞增殖活性、迁移性能等的影响;WB验证miR-141-3p通过抑制PTEN促进CAF的形成。【实验结果】1.通过差速超速离心分离得到了纯度较高的外泌体,透射电镜观察其形态,呈近似卵圆形,有明显的膜包被;粒径分析测得所提外泌体直径约为100nm;WB检测外泌体标志蛋白TSG101、CD9呈强阳性。2.提取成对原代CAF及NF,利用免疫荧光染色标记α-SMA,可观察到CAF中α-SMA的表达明显强于NF,且CAF细胞体积更大,形态多变,胞体突起更多。利用q-PCR及WB检测α-SMA、FAP-α等CAF标志物的表达情况,发现CAF中表达均高于NF。3.以CAF作为对照,将肿瘤外泌体按照0、5、10、20mg/ml的梯度蛋白浓度作用于NF,WB检测CAF标志蛋白的表达情况,发现随着肿瘤外泌体浓度增加,FAP-α的表达也明显增加。该结果表明:肿瘤外泌体具有促进NF向CAF转化的作用,且与浓度呈正相关。4.将HSC-3、CAL-27、SCC-4及HGEC外泌体进行了高通量测序,对结果进行生物信息学分析,筛选出可能参与促进NF向CAF转化的miR-141-3p及靶基因PTEN。5.将miR-141-3p的模拟物(mimics)、抑制物(inhibitor)及对应空白对照(negative control,NC)瞬时转染NF,培养后分别进行免疫荧光染色、q-PCR、WB、划痕实验、transwell迁移实验,发现mimics作用后,NF增殖性能明显提高,表型发生改变,FAP-α、α-SMA、PDGFR-β转录及蛋白水平均有明显提高。免疫荧光染色显示细胞形态更近似于CAF,胞体增大,突起增多;划痕实验及transwell迁移实验结果表明细胞活动性及迁移性增加。通过WB验证,证实NF中该基因在miR-141-3p作用下被抑制而参与了CAF活化。【结论】口腔鳞癌肿瘤细胞外泌体miR-141-3p进入NF后,通过靶向抑制PTEN,最终引起PDGFR-β的高表达,促进CAF的形成。
钱明禹[7](2020)在《低氧胶质瘤外泌体与PLEKHG5在胶质瘤恶性进展中的作用机制研究》文中认为研究背景胶质瘤(Glioma)是成年人中枢神经系统中最常见的原发性恶性肿瘤,其中,脑胶质瘤能够占到所有颅内原发性肿瘤的百分之七十左右,而半数以上的脑胶质瘤为恶性程度最高的胶质母细胞瘤(Glioblastoma Multiforme,GBM)。近年来,虽然针对胶质瘤的外科手术治疗、放疗与化疗、基因与免疫治疗等均有重大发展,但在临床实践中仍未能取得令人满意的效果,胶质瘤依然是治愈率低、复发率高、预后差的中枢神经系统肿瘤。胶质瘤发生发展过程中会逐步形成免疫抑制性肿瘤微环境,且胶质瘤具有浸润性生长的特点,这些是导致胶质瘤治疗效果不佳的主要原因。因此,对胶质瘤免疫抑制性微环境及胶质瘤恶性表型的深入研究,将有助于揭示胶质瘤恶性进展的机制,从而完善胶质瘤的综合治疗策略,提升胶质瘤的治疗效果。肿瘤微环境(Tumor Microenvironment,TME)是肿瘤发生发展过程中逐步形成的由物理组分、生化组分及细胞组分构成的复杂微环境,其在促进肿瘤恶性进展、抵抗化疗药物、免疫抑制等方面均有重要作用。由于实体肿瘤早期增殖迅速,氧气消耗过多,且肿瘤内部血管结构及功能异常,导致低氧成为实体肿瘤微环境标志性的特征之一。胶质瘤作为典型的实体肿瘤,其微环境中亦存在广泛的低氧区域。低氧不但能够调控胶质瘤的生物学行为,导致其代谢方式改变、增殖及侵袭能力增强,还可以促进胶质瘤免疫抑制性微环境的形成。因此,阐明低氧对胶质瘤恶性生物学行为及胶质瘤免疫抑制性微环境形成的作用及机制,有助于寻找新的靶点,抑制胶质瘤恶性进展,改善患者预后。作为肿瘤微环境的重要组分,外泌体(Exosome)在肿瘤发生发展中发挥关键作用。外泌体是一类直径在30~100纳米的囊泡状结构,可以由多种类型的细胞分泌,含有蛋白质、核酸等成分,能够参与细胞间的物质交换和信息传递。在肿瘤微环境中,外泌体可以直接作用于肿瘤细胞,促进其发生发展;也可以靶向浸润肿瘤微环境的免疫细胞,诱导免疫抑制性肿瘤微环境的形成。更重要的是,低氧能够改变外泌体的分泌特征,影响外泌体对靶细胞的调节作用。因此,探究低氧如何通过外泌体影响胶质瘤恶性表型及胶质瘤免疫抑制性微环境的形成,有利于明确胶质瘤恶性进展的调控机制,为丰富胶质瘤治疗策略提供新的依据。肿瘤微环境中浸润的免疫抑制性细胞是形成免疫抑制性肿瘤微环境的关键因素,这些免疫抑制性细胞包括肿瘤相关巨噬细胞(Tumor associated macrophage,TAM)、骨髓来源的抑制性细胞(Myeloid-derived suppressor cell,MDSC)、调节性T细胞(Regulatory T cell,Treg)以及调节性树突状细胞(Regulatorydendritic cell,regDC)等,其中,肿瘤相关巨噬细胞是胶质瘤微环境中最主要的免疫抑制性细胞。巨噬细胞存在两种极化类型,即具有免疫促进功能的M1型(经典活化型)和具有免疫抑制功能的M2型(选择活化型)。肿瘤相关巨噬细胞具有M2型巨噬细胞的特征,其通过参与免疫抑制性肿瘤微环境形成促进肿瘤的恶性进展。低氧能够通过诱导巨噬细胞M2型极化促进免疫抑制性肿瘤微环境形成,但肿瘤外泌体是否参与此过程尚不清楚。因此,阐明胶质瘤外泌体在低氧诱导的肿瘤相关巨噬细胞M2型极化中的作用机制,能够发现调控免疫抑制性肿瘤微环境的重要靶点,为抑制胶质瘤恶性进展、抗胶质瘤免疫治疗提供新的证据。除了免疫抑制性肿瘤微环境,胶质瘤的恶性表型也是导致其治疗效果不理想的重要原因,其中,侵袭和迁移是胶质瘤最主要的恶性生物学行为之一。胶质瘤在脑内呈弥漫浸润性生长,因此,手术难以完全切除,残余胶质瘤细胞可继续增殖、侵袭和迁移,导致胶质瘤难治愈、易复发。肿瘤的侵袭和迁移涉及细胞外基质(Extracellularmatrix,ECM)降解、细胞骨架变化、上皮-间充质转化(Epithelial-mesenchymal transition,EMT)等过程,有基质金属蛋白酶(Matrix metalloproteinase,MMP)家族成员、Rho家族蛋白等参与,并受到PI3K、MAPK等信号通路调控。低氧能够增强MMP的表达和分泌、影响细胞骨架变化、促进EMT发生,进而促进胶质瘤的侵袭和迁移,但是,胶质瘤外泌体是否参与上述过程尚不明确。因此,阐明低氧胶质瘤外泌体对胶质瘤侵袭和迁移的作用机制,有利于发现胶质瘤治疗的新靶点,为抑制胶质瘤的侵袭和迁移提供新的理论。此外,Rho家族蛋白RhoA、Racl以及Cdc42是影响胶质瘤侵袭和迁移的关键分子,而鸟苷酸交换因子(Guaninenucleotideexchangefactor,GEF)是Rho家族蛋白最重要的活性调控分子。PLEKHG5(Pleckstrin homology and RhoGEF domain containing G5)是GEF家族成员之一,能够调节Rho家族蛋白的活性,参与细胞迁移、细胞自噬、血管新生等过程。但是,PLEKHG5在胶质瘤中是否表达,其对胶质瘤的具体作用尚不清楚。因此,探究PLEKHG5在胶质瘤中的表达情况及其对胶质瘤的具体作用,可能为抑制胶质瘤恶性进展发现新的靶点,改善胶质瘤患者的预后。本文主要从胶质瘤免疫抑制性微环境及胶质瘤恶性表型两方面进行研究,分别阐明了低氧胶质瘤外泌体对巨噬细胞M2型极化的作用机制、低氧胶质瘤外泌体对胶质瘤侵袭迁移的作用机制和PLEKHG5在胶质瘤侵袭迁移中的作用。首先,我们揭示了胶质瘤外泌体在低氧诱导的巨噬细胞M2型极化中发挥重要作用;其次,我们发现了低氧胶质瘤外泌体在胶质瘤侵袭和迁移中的关键作用;最后,我们明确了 PLEKHG5在胶质瘤中的表达情况,并证明PLEKHG5对胶质瘤侵袭和迁移的调控作用。综上所述,本文对胶质瘤免疫抑制性微环境及胶质瘤恶性生物学行为进行了相关基础研究,为揭示胶质瘤恶性进展的机制提供了新的依据,为完善胶质瘤的综合治疗策略提供了新的靶点,有助于提升胶质瘤的临床治疗效果,有着重要的学术意义和广泛的应用前景。第一部分低氧胶质瘤外泌体对巨噬细胞M2型极化的作用机制研究1.目的(1)探究低氧胶质瘤外泌体对巨噬细胞M2型极化的作用。(2)基于外泌体microRNA测序分析,筛选出低氧胶质瘤外泌体中富集的可能与巨噬细胞M2型极化相关的microRNA(microRNA-1246)。(3)阐明microRNA-1246对巨噬细胞M2型极化的具体作用机制。(4)揭示microRNA-1246在胶质瘤患者脑脊液中的表达情况,明确microRNA-1246在胶质瘤中的临床相关性。2.方法(1)外泌体的分离与鉴定通过超速离心法和沉淀法提取胶质瘤外泌体。应用透射电镜、粒径分析、Western blot对提取的外泌体进行鉴定。(2)巨噬细胞M2型极化的检测对巨噬细胞M2型极化的检测包括以下几种方法:①PCR检测巨噬细胞M2型极化相关分子(CD163、IL10、IL1RA等)的表达。②流式细胞术检测巨噬细胞表面CD163的表达。③ELISA检测巨噬细胞IL-10、TNF-α的分泌。(3)胶质瘤细胞增殖能力的检测胶质瘤细胞与不同处理的巨噬细胞共培养后,EdU实验检测胶质瘤细胞的增殖能力。(4)胶质瘤侵袭和迁移能力的检测胶质瘤细胞与不同处理的巨噬细胞共培养后,Transwell实验检测胶质瘤细胞的侵袭和迁移能力。(5)胶质瘤外泌体的microRNA测序分别提取常氧、低氧胶质瘤的外泌体,并对外泌体中microRNA进行测序,获得常氧、低氧胶质瘤外泌体的microRNA表达谱数据。(6)胶质瘤患者脑脊液的microRNA测序收集胶质瘤患者脑脊液,并对脑脊液中microRNA进行测序,获得胶质瘤患者脑脊液的microRNA表达谱数据。(7)MicroRNA、mRNA和蛋白水平的检测对外泌体中microRNA和细胞内microRNA、mRNA、蛋白的表达检测,分别进行相应特定处理提取总RNA或总蛋白,PCR和Western blot检测microRNA、mRNA、蛋白的表达水平。(8)细胞转染及稳定表达microRNA-1246的单核细胞系的构建MicroRNA-1246 mimic、microRNA-1246 inhibitor、TERF2IP siRNAs、TERF2IP过表达质粒、TERF2IP 的 3’非翻译区(Untranslatedregion,UTR)含有 microRNA-1246野生型或突变型互补结合序列的双荧光素酶报告基因质粒,利用Lipo3000进行转染,用于过表达或者敲除相应目的分子,进而研究相应表型变化。稳定表达microRNA-1246的慢病毒转染U937细胞系以构建稳定表达microRNA-1246的单核细胞系。(9)巨噬细胞的mRNA测序将对照细胞与过表达microRNA-1246的巨噬细胞进行mRNA测序,获得对照、过表达microRNA-1246的巨噬细胞的mRNA表达谱数据。(10)裸鼠颅内原位人脑GBM细胞成瘤实验利用荧光素酶标记的U87MG胶质瘤细胞系建立裸鼠颅内原位成瘤模型。将荧光素酶标记的U87MG细胞与不同处理的巨噬细胞共同原位注射于裸鼠脑内,通过小动物活体成像系统监测颅内肿瘤状况,观察记录裸鼠症状体征,裸鼠死后取其脑组织进行后续研究和分析。3.结果(1)低氧胶质瘤外泌体诱导巨噬细胞M2型极化PCR、流式细胞术及ELISA结果显示,低氧胶质瘤外泌体能够诱导巨噬细胞M2型极化。并且,EdU、Transwell实验显示低氧胶质瘤外泌体处理的巨噬细胞增强胶质瘤的增殖、侵袭和迁移。裸鼠颅内原位成瘤实验显示,低氧胶质瘤外泌体处理的巨噬细胞会促进胶质瘤的增殖和侵袭,使裸鼠生存期缩短。(2)MicroRNA-1246在低氧胶质瘤外泌体及胶质瘤患者脑脊液中富集胶质瘤外泌体microRNA测序结果显示,microRNA-1246在低氧胶质瘤外泌体中表达上调且含量最高。PCR结果显示低氧上调胶质瘤外泌体中microRNA-1246的表达,并且胶质瘤外泌体中的microRNA-1246能够被传递给巨噬细胞。胶质瘤患者脑脊液microRNA测序结果显示,microRNA-1246的表达与胶质瘤患者的肿瘤级别和手术状态密切相关。(3)MicroRNA-1246诱导巨噬细胞M2型极化PCR、流式细胞术及ELISA结果显示,microRNA-1246能够诱导巨噬细胞M2型极化。并且,EdU、Transwell实验显示过表达microRNA-1246的巨噬细胞增强胶质瘤的增殖、侵袭和迁移。裸鼠颅内原位成瘤实验显示,过表达microRNA-1246 的巨噬细胞会促进胶质瘤的增殖和侵袭,使裸鼠生存期缩短。(4)TERF2IP是低氧胶质瘤外泌体中microRNA-1246诱导巨噬细胞M2型极化的直接靶基因巨噬细胞mRNA测序结果显示,TERF2IP的表达受microRNA-1246调控。PCR、Western blot结果显示低氧胶质瘤外泌体及microRNA-1246下调TERF2IP的表达。荧光素酶报告基因实验显示,microRNA-1246能够与TERF2IP的3’UTR的互补序列结合。PCR、流式细胞术及ELISA结果显示,敲除TERF2IP能够诱导巨噬细胞M2型极化。并且,EdU、Transwell实验显示敲除TERF2IP的巨噬细胞增强胶质瘤的增殖、侵袭和迁移。此外,过表达TERF2IP能够减弱microRNA-1246 对巨噬细胞 M2 型极化的诱导作用。(5)低氧胶质瘤外泌体来源的microRNA-1246通过调控STAT3及NF-κB信号通路诱导巨噬细胞的M2型极化Western blot结果显示低氧胶质瘤外泌体能够引起巨噬细胞内STAT3及NF-κB信号通路相关蛋白表达的变化。同样地,Western blot结果显示microRNA-1246及TERF2IP也能导致巨噬细胞内STAT3及NF-κB信号通路相关蛋白表达的改变。4.结论(1)低氧胶质瘤外泌体中的microRNA-1246通过靶向TERF2IP调控STAT3及NF-κB信号通路进而诱导巨噬细胞的M2型极化。(2)MicroRNA-1246在胶质瘤患者脑脊液中富集,在胶质瘤患者中存在临床相关性,可以作为胶质瘤诊断和治疗的靶点。第二部分低氧胶质瘤外泌体对常氧胶质瘤细胞侵袭和迁移的作用机制研究1.目的(1)探究低氧胶质瘤外泌体对常氧胶质瘤细胞侵袭和迁移的作用。(2)基于外泌体microRNA测序分析,筛选出低氧胶质瘤外泌体中富集的可能与胶质瘤侵袭和迁移相关的microRNA(microRNA-1246和microRNA-10b-5p)。(3)阐明microRNA-1246、microRNA-1 0b-5p对胶质瘤侵袭和迁移的具体作用机制。(4)明确microRNA-1246、microRNA-10b-5p在胶质瘤中的临床相关性。2.方法(1)外泌体的分离与鉴定通过超速离心法和沉淀法提取胶质瘤外泌体。应用透射电镜、粒径分析、Western blot对提取的外泌体进行鉴定。(2)胶质瘤侵袭和迁移能力的检测对胶质瘤侵袭和迁移能力的检测包括以下几种方法:①Transwell实验检测胶质瘤细胞的侵袭和迁移能力。②3D肿瘤球侵袭实验检测胶质瘤细胞的侵袭能力。(3)胶质瘤外泌体的microRNA测序分别提取常氧、低氧胶质瘤的外泌体,并对外泌体中microRNA进行测序,获得常氧、低氧胶质瘤外泌体的microRNA表达谱数据。(4)MicroRNA、mRNA和蛋白水平的检测对外泌体中microRNA和细胞内microRNA、mRNA、蛋白的表达检测,分别进行相应特定处理提取总RNA或总蛋白,PCR和Western blot检测microRNA、mRNA、蛋白的表达水平。(5)细胞转染及稳定表达microRNA-1246和microRNA-10b-5p的胶质瘤细胞系的构建MicroRNA-1246 mimic、microRNA-10b-5p mimic、FRK siRNAs、TFAP2A siRNAs、FRK过表达质粒、TFAP2A过表达质粒、FRK的3’非翻译区(Untranslated region,UTR)含有microRNA-1246野生型或突变型互补结合序列的双荧光素酶报告基因质粒,TFAP2A 的 3’非翻译区(Untranslatedregion,UTR)含有microRNA-10b-5p野生型或突变型互补结合序列的双荧光素酶报告基因质粒,利用Lipo3000进行转染,用于过表达或者敲除相应目的分子,进而研究相应表型变化。稳定表达microRNA-1246和microRNA-10b-5p的慢病毒分别转染胶质瘤细胞系以构建稳定表达microRNA-1246和microRNA-10b-5p的胶质瘤细胞系。(6)裸鼠颅内原位人脑GBM细胞成瘤实验利用荧光素酶标记的U87MG胶质瘤细胞系建立裸鼠颅内原位成瘤模型。将不同处理的荧光素酶标记的U87MG细胞原位注射于裸鼠脑内,通过小动物活体成像系统监测颅内肿瘤状况,观察记录裸鼠症状体征,裸鼠死后取其脑组织进行后续研究和分析。3.结果(1)低氧胶质瘤外泌体促进常氧胶质瘤细胞的侵袭和迁移Transwell及3D肿瘤球侵袭实验结果显示,低氧胶质瘤外泌体能够促进常氧胶质瘤细胞的侵袭和迁移。并且,Western blot结果显示低氧胶质瘤外泌体能够增强常氧胶质瘤细胞中MMP2、MMP9、N-cadherin、Vimentin等蛋白的表达。裸鼠颅内原位成瘤实验显示,低氧胶质瘤外泌体会促进胶质瘤的侵袭和迁移,使裸鼠生存期缩短。(2)MicroRNA-1246与microRNA-l0b-5p在低氧胶质瘤外泌体中富集且存在临床相关性PCR结果显示低氧上调胶质瘤外泌体中microRNA-1246和microRNA-10b-5p的表达,并且低氧胶质瘤外泌体中的microRNA-1246和microRNA-10b-5p能够被传递给常氧胶质瘤细胞。生物信息学分析结果显示microRNA-1246与microRNA-10b-5p与胶质瘤患者的肿瘤级别和预后相关。(3)MicroRNA-1246、microRNA-10b-5p促进胶质瘤细胞的侵袭和迁移Transwell及3D肿瘤球侵袭实验结果显示,microRNA-1246与microRNA-10b-5p能够促进胶质瘤细胞的侵袭和迁移。并且,Western blot结果显示microRNA-1246 与 microRNA-10b-5p 能够增强胶质瘤细胞中 MMP2、MMP9、N-cadherin、Vimentin等蛋白的表达。裸鼠颅内原位成瘤实验显示,microRNA-1246与microRNA-10b-5p会促进胶质瘤的侵袭和迁移,使裸鼠生存期缩短。(4)FRK 与 TFAP2A 分别是 microRNA-1246 和 microRNA-10b-5p 促进胶质瘤细胞侵袭和迁移的直接靶基因Western blot 结果显示 microRNA-1246 下调 FRK 的表达,microRNA-10b-5p下调TFAP2A的表达。荧光素酶报告基因实验显示,microRNA-1246能够与FRK的3’UTR的互补序列结合,microRNA-10b-5p能够与TFAP2A的3’UTR的互补序列结合。Transwell实验结果显示,敲除FRK和TFAP2A能够促进胶质瘤细胞的侵袭和迁移。并且,过表达FRK能够减弱microRNA-1246对胶质瘤细胞侵袭和迁移的作用,过表达TFAP2A能够减弱microRNA-10b-5p对胶质瘤细胞侵袭和迁移的作用。4.结论(1)低氧胶质瘤外泌体通过向常氧胶质瘤细胞传递microRNA-1246和microRNA-10b-5p,进而靶向FRK和TFAP2A,最终促进常氧胶质瘤细胞的侵袭和迁移。(2)MicroRNA-1246与microRNA-10b-5p在胶质瘤患者中存在临床相关性,可以作为抑制胶质瘤侵袭和迁移的治疗靶点。第三部分:PLEKHG5在胶质瘤中的作用研究1.目的(1)探究PLEKHG5在胶质瘤中的表达情况。(2)明确PLEKHG5在胶质瘤患者中的临床相关性。(3)揭示PLEKHG5对胶质瘤的作用。2.方法(1)临床组织标本免疫组化染色临床收集不同级别的61例胶质瘤组织以及6份正常脑组织,制作石蜡切片并利用免疫组织化学染色检测正常脑组织及不同级别胶质瘤组织中PLEKHG5的表达情况。(2)生物信息学分析利用TCGA数据库中的胶质瘤数据,针对PLEKHG5进行相应的GO、KEGG及GSEA分析,探究PLEKHG5参与的生物学过程及调控的信号通路。(3)细胞转染将PLEKHG5 siRNA利用Lipo3000转染胶质瘤细胞,用于敲除PLEKHG5,进而研究相应表型变化。(4)胶质瘤细胞迁移能力的检测Transwell实验检测不同处理的胶质瘤细胞的迁移能力。(5)蛋白水平的检测对细胞内蛋白的表达检测,进行特定处理提取细胞总蛋白,Western blot检测蛋白的表达水平。3.结果(1)PLEKHG5的表达与胶质瘤级别相关免疫组化染色结果显示,相比正常脑组织,胶质瘤组织中PLEKHG5的表达更高,且PLEKHG5表达与胶质瘤级别相关。对免疫组化染色结果进一步分析发现,在胶质瘤组织中,PLEKHG5的阳性比例和表达强度均与胶质瘤级别相关。(2)PLEKHG5的表达与胶质瘤患者预后相关对纳入研究的胶质瘤患者进行随访和生存分析,结果显示PLEKHG5的表达与胶质瘤患者预后相关,PLEKHG5高表达的胶质瘤患者预后较差。(3)生物信息学分析揭示PLEKHG5在胶质瘤中的作用针对PLEKHG5进行相应GO、KEGG、GSEA分析,结果显示PLEKHG5参与胶质瘤的细胞外基质降解、细胞骨架调控、上皮-间充质转化等过程,并调控VEGF、PI3K以及HIF-1等信号通路。(4)PLEKHG5影响胶质瘤细胞的侵袭和迁移Transwell实验显示,敲除PLEKHG5能够抑制胶质瘤细胞的迁移。Western blot结果显示,敲除PLEKHG5能够下调MMP2、MMP9、mDia等胶质瘤侵袭迁移相关蛋白的表达。4.结论(1)PLEKHG5的表达与胶质瘤级别和胶质瘤患者预后相关,PLEKHG5可以作为协助胶质瘤诊断和评估胶质瘤患者预后的重要指标。(2)PLEKHG5能够促进胶质瘤细胞的侵袭和迁移,可以作为抗胶质瘤侵袭和迁移治疗的新靶点。
秦芳[8](2019)在《胞外囊泡miR-122-5p功能及选择性运输机制研究》文中研究说明胞外囊泡(extracellular vesicles,EVs)是细胞分泌到胞外的具有膜结构的囊泡,其携带的多种具有生物活性的分子能传递给邻近和远端的细胞,从而激发受体细胞的多种信号级联反应,因而在细胞通讯中发挥重要的作用。越来越多的研究表明,胞外囊泡微小RNA(microRNAs,miRNAs)在癌症中发挥着重要的作用,它们能被受体细胞摄取,从而对癌细胞的增殖、迁移、血管生成、代谢以及免疫等病理过程产生影响。目前,胞外囊泡miRNAs在肿瘤转移中的作用受到了广泛的关注。通过高通量测序手段,本课题组前期研究发现,非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)患者血浆来源的胞外囊泡microRNAs与正常样本在组成和表达量上具有显着差异。在此基础上,我们在细胞系水平对测序结果进行了验证。实验结果显示miR-451a和miR-122-5p选择性进入胞外囊泡,可作为NSCLC早期诊断的标志物。本工作中,我们对人肺癌细胞A549和人胚肺成纤维细胞IMR-90来源的胞外囊泡的功能进行了比较,发现A549胞外囊泡能够促进正常肝细胞L02的迁移。通过进一步实验证明A549胞外囊泡来源的、肝细胞特异性的miR-122-5p在其中发挥关键作用。于是我们的研究围绕着胞外囊泡miR-122-5p在肺癌发生发展中的功能及其选择性进入胞外囊泡的机制展开。通过检测与上皮间质转化(Epithelial–mesenchymal transition,EMT)相关的蛋白,我们发现胞外囊泡miR-122-5p可能通过促进EMT过程来促进L02的迁移,从而为肺癌向肝脏转移创造有利条件。通过下调与胞外囊泡miRNAs选择性运输相关蛋白的表达量,我们发现了hnRNPA2B1能促进miR-122-5p进入胞外囊泡。而这一促进作用可能是由于miR-122-5p上存在的EXOmotif和hnRNPA2B1识别基序发挥重要作用。综上所述,hnRNPA2B1蛋白在介导miR-122-5p选择性进入胞外囊泡中发挥重要作用,而在NSCLC胞外囊泡中异常高表达的miR-122-5p通过促进转移位点的正常细胞,如L02的迁移从而在肿瘤转移中扮演着重要的角色。本论文以NSCLC胞外囊泡来源的miR-122-5p为研究对象,对其在胞内的作用、借助胞外囊泡选择性运输到细胞外的机制以及在受体细胞中发挥的功能进行了较为详细的研究,为阐明胞外囊泡miRNAs的生物学功能提供了相关的实验证据,为NSCLC的早期诊断提供了新的靶标。
张静[9](2020)在《人巨细胞病毒感染细胞外泌体的microRNA深度测序及其在HCMV活动性感染患儿外周血检测结果与临床指标相关性的分析》文中提出目的:人巨细胞病毒(human cytomegalovirus,HCMV)是人类疱疹病毒组中最大的双链DNA病毒,感染较广泛,但是通常在健康群体中不发病,呈亚临床状态。然而,对于免疫低下或缺陷的群体,比如孕妇、儿童、移植受体或艾滋病患者,它会导致机体出现严重的并发症,甚至死亡。HCMV至今仍被认为是导致新生儿先天及围产期感染最重要的病毒之一,儿童尤其是6个月以下的婴儿和早产儿,由于其免疫力较低,极易罹患HCMV的感染,主要表现为不同程度的多器官组织的损伤尤其是对肝功能的损伤,此外神经系统、呼吸、血液及泌尿等系统都会出现不同程度的感染和损伤。HCMV感染机体后所诱导的免疫逃逸机制及致病机制十分复杂。而具有重要的基因调节作用的microRNA(miRNA)在HCMV感染过程中发挥了重要作用,在基因表达的转录后水平发挥作用,通过完全或不完全结合介导靶分子mRNA的降解或抑制其翻译,进一步调控基因的表达。细胞或病毒编码的miRNAs可以选择性地包装入外泌体等囊泡,广泛存在于人的多种体液,包括尿液、唾液、血液、乳汁、羊水、脑脊液等,并且不被相关核酸酶所降解,从而在机体局部或全身循环发挥细胞间信息交流等重要的生理功能。作为介导细胞间物质和信息交流的载体,外泌体属于胞外囊泡(extracellular vesicles,EVs)的一种,根据结构直径的大小,胞外囊泡可以分为3种亚型:凋亡小体(apoptotic bodies)、微泡(microvesicles)和外泌体(exosome)。越来越多的证据表明,胞外囊泡特别是外泌体对细胞间通讯传递信息起着重要的作用,从而影响到各种生理和病理过程。多种类型的细胞均可分泌外泌体。外泌体中不仅含有蛋白质、脂质,而且含有大量的mRNA、miRNA和其它非编码RNA,释放到细胞外环境中的外泌体可吸附于细胞的包膜上,通过融合或者是内吞作用进入胞内,释放包裹的物质,触发这些受体细胞不同的特定反应。根据miRBase数据库最新数据显示在HCMV中已发现15种miRNA前体,编码26种成熟的miRNA,其编码区分散存在于HCMV的基因组中。HCMV编码的miRNA不仅调节自身基因的表达,还可以在感染过程中调节宿主基因的表达,从而创造出适合于病毒感染和复制的微环境。鉴于外泌体在病毒感染过程可能发挥重要的生物学功能,我们有必要了解在HCMV感染复制的过程中,感染细胞分泌的外泌体所含的病毒miRNA种类及分布情况。在本研究中,首先通过高通量测序对HELF以及HCMV感染HELF后其上清外泌体的miRNA的表达谱进行分析,筛选出差异表达的HCMV miRNA,通过TaqMan方法对HCMV miRNA进行检测验证,最后分析其在HCMV患者外周血中的含量及在临床中的意义。方法:1、从HCMV Han BAC感染细胞培养上清物和感染患者的外周血清中分离出外泌体:利用exoEasy Maxi Kit(QIAGEN)用于分离、纯化HCMV感染HELF细胞和患儿外周血清中的外泌体,采用透射电镜和通过western blot检测外泌体蛋白标志物TSG101的方法进行外泌体鉴定。鉴定经试剂盒分离纯化的外泌体是否混有HCMV病毒颗粒,将感染HCMV Han BAC的外泌体与HELF细胞孵育后,荧光显微镜观察是否有GFP的表达。2、外泌体miRNA的提取:利用miRNeasy Mini Kit(QIAGEN)提取细胞内的总RNA,利用exoRNeasy Maxi Kit(QIAGEN)提取外泌体的总RNA,Nanodrop 1000分光光度计测量RNA的浓度及纯度。3、文库的构建及测序:取HELF细胞及Han BAC感染HELF后分泌的外泌体总RNA各2ug用于构建小RNA文库。方法如下:对纯化后的总RNA进行3’端接头及5’端接头的连接,反转录及扩增,cDNA文库的纯化及质检,完成测序样本文库构建。使用Qubit?2.0 Fluorometer检测浓度,Agilent 2100生物分析仪检测文库的大小。测序采用lllumina公司的Hiseq 2500。根据以下原则对两组间有显着差异表达的miRNA进行筛选:1)绝对reads数大于10;2)miRNA表达的差异倍数即log2HAN1/HELF大于2或者小于0.5;3)P值小于0.05。4、TaqMan茎环探针法:检测hcmv-miR-US25-1-5p(MIMAT0001581,ABI)和hcmv-miR-UL112-3p(MIMAT0001577,ABI)的相对定量,计算三个复孔的平均值作为每个样本的实际CT值,以U6为内参基因,采用相对定量方法(2-△△CT)对结果进行比较、分析。5、HCMV感染患者血清标本收集:HCMV患者均为中国医科大学附属盛京医院住院患者,诊断标准符合2012年中华医学会儿科学分会感染学组修订的诊断标准,选择年龄小于6个月以下,通过常规化学发光法检测血清抗HCMV-IgM阳性,实时荧光定量聚合酶链反应(QRT-PCR)法检测尿液中HCMV的DNA拷贝量≥103/ml。所有患儿的血清标本系本院常规临床生化检查后的废弃标本,取血清1-4ml。有关研究已获得盛京医院伦理委员会批准,同意免除知情同意书签署的申请。6、使用SPSS 22.0和GraphPad Prism 5等统计学软件对所得结果进行数据统计,当P<0.05时,认为差异有统计学意义。结果:1、从HCMV Han BAC感染的HELF细胞中提取到的外泌体,通过透射电镜的结果显示,符合文献所报道的特征;并且用Western blot检测到外泌体蛋白标记物TSG101。感染HCMV Han BAC的外泌体与HELF细胞孵育后,在绿色荧光激发条件下始终未见GFP荧光信号,说明实验中分离纯化的HCMV感染细胞外泌体样本中没有HCMV病毒颗粒的污染。2、通过IIIumina公司的Hiseq 2500测序技术对HELF细胞及其Han BAC感染后的HELF细胞分泌的外泌体中小RNA文库进行测序,各获得干净序列的总read数分别为33074443和27976426;与HELF细胞外泌体比较,Han BAC感染细胞外泌体中共有58种宿主miRNA含量显着性升高,其中有32种是Han BAC感染细胞外泌体特异性miRNA,hsa-miR-182-5p含量增高倍数最高,上调857.42倍,其次是hsa-miR-4634和hsa-miR-3651,分别为367.46和102.77倍;在Han BAC感染细胞外泌体中含量显着性下降的宿主miRNA共有70种,其中有22种miRNA是在非感染HELF外泌体中特异性检测到的,下降倍数最高的分别是hsa-miR-561-5p(180倍),hsa-miR-598-3p(128倍)和hsa-miR-589-5p(128倍)。此外,在感染细胞外泌体中发现了16种HCMV编码的成熟miRNA,其中含量最高的是miR-US25-1-5p和miR-UL112-3p。3、收集HCMV HAN BAC株感染HELF后的0、6、24、48、72及96小时外泌体及细胞的总RNA,通过TaqMan PCR技术检测HCMV miR-US25-1-5p和miR-UL112-3p的相对含量,结果显示均在感染后的6小时即可在外泌体及细胞中检测到两种HCMV miRNA,且随着复制周期时间的延长,含量逐渐增加;对这两者在细胞和外泌体的含量做相关性统计学分析,发现HCMV的miRNA在感染后的不同时间中外泌体的含量与在相应细胞内的含量成正相关;但是通过western blot检测外泌体蛋白标志物TSG101,发现在相应时间点的外泌体的浓度和数量并没有随着HCMV复制周期的延长而增加。4、提取感染HCMV 72小时后的外泌体和正常HELF细胞共培养,通过TaqMan发现2小时后即可在细胞内检测到HCMV miR-US25-1-5p和miR-UL112-3p,并且随着共培养时间的延长,两种miRNA在细胞中的含量逐渐增高。5、72例HCMV(+)患儿外周血清,22例HCMV(-)的健康患儿血清为对照组同时进行扩增。在72例HCMV(+)患儿外周血清提取的外泌体中有64例检测出miR-US25-1-5p阳性,8例阴性;60例miR-UL112-3p的阳性,12例阴性(P<0.05);其中两者均为阴性的共5例。统计分析发现hcmv-miR-US25-1-5p和hcmv-miR-UL112-3p不仅与尿中HCMV病毒颗粒的拷贝量成正相关,并且hcmv-miR-US25-1-5p相对含量和胆汁淤积生化指标成正相关(P<0.05)。结论:1、HCMV感染改变了HELF细胞分泌的外泌体中宿主miRNA的种类和含量。2、HCMV感染HELF细胞的外泌体中含有16种HCMV编码的成熟miRNA,其中含量最高的是hcmv-miR-US25-1-5p和hcmv-miR-UL112-3p。3、HCMV miRNA在感染细胞外泌体中含量的升高是与感染细胞中病毒miRNA转录量的升高密切相关的,似乎外泌体对病毒核酸的包装不具有显着富集作用。4、HCMV感染可使病毒miRNA包装入细胞外泌体中且经外泌体在细胞间转运。5、hcmv-miR-US25-1-5p和hcmv-miR-UL112-3p在感染患者外周血清的外泌体中高比例存在,并且含量与病毒复制水平显着正相关。6、hcmv-miR-US25-1-5p和胆汁淤积生化指标γ-谷氨酰基转肽酶、结合胆红素及胆汁酸水平显着正相关。
宁丽峰[10](2016)在《MAPK通路基因多态性与甲状腺乳头状癌关系的遗传流行病学研究》文中研究说明甲状腺癌是临床上常见的内分泌系统恶性肿瘤,以甲状腺乳头状癌居多。甲状腺癌多于青壮年发病,40-60为发病高峰年龄,男女患者数量存在1:3的比例。研究表明,甲状腺癌的发病率呈逐年上升趋势。目前,尚不完全明确甲状腺癌的发病机制。随着分子生物技术的发展,已证明某些基因的多态性有可能与甲状腺癌相关。MAPK信号转导通路,含有苏氨酸/丝氨酸蛋白激酶,能将细胞外信号向内转导至细胞核内。随后通过保守的MAPKKK-MAPKK-MAPK三级级联反应激活转录因子,进而调节基因的表达。MAPK通路影响多种细胞功能,可参与细胞的多种生理过程,如运动、凋亡、分化及生长增殖等。其中,KRAS基因、NRAS基因、HRAS基因、ALK基因、MET基因和VEGFA基因在MAPK通路中起重要作用。目的:探讨MAPK信号转导通路中的KRAS基因、NRAS基因、HRAS基因、ALK基因、MET基因和VEGFA基因的多态性与甲状腺乳头状癌之间的关系,为甲状腺癌的病因研究提供科学依据。方法:采用病例-对照的研究方法,病例组选取860例甲状腺乳头状癌患者(甲状腺乳头状癌组)和420例结节性甲状腺肿患者(结节性甲状腺肿组),健康对照组选取896例无甲状腺相关疾病的健康人。上述各组研究对象的年龄、性别均已匹配。分别采集各组研究对象的外周血液样本,提取基因组的DNA。应用MALDI-TOF-MS技术检测候选位点的基因型。数据整理录入使用Epidata3.1,统计学分析使用SPSS19.0、SNPStats、Haploview4.2和UNPHASE等软件。结果:1本研究选取MAPK通路上KRAS、HRAS、NRAS、ALK、MET和VEGFA基因为候选基因,使用Hap Map和NCBI-db SNP数据库,利用Haploview 4.2软件,筛选上述每个候选基因上的tag SNPs。共筛选出13个tag SNPs,分别为KRAS基因的rs712、rs7315339、rs12427141,HRAS基因的rs12628,NRAS基因的rs2273267、rs14804,ALK基因的rs1881421,MET基因的rs1621、rs6566和VEGFA基因的rs3024997、rs3025040、rs25648、rs10434位点。2在甲状腺乳头状癌组、结节性甲状腺肿组和健康对照组中分别做各位点的Hardy-Weinberg平衡。除了rs7315339在甲状腺乳头状癌组,rs712、rs12427141、rs1881421在健康对照组,rs3024997在结节性甲状腺肿组和健康对照组中不符合H-W平衡定律(P<0.01)外,其它各位点在各组中均符合H-W平衡定律。3与甲状腺乳头状癌相关的基因型(P<0.05)包括:MET基因rs1621的GA基因型(ORGA/AA=1.346,95%CI=1.064-1.703),rs6566的GG基因型(ORGG/AA=1.391,95%CI=1.063-1.822);KRAS基因rs712的GT基因型(ORGT/GG=1.334,95%CI=1.084-1.641),rs12427141的AA基因型(ORAA/GG=3.685,95%CI=1.352-10.047)。按性别分层分析结果表明,与女性甲状腺乳头状癌患者相关(P<0.05)的基因型包括:KRAS基因rs712的GT基因型(ORGT/GG=1.436,95%CI=1.132-1.821),rs12427141的AA基因型(ORAA/GG=3.280,95%CI=1.183-9.095),ALK基因rs1881421的GC基因型(ORGC/GG=0.727,95%CI=0.580-0.911),VEGFA基因rs3025040的CC基因型(ORCC/TT=2.019,95%CI=1.068-3.819),rs25648的CT基因型(ORCT/CC=1.540,95%CI=1.082-2.190)。与结节性甲状腺肿相关的基因型(P<0.05)包括:VEGFA基因rs3024997的AG基因型(ORAG/GG=0.628,95%CI=0.478-0.825)。按性别分层分析结果表明,与女性结节性甲状腺肿患者显着相关(P<0.05)的基因型包括:VEGFA基因rs3024997的AG基因型(ORAG/GG=0.618,95%CI=0.449-0.851)。4与甲状腺乳头状癌相关的等位基因(P<0.05)包括:KRAS基因rs12427141位点G→A突变危险性增加(ORA/G=1.222,95%CI=1.004-1.487),MET基因rs6566位点A→G突变危险性增加(ORG/A=1.177,95%CI=1.031-1.344)。按性别分层分析结果表明,与女性甲状腺乳头状癌患者显着相关(P<0.05)的等位基因包括:KRAS基因rs712位点G→T突变危险性增加(ORT/G=1.254,95%CI=1.040-1.513),rs12427141位点G→A突变危险性增加(ORA/G=1.272,95%CI=1.017-1.590),HRAS基因rs12628位点C→T突变危险性增加(ORT/C=1.269,95%CI=1.042-1.545),MET基因rs1621位点A→G突变、rs6566位点A→G突变危险性增加(rs1621:ORG/A=1.272,95%CI=1.000-1.618。rs6566:ORG/A=1.192,95%CI=1.023-1.388),VEGFA基因rs3025040位点T→C突变、rs25648位点C→T突变危险性增加(rs3025040:ORC/T=1.290,95%CI=1.058-1.574。rs25648:ORT/C=1.550,95%CI=1.116-2.152)。与结节性甲状腺肿相关的等位基因(P<0.05)包括:HRAS基因rs12628位点C→T突变危险性增加(ORT/C=1.275,95%CI=1.064-1.640),NRAS基因rs14804位点的T→C突变危险性降低(ORC/T=0.655,95%CI=0.401-0.975),VEGFA基因rs3025040位点的T→C突变危险性增加(ORC/T=1.247,95%CI=1.026-1.583)。按性别分层分析结果表明,与女性结节性甲状腺肿患者显着相关(P<0.05)的等位基因包括:VEGFA基因rs3025040位点的T→C突变危险性增加(ORC/T=1.333,95%CI=1.035-1.716)。5在甲状腺乳头状癌组与健康对照组频数分布差异存在统计学意义(P<0.05)的单倍型包括:KRAS基因的rs712-rs12427141、MET基因的rs1621-rs6566、KRAS基因的rs712-rs12427141-rs7315339。结论:1 MAPK通路中MET基因和KRAS基因多态性可能与甲状腺乳头状癌相关。其中MET基因rs1621位点GA基因型、rs6566位点GG基因型和A→G突变,KRAS基因rs712位点GT基因型、rs12427141位点AA基因型和G→A突变可能是甲状腺乳头状癌的危险因素。2 MAPK通路中HRAS基因、NRAS基因和VEGFA基因多态性可能与结节性甲状腺肿相关。其中HRAS基因rs12628位点C→T突变、VEGFA基因rs3025040位点T→C突变可能是结节性甲状腺肿的危险因素。VEGFA基因rs3024997位点AG基因型、NRAS基因rs14804位点T→C突变可能是结节性甲状腺肿的保护因素。3 KRAS基因、HRAS基因、MET基因、ALK基因、VEGFA基因与女性罹患甲状腺乳头状癌相关。其中KRAS基因rs712位点GT基因型和G→T突变、rs12427141位点AA基因型和G→A突变,VEGFA基因rs3025040位点CC基因型和T→C突变、rs25648位点CT基因型和C→T突变,HRAS基因rs12628位点C→T突变,MET基因rs1621位点A→G突变、rs6566位点A→G突变可能增加女性罹患甲状腺乳头状癌的危险性。ALK基因rs1881421位点GC基因型可能降低女性罹患甲状腺乳头状癌的危险性。4 VEGFA基因与女性罹患结节性甲状腺肿相关。VEGFA基因rs3025040位点T→C突变可能增加女性罹患结节性甲状腺肿的危险性。VEGFA基因rs3024997位点AG基因型可能降低女性罹患结节性甲状腺肿的危险性。5 KRAS基因的rs712-rs12427141、rs712-rs12427141-rs7315339,MET基因的rs1621-rs6566,上述单倍型与甲状腺乳头状癌有关联。6除了VEGFA基因rs3025040位点是女性甲状腺乳头状癌和女性结节性甲状腺肿的共同易感基因位点外,在MAPK通路未发现甲状腺乳头状癌和结节性甲状腺肿共同的易感基因。7 MAPK通路基因多态性与甲状腺乳头状癌相关。
二、鼻咽癌中TSG101基因的突变研究(论文开题报告)
(1)论文研究背景及目的
此处内容要求:
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景,再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题,并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例:
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
(2)本文研究方法
调查法:该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法:用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法:通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法:通过调查文献来获得资料,从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法:依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法:对研究对象进行“质”的方面的研究,这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法:通过具体的数字,使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法:运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法:这是社会科学用来分析社会现象的一种方法,从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法:通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、鼻咽癌中TSG101基因的突变研究(论文提纲范文)
(1)长链非编码RNA FOXP4-AS1在尤文肉瘤及其肿瘤微环境中的功能机制研究(论文提纲范文)
摘要 |
ABSTRACT |
第1章 前言 |
第2章 长链非编码RNA FOXP4-AS1的筛选和临床意义研究 |
2.1 背景与目的 |
2.2 实验材料与方法 |
2.2.1 实验材料 |
2.2.2 实验方法 |
2.3 实验结果 |
2.3.1 Lasso-Cox回归筛选尤文肉瘤预后相关lncRNA |
2.3.2 Kaplan-Meier生存分析筛选差异表达的预后lncRNA |
2.3.3 FOXP4-AS1表达量检测 |
2.4 结论 |
2.5 讨论 |
第3章 FOXP4-AS1对尤文肉瘤细胞系增殖、迁移、侵袭功能的影响 |
3.1 背景与目的 |
3.2 实验材料与方法 |
3.2.1 实验材料 |
3.2.2 实验方法 |
3.3 实验结果 |
3.3.1 敲低FOXP4-AS1对尤文肉瘤细胞增殖功能的影响 |
3.3.2 敲低FOXP4-AS1对尤文肉瘤细胞迁移、侵袭能力的影响 |
3.3.3 过表达FOXP4-AS1对尤文肉瘤细胞增殖功能的影响 |
3.3.4 过表达FOXP4-AS1对尤文肉瘤细胞迁移、侵袭能力的影响 |
3.3.5 FOXP4-AS1对尤文肉瘤细胞裸鼠皮下成瘤的影响 |
3.4 结论 |
3.5 讨论 |
第4章 生物信息学分析FOXP4-AS1在尤文肉瘤中的潜在作用机制 |
4.1 背景与目的 |
4.2 实验材料与方法 |
4.2.1 实验材料 |
4.2.2 实验方法 |
4.3 分析结果 |
4.3.1 FOXP4-AS1相关性基因筛选 |
4.3.2 FOXP4-AS1相关性基因生物学功能、通路富集分析以及蛋白互作网络分析 |
4.3.3 GSVA、GSEA分析FOXP4-AS1相关的信号通路 |
4.3.4 FOXP4-AS1亚细胞定位 |
4.3.5 FOXP4-AS1相关ceRNA网络构建 |
4.3.6 FOXP4-AS1相关信号通路的ceRNA分子作用机制筛选 |
4.4 结果 |
4.5 讨论 |
第5章 FOXP4-AS1通过miR-298/TMPO途径调控尤文肉瘤增殖、迁移、侵袭能力的研究 |
5.1 背景与目的 |
5.2 实验材料与方法 |
5.2.1 实验材料 |
5.2.2 实验方法 |
5.3 实验结果 |
5.3.1 FOXP4-AS1通过吸附miR-298,负向调控miR-298表达 |
5.3.2 miR-298可逆转FOXP4-AS1对尤文肉瘤增殖、迁移、侵袭能力的影响 |
5.3.3 miR-298靶向结合TMPO,负向调控TMPO表达 |
5.3.4 TMPO可逆转miR-298对尤文肉瘤增殖、迁移、侵袭能力的影响 |
5.4 结论 |
5.5 讨论 |
第6章 FOXP4-AS1在尤文肉瘤肿瘤微环境中的功能研究 |
6.1 背景与目的 |
6.2 实验材料与方法 |
6.2.1 实验材料 |
6.2.2 实验方法 |
6.3 实验结果 |
6.3.1 肿瘤微环境中FOXP4-AS1与免疫细胞浸润的关系研究 |
6.3.2 FOXP4-AS1在肿瘤相关巨噬细胞中的表达水平检测 |
6.3.3 FOXP4-AS1促进M2型巨噬细胞极化 |
6.3.4 尤文肉瘤细胞可通过细胞外囊泡递送FOXP4-AS1 |
6.3.5 尤文肉瘤细胞外囊泡来源FOXP4-AS1可促进M2型巨噬细胞极化 |
6.4 结论 |
6.5 讨论 |
第7章 全文总结 |
7.1 FOXP4-AS1在尤文肉瘤中的功能机制研究 |
7.2 FOXP4-AS1在尤文肉瘤肿瘤微环境中的功能研究 |
7.3 本课题研究成果小结如下 |
7.4 本课题研究的后续工作 |
致谢 |
参考文献 |
攻读学位期间的研究成果 |
综述 LncRNA在肿瘤及其微环境中的功能机制研究进展 |
参考文献 |
(2)TGF-B1诱导后外泌体MIR-663B促进宫颈癌转移和上皮-间质转化的机制研究(论文提纲范文)
中文摘要 |
英文摘要 |
缩略词表 |
前言 |
第一部分: TGF-β1诱导后宫颈癌细胞系外泌体miRNA表达谱鉴定 |
引言 |
1.1 实验材料 |
1.2 实验方法 |
1.3. 实验结果 |
1.4 讨论 |
1.5 结论 |
第二部分 miR-663b及其靶基因MGAT3对宫颈癌转移和上皮-间质转化的作用机制研究 |
引言 |
2.1 实验材料 |
2.2 实验方法 |
2.3 结果 |
2.4 讨论 |
2.5 结论 |
参考文献 |
致谢 |
攻读学位期间发表的论文 |
学位论文评阅及答辩情况表 |
外文论文 |
(3)PTEN缺失通过损害溶酶体功能增加外泌体分泌进而促进胆管癌转移(论文提纲范文)
摘要 |
abstract |
缩略词表 |
前言 |
材料和方法 |
一、材料 |
二、实验方法 |
实验结果 |
一、PTEN缺失促进胆管癌的复发转移 |
二、PTEN差异表达影响胆管癌细胞的外泌体释放 |
三、PTEN缺失增加胆管癌细胞内MVB的数量 |
四、溶酶体功能的抑制可以促进胆管癌细胞的外泌体分泌 |
五、PTEN差异表达可以调节胆管癌细胞的溶酶体功能 |
六、PTEN调控溶酶体功能的机制研究 |
讨论 |
参考文献 |
综述 外泌体在肿瘤进展和诊疗中的作用 |
一、外泌体的发现和内容物组成 |
二、外泌体的生物发生和释放过程 |
三、外泌体在肿瘤发生进展中的作用 |
四、外泌体促进肿瘤化疗抵抗 |
五、外泌体在肿瘤治疗中的应用 |
参考文献 |
在读期间发表论文和参加科研工作情况说明 |
致谢 |
(4)喉鳞癌血清外泌体差异miRNAs筛选及miR-941功能研究(论文提纲范文)
中文摘要 |
Abstract |
常用缩写词中英文对照表 |
前言 |
第一部分 血清外泌体提取方法比较研究 |
1 材料与方法 |
1.1 实验材料 |
1.2 实验方法 |
2 结果 |
2.1 四种方法分离血清外泌体的形态观察 |
2.2 四种方法分离血清外泌体的粒径和浓度比较 |
2.3 四种方法分离血清外泌体的标志蛋白检测 |
2.4 四种方法分离血清外泌体miRNA表达谱比较 |
3 讨论 |
4 结论 |
第二部分 喉鳞癌患者血清外泌体miRNA标志物筛选 |
第一节 高通量测序筛选喉鳞癌患者血清外泌体差异miRNAs |
1 材料和方法 |
1.1 实验材料 |
1.2 实验方法 |
2 结果 |
2.1 喉鳞癌患者和健康对照者血清外泌体表征分析 |
2.2 喉鳞癌患者和健康对照者血清外泌体RNA质检分析 |
2.3 高通量测序数据分析 |
2.4 生物信息学分析 |
3 讨论 |
4 结论 |
第二节 喉鳞癌患者和健康对照者血清外泌体内参基因筛选 |
1 材料和方法 |
1.1 实验材料 |
1.2 实验方法 |
2 结果 |
2.1 候选内参基因筛选 |
2.2 候选内参基因qRT-PCR验证情况 |
2.3 内参基因稳定性筛选 |
3 讨论 |
4 结论 |
第三节 喉鳞癌患者和健康对照者血清外泌体差异miRNAs qRT-PCR验证及ROC分析 |
1 材料和方法 |
1.1 实验材料 |
1.2 实验方法 |
2 结果 |
2.1 miR-941和miR-27a-5p在喉鳞癌患者血清外泌体中显着上调表达 |
2.2 ROC曲线分析miR-941和miR-27a-5p诊断效能 |
2.3 血清外泌体miR-941表达水平与喉鳞癌患者病理参数相关性分析 |
2.4 miR-941在其他数据集中表达情况 |
3 讨论 |
4 结论 |
第三部分 miR-941在喉鳞癌细胞中的功能研究 |
1 材料和方法 |
1.1 实验材料 |
1.2 实验方法 |
2 结果 |
2.1 miR-941在喉鳞癌细胞及外泌体中表达上调 |
2.2 细胞转染效率分析 |
2.3 过表达或抑制miR-941对喉鳞癌细胞增殖能力的影响 |
2.4 过表达或抑制miR-941对喉鳞癌细胞侵袭能力的影响 |
3 讨论 |
4 结论 |
参考文献 |
综述 |
参考文献 |
致谢 |
个人简介 |
(5)雌二醇通过MAPK信号通路对甲状腺乳头状癌细胞增殖迁移的影响(论文提纲范文)
摘要 |
abstract |
英文缩略表 |
引言 |
第1章 实验研究 |
1.1 材料与方法 |
1.1.1 相关材料 |
1.1.2 实验方法 |
1.1.3 统计学处理 |
1.2 实验结果 |
1.2.1 雌激素最佳作用浓度 |
1.2.2 雌激素对细胞增殖的作用 |
1.2.3 划痕实验检测细胞迁移能力 |
1.2.4 雌激素对MAPK信号通路下游蛋白Erk1/2 活性的作用 |
1.3 讨论 |
1.3.1 雌激素对细胞增殖的影响 |
1.3.2 雌激素对甲状腺癌乳头状癌细胞迁移的影响 |
1.3.3 雌激素对MAPK信号通路的影响 |
1.4 小结 |
参考文献 |
结论 |
第2章 综述 雌激素通过MAPK信号通路与甲状腺癌相关性的研究进展 |
2.1 雌激素促进甲状腺癌转移的作用机制 |
2.2 雌激素对MAPK信号通路的作用 |
2.3 MAPK信号通路在肿瘤中的作用 |
参考文献 |
致谢 |
在学期间研究成果 |
(6)口腔鳞癌外泌体miR-141-3p促进NF向CAF转化的作用及其机制研究(论文提纲范文)
前言 |
中文摘要 |
Abstract |
缩略词表 |
第一章 绪论 |
1.1 肿瘤相关成纤维细胞(CAF) |
1.2 肿瘤外泌体参与肿瘤相关成纤维细胞形成 |
1.3 存在的问题和展望 |
第二章 口腔鳞癌外泌体促进NF向CAF转化 |
2.1 引言 |
2.2 实验材料及方法 |
2.3 实验结果 |
2.4 讨论 |
2.5 小结 |
第三章 口腔鳞癌外泌体高通量测序及生物信息学分析 |
3.1 引言 |
3.2 实验材料及方法 |
3.3 实验结果 |
3.4 讨论 |
3.5 小结 |
第四章 miR-141-3p促NF向CAF转化作用及机制初步研究 |
4.1 引言 |
4.2 实验材料及方法 |
4.3 实验结果 |
4.4 讨论 |
4.5 小结 |
第五章 全文总结 |
参考文献 |
致谢 |
(7)低氧胶质瘤外泌体与PLEKHG5在胶质瘤恶性进展中的作用机制研究(论文提纲范文)
中文摘要 |
英文摘要 |
符号说明 |
第一部分 低氧胶质瘤外泌体对巨噬细胞M2型极化的作用机制研究 |
前言 |
材料与方法 |
实验结果 |
讨论 |
结论 |
附图表 |
参考文献 |
第二部分 低氧胶质瘤外泌体对常氧胶质瘤细胞侵袭和迁移的作用机制研究 |
前言 |
材料与方法 |
实验结果 |
讨论 |
结论 |
附图表 |
参考文献 |
第三部分 PLEKHG5在胶质瘤中的作用研究 |
前言 |
材料与方法 |
实验结果 |
讨论 |
结论 |
附图表 |
参考文献 |
文献综述 外泌体在胶质瘤恶性进展中的作用 |
参考文献 |
致谢 |
攻读学位期间发表的学术论文目录 |
学位论文评阅及答辩情况表 |
英文文章 |
(8)胞外囊泡miR-122-5p功能及选择性运输机制研究(论文提纲范文)
摘要 |
Abstract |
中英文缩略词对照表 |
第一章 胞外囊泡miRNAs研究进展概述 |
1.1 胞外囊泡概述 |
1.2 胞外囊泡在肿瘤转移中的作用 |
1.3 胞外囊泡miRNAs简介 |
1.4 胞外囊泡miRNAs选择性运输相关蛋白简介 |
第二章 非小细胞肺癌胞外囊泡标志物miRNAs筛选 |
2.1 引言 |
2.2 实验材料与仪器 |
2.2.1 实验材料 |
2.2.2 实验仪器 |
2.3 实验方法与步骤 |
2.3.1 细胞培养 |
2.3.2 超速离心法提取胞外囊泡 |
2.3.3 胞外囊泡标志蛋白检测 |
2.3.4 透射电镜检测胞外囊泡结构 |
2.3.5 纳米粒度仪分析胞外囊泡粒径 |
2.3.6 试剂盒法提取胞外囊泡 |
2.3.7 胞外囊泡RNA和细胞总RNA提取 |
2.3.8 实时荧光定量PCR |
2.4 实验结果与分析 |
2.4.1 胞外囊泡分析与表征 |
2.4.2 miR-122-5p和 miR-451a选择性进入肺癌胞外囊泡 |
2.5 小结与讨论 |
第三章 A549 胞外囊泡来源的miR-122-5p促进L02 迁移 |
3.1 引言 |
3.2 实验材料和仪器 |
3.2.1 实验材料 |
3.2.2 实验仪器 |
3.3 实验方法与步骤 |
3.3.1 胞外囊泡摄取实验 |
3.3.2 Transwell检测细胞迁移 |
3.3.3 细胞增殖实验 |
3.3.4 胞外囊泡过表达miR-122-5p |
3.3.5 Western Blot检测迁移相关蛋白 |
3.4 实验结果与分析 |
3.4.1 受体细胞摄取IMR-90和A549 的胞外囊泡 |
3.4.2 A549 胞外囊泡促进L02 迁移 |
3.4.3 胞外囊泡中过表达miR-122-5p促进L02 迁移 |
3.4.4 A549 胞外囊泡对L02 增殖无显着影响 |
3.4.5 miR-122-5p抑制A549 增殖 |
3.5 小结与讨论 |
第四章 hnRNPA2B1 介导miR-122-5p的选择性运输 |
4.1 引言 |
4.2 实验材料和仪器 |
4.2.1 实验材料 |
4.2.2 实验仪器 |
4.3 实验方法与步骤 |
4.3.1 siRNA下调hnRNPA2B1 蛋白 |
4.3.2 miRNAs蛋白质pull down 实验 |
4.3.3 miR-122-5p的基序突变 |
4.3.4 hnRNPA2B1 载体构建 |
4.3.5 hnRNPA2B1 载体表达鉴定 |
4.4 实验结果与分析 |
4.4.1 miR-122-5p选择性运输蛋白筛选 |
4.4.2 下调hnRNPA2B1 后的胞外囊泡抑制L02 迁移 |
4.4.3 miR-122-5p与 hnRNPA2B1 互作 |
4.4.4 miR-122-5p上的碱基序列突变抑制其选择性运输 |
4.4.5 hnRNPA2B1 过表达促进miR-122-5p选择性运输 |
4.4.6 临床数据分析 |
4.5 小结与讨论 |
研究总结与展望 |
参考文献 |
硕士阶段发表的论文 |
致谢 |
(9)人巨细胞病毒感染细胞外泌体的microRNA深度测序及其在HCMV活动性感染患儿外周血检测结果与临床指标相关性的分析(论文提纲范文)
摘要 |
Abstract |
英文缩略语 |
第一部分 、人巨细胞病毒感染细胞外泌体miRNA高通量测序及结果分析 |
1 前言 |
2 材料和方法 |
2.1 实验材料和仪器 |
2.1.1 细胞系及病毒株 |
2.1.2 主要实验材料 |
2.1.3 主要仪器设备 |
2.2 实验方法 |
2.2.1 外泌体的分离纯化及鉴定 |
2.2.2 HELF细胞和HCMV感染后的HELF细胞外泌体miRNA的表达谱的高通量分析 |
3 结果 |
3.1 外泌体的分离纯化与鉴定结果 |
3.2 外泌体总RNA的质量检测 |
3.3 构建文库的质量检测 |
3.4 测序结果分析 |
3.4.1 小RNA文库的数据分析 |
3.4.2 HCMV Han BAC感染/非感染HELF细胞外泌体宿主基因组miRNA的差异性分析 |
3.4.3 HCMV Han BAC感染细胞外泌体中HCMV基因组miRNA分析 |
3.4.4 生物学信息学的分析 |
4 讨论 |
4.1 HCMV和 miRNA简介 |
4.2 外泌体的提取及检测技术 |
4.3 外泌体和病毒间的关系 |
4.4 miRNA在病毒和宿主细胞之间的调控关系 |
5 结论 |
第二部分 、HCMV感染细胞外泌体中病毒miR-US25-1-5p和 miR-UL112-3p的含量分析 |
6 前言 |
7 材料和方法 |
7.1 实验材料和仪器 |
7.1.1 细胞系及病毒株 |
7.1.2 主要实验材料 |
7.1.3 主要仪器设备 |
7.2 实验方法 |
7.2.1 外泌体的分离及表达 |
7.2.2 HCMV感染HELF后外泌体及细胞内miR-US25-1-5p和 miR-UL112-3p在不同时期的表达 |
7.2.3 hcmv-miR-US25-1-5p和 hcmv-miR-UL112-3p通过外泌体传递至HELF的表达 |
8 结果 |
8.1 HCMV感染细胞外泌体中miR-US25-1-5p和 miR-UL112-3p含量动力学检测 |
8.2 外泌体中HCMV miR-US25-1-5p和 miR-UL112-3p进入非感染受体HELF细胞的动力学检测 |
9 讨论 |
10 结论 |
第三部分 、HCMV感染患儿血清外泌体miR-US25-1-5p和 miR-UL112-3p的检测及与临床指标的相关性分析 |
11 前言 |
12 材料和方法 |
12.1 实验材料和仪器 |
12.1.1 研究对象 |
12.1.2 主要实验材料 |
12.1.3 主要仪器设备 |
12.2 实验方法 |
12.2.1 临床资料的收集 |
12.2.2 血清标本的收集 |
12.2.3 血清外泌体中总RNA的提取 |
12.2.4 Taq Man茎环探针检测miR-US25-1-5p和 miR-UL112-3p的相对含量 |
12.2.5 miR-US25-1-5p及 miR-UL112-3p的前体序列多态性分析 |
12.2.5 统计学分析 |
13 结果 |
13.1 临床基本资料及各项生化指标的比较 |
13.2 HCMV感染患儿miR-US25-1-5p和 miR-UL112-3p在血清外泌体中的含量 |
13.3 HCMV感染患儿血清外泌体miR-US25-1-5p和 miR-UL112-3p的含量与临床生化指标的相关性分析结果 |
14 讨论 |
15 结论 |
本研究创新性的自我评价 |
参考文献 |
综述 |
参考文献 |
攻读学位期间取得的研究成果 |
致谢 |
个人简介 |
(10)MAPK通路基因多态性与甲状腺乳头状癌关系的遗传流行病学研究(论文提纲范文)
中文摘要 |
Abstract |
第1章 绪论 |
1.1 甲状腺癌概述 |
1.1.1 定义和分类 |
1.1.2 发病机制 |
1.1.3 临床表现 |
1.1.4 诊断 |
1.1.5 治疗 |
1.2 甲状腺癌的流行病学 |
1.2.1 人群分布 |
1.2.2 时间分布 |
1.2.3 地区分布 |
1.3 甲状腺癌的致病因素 |
1.3.1 碘摄取异常 |
1.3.2 放射线照射 |
1.3.3 促甲状腺激素增多 |
1.3.4 性激素作用 |
1.3.5 生甲状腺肿物质诱导 |
1.3.6 其他甲状腺疾病引发 |
1.3.7 家族因素 |
1.4 甲状腺癌的分子遗传学研究 |
1.4.1 MAPK/ERK通路 |
1.4.2 PI3K/AKT通路 |
1.4.3 果蝇WNT同源基因/β-连锁蛋白(Wnt/β-catenin)通路 |
1.4.4 NF-κB通路 |
1.4.5 TSH/TSHR通路 |
1.4.6 其他相关通路 |
1.4.7 其他相关基因 |
1.5 立题依据 |
第2章 材料与方法 |
2.1 研究对象 |
2.1.1 甲状腺乳头状癌组 |
2.1.2 结节性甲状腺肿组 |
2.1.3 健康对照组 |
2.2 试剂、仪器和器材 |
2.2.1 主要试剂 |
2.2.2 主要仪器 |
2.2.3 主要器材 |
2.3 实验方法与实验步骤 |
2.3.1 研究对象全血基因组DNA的提取 |
2.3.2 DNA含量及纯度检测 |
2.4 SNPS位点的选择 |
2.4.1 确定tag SNPs |
2.4.2 引物设计 |
2.4.3 基因型检测 |
2.5 数据分析 |
2.5.1 各组间的均衡性检验 |
2.5.2 Hardy-Weinberg(H-W)平衡定律检验 |
2.5.3 关联分析和按照性别分层的关联性分析 |
2.5.4 连锁不平衡程度的检验 |
2.5.5 多位点联合分析(单倍型分析) |
第3章 结果 |
3.1 甲状腺乳头状癌组和结节性甲状腺肿组的一般情况 |
3.1.1 甲状腺乳头状癌组 |
3.1.2 结节性甲状腺肿组 |
3.2 基因多态性与甲状腺乳头状癌、结节性甲状腺肿的关联性分析 |
3.2.1 选择tag SNPs |
3.2.2 SNPs各等位基因与基因型频数分布 |
3.2.3 Hardy-Weinberg平衡定律检验 |
3.2.4 SNP基因型多态性、等位基因多态性与甲状腺乳头状癌、结节性甲状腺肿关联性分析 |
3.2.5 按照性别分层的SNP基因型多态性、等位基因多态性与甲状腺乳头状癌、结节性甲状腺肿关联性分析 |
3.2.6 连锁不平衡程度的检验 |
3.2.7 多位点联合分析(单倍型分析) |
第4章 讨论 |
4.1 基因多态性与甲状腺乳头状癌的关联性分析 |
4.1.1 Hardy-Weinberg平衡定律检验 |
4.1.2 KRAS基因多态性与甲状腺乳头状癌的关系 |
4.1.3 HRAS基因多态性与甲状腺乳头状癌的关系 |
4.1.4 NRAS基因多态性与甲状腺乳头状癌的关系 |
4.1.5 ALK基因多态性与甲状腺乳头状癌的关系 |
4.1.6 MET基因多态性与甲状腺乳头状癌的关系 |
4.1.7 VEGFA基因多态性与甲状腺乳头状癌的关系 |
4.1.8 多位点联合分析(单倍型分析) |
4.2 结节性甲状腺肿与甲状腺乳头状癌的关系 |
4.3 MAPK通路基因多态性与甲状腺乳头状癌的关系 |
第5章 结论 |
本研究的创新之处 |
参考文献 |
攻读学位期间发表的学术论文及取得的科研成果 |
致谢 |
四、鼻咽癌中TSG101基因的突变研究(论文参考文献)
- [1]长链非编码RNA FOXP4-AS1在尤文肉瘤及其肿瘤微环境中的功能机制研究[D]. 熊家超. 南昌大学, 2021(01)
- [2]TGF-B1诱导后外泌体MIR-663B促进宫颈癌转移和上皮-间质转化的机制研究[D]. 尤学武. 山东大学, 2021(12)
- [3]PTEN缺失通过损害溶酶体功能增加外泌体分泌进而促进胆管癌转移[D]. 石园园. 中国人民解放军海军军医大学, 2020(02)
- [4]喉鳞癌血清外泌体差异miRNAs筛选及miR-941功能研究[D]. 赵沁丽. 山西医科大学, 2020(10)
- [5]雌二醇通过MAPK信号通路对甲状腺乳头状癌细胞增殖迁移的影响[D]. 孙国欣. 华北理工大学, 2020(02)
- [6]口腔鳞癌外泌体miR-141-3p促进NF向CAF转化的作用及其机制研究[D]. 邓涵. 南京大学, 2020
- [7]低氧胶质瘤外泌体与PLEKHG5在胶质瘤恶性进展中的作用机制研究[D]. 钱明禹. 山东大学, 2020(08)
- [8]胞外囊泡miR-122-5p功能及选择性运输机制研究[D]. 秦芳. 武汉大学, 2019(06)
- [9]人巨细胞病毒感染细胞外泌体的microRNA深度测序及其在HCMV活动性感染患儿外周血检测结果与临床指标相关性的分析[D]. 张静. 中国医科大学, 2020(01)
- [10]MAPK通路基因多态性与甲状腺乳头状癌关系的遗传流行病学研究[D]. 宁丽峰. 吉林大学, 2016(03)