一、人过氧化物酶体增殖体激活受体γ2基因克隆及真核表达载体的构建与鉴定(论文文献综述)
夏立新[1](2021)在《基于mRNA-miRNA分析的牛乳脂代谢功能基因筛选及KLF6基因功能验证》文中指出作为奶牛重要的经济性状,乳脂率是影响牛奶品质的重要因素之一,也是奶牛遗传育种研究领域的重要课题。随着全基因组关联分析等新育种方法的应用,奶牛分子育种发展非常迅速,但重要经济性状相关功能基因的筛选和功能基因的调控机制解析依然是奶牛遗传育种领域的热点和难点。本研究以乳腺上皮细胞为研究对象,采用RNA-seq和mi RNA-seq联合分析方法,筛选与乳品质相关的功能基因,同时对KLF6等基因对乳脂代谢的调控机制进行解析,其结果为优质奶牛改良提供候选基因,为了解乳腺上皮细胞中脂质代谢的调控机制及解析奶牛乳品质重要经济性状的调控机制提供理论依据。1牛乳脂代谢功能基因筛选与鉴定对高乳脂率(4.85%)和低乳脂率(3.41%)奶牛的原代乳腺上皮细胞进行RNA-seq,共筛选到829个差异表达基因。进一步地,将RNA-seq数据与试验室前期发表的mi RNA-seq数据进行联合分析,共鉴定到190个差异表达基因(包括159个上调的差异表达基因和31个下调的差异表达基因)和33个差异表达mi RNAs(包括11个上调的差异表达mi RNAs和22个下调的差异表达mi RNAs)。基于mi RNAs与基因之间的靶标关系,构建乳脂代谢相关m RNA-mi RNA调控网络。双荧光素酶报告试验和q PCR试验结果表明,mi R-148a与PDE4D基因、mi R-2382-5p与SOD3、NDRG2和KLF6基因、mi R-2425-5p与ADAMTS1基因之间存在靶标关系,证实靶标关系预测的准确性。对联合分析鉴定到的190个差异表达基因进行功能注释,选择富集在脂质代谢相关GO条目中的18个差异表达mi RNAs及其靶向调控的27个差异表达基因(p<0.05),构建脂质代谢相关m RNA-mi RNA调控网络。其中,其中mi R-21-3p和mi R-148a能够促进牛乳腺上皮细胞中甘油三酯的合成,相反的,mi R-2382-5p和mi R-2425-5p能够降低牛乳腺上皮细胞中甘油三酯的含量。并且,mi R-2382-5p可以通过调节脂质代谢相关基因促进甘油三酯的分解。同时,对mi R-2382-5p的两个靶基因NDRG2和KLF6在细胞水平进行功能验证。结果表明NDRG2和KLF6基因的表达水平与牛乳腺上皮细胞中甘油三酯和胆固醇的含量呈正相关。2细胞水平解析KLF6基因对乳脂代谢的调控机制本研究利用CRISPR/Cas9技术构建牛乳腺上皮细胞KLF6基因敲除细胞系(KLF6-/-)。从KLF6-/-中提取DNA进行PCR,PCR产物测序结果显示,KLF6基因产生了DNA序列的大片段缺失,同时氨基酸编码序列发生移码变异;从KLF6-/-中提取RNA进行q PCR,结果表明KLF6基因的m RNA不表达。同时,KLF6-/-中甘油三酯和胆固醇含量显着降低(p<0.05),单不饱和脂肪酸含量显着降低(p<0.05),其中棕榈油酸、油酸和γ-亚麻酸等10种脂肪酸(p<0.05)在KLF6-/-中的含量显着低于野生型牛乳腺上皮细胞(WT)。RNA-seq数据共获得4936个上调的差异表达基因和4596个下调的差异表达基因,其中包括与脂质代谢密切相关的FASN、FABP3、VLDLR、NDRG2和PPARγ基因等。筛选脂质代谢相关的GO条目(p<0.05),包括脂肪酸β氧化、脂肪细胞分化调节、棕色脂肪细胞分化调节、非常长链脂肪酸代谢过程和脂肪酸生物合成过程,构建脂质代谢相关GO条目与差异表达基因之间的调控网络。对差异表达基因进行KEGG通路富集分析,其中有47个差异表达基因显着富集在脂肪酸代谢通路、14个差异表达基因显着富集在脂肪酸生物合成通路和21个差异表达基因显着富集在脂肪酸延伸通路。分别对WT和KLF6-/-进行代谢组学分析,正离子模式鉴定到342个代谢物,负离子模式鉴定到294个代谢物。各类代谢物中数量占比最高的是脂质及脂质样分子(29.874%),其次为有机酸和衍生物(24.843%),说明在乳腺上皮细胞中,脂质代谢是十分重要的生物进程。对负离子模式下的差异代谢物进行分析,结果显示很多脂质及脂质样分子种类的代谢物含量存在显着差异(p<0.05),包括1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸-1-丝氨酸、1-棕榈酰基-2-亚油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱、1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸-1-丝氨酸和1-硬脂酰基-2-油酰基-sn-甘油-3-磷酸-(1’-sn-甘油)。对差异代谢物进行KEGG富集分析,显着富集的通路包括氧化磷酸化、柠檬酸循环、甘油磷脂的新陈代谢、胰岛素信号通路和胰高血糖素信号通路(p<0.05)。3小鼠体内KLF6基因对乳脂代谢的调控机制研究利用CRISPR/Cas9技术构建KLF6基因乳腺组织特异性敲除小鼠模型。PCR产物测序结果显示,在纯合型小鼠中,KLF6基因上的lox P位点被Cre基因识别并成功发生DNA片段的剪切;q PCR和Western Blot试验结果显示纯合型小鼠乳腺组织中KLF6基因m RNA和蛋白不表达,即KLF6基因乳腺组织特异性敲除小鼠模型构建成功。此外,对小鼠进行组织形态学观察,发现小鼠各器官(心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、肌肉和脂肪)形态正常,说明KLF6基因在乳腺组织的敲除并不会引起小鼠的疾病发生。使用ELISA试剂盒检测乳汁中甘油三酯的含量,结果显示纯合型小鼠乳汁中甘油三酯含量显着低于杂合型小鼠和野生型小鼠(p<0.05)。乳腺组织的形态学分析表明,纯合型小鼠的乳腺组织中脂肪细胞的直径小于野生型小鼠,且纯合型小鼠乳腺组织中甘油三酯和胆固醇含量显着减少(p<0.05)。此外,在纯合型小鼠的乳腺组织中,调控脂解作用的相关基因(ATGL、PKA、HSL和FABP4基因)的表达水平显着上调。综上所述,本研究通过m RNA-mi RNA分析精准筛选到KLF6基因等乳脂代谢候选调控因子。在乳腺上皮细胞中,KLF6基因通过调控乳脂代谢相关基因,参与到脂肪酸合成与代谢相关通路,影响细胞中脂质及脂质样分子种类的代谢物含量,进而作用于甘油三酯、胆固醇和脂肪酸等乳脂代谢指标。在小鼠乳腺组织中,KLF6基因能够作用于脂肪细胞脂解作用的调控通路,引起乳腺组织中脂肪细胞的形态学变化以及甘油三酯和胆固醇含量变化,进而影响乳脂率。本试验从细胞水平和试验动物水平解析KLF6基因对脂质代谢的调控机制,为优质奶牛改良提供候选基因,为进一步研究奶牛的乳脂代谢调控机制提供理论依据。
孙仁杰[2](2021)在《猪圆环病毒2型利用宿主细胞应激反应促进其自身复制的分子机制》文中进行了进一步梳理猪圆环病毒2型(Porcine circovirus type 2,PCV2)是引起猪圆环病毒相关疾病(Porcine circovirus associated disease,PCVAD)的重要病原,给全球养猪业造成重大经济损失。但PCV2单独感染的致病力不强,共感染或继发感染或环境应激,可以触发PCVAD。受限于自身基因组大小和编码能力,PCV2复制在很大程度上依赖于宿主细胞,因此易引起内质网应激、氧化应激和自噬等细胞应激反应。本实验室研究表明,PCV2能通过与相关宿主因子的相互作用,调控宿主细胞的应激反应从而促进自身复制。高迁移率族蛋白1(High mobility group box 1protein,HMGB1)是高度保守的非组蛋白染色体结合蛋白,在细胞中的功能取决于其在细胞内的位置,在核内主要起DNA分子伴侣作用。研究表明,氧化应激或一些病毒感染可以引起HMGB1在细胞中重新分布,并在病毒感染过程中发挥重要作用。那么,PCV2感染引起的内质网应激是否诱导氧化应激?通过何种机制诱导?由此产生的氧化应激是否影响HMGB1在细胞内的分布?HMGB1是否影响PCV2复制?通过何种机制影响病毒复制?本论文针对这些科学问题展开了系统研究,目的是解明PCV2利用宿主细胞应激反应,促进其自身复制的分子机制。主要研究内容和结果如下:1.核内HMGB1负调控PCV2复制通过免疫印迹、免疫荧光等技术分析HMGB1蛋白在PCV2感染的PK-15细胞或3D4/31细胞(猪肺泡巨噬细胞)中的表达和分布情况,发现PCV2感染可以诱导HMGB1向核外转移至细胞质,但不影响HMGB1的转录和表达。利用过表达或基因沉默技术调节HMGB1在细胞内的水平,并分析其对PCV2复制的影响。结果显示,过表达HMGB1能够抑制PCV2复制,细胞内病毒DNA拷贝数、m RNA水平以及病毒衣壳蛋白(Cap)表达水平均下降;而下调HMGB1表达,可以显着促进PCV2的复制,表明HMGB1负调控PCV2复制。为探究是否是核内HMGB1调控PCV2复制,我们将PCV2感染细胞进行HMGB1出核抑制剂处理,发现丙酮酸乙酯可以有效抑制PCV2诱导的HMGB1出核,并抑制PCV2在细胞中的复制;而用甘草酸抑制胞外HMGB1活性(直接与其结合)并不影响病毒复制。以上结果表明,细胞核内HMGB1可抑制病毒复制,而PCV2感染可以促使HMGB1向核外转移。那么,核内HMGB1如何影响PCV2复制?2.核内HMGB1通过与病毒基因组DNA复制起始区茎环结构结合影响PCV2复制为探明HMGB1是否与病毒基因组DNA互作?互作过程涉及哪个区域?我们制备了PCV2基因组全长和包含或不包含复制起始区(Ori)的不同DNA片段(orf1、orf2、Ori-orf1和Ori-orf2),并构建了表达HMGB1全长或不同结构域截短蛋白(A box、AB box和B box CT)的载体,通过凝胶阻滞或DNA结合蛋白免疫共沉淀分析HMGB1蛋白-病毒DNA互作,结合病毒复制水平检测,发现只有携带B box的区域与全长HMGB1一样可以抑制病毒在PK-15细胞中的复制,且只有携带复制起始区茎环结构的病毒DNA片段与HMGB1互作才能阻滞蛋白-DNA复合物在凝胶中的迁移。表明HMGB1中的B box结构域是影响PCV2复制的关键区域,核内HMGB1通过与病毒DNA的复制起始区茎环结构结合抑制病毒复制。3.PCV2通过提高胞内活性氧水平促进HMGB1出核和自身复制应用流式细胞术检测PCV2感染PK-15细胞中的活性氧(Reactive oxygen species,ROS)水平变化,抗氧化剂乙酰半胱氨酸(N-acetylcysteine,NAC)和过氧化氢(H2O2)处理PCV2感染细胞,结合分析HMGB1在细胞核内外的分布。我们发现PCV2感染可以显着提高细胞内ROS水平和核内HMGB1向核外转移;用NAC处理PCV2感染细胞,可抑制HMGB1向核外转移,并抑制病毒复制;用H2O2处理PCV2感染细胞,则在促进HMGB1出核的同时,增强PCV2复制。以上结果表明,PCV2感染可增加细胞中ROS水平,引起氧化应激并促进HMGB1向核外转移,降低了核内HMGB1对病毒DNA复制的抑制,有利于PCV2复制。4.PCV2感染诱导内质网应激和氧化应激促进HMGB1向核外转移本实验室前期研究表明,PCV2感染可激活PK-15或3D4/31细胞内质网应激的PERK-e IF2α-ATF4-CHOP通路;已知ERO1α(内质网氧化还原酶1α)受CHOP调控,参与内质网新生蛋白的氧化折叠,并将电子传递给氧分子,最后形成H2O2。我们通过RNA干扰下调PERK蛋白表达、GSK2606414抑制PERK磷酸化或用EN460抑制ERO1α活性,结合细胞内ROS、HMGB1核内外分布以及病毒复制水平的检测,发现PERK或ERO1α抑制均能下调PCV2感染细胞中的ROS水平,抑制HMGB1向核外转移,且PCV2复制受到显着抑制。表明PCV2诱导的内质网应激可以伴随氧化应激,且内质网应激引起的ROS水平增加足以促进HMGB1向核外转移,进而降低核内HMGB1对病毒DNA复制的抑制。5.PCV2诱导内质网氧化还原稳态失衡和HMGB1出核的分子基础在PK-15细胞中过表达PCV2的ORF1(Rep)、ORF2(Cap)、ORF3、ORF4和ORF5蛋白,发现只有Rep和Cap促进ERO1α表达、ROS产生以及HMGB1向核外转移。通过对Rep和Cap中半胱氨酸残基分析,构建了Cap C108S以及RepC107S和Rep C305S的突变蛋白,与野生型蛋白相比,半胱氨酸置换均显着降低它们对PERK和ERO1α的激活作用,下调ROS水平,抑制HMGB1出核。为进一步探究这三个半胱氨酸残基在PCV2感染过程中的作用,通过反向遗传技术构建携带Rep和Cap中半胱氨酸残基单突变和三突变的重组病毒PCV2Rep1(C107S)、PCV2Rep2(C305S)、PCV2Cap1(C108S)和PCV2Rep1/2-Cap1。结果表明,只有三突变的重组病毒(PCV2Rep1/2-Cap1)对PERK和ERO1α的激活作用减弱,并显着降低胞内ROS水平、减少HMGB1向核外转移,病毒复制及增殖水平也显着下降。提示内质网中半胱氨酸介导的蛋白氧化折叠和ROS产生量在单一蛋白水平和全病毒水平之间存在差别,可能与单一蛋白过表达和全病毒水平相关蛋白的表达量存在一定差异有关,也可能是全病毒水平半胱氨酸残基的协同作用所致。综上所述,本研究首次报道了宿主蛋白HMGB1与PCV2基因组DNA之间的相互作用及其对PCV2复制的影响:核内HMGB1通过与病毒基因组DNA的复制起始区茎环结构结合,起到抑制病毒复制的作用,是一种抗PCV2复制的宿主因子。阐明了PCV2通过诱导细胞应激逃避宿主抗病毒反应的新机制:PCV2通过激活PERK-ERO1α系统,在发生内质网应激的同时伴随氧化应激,产生的ROS足以促使核内HMGB1向胞质转移,降低核内HMGB1对病毒基因组DNA的“劫持”,进而有利于PCV2复制。研究结果为猪场通过抗氧化辅助手段防治PCVAD提供借鉴,为深入探索PCV2在宿主体内的相关应激激活机制奠定重要基础。
阳明会[3](2021)在《ATG4B在DHA影响草鱼肾脏细胞脂质代谢中的作用分析》文中研究说明脂质蓄积调控是生命科学研究领域中的重要课题之一,外源性脂类摄入可以改变细胞内脂质含量或组成,进而影响机体内脂质代谢。二十二碳六烯酸(DHA)作为一种多不饱和脂肪酸,能够改变细胞膜特性,并且可以有效的抑制脂肪细胞中甘油三酯的合成、诱导细胞凋亡以及促进脂质分解。研究发现脂质对病毒的复制、成熟和传播等过程产生影响,在病毒感染的草鱼肾脏细胞(CIK)中,三酰甘油等脂质在某些信号和免疫反应途径(如调节自噬)中明显富集。因此脂质代谢对于鱼类肾脏细胞的免疫及信号调节有着重要的影响。自噬相关蛋白(ATG),参与调控自噬过程的各个阶段,其中ATG4的主要作用是对LC3进行剪切,并使LC3循环,进而诱导自噬的发生。ATG4四个亚型中,ATG4B对LC3B表现出高度特异性。自噬对维持细胞稳态有着重要的作用,但目前与自噬有关的研究大多集中在哺乳动物细胞、植物细胞和酵母细胞方向上。由于鱼类研究技术等方面的局限性,对鱼类细胞自噬研究相对较少,有关DHA对CIK细胞自噬和脂质代谢的影响尚未见到系统探讨。因此,本论文开展了三个试验,着重探讨了DHA对CIK细胞自噬和脂质代谢的影响,以及分析ATG4B在DHA影响CIK细胞自噬和脂质代谢中的作用。试验一,草鱼ATG4四个亚型的克隆和生物信息学分析。将克隆得到的草鱼ATG4四个亚型进行氨基酸多序列比对发现,草鱼ATG4A(MK359084)、ATG4B(MK370054)、ATG4C(MK370055)和ATG4D(MK370056)分别包含1212、1194、1429和1482 bp的完整CDS,分别编码403、394、475和493个氨基酸,分子量分别为45.9、44.5、52.4和54.6 k Da;草鱼ATG4氨基酸序列从哺乳动物到鱼类高度保守,系统进化树分析表明其亲缘关系与鱼类(斑马鱼和金线鲃)较近,此外ATG4四个亚型分别在心、白肌、头肾和肝脏组织中具有较高的表达水平。试验二,ATG4四个亚型参与DHA对CIK细胞脂质代谢的影响。(1)分别用50、100、200μM的DHA处理CIK细胞24 h,通过尼罗红染色和甘油三酯含量的检测,发现随着DHA浓度增加,CIK细胞中脂滴数量增多,甘油三酯含量增加;实时定量结果显示ATG4家族、ATG5、ATG7、Beclin-1和脂代谢相关基因FAS、ACC、ATGL、HSL mRNA表达水平均增加(P<0.01);(2)DHA处理CIK细胞的同时,用自噬激活剂(Rapa)激活自噬,与DHA处理组相比较,尼罗红染色显示细胞中脂滴减少,同时细胞内甘油三酯的含量显着降低(P<0.01);脂生成相关基因FAS和ACC基因mRNA表达水平降低(P<0.01),脂解相关基因ATGL、HSLa和HSLb基因mRNA表达水平增加(P<0.01);(3)CIK细胞先用自噬抑制剂(CQ)预处理4小时后结合DHA处理,尼罗红染色结果显示细胞内脂滴的储蓄增加,同时细胞内甘油三酯含量显着增加(P<0.01);实时定量结果显示脂质生成相关基因PPARγ、FAS、ACC、CREB和CEBPα和基因mRNA表达水平增加(P<0.01),脂解相关基因ATGL、HSLa和HSLb基因mRNA基因表达水平降低(P<0.01)。研究结果表明,DHA处理CIK细胞,增加了细胞中LDs的蓄积,并且诱导自噬和脂解的发生;激活(抑制)自噬可以降低(增加)DHA诱导的CIK细胞脂质蓄积。试验三,ATG4B在DHA调控CIK细胞自噬和脂质代谢中的作用(1)在CIK细胞中过表达ATG4B,与对照组相比,ATG4A、ATG4B、ATG4C、ATG5、ATG7基因mRNA表达水平升高(P<0.01),ATG4D的表达水平降低(P<0.01);过表达ATG4B的同时用DHA处理CIK细胞,与DHA处理组相比,ATG4C、ATG5和ATG7基因mRNA表达水平升高(P<0.01),ATG4B和ATG4D表达水平降低(P<0.01),ATG4A表达无显着性差异;(2)过表达ATG4B同时用200μM DHA处理,与DHA处理组相比,ATGL、HSLa和HSLb基因mRNA表达水平显着升高(P<0.01),FAS和ACC基因mRNA表达水平显着降低(P<0.01)。结果表明过表达ATG4B促进DHA诱导CIK细胞自噬同时降低DHA诱导CIK细胞脂质蓄积。综上所述,DHA可以增加CIK细胞的脂质含量,同时还可以诱导自噬的发生。自噬参与了DHA对CIK细胞脂质代谢的影响,激活自噬可以减少DHA诱导的CIK细胞脂质蓄积,过表达ATG4B可以促进DHA诱导的CIK细胞的自噬,并且可以减少脂质的积累。
金夏阳[4](2021)在《绵羊脂肪细胞分化中miRNAs的鉴定及miR-148a和miR-200b功能研究》文中研究表明绵羊的脂肪组织不仅在提供能量、维持体温、保护内脏等方面发挥重要作用,而且适度的脂肪沉积是提高羊肉品质的关键。因此,从细胞和分子水平研究脂质代谢和脂沉积的调控机制在绵羊产业中有重要的应用前景。Micro RNAs(miRNAs)是哺乳动物脂质沉积和代谢的重要调节分子。目前,对绵羊脂肪细胞增殖和脂质沉积的研究主要聚焦在功能基因或转录因子的调控,而对非编码RNA,特别是miRNAs的转录后调控机制缺乏深入解析。因此,筛选、鉴定绵羊脂肪细胞增殖和分化相关miRNAs,并阐释其调控机制,对改善羊肉品质具有重要的理论和经济意义。本研究采用RNA-Seq技术分析绵羊脂肪细胞分化过程中差异表达的miRNAs,并利用过表达、小干扰、RT-q PCR、油红O染色、双荧光素酶报告检测系统和Ed U标记等技术深入探讨了miR-148a和miR-200b对绵羊前脂肪细胞增殖分化的调控机制。主要研究结果如下:1.绵羊脂肪细胞具有很强的分化成脂能力。诱导分化开始后第0 d为前脂肪细胞阶段,第2 d为早期分化阶段,第8 d为终末期分化阶段。2.miRNAs在绵羊脂肪细胞分化中具有不同的表达模式。高通量测序分析分化第0 d、第2 d和第8 d脂肪细胞,从3个时期的小RNA文库中获得的质控序列(Cleans reads)读数分别为11396070,12342040和12438379,D2 vs.D0、D8 vs.D2和D8 vs.D0组鉴定到127个、220个和318个显着差异表达miRNAs,时序表达趋势聚类分析显示这些差异表达的miRNAs富集到了8种表达模式中。功能富集分析显示差异表达miRNAs的预测靶基因分别显着富集到186、197和201个GO条目;KEGG富集分析显示预测靶基因均富集到345个信号通路中;随机选取16个差异表达miRNAs进行RT-q PCR验证,结果与RNA-Seq结果一致。3.miR-148a和miR-200b影响绵羊脂肪细胞的分化和脂质合成。在绵羊的8个不同组织中,miR-148a和miR-200b在皮下脂肪组织中均优势表达。在绵羊前脂肪细胞分化过程中,miR-148a的表达持续上调而miR-200b的表达持续下降。miR-148a的上调显着促进了绵羊脂肪细胞的分化而miR-200b的过表达则显着抑制了分化。此外,双荧光素酶报告试验结果表明同源性磷酸酶-张力蛋白(PTEN)和Krüppel样因子9(KLF9)分别是miR-148a和miR-200b的靶基因。靶基因功能试验表明,PTEN的上调表达抑制了绵羊脂肪细胞的分化,而KLF9的过表达则显着促进了前脂肪细胞的分化。这说明miR-148a和miR-200b分别通过抑制PTEN和KLF9的表达调控绵羊脂肪细胞的分化。4.miR-148a和miR-200b参与调控了绵羊前脂肪细胞的增殖。虽然本研究中的RNA-Seq分析并未涉及绵羊前脂肪细胞的增殖阶段,但miRNAs对脂肪细胞的增殖和分化过程均具有至关重要的调控作用。因此,本研究通过细胞活力检测和Ed U标记等方法进一步研究了miR-148a和miR-200b对绵羊前脂肪细胞增殖的影响,以便更加全面的了解miR-148a和miR-200b对绵羊脂肪组织发育的调控作用。绵羊前脂肪细胞中miR-148a的上调表达显着抑制了细胞的增殖,miR-200b的过表达则促进了前脂肪细胞增殖。靶基因分析显示miR-200b直接靶向细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂1B(p27)基因。p27功能验证试验表明,绵羊前脂肪细胞中p27的过表达抑制了前脂肪细胞的增殖,而下调p27的表达则促进了前脂肪细胞的增殖活性。本研究建立了绵羊脂肪细胞成脂分化模型,获得了绵羊脂肪细胞分化过程中miRNAs的表达谱,初步探讨了差异表达miRNAs在脂肪细胞分化和脂质沉积中的功能,并系统性的探讨了miR-148a和miR-200b及其靶基因对脂肪细胞增殖和分化的影响。研究结果为进一步了解miRNAs调控绵羊脂肪细胞分化和脂质沉积的机制提供基础数据,为改良绵羊肉品质奠定理论基础。
孙红梅[5](2020)在《桑树(Morus alba)三个干旱诱导基因的表达规律及MaCDSP32基因的功能分析》文中指出桑树(Morus alba)根系发达,枝繁叶茂,生命力旺盛,具有较强的环境适应性,因此在世界范围内分布广泛。在我国,桑树作为生态防护林选用树种,可起到防沙固土,减少地表径流,保持原生态土壤结构的作用。另一方面,因桑树生长迅速,地上部分生物量大,被应用到自然生态修复系统中,例如修复被重金属污染的土壤、多石的贫瘠荒漠以及戈壁沙漠化区域等。桑树具有顽强的生存能力,源于其所拥有的独特生理特性,近年来在植物遗传学应用领域备受关注,涉及桑树抗逆基因资源挖掘及开发利用等研究。本研究从桑树中克隆得到3个干旱差异表达基因:叶绿体干旱胁迫诱导蛋白编码基因(chloroplast drought-induced stress protein of 32 k Da,Ma CDSP32),IAA-氨基酸水解酶编码基因(ILR1-5(IAA-amino acid hydrolase ILR1-like 5,Ma ILR1)和抗坏血酸过氧化物酶(ascorbate peroxidase,Ma APX2))进行基因克隆、表达分析及基因功能分析,通过对目标序列的生物信息学分析、表达特性分析、转基因植株的抗逆性分析以及在干旱胁迫下的转录组数据分析,实现对目标基因在植物响应环境胁迫条件下分子功能的探索,为在未来以生物技术工程为手段改善植物的环境适应性和在实际生产中发挥桑树品种质资源优势等工作铺垫基石。本研究取得的主要结果如下:1.三个基因的克隆及亚细胞定位桑树中Ma CDSP32、Ma ILR1和Ma APX2基因的编码区长度分别为909 bp、1302 bp和750bp,分别编码303、434和250个氨基酸。预测结果显示,三个编码蛋白的亲水性和稳定性良好。Ma CDSP32编码的蛋白质定位在叶绿体基质中;Ma APX2编码的蛋白酶定位在细胞质内,主要富集在细胞膜和细胞核附近;Ma ILR1编码一个膜蛋白,为分泌型蛋白,定位在细胞膜上。2.三个基因在不同生长条件下的表达模式Ma CDSP32基因主要在桑树成熟叶片中表达,在桑树不同种间具有表达偏好性,但与基因组倍性无关;一天内,Ma CDSP32在15:00时达到表达高峰,呈生物钟节律表达规律;非生物胁迫和外源激素可诱导Ma CDSP32表达水平发生变化,但在叶片和根中表达模式不同。Ma ILR1基因主要在幼叶中表达,在桑树不同种间具有表达偏好性,但与基因组倍性无关;Ma ILR1无明显生物钟表达规律;非生物胁迫和外源激素可诱导Ma ILR1表达水平发生变化,但在叶片和根中表达模式不同。Ma APX2基因在地上部分表达量一致,在桑树不同种间具有表达偏好性,但与基因组倍性无关;一天内,Ma APX2在12:00时达到表达高峰,呈生物钟节律表达规律;非生物胁迫和外源激素可诱导Ma APX2表达水平发生变化,但在叶片和根中表达模式不同。3.Ma CDSP32瞬时表达桑叶的基因功能研究瞬时过表达Ma CDSP32的离体桑叶相比于未转化桑叶,在自然晾干过程中失水量增加。PEG模拟的水分胁迫下,桑叶中Ma MRSB、Ma P5CS、Ma PRX、Makds A、Ma DREB和Ma MAPK基因的表达水平以及ROS的积累量受Ma CDSP32过表达影响发生改变;盐胁迫下,桑叶中Ma WRKY、Makds A、Ma DREB和Ma MAPK基因的表达水平也受到Ma CDSP32过表达影响发生改变。这些结果表明Ma CDSP32会影响胁迫相关基因的表达水平,并参与植物非生物胁迫应答过程。4.Ma CDSP32在转基因烟草中的基因功能研究Ma CDSP32稳定转化烟草获得的转基因株系(OE-2和OE-7)与野生型烟草相比,在自然晾干过程其离体叶片失水量增加。转基因烟草对干旱敏感性增加,叶片中ROS积累和MDA含量增加,多种抗氧化酶活性降低,脯氨酸和可溶性糖积累减少;但复水后转基因植株的生长恢复能力增强,ROS积累减少,MDA含量减少,多种抗氧化酶活性增强,脯氨酸和可溶性糖积累增加。胁迫期间,转基因植株中Nt CAT、Nt ADC2、Nt LEA5和Nt MSRB基因的表达水平相对野生型发生改变。此外,Ma CDSP32通过促进转基因烟草种子和幼苗中Nt MSRB表达上调,减少ROS积累,显着增加了种子在渗透胁迫下的萌发率和幼苗生长。在盐胁迫下,叶绿素含量在Ma CDSP32转基因植株中增加,而在野生型植株中减少。这些结果揭示Ma CDSP32主要是通过参与氧化还原途径调节植物的抗逆性。5.Ma CDSP32在转基因拟南芥中的基因功能研究Ma CDSP32转基因拟南芥株系(OE-3和OE-9)与野生型拟南芥和At CDSP32突变拟南芥株系(mt-1和mt-2)相比,在干旱胁迫期间OE株系萎蔫较严重,ROS积累和MDA含量较多,SOD、POD和APX抗氧化酶活性较低。但OE株系相比野生型和突变体株系,在复水后成活率较高。在干旱和盐胁迫下,植株中不同Ma CDSP32或At CDSP32表达水平会影响At SOD、At POD、At CAT、At PRX、At APX2和At GR基因的表达水平。盐胁迫处理后,突变体株系的叶绿素含量相比野生型和OE株系降低。在渗透胁迫下OE拟南芥种子的萌发率较野生型和突变体种子显着增加。此外,OE拟南芥株系出现早花现象,其中At SOC1基因表达较野生型和突变体显着上调。这些结果表明Ma CDSP32主要是通过参与逆境应答的氧化还原途径影响植物的逆境生理和种子萌发过程,且Ma CDSP32通过影响At SOC1基因表达参与植物开花时间调节。6.Ma CDSP32过表达烟草干旱胁迫转录组学分析转基因烟草的转录组数据分析显示,在干旱处理期间,OE与WT株系差异表达基因主要集中在催化活性、核酸结合转录、转录因子活性、光合作用相关膜组件、糖类代谢进程和肽链内切酶调节因子酶活性等生理过程方面;复水后,OE与WT株系差异表达基因主要集中在高分子生物合成、氮化合物生物合成、催化活性和水解酶活性等生理过程方面。进一步分析发现,这些差异表达基因在苯丙素的生物合成、光合作用-触角蛋白、角质素,软木脂和蜡质的生物合成、核糖体和光合系统的固碳作用等通路中上调基因最多;这些差异表达基因在内质网蛋白加工、半乳糖代谢、倍半萜和三萜生物合成和脂肪酸延伸等通路中下调基因最多。此外,与WT株系相比,OE株系中在半胱氨酸和甲硫氨酸代谢途径、淀粉和糖类代谢途径、油菜素类固醇代谢途径、植物激素信号传导代谢途径和光合元件固碳作用代谢途径,以及抗氧化酶活性、脯氨酸合成代谢和糖合成代谢等方面所涉及的差异表达基因均出现干旱期间下调而复水后上调的变化趋势。推测这些差异表达基因是Ma CDSP32基因在干旱期间和复水后参与调节植物抗旱性相互作用的关键位点。综上,本研究得到的主要结果表明,桑树中的干旱持续表达基因Ma CDSP32通过参与植物抗逆过程中的ROS代谢调节过程,增强了植株的抗旱性,揭示了Ma CDSP32参与提高植物旱后恢复能力的分子机制。这项研究为桑树品种质资源优势的开发利用筛选了基因资源,为以分子生物技术手段改善植物的环境适应性和生存能力提供了新思路。
戴佳锟[6](2019)在《基于纳米微球的脂联素高聚体模型构建及功能研究》文中提出脂联素是由脂肪组织分泌的细胞因子,与糖尿病、肥胖和代谢综合征等密切相关,在心血管疾病、癌症、非酒精性脂肪肝等多种疾病的病程中发挥着积极的保护作用。脂联素在体内有单体、三聚体、高聚体以及球型核心区域等多种存在形态,且不同形态的功能和作用方式不尽相同。其中,脂联素高聚体由18个或更多单体通过尾部交联聚合而成,在多方面具有最强的生物学活性。因脂联素高聚体空间结构较为复杂,一直未能够在体外获得,极大限制了其相关研究。鉴于此,本研究尝试以纳米微球为载体,在体外构建一种具备生物学活性的脂联素高聚体模型。研究中首先制备具有锚定功能的脂联素融合蛋白;然后优选兼具生物相容性和降解性的高分子聚合材料,并将其制备成稳定性好、分散性强的纳米级微球颗粒;最后,将融合蛋白与纳米微球孵育结合,通过脂联素融合蛋白尾部的锚定作用,将数个单体蛋白聚集,模拟脂联素高聚体结构。随后对其生物活性进行验证并进一步挖掘脂联素高聚体的生物学功能。研究取得如下结果:1、独创性的设计融合蛋白和脂联素高聚体模型。融合蛋白中引入具有延展性的链接序列使得脂联素功能区域更利于分布于纳米微球表面。根据生物信息学分析,融合蛋白结构和特性符合设计预期,具备有效锚定于纳米微球表面并展现完整生物学活性的可行性。2、构建了四个表达体系用于获得目的蛋白。为了获得活性和产量均优异的目的蛋白,研究中构建了目前应用最为广泛的四个表达体系。经过多次不同方法的筛选,最终确定以杆状病毒-昆虫表达系统合成目的蛋白。经检测,脂联素和融合蛋白表达量分别为1.8和2.3 mg/L,生物活性优良。3、制备纳米微球及高聚体模型。优选6种生物相容性和降解性优异的高分子聚合材料,通过溶剂挥发法和超声乳化法制备纳米级微球。然后在多种复合条件下制备数种高聚体模型,并以粒径、Zeta电位以及扫描电镜检测、筛选,最终通过PLA、PLGA和PHB三种材料得到符合试验要求的高聚体模型。4、细胞和动物试验证实脂联素高聚体模型具有基本的生物学活性。通过在ob/ob小鼠中对NF-κB和AMPK等指标的检测验证以及细胞试验的辅助证明,确认成功构建了两种具有脂联素高聚体生物学活性的聚合体模型。5、探讨脂联素高聚体与AKT激活的作用关系。通过对AMPK、PI3K、T-钙黏蛋白和AKT等指标的检测分析,确定了脂联素单体和脂联素高聚体对AKT激活的影响。脂联素单体既可激活AMPK(主要通路),也可激活PI3K,并从两个方向激活AKT;而脂联素高聚体则显着地通过活化PI3K从而激活AKT。6、探讨脂联素高聚体和T-钙黏蛋白表达的联系。在ob/ob小鼠骨骼肌和内皮细胞中,脂联素和脂联素高聚体均可温和的促进T-钙黏蛋白表达,脂联素较微弱,脂联素高聚体略强。研究证实,通过脂联素融合蛋白和纳米微球复合得到的脂联素高聚体模型具备相应的生物学功能,模型构建成功,为脂联素高聚体的后续研究提供支持。
张德荣[7](2019)在《脂联素及其受体介导绵羊肌内、内脏和皮下脂肪细胞生脂基因表达与分子调控机理研究》文中研究表明脂肪性状作为绵羊肉品质最重要的一个经济性状,在绵羊体内维持着正常生命活动以及在生理代谢中发挥着重要的作用。作为含量最高、唯一与肥胖呈负相关的脂肪细胞因子,脂联素在体内参与调节脂肪与糖代谢、维持能量平衡及抵抗胰岛素、抗消炎反应等生理过程。目前,有关绵羊脂联素及其受体基因在脂肪分化过程中作用的报道较少。本研究以兰州大尾羊为研究对象,利用RACE技术首次克隆了绵羊脂联素及其受体基因的全长c DNA序列,运用实时荧光定量PCR技术(q PCR)分析了绵羊脂联素基因、脂联素受体1和脂联素受体2基因在绵羊15种组织的表达规律;分离培养绵羊肌内、皮下和内脏组织的前脂肪细胞,研究了前体脂肪细胞在分化过程中脂联素及其受体、生脂基因脂蛋白脂肪酶(LPL)、激素敏感性脂肪酶(HSL)、脂肪酸合成酶(FAS)及过氧化物激活酶增值物受体α/γ(PPARα/γ)的表达;运用过表达和si RNA技术分析了脂联素受体对肌内前体脂肪细胞生脂的影响及相关生脂基因表达影响;应用pull-down技术和质谱分析,初步筛选出了与脂联素受体蛋白互作的蛋白,以期阐明绵羊脂联素及其受体介导绵羊肌内、内脏和皮下脂肪细胞生脂基因表达与分子调控机理,为现代肉羊育种体系中优良性状的筛选与利用提供理论依据。研究结果表明:1.应用RACE技术首次克隆出绵羊脂联素2010bp(KJ159213)、脂联素受体1基因2035bp(KJ159212)和脂联素受体2基因1809bp(KF921623)全长c DNA;q PCR研究了三种基因在绵羊肝脏、肾脏、心脏、肺脏、脾脏、皮下脂肪、内脏脂肪、肌肉、卵巢、睾丸、大肠、小肠、间脑、瘤胃和皱胃15种组织中的特异性表达,APN肌肉组织中表达最高,心脏和皱胃表达量次之;Adipo R1在皮下组织和内脏脂肪组织中的表达量最高,其次是脾脏、心脏、小肠;Adipo R2在皮下组织和内脏组织中表达量最高,在其他组织中表达量均很低,几乎不表达。2.应用Ⅰ型胶原酶消化法分离获得绵羊肝脏和皮下组织前体脂肪细胞,并用DMEM/F12+胰岛素(5μg/m L)+转铁蛋白(50μg/m L)+亚硒酸钠(5ng/m L)+氢化可的松(50ng/m L)将其诱导11天后能分化为内脏和皮下脂肪细胞;应用II型胶原酶消化法和差速贴壁法分离获得绵羊背最长肌肌内前体脂肪细胞,被DMEM/F12+IBMX(0.5 mmol/L)+DEX(1μmol/L)+Insulin(10 mg/L)诱导10 d后分化为肌内脂肪细胞。3种前体脂肪细胞分化过程中脂肪生成量逐渐增加,生长曲线均呈“S”型,第39 d为指数生长期。绵羊内脏和皮下前体脂肪细胞中LPL和PPARγ分化第7d和11d显着高于第3d(p<0.05),FAS基因第7天最高;脂联素及其受体基因在两种细胞中的表达水平差异不显着(p>0.05),但三个基因之间Adipo R2表达量最高(35.27),Adipo R1居中(5.24),APN最低(0.60)。类似地,绵羊肌内脂肪细胞中Adipo R2表达量极显着高于Adipo R1和APN(p<0.01),表达趋势也与3基因在内脏脂肪组织和皮下脂肪组织中相类似,但表达水平有所下降。LPL、PPARγ和FAS在肌内前体脂肪细胞诱导分化过程中的表达模式与内脏和皮下前体脂肪细胞相一致,表明Adipo Rs、LPL和PPARγ是脂肪细胞分化的早期标记基因。3.Adipo R1在绵羊肌内前体脂肪细胞分化过程中,能通过调节激素敏感性脂肪酶(HSL)和过氧化物激活酶增值物受体γ(PPARγ)表达在脂肪生成中起重要作用。(1)诱导分化后第7天,肌内前体脂肪细胞中的HSL和Adipo R1的m RNA表达水平降低,其余标志基因的m RNA表达增加,但对Adipo R2表达无显着影响;(2)过表达Adipo R1可显着降低肌肉前体脂肪细胞沉积,过表达Adipo R2对其脂肪沉积无显着影响。过表达Adipo R1后可增加HSL的表达,降低PPARγ表达,不影响FAS和PPARα的表达,而Adipo R2基因过表达后,对HSL、FAS、PPARα和PPARγ表达没有影响;(3)Adipo R1基因沉默,肌内前体脂肪细胞的体积增大,脂肪沉积含量增加,极显着地降低肌内前体脂肪细胞中HSL的表达,增加PPARγ表达,对FAS和PPARα表达无影响;Adipo R2基因沉默后,对肌内前体脂肪细胞体积与脂肪沉积含量没有显着影响,同时对HSL、FAS、PPARα和PPARγ表达也无影响;4.运用Pull-down技术和质谱分析表明,在绵羊内脏脂肪中L-乳酸脱氢酶(L-lactate dehydrogenase)和1-型长链脂酰辅酶A合成酶(Acyl-Co A synthetase long chain family member-1)能与Adipo R1互作;尾部脂肪中1-型长链脂酰辅酶A合成酶(Acyl-Co A synthetase long chain family member-1)能与Adipo R2互作,为进一步研究脂联素受体功能奠定了基础。综上所述,综上所述,Adipo R1在绵羊肌内前体脂肪细胞分化过程中,通过调节激素敏感性脂肪酶(HSL)和过氧化物激活酶增值物受体γ(PPARγ)的表达在脂肪生成中起重要作用,可作为重要遗传标记基因应用肉羊育种实践。
刘宁[8](2019)在《玉米大斑病菌漆酶基因家族鉴定及关键基因的功能解析》文中研究指明漆酶是一种多铜氧化酶,多以基因家族形式存在,编码不同活性的同工酶,参与真菌形态建成、宿主与病原互作、合成色素、应激反应等多种重要生物学过程,但由于漆酶家族成员众多及作用底物范围广泛,对其功能的阐释多为表型分析,对漆酶参与的生化途径了解较少。玉米大斑病菌(Setosphaeria turcica)是一种半活体子囊真菌,可以侵染玉米、高粱等作物,形成梭形病斑,影响植物光合作用从而降低产量。前期研究发现,玉米大斑病菌漆酶基因StLAC1、StLAC2影响病菌生长、发育及致病,本论文对玉米大斑病菌漆酶家族基因进行了系统鉴定,并在转录及蛋白水平上寻找关键基因,结合基因组学、代谢组学研究玉米大斑病菌中关键漆酶基因在病菌生长、发育及致病中的功能。得到以下结果:1.利用多铜氧化酶结构域的隐马尔可夫模型,在玉米大斑病菌基因组中鉴定得到了9个漆酶样多铜氧化酶,均含有保守的铜离子结合特征序列,但其蛋白氨基酸序列同源性低,仅为19.79%-48.70%,聚类在5个不同的超家族,其中Stlac1、Stlac2、Stlac4、Stlac6为子囊菌多铜氧化酶。在9个基因上游含有正向氮调控基因作用元件(NIT2)、正向调控过氧化物酶体蛋白基因作用元件(ADR1)、异物质响应元件(XRE)、负责碳代谢产物阻遏的元件(CRE-A)等多个顺式作用元件。利用转录组数据分析发现,玉米大斑病菌01-23菌丝中StLAC2、StLAC6的基因表达量最高,StLAC3较高,其余基因表达量均相对较低。漆酶家族蛋白酶活性和基因转录水平均受培养时间、碳源、氮源、铜离子、铁离子的影响,且在侵染的早期、中期和后期差异表达,除了StLAC6和StLAC8的表达量下降,其他基因在不同时期相对表达量均增加。2.利用Native-PAGE及MS检测玉米大斑病菌01-23中漆酶同工酶谱,发现Stlac1、Stlac2及Stlac6为主要表达的活性蛋白,其中Stlac2主要在胞内表达,Stlac1和Stlac6在胞内、胞外均可以检测到。在原核宿主Escherichia coli Rossetta中诱导表达以上蛋白,通过对IPTG浓度、诱导温度、初始菌液浓度、转速及铜离子进行优化,最终分离得到重组同工酶Stlac1、Stlac2及Stlac6,酶活分别为:1.058 U/mg、0.861U/mg和0.028 U/mg。对其酶学性质进行分析发现,重组漆酶均具有较低的最适pH(3-4.5)及较高的最适温度(60-70℃),金属离子对酶活的影响不同,但Fe3+对3种同工酶酶活都具有较强的激活作用。同时在真核宿主Pichia pastoris KM71H中表达的重组漆酶Stlac2活性丧失,推测其可能原因为Asn97位的不正确的糖基化导致。3.利用原生质体转化创制关键漆酶基因StLAC6基因敲除突变体,获得两个突变菌株,对其表型分析表明,StLAC6基因的缺失对病菌生长、形态、产孢及侵染能力并没有影响,但基因缺失后导致其对玉米感病品种致病性增加,粗毒素使叶片伤口褐化,黑色素合成增加,过氧化物酶体增加且形态异常,脂质体及产生的酚类物质含量增加。StLAC6基因的缺失导致StLAC1、StLAC4和StLAC5基因相对表达显着增加,同时影响StLAC6的邻近基因的表达,包括N乙酰转移酶、细胞色素P450单加氧酶及磷脂代谢相关的酶类的相关编码基因等。4.对玉米大斑病菌菌丝的代谢物提取方法进行了优化并利用超高效液相色谱串联飞行时间质谱对野生型菌株、ΔStLAC1、ΔStLAC6进行代谢组分析及化合物结构解析,结果显示,与野生型菌株相比,两个同工酶缺失引起病菌代谢物明显变化,StLAC1基因缺失引起的差异代谢物更多且大多数为其所特有的,而StLAC6基因缺失导致的差异代谢物多数是在两个突变体中共同变化的。利用ELISA酶联免疫检测定量测定了不同菌株中差异代谢物植物鞘氨醇、前列腺素PGE2和真菌毒素相关代谢物玉米赤霉醇、桔霉素等次级代谢产物含量,与代谢组学结果一致。5.代谢组学分析表明,同工酶Stlac1和Stlac6参与脂质及芳香类化合物尤其是聚酮化合物的合成,其中StLAC6基因缺失导致镰孢红素酮、桔霉素、双孢菌素等真菌毒素含量增加,影响真菌致病性;StLAC1缺失主要影响磷脂及类固醇类化合物合成,从而影响致病性及病菌形态;部分前列腺素类化合物在2个漆酶同工酶突变体中变化趋势相反。通过蛋白与差异代谢物分子对接及荧光滴定法证实,前列腺素PGE2和桔霉素是Stlac6的天然底物,核黄素是Stlac1的天然底物,漆酶直接参与其代谢途径;而漆酶不直接作用于磷脂及脂肪酸,但缺失引起磷脂及脂肪酸类等代谢物的变化,通过信号转导途径最终实现对病菌形态、黑色素合成及致病性的影响。
张亚冉[9](2017)在《SIRT2基因对牛前体脂肪细胞分化的作用及其转录调控机制研究》文中研究指明Sirtuins家族是调控动物生长发育、衰老及新陈代谢等多方面功能的一组烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(Nicotinamide adenine dinucleotide,NAD+)依赖的蛋白去乙酰化酶,是当今长寿与衰老、癌症及代谢紊乱疾病等相关领域的研究热点。哺乳动物Sirtuins家族包括7个成员,命名为SIRT1-SIRT7;它们有不同的亚细胞定位和功能。其中Sirtuin 2(SIRT2)主要位于胞浆,其通过作用于下游不同的靶蛋白底物在多个生理过程中发挥作用,包括脂肪细胞分化、脂肪酸氧化、胰岛素抵抗和葡萄糖异生等。但目前关于牛SIRT2基因对前体脂肪细胞分化的作用及其转录调控机制仍不清楚。本研究旨在利用腺病毒介导的过表达和干扰技术,从细胞和分子水平研究牛SIRT2基因对前体脂肪细胞分化的作用。通过利用生物信息学方法及双荧光素酶报告载体系统,分析牛SIRT2基因的启动子特征和活性,寻找牛SIRT2基因的核心启动子区域。在此基础上借助于定点突变、电泳迁移率变动分析(electrophoretic mobility shift assay,EMSA)和染色质免疫沉淀(chromatin immunoprecipitation,ChIP)技术,研究SIRT2基因的转录调控机制。主要研究成果如下:(1)克隆获得秦川牛SIRT2基因1173 bp的CDS区,共编码390个氨基酸。构建了牛SIRT2基因的腺病毒过表达载体,经过在HEK 293 A细胞系中包装和扩繁后得到高滴度腺病毒Ad-SIRT2。(2)利用HEK 293 A细胞系,筛选得到一条靶向干扰牛SIRT2基因的干扰效率为的74.7%的shRNA,命名为shRNA-1002。将其与腺病毒骨架载体重组后,在HEK 293A细胞系中包装和扩繁,获得高滴度重组腺病毒Ad-shRNA-1002。(3)利用酶消化法培养获得牛原代前体脂肪细胞。Real-time PCR检测病毒的有效性,结果表明,在牛前体脂肪细胞中Ad-SIRT2处理组比Ad-CMV-NC对照组的SIRT2mRNA表达量提高了316.3倍(P<0.01),而Ad-shRNA-1002处理组比Ad-shRNA-NC对照组的SIRT2 mRNA表达量降低了68.3%(P<0.01),表明Ad-SIRT2和Ad-shRNA-1002可分别成功介导牛SIRT2基因的过量表达和沉默。(4)油红O染色结果显示,在牛前体脂肪细胞中过量表达SIRT2基因,抑制细胞中脂滴的积累及前体脂肪细胞的分化。相反,干扰SIRT2基因,促进脂肪细胞中脂滴的累积及前体脂肪细胞的分化。(5)牛前体脂肪细胞诱导分化4 d时,real-time PCR检测过表达和干扰SIRT2基因后调控脂肪细胞分化的关键转录因子及脂滴代谢关键基因的表达情况。结果显示,过量表达SIRT2基因后,转录因子C/EBPα(CCAAT/enhancer-binding proteinα)和PPARγ(peroxisome proliferator-activated receptorγ)mRNA的表达量显着降低(P<0.05)。另外,PPARγ通路下游的脂滴代谢关键基因FABP4(fatty acid binding protein 4)、FAS(fatty acid synthase)和LPL(lipoprotein lipase)的表达量也显着下调(P<0.05)。反之,干扰SIRT2基因后,C/EBPα和PPARγmRNA的表达量显着上调,同样PPARγ通路下游的脂滴代谢关键基因FABP4、FAS和LPL的表达量也显着上调(P<0.05)。但是,不论过表达还是干扰SIRT2对转录因子C/EBPβ、C/EBPδ和SREBP1(sterol regulatory element binding protein 1)的表达无显着影响(P>0.05)。(6)利用5’末端cDNA快速扩增法,发现牛SIRT2基因存在多个转录起始位点,将位于翻译起始位点(ATG)上游85 bp处的鸟嘌呤残基“G”指定为“+1”,与GenBank提供的SIRT2 mRNA参考序列(NM001113531.1)的5’末端位点一致。(7)克隆获得牛SIRT2基因2017 bp(-1956/+61)的5’侧翼序列。5’末端逐段缺失片段的荧光素酶活性分析结果表明牛,牛SIRT2基因的核心启动子区位于-178/+4。生物信息学预测发现,核心启动子区-178/+4存在E2F1、SP1、YY1和XBP1等转录因子结合位点。但没有发现典型的真核启动子元件TATA box和CAAT box,即SIRT2启动子为无TATA box的启动子。(8)通过定点突变转录因子YY1结合位点,发现牛SIRT2基因启动子活性下降约60%(P<0.01)。进一步利用EMSA和ChIP技术分别在体外和体内证实YY1转录因子能够与牛SIRT2基因核心启动子区结合。以上研究结果表明,YY1促进牛SIRT2基因的转录。综上所述,牛SIRT2基因抑制前体脂肪细胞的分化。YY1通过结合于SIRT2核心启动子区正向调控牛SIRT2基因的转录活性。同时,根据之前报道以及本研究结果,绘制了一张YY1、SIRT2通路和PPARγ之间的调控网络草图。总之,本研究结果为解析牛SIRT2基因在牛脂肪细胞分化中的作用提供了科学依据,并在此基础上揭示了SIRT2的启动子特征和转录调控机制,拓宽了脂肪细胞分化相关基因的调控网络。研究结果不仅为深入研究及理解动物脂肪形成和沉积的复杂分子机理提供了理论依据,也为选育高品质肉牛良种奠定了一定的理论基础。
王建勇[10](2014)在《油茶种子脂肪酸代谢过程7个关键酶基因的克隆与功能研究》文中研究表明油茶(Camellia oleifera)是我国重要的木本食用油料树种,与油棕、油橄榄和椰子并称为世界四大木本食用油料树种,主要栽培分布于南方丘陵酸性红壤地区。茶油主要由油酸、亚油酸等不饱和脂肪酸组成,其含量一般在90%以上,是一种优质食用油。在油茶种子脂肪酸代谢的过程中,涉及到一系列调控生理生化代谢过程的酶和基因,其中包括参与饱和脂肪酸合成的装载酶-丙二酰单酰CoA:ACP转酰酶(MCAT),参与长链脂肪酸合成的脱水酶-3羟酰CoA脱水酶(HCD),参与脂肪酸p氧化的脂酰CoA脱氢酶(ACAD)、多功能蛋白(MFP)和脂酰CoA硫酯酶(ACOT),以及参与植物抗逆的醛脱氢酶(ALDH)和脂氢过氧化物裂解酶(HPL)。本研究是以国审油茶品种‘华硕’发育过程中的种子为材料,在已构建的转录组和表达谱数据库的基础之上,对上述这些关键酶基因进行全长cDNA克隆和生物信息学分析;构建表达载体和干扰载体,让相关基因在不同的宿主细胞进行表达;开展了油茶脂酰CoA脱氢酶基因、醛脱氢酶基因和脂氢过氧化物裂解酶基因等3个基因转录水平的表达研究。主要研究结果如下:1.油茶脂肪酸代谢过程中7个关键酶基因的克隆与序列分析。根据转录组分析数据,分别设计简并或特异引物,采用RACE技术,克隆到油茶脂肪酸代谢和抗逆的7条基因的全长cDNA序列:(1)CoMCAT基因cDNA全长为1867bp,GenBank登录号为KJ910337,含有1131bp的开放读码框,编码376个氨基酸,分子量为39.9797kDa,理论等电点pI为6.84,具有58个氨基酸长度的导肽;含有两个高度保守的基序“GQGXQ"和‘’GXSXG",它们分别位于nalonyl-CoA结合位点和ACP结合位点上;(2)CoHCD基因cDNA全长为1145bp,GenBank登录号为KJ910336,含有666bp的开放读码框,编码221个氨基酸,分子量为25.2045kDa,理论等电点pI为9.40;疏水残基占整个氨基酸残基的48.9%,是亲水性蛋白;具有四个比较明显的跨膜区和蛋白质酪氨酸磷酸酶基序"HGXXGXXRS";(3)CoACAD基因cDNA全长为2702bp,GenBank登录号为KJ910338,含有2487bp的开放读码框,编码828个氨基酸,分子量为92.4113kDa,理论等电点pI为8.47,具有两个比较明显的跨膜区和酪氨酸蛋白激酶活性位点“LVHGDFRIDNLVF",存在五个亚结构域即蛋白激酶域、氨基糖苷磷酸转移酶(APH)结合域、酯酰辅酶A脱氢酶N端域、酯酰辅酶A脱氢酶中心域和酯酰辅酶A脱氢酶C端域;(4) CoMFP基因cDNA全长为2541bp,GenBank登录号为KJ910342,含有2178bp的开放读码框,编码725个氨基酸,分子量为79.0333kDa,理论等电点pI为9.11,具有六个比较明显的跨膜区,存有ECH信号序列“VAAIDGLALGGGLEVAMA CHA"、HCDH信号序列"NCTGFAVNRMFFP YTQAAILLVERGV"、ECH基序‘’-N25-P26-P27”和磷酸结合基序“319G-X-G321-X-X-G324",且还具有相当保守的盐桥"Rsoo Nε和E638Oε”、“R500Nη1/n2和E6450ε1/ε2”及活性位点S428、H449、E461、N499、D523等,存在五个亚结构域即ECH结合域、3HCDHN端结合域、NAD(P)结合Rossmann-fold域、3HCDHC端结合域和6-磷酸葡糖酸脱氢酶结合域;(5)CoACOT基因cDNA全长为1588bp, GenBank登录号为KJ910339,含有1164bp的开放读码框,编码387个氨基酸,分子量为43.5478kDa,理论等电点pI为7.14,存有cNMP结合域1保守序列“VVREGEAGDGVYFIWDG",C端具有过氧化物酶体信号序列保守的三联肽“SKL”,存在环核苷酸结合域和类似于RmlC-jelly roll fold的结合域;(6)CoALDH基因cDNA全长为1809bp,GenBank登录号为KJ910340,含有1506bp的开放读码框,编码501个氨基酸,分子量为54.5137kDa,理论等电点pI为5.50,具有三个比较明显的跨膜区和36个氨基酸长度的细胞质基质转运肽,不仅含有醛脱氢酶基因家族的3个保守结构域即醛脱氢酶谷氨酸激活位点"LELGGKSP”、醛脱氢酶半胱氨酸激活位点‘’LYNKGEICVAGS"和辅酶结合位点"GFGPTAG",还具有保守十肽“VSLELGGKSP"及高度保守的“FTGSTE"、"GPWPR"和‘’IIPMNFP"等序列,存在醛脱氢酶域,是属于依赖于NAD的醛脱氢酶家族;(7)CoHPL基因cDNA全长为1648bp, GenBank登录号为KJ910341,含有1476bp的开放读码框,编码491个氨基酸,分子量为54.8581kDa,理论等电点pI为8.04,具有五个比较明显的跨膜区和由21个疏水氨基酸残基组成且富含脯氨酸的38个aa长度的叶绿体转运肽,含有细胞色素P450蛋白家族的4个保守结构域即结构域A(螺旋I区)"LFMLGFNAYGGYSIF"、结构域B(螺旋K区)‘’LSFDSVKEMELVKSFVYETLRLNPP"、结构域C"RDSKVFDDPEKFIFDRF-TKEK”和结构域D(血红素结合区)‘’PSESNKQCAAKDYVTLACL"2.油茶基因的原核表达。采用pET30a和BL21(DE3)原核表达体系,成功构建了pET30a-MCAT、pET30a-HCD、pET30a-ACAD、pET30a-MFP、pET30a-ACOT, pET30a-ALDH和pET30a-HPL的重组表达质粒,并分别获得了表观分子量约为4OkD、5kD、93kD、79kD、44kD、551D和55kD相应的目的蛋白。3.油茶基因ACAD,ALDH和HPL在油茶种子不同发育时期的相对表达量。采用实时荧光定量PCR分析了13个不同发育时期油茶种子中CoACAD、CoALDH和CoHPL相对表达量:(1)CoACAD基因在‘华硕’种子发育过程中有三个转录高峰,分别是在8月初、9月底和10月中旬;(2)CoALDH基因的表达出现了三个转录高峰,分别是在8月上中旬、9月底及10月中旬;(3)CoHPL基因高效地表达主要集中于8月,转录最高峰发生在8月初。4.油茶基因真核表达载体的构建及CoALIDH和CoHPL基因的遗传转化研究。分别构建了CoMCAT、CoHCD、CoACAD、CoMFP、CoACOT、CoALI)H和CoHPL的超表达载体和RNA干扰载体,CoALDH和CoHPL基因的真核表达载体农杆菌介导转化哥伦比亚野生型拟南芥,筛选都获得了T0代转基因拟南芥,经抗生素筛选和PCR检测均初步获得了转基因T1代阳性植株。
二、人过氧化物酶体增殖体激活受体γ2基因克隆及真核表达载体的构建与鉴定(论文开题报告)
(1)论文研究背景及目的
此处内容要求:
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景,再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题,并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例:
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
(2)本文研究方法
调查法:该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法:用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法:通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法:通过调查文献来获得资料,从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法:依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法:对研究对象进行“质”的方面的研究,这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法:通过具体的数字,使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法:运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法:这是社会科学用来分析社会现象的一种方法,从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法:通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、人过氧化物酶体增殖体激活受体γ2基因克隆及真核表达载体的构建与鉴定(论文提纲范文)
(1)基于mRNA-miRNA分析的牛乳脂代谢功能基因筛选及KLF6基因功能验证(论文提纲范文)
中文摘要 |
abstract |
英文缩写表 |
引言 |
第一篇 文献综述 |
第一章 KLF6 基因研究进展 |
1.1 KLF家族研究进展 |
1.2 KLF6 基因概述 |
1.3 KLF6 基因对动物脂质代谢的影响 |
第二章 转录组测序技术研究进展 |
2.1 转录组测序概述 |
2.2 转录组测序在动物脂质代谢研究中的应用 |
2.3 多组学联合分析方法在动物脂质代谢研究中的应用 |
第三章 代谢组学研究进展 |
3.1 代谢组学概述 |
3.2 代谢组学在动物脂质代谢的研究进展 |
第四章 基因编辑技术研究进展 |
4.1 基因编辑技术概况 |
4.2 CRISPR/Cas9 技术在动物脂质代谢研究中的应用 |
第二篇 研究内容 |
第一章 基于m RNA-mi RNA联合分析的牛乳脂代谢功能基因筛选与鉴定 |
1.1 试验材料 |
1.2 试验方法 |
1.3 结果 |
1.4 讨论 |
1.5 小结 |
第二章 KLF6 基因敲除细胞系构建及其对乳脂代谢的调控机制研究 |
2.1 试验材料 |
2.2 试验方法 |
2.3 结果 |
2.4 讨论 |
2.5 小结 |
第三章 KLF6 基因乳腺组织特异性敲除小鼠模型建立及其对乳脂代谢的调控作用 |
3.1 试验材料 |
3.2 试验方法 |
3.3 结果 |
3.4 讨论 |
3.5 小结 |
结论 |
参考文献 |
导师简介 |
作者简介及在学期间所获得的科研成果 |
致谢 |
(2)猪圆环病毒2型利用宿主细胞应激反应促进其自身复制的分子机制(论文提纲范文)
摘要 |
Abstract |
第一部分 文献综述 |
第一章 猪圆环病毒2 型研究进展 |
1 猪圆环病毒的分类 |
2 猪圆环病毒2 型基因组结构及其编码产物功能 |
3 猪圆环病毒2 型基因组的复制 |
4 猪圆环病毒2 型与细胞应激反应 |
第二章 HMGB1 蛋白的研究进展 |
1 HMGB1 蛋白的发现与分类 |
2 HMGB1 蛋白的基本结构 |
3 HMGB1 蛋白的功能 |
4 HMGB1 蛋白的核-质穿梭和释放 |
5 HMGB1 与病毒感染 |
第三章 内质网应激与活性氧的相关研究进展 |
1 内质网应激及未折叠蛋白反应的信号通路 |
2 蛋白质氧化折叠与内质网活性氧的生成 |
3 内质网和线粒体与氧化应激之间的联系 |
第四章 本研究拟探索的科学问题 |
第二部分 试验研究 |
第一章 PCV2 与宿主蛋白HMGB1 的相互作用 |
1 引言 |
2 材料与方法 |
2.1 实验材料 |
2.2 质粒构建 |
2.3 病毒感染及药物处理 |
2.4 细胞转染 |
2.5 细胞核-质组分分离 |
2.6 实时荧光定量PCR |
2.7 病毒基因组DNA提取 |
2.8 免疫印迹 |
2.9 免疫荧光 |
2.10 统计分析 |
3 结果 |
3.1 PCV2 感染影响HMGB1 蛋白的核内外分布 |
3.2 PCV2 感染不影响HMGB1 蛋白的转录和翻译 |
3.3 核内HMGB1 负调控PCV2 复制 |
4 分析与讨论 |
第二章 HMGB1 蛋白通过与病毒基因组DNA结合抑制 PCV2 复制 |
1 引言 |
2 材料与方法 |
2.1 实验材料 |
2.2 HMGB1 蛋白不同截短片段的真核表达载体构建 |
2.3 病毒感染与质粒转染 |
2.4 细胞核-质组分分离 |
2.5 凝胶迁移实验 |
2.6 DNA结合蛋白免疫共沉淀 |
2.7 病毒基因组DNA提取与实时荧光定量PCR |
2.8 免疫印迹与免疫荧光 |
2.9 统计分析 |
3 结果 |
3.1 HMGB1与PCV2 基因组DNA的复制起始区相互作用 |
3.2 HMGB1 B box是抑制PCV2 复制的关键结构域 |
4 分析与讨论 |
第三章 PCV2 通过提高感染细胞内ROS促进HMGB1 蛋白出核和病毒自身复制 |
1 引言 |
2 材料与方法 |
2.1 实验材料 |
2.2 病毒感染及药物处理 |
2.3 细胞核-质组分分离 |
2.4 病毒基因组DNA提取与实时荧光定量PCR |
2.5 免疫印迹与免疫荧光 |
2.6 流式细胞术检测细胞内活性氧(ROS) |
2.7 统计分析 |
3 结果 |
3.1 胞内ROS能影响HMGB1 的亚细胞定位 |
3.2 H_2O_2促进HMGB1 出核并增强PCV2 复制 |
3.3 NAC阻断HMGB1 向核外转移并抑制 PCV2 复制 |
4 分析与讨论 |
第四章 PCV2 感染诱导内质网应激和氧化应激促进HMGB1 向核外转移 |
1 引言 |
2 材料与方法 |
2.1 实验材料 |
2.2 病毒感染及药物处理 |
2.3 细胞转染 |
2.4 细胞核-质组分分离 |
2.5 病毒基因组DNA提取与实时荧光定量PCR |
2.6 免疫印迹与免疫荧光 |
2.7 流式细胞术检测细胞内活性氧(ROS) |
2.8 统计分析 |
3 结果 |
3.1 PCV2 感染促进内质网ERO1α表达 |
3.2 PCV2 感染激活内质网应激(PERK)通路调控ERO1α表达 |
3.3 PCV2 利用PERK通路激活产生的ROS诱导HMGB1 出核促进自身复制 |
4 分析与讨论 |
第五章 PCV2 通过Rep和 Cap蛋白诱导内质网氧化还原稳态失衡和 HMGB1 核外转移的机制 |
1 引言 |
2 材料与方法 |
2.1 实验材料 |
2.2 PCV2 主要病毒蛋白及其半胱氨酸突变体的真核表达载体构建 |
2.3 病毒感染与质粒转染 |
2.4 细胞核-质组分分离 |
2.5 病毒基因组DNA提取 |
2.6 免疫印迹与免疫荧光 |
2.7 流式细胞术检测细胞内活性氧(ROS) |
2.8 重组病毒体外拯救 |
2.9 病毒滴度测定 |
2.10 统计分析 |
3 结果 |
3.1 Rep和 Cap蛋白能引起内质网ERO1α上调以及ROS的产生 |
3.2 Rep和 Cap蛋白的半胱氨酸残基参与内质网ROS的产生 |
3.3 Rep和 Cap蛋白促进HMGB1 向核外转移 |
3.4 Rep和 Cap的半胱氨酸残基影响细胞应激反应及病毒复制 |
4 分析与讨论 |
全文结论 |
创新性 |
展望 |
主要缩略词表 |
参考文献 |
作者简介 |
攻读博士期间科研成果 |
致谢 |
(3)ATG4B在DHA影响草鱼肾脏细胞脂质代谢中的作用分析(论文提纲范文)
摘要 |
ABSTRACT |
第一章 文献综述 |
1.1 细胞自噬的研究进展 |
1.1.1 细胞自噬基本过程及分类 |
1.1.2 调控自噬的信号通路 |
1.1.3 ATG4 家族的作用及功能 |
1.1.4 自噬在脂质代谢中的作用 |
1.2 DHA与细胞自噬 |
1.2.1 脂肪酸的简介 |
1.2.2 脂滴的合成与分解 |
1.2.3 DHA对细胞自噬的影响 |
1.3 鱼类细胞自噬的研究 |
1.4 鱼类肾细胞的研究 |
1.4.1 鱼类的肾脏 |
1.4.2 脂质对肾细胞的影响 |
1.5 本研究的目的意义 |
第二章 草鱼ATG4 家族基因的克隆及生物信息学分析 |
2.1 前言 |
2.2 材料与方法 |
2.2.1 试验鱼及样品采集 |
2.2.2 主要试剂和仪器 |
2.2.3 总RNA提取与反转录 |
2.2.4 引物设计合成检测 |
2.2.5 ORF扩增 |
2.2.6 PCR产物回收与DNA纯化 |
2.2.7 载体的连接、转化和筛选 |
2.2.8 生物信息学分析 |
2.2.9 组织表达谱分析 |
2.2.10 数据分析 |
2.3 结果 |
2.3.1 草鱼自噬相关基因ATG4 家族c DNA序列特征 |
2.3.2 草鱼自噬相关基因ATG4 家族氨基酸序列特征 |
2.3.3 草鱼自噬相关基因ATG4 家族氨基酸序列系统进化树分析 |
2.3.4 草鱼ATG4 四个亚型组织分布水平 |
2.4 讨论 |
第三章 ATG4 参与DHA影响CIK脂质代谢的过程 |
3.1 前言 |
3.2 材料与方法 |
3.2.1 试验材料 |
3.2.2 主要试剂 |
3.2.3 CIK细胞培养及处理 |
3.2.4 尼罗红和DAPI染色 |
3.2.5 甘油三酯的检测 |
3.2.6 荧光定量PCR |
3.2.7 蛋白质免疫印迹分析 |
3.2.8 数据分析 |
3.3 结果 |
3.3.1 DHA 诱导 CIK 细胞自噬和脂质蓄积 |
3.3.2 ATG4 不同亚型在DHA诱导CIK细胞自噬中的表达模式 |
3.3.3 自噬的激活/抑制可以降低/增加DHA诱导的脂质蓄积 |
3.4 讨论 |
3.4.1 DHA诱导CIK 细胞自噬和增加CIK 细胞脂质含量 |
3.4.2 DHA诱导CIK细胞中ATG4 不同亚型的表达 |
3.4.3 自噬影响DHA诱导CIK细胞的脂质蓄积 |
第四章 ATG4B参与DHA对 CIK脂质代谢的调控 |
4.1 前言 |
4.2 材料与方法 |
4.2.1 实验材料 |
4.2.2 主要试剂 |
4.2.3 表达载体的构建和转染 |
4.2.4 CIK和 HEK-293 细胞的培养及处理 |
4.2.5 荧光定量PCR |
4.2.6 蛋白质免疫印迹分析 |
4.2.7 数据分析 |
4.3 结果 |
4.3.1 草鱼ATG4B基因过表达载体的鉴定 |
4.3.2 草鱼ATG4B的亚细胞定位 |
4.3.3 ATG4B过表达对DHA调控CIK细胞自噬的影响 |
4.3.4 ATG4B过表达对DHA调控CIK细胞脂质代谢的影响 |
4.4 讨论 |
第五章 综合讨论与结论 |
5.1 综合讨论 |
5.2 主要结论 |
5.3 创新点 |
5.4 下一步研究计划 |
参考文献 |
附录 |
致谢 |
个人简介 |
(4)绵羊脂肪细胞分化中miRNAs的鉴定及miR-148a和miR-200b功能研究(论文提纲范文)
摘要 |
Summary |
缩略词表 |
第一章 文献综述 |
1 脂肪组织的研究进展 |
1.1 脂肪组织的分类和功能 |
1.2 影响脂肪沉积的遗传和营养因素 |
2 脂肪细胞的研究进展 |
2.1 脂肪细胞及其来源 |
2.2 前脂肪细胞的成脂分化 |
2.2.1 间充质干细胞的定向分化和前脂肪细胞的增殖 |
2.2.2 前脂肪细胞的分化和脂质积累 |
2.3 脂肪细胞增殖分化的调控因子 |
2.3.1 PPAR家族基因 |
2.3.2 C/EBP家族基因 |
2.3.3 EBF家族基因 |
2.3.4 E2F家族基因 |
2.3.5 Krüppel-like factor家族基因 |
2.3.6 固醇调节元件结合蛋白和糖原合成酶激酶-3β |
2.3.7 锌指蛋白 |
2.3.8 其他调控因子 |
3 哺乳动物miRNAs的基本特性 |
3.1 miRNAs的生成 |
3.2 miRNAs调控基因表达的机制 |
4 miRNAs调控脂肪生成的研究进展 |
4.1 miRNAs调节白色脂肪组织的功能 |
4.2 miRNAs调控间充质干细胞到前脂肪细胞系的定向分化 |
4.3 miRNAs调控前脂肪细胞的增殖和分化 |
5 本研究的目的与意义 |
第二章 材料与方法 |
1.试验材料 |
1.1 试验动物与样本采集 |
1.2 主要仪器设备 |
1.3 主要试剂及来源 |
2.试验方法 |
2.1 绵羊前脂肪细胞分离培养 |
2.1.1 绵羊前脂肪细胞的分离 |
2.1.2 绵羊前脂肪细胞诱导分化 |
2.2 苏木精-伊红染色 |
2.3 总RNA提取和逆转录定量PCR(RT-q PCR)分析 |
2.4 绵羊脂肪细胞分化中miRNAs鉴定和筛选 |
2.4.1 RNA-Seq文库构建和测序 |
2.4.2 数据质控 |
2.4.3 miRNAs表达分析和差异表达miRNAs的鉴定 |
2.4.4 差异表达miRNAs靶基因预测和功能富集分析 |
2.4.5 差异表达miRNAs RT-q RCR验证 |
2.5 miR-148a和 miR-200b对绵羊脂肪细胞分化的影响 |
2.5.1 miR-148a和 miR-200b的过表达和沉默 |
2.5.2 油红O染色 |
2.5.3 miR-148a和 miR-200b靶基因的预测和验证 |
2.5.4 靶基因PTEN和 KLF9 对绵羊脂肪细胞分化的影响 |
2.6 miR-148a和 miR-200b对绵羊前脂肪细胞增殖的影响 |
2.6.1 miR-148a和 miR-200b的过表达和沉默 |
2.6.2 细胞活力检测 |
2.6.3 EdU细胞增殖检测 |
2.6.4 细胞周期检测 |
2.6.5 miR-200b靶基因的预测和验证 |
2.6.6 靶基因p27 的功能验证 |
2.7 数据分析 |
第三章 结果与分析 |
1.绵羊前脂肪细胞的培养和诱导分化 |
1.1 绵羊前脂肪细胞的分化和油红O染色 |
1.2 脂肪生成标志基因表达分析 |
2.绵羊脂肪细胞分化中miRNAs的鉴定和筛选 |
2.1 绵羊脂肪细胞总RNA质量检测 |
2.2 RNA-Seq数据概述 |
2.3 已知miRNAs的鉴定 |
2.4 miRNAs的表达和主成分分析 |
2.5 不同分化时期绵羊脂肪细胞中差异表达miRNAs筛选 |
2.6 差异表达miRNAs表达趋势的聚类分析 |
2.7 差异表达miRNAs靶基因预测和功能富集分析 |
2.8 差异表达miRNAs的 RT-q PCR验证 |
3.miR-148a和 miR-200b对绵羊脂肪细胞分化的影响 |
3.1 miR-148a和 miR-200b的表达特征 |
3.1.1 miR-148a和 miR-200b在绵羊不同组织中的表达特征 |
3.1.2 miR-148a和 miR-200b在绵羊脂肪组织不同发育阶段中的表达特征 |
3.1.3 miR-148a和 miR-200b在绵羊脂肪细胞分化中的表达特征 |
3.2 miR-148a和 miR-200b调控绵羊脂肪细胞分化 |
3.2.1 miR-148a促进绵羊脂肪细胞分化 |
3.2.2 miR-148a靶向PTEN的3?UTR区域 |
3.2.3 PTEN抑制绵羊脂肪细胞的分化 |
3.2.4 miR-200b抑制绵羊脂肪细胞分化 |
3.2.5 miR-200b靶向抑制KLF9 的表达 |
3.2.6 KLF9 促进绵羊前脂肪细胞的成脂分化 |
4.miR-148a和 miR-200b对绵羊前脂肪细胞增殖的影响 |
4.1 miR-148a抑制绵羊前脂肪细胞增殖 |
4.2 miR-200b促进绵羊前脂肪细胞增殖 |
4.3 miR-200b在绵羊脂肪细胞中靶向结合p27 并抑制其表达 |
4.4 p27 抑制绵羊前脂肪细胞的增殖 |
第四章 讨论 |
1.绵羊前脂肪细胞的培养和诱导分化 |
2.绵羊脂肪细胞分化中miRNAs的鉴定和筛选 |
3.miR-148a和 miR-200b对绵羊脂肪细胞分化的影响 |
4.miR-148a和 miR-200b对绵羊前脂肪细胞增殖的影响 |
第五章 结论 |
第六章 创新与展望 |
1 创新点 |
2 需要继续研究的内容 |
参考文献 |
致谢 |
作者简介 |
导师简介(一) |
导师简介(二) |
附录 |
(5)桑树(Morus alba)三个干旱诱导基因的表达规律及MaCDSP32基因的功能分析(论文提纲范文)
摘要 |
ABSTRACT |
第一章 文献综述 |
1.1 干旱对植物生长的影响 |
1.2 植物抗旱性的研究进展 |
1.2.1 植物的抗旱性与旱后复水恢复生长的调节机制 |
1.2.2 植物的抗旱性评价体系及提高植物抗逆性的需求和措施 |
1.3 植物非生物胁迫下的氧化还原调节系统 |
1.3.1 非生物胁迫对植物氧化还原系统的影响 |
1.3.2 非生物胁迫下植物细胞中ROS的产生和代谢 |
1.4 植物硫氧还蛋白家族(Trxs)及其广泛作用 |
1.4.1 Trxs功能概况 |
1.4.2 叶绿体中的Trxs系统 |
1.4.3 叶绿体中一种类硫氧还蛋白-CDSP32 |
1.5 植物胞质抗坏血酸过氧化物酶(APX)研究进展 |
1.6 植物生长素氨基酸水解酶家族(ILR-like)研究进展 |
1.7 参与植物抗逆性几种胁迫应答因子的研究进展 |
1.7.1 脯氨酸参与抗逆性的研究进展 |
1.7.2 甜菜碱参与抗逆性的研究进展 |
1.7.3 可溶性糖类参与抗逆性的研究进展 |
1.7.4 脱落酸(ABA)参与抗逆性的研究进展 |
1.7.5 超氧化物歧化酶(SOD)参与抗逆性的研究进展 |
1.8 桑树抗逆性及资源应用研究进展 |
1.8.1 古老的桑树物种及其生存能力 |
1.8.2 桑树资源应用发展现状 |
1.8.3 桑树抗旱性分子机制研究进展 |
1.9 本研究前期工作基础和技术依据 |
1.9.1 前期工作基础 |
1.9.2 技术流程 |
第二章 桑树中MaCDSP32、MaILR1和MaAPX2 基因克隆和序列分析 |
2.1 引言 |
2.2 试验材料 |
2.2.1 植物材料 |
2.2.2 主要仪器设备 |
2.2.3 主要试剂及菌株 |
2.3 试验方法 |
2.3.1 桑树叶片总RNA提取与鉴定 |
2.3.2 桑树叶片cDNA合成 |
2.3.3 基因克隆 |
2.3.4 序列的生物信息学分析 |
2.4 结果与分析 |
2.4.1 桑树中三个基因编码区克隆及测序 |
2.4.2 核酸和氨基酸序列的生物信息学分析 |
2.4.3 编码蛋白的系统发育树分析 |
2.4.4 GO(Gene ontology)数据库预测目标基因功能 |
2.5 小结 |
第三章 MaCDSP32、MaILR1和MaAPX2 的表达模式分析及多克隆抗体制备 |
3.1 引言 |
3.2 试验材料 |
3.2.1 植物材料与胁迫处理 |
3.2.2 主要试剂耗材及仪器 |
3.3 试验方法 |
3.3.1 总RNA提取和反转录cDNA |
3.3.2 基因定量引物设计 |
3.3.3 实时荧光定量qRT-PCR |
3.3.4 叶片含水量测定 |
3.3.5 脯氨酸含量测定 |
3.3.6 原核表达载体的构建 |
3.3.7 多克隆抗体制备 |
3.3.8 多克隆抗体效价检测 |
3.3.9 数据统计分析 |
3.4 结果与分析 |
3.4.1 基因在桑树地上部分组织的表达规律 |
3.4.2 基因在不同桑树品种中的表达规律 |
3.4.3 基因在桑树中的生物钟节律表达规律 |
3.4.4 盐胁迫对基因表达水平的影响 |
3.4.5 高温胁迫对基因表达水平的影响 |
3.4.6 水分胁迫对基因表达水平的影响 |
3.4.7 施加外源ABA对基因表达水平的影响 |
3.4.8 施加外源乙烯利对基因表达水平的影响 |
3.4.9 施加外源水杨酸对基因表达水平的影响 |
3.4.10 氨基酸序列的抗原性分析 |
3.4.11 基因表达与蛋白纯化 |
3.4.12 多克隆抗体效价检测 |
3.5 小结 |
第四章 MaCDSP32、MaILR1和MaAPX2 的瞬时表达分析 |
4.1 引言 |
4.2 试验材料 |
4.3 试验方法 |
4.3.1 植物表达载体构建 |
4.3.2 重组质粒转化农杆菌 |
4.3.3 基因瞬时转化桑叶的处理方式 |
4.3.4 qRT-PCR检测基因表达量 |
4.3.5 叶片中H_2O_2和O_2~-的含量测定 |
4.3.6 转化烟草的亚细胞定位分析 |
4.3.7 数据统计分析 |
4.4 结果与分析 |
4.4.1 基因瞬时转化浸染后离体桑叶的状态 |
4.4.2 基因产物的亚细胞定位 |
4.4.3 瞬时表达MaCDSP32 基因对离体桑叶持水能力的影响 |
4.4.4 MaCDSP32 瞬时表达离体桑叶的自然失水情况 |
4.4.5 NaCl胁迫下离体桑叶气孔开度的变化 |
4.4.6 PEG胁迫下离体桑叶气孔开度的变化 |
4.4.7 PEG处理下胁迫相关基因表达量的变化 |
4.4.8 NaCl处理下胁迫相关基因表达量的变化 |
4.4.9 基因产物的亚细胞定位确认 |
4.5 小结 |
第五章 桑树MaCDSP32 转化烟草的功能研究 |
5.1 引言 |
5.2 试验材料 |
5.2.1 植物材料和生长条件 |
5.2.2 主要试剂和耗材 |
5.2.3 主要仪器 |
5.3 试验方法 |
5.3.1 叶盘法转化烟草及转基因烟草鉴定 |
5.3.2 MaCDSP32 表达产物亚细胞定位 |
5.3.3 转基因烟草非生物胁迫处理 |
5.3.4 转基因烟草种子萌发和幼苗生长处理 |
5.3.5 丙二醛、脯氨酸、可溶性糖和甜菜碱含量测定 |
5.3.6 叶片中ROS的组织定位和含量测定 |
5.3.7 SOD、APX、POD和 CAT抗氧化酶活性测定 |
5.3.8 光合作用气体交换参数测定 |
5.3.9 叶绿色素含量测定 |
5.3.10 数据统计分析 |
5.4 结果与分析 |
5.4.1 CDSP32序列在桑树和烟草中的同源性比对 |
5.4.2 阳性转基因烟草PCR鉴定 |
5.4.3 MaCDSP32 表达产物的亚细胞定位 |
5.4.4 MaCDSP32 对转基因烟草抗逆性的影响 |
5.5 小结 |
第六章 桑树MaCDSP32 转化拟南芥的功能研究 |
6.1 引言 |
6.2 试验材料 |
6.2.1 植物材料和生长条件 |
6.2.2 主要试剂和耗材 |
6.2.3 主要仪器 |
6.3 试验方法 |
6.3.1 构建MaCDSP32 过表达拟南芥植株 |
6.3.2 突变体拟南芥T-DNA插入鉴定 |
6.3.3 转基因拟南芥种子胁迫处理 |
6.3.4 转基因拟南芥植株非生物胁迫处理 |
6.3.5 生理生化指标测定 |
6.3.6 拟南芥叶片气孔开度测量 |
6.3.7 数据统计分析 |
6.4 结果与分析 |
6.4.1 MaCDSP32和AtCDSP32 序列同源性分析 |
6.4.2 AtCDSP32 突变体拟南芥植株鉴定 |
6.4.3 转基因拟南芥株系在非生物胁迫下的抗逆性分析 |
6.4.4 干旱胁迫对转基因拟南芥气孔开度的影响 |
6.4.5 非生物胁迫对转基因拟南芥抗氧化物酶活性的影响 |
6.4.6 非生物胁迫对拟南芥抗氧化物酶编码基因表达量的影响 |
6.4.7 渗透胁迫对拟南芥种子萌发及幼苗生长的影响 |
6.4.8 MaCDSP32 过表达拟南芥植株的早花现象 |
6.5 小结 |
第七章 MaCDSP32 转基因烟草干旱胁迫转录组数据分析 |
7.1 引言 |
7.2 试验材料 |
7.2.1 植物材料 |
7.2.2 胁迫处理方式及取样 |
7.3 试验方法 |
7.3.1 样品转录组文库构建 |
7.3.2 上机测序 |
7.3.3 信息分析流程 |
7.4 结果与分析 |
7.4.1 OE和WT烟草干旱样品转录组数据总体分析 |
7.4.2 OE和WT烟草干旱转录组样品差异表达基因分析 |
7.4.3 OE和WT烟草干旱转录组差异表达基因维恩图 |
7.4.4 OE和WT烟草干旱转录组差异表达基因聚类热图 |
7.4.5 OE和WT烟草干旱差异表达基因GO富集分析 |
7.4.6 OE和WT烟草复水差异表达基因KEGG通路分析 |
7.4.7 半胱氨酸和甲硫氨酸代谢途径差异基因KEGG通路分析 |
7.4.8 淀粉和糖代谢途径差异基因KEGG通路分析 |
7.4.9 油菜素类固醇代谢途径差异基因KEGG通路分析 |
7.4.10 植物激素信号传导代谢途径差异基因KEGG通路分析 |
7.4.11 光合元件固碳作用代谢途径差异基因KEGG通路分析 |
7.4.12 硫代谢途径差异基因KEGG通路分析 |
7.5 干旱和复水相反生理参数涉及差异表达基因GO富集分析 |
7.6 小结 |
第八章 结论 |
8.1 本研究总结 |
8.2 本研究创新点 |
8.3 有待进一步研究的问题 |
参考文献 |
附录 |
致谢 |
个人简历 |
(6)基于纳米微球的脂联素高聚体模型构建及功能研究(论文提纲范文)
摘要 |
ABSTRACT |
英文缩略表 |
第一章 绪论 |
1.1 细胞因子——脂联素 |
1.1.1 脂联素的发现及作用 |
1.1.2 脂联素的分子构成与表达分泌 |
1.1.3 脂联素的受体及其相关信号通路 |
1.1.4 脂联素的生物学功能 |
1.2 基于脂联素的治疗药物开发 |
1.3 脂联素和脂联素高聚体 |
1.3.1 不同形态脂联素的丰度差异和功能特性 |
1.3.2 脂联素高聚体的功能特性 |
1.4 聚合物及聚合物微球 |
1.4.1 医用聚合物材料 |
1.4.2 微球和聚合物微球 |
1.4.3 微球和聚合物微球的体内代谢和生物安全性 |
1.4.4 聚合物微球的制备 |
1.5 研究目的 |
第二章 体外模拟脂联素高聚体的模型设计和分析 |
2.1 前言 |
2.2 材料与方法 |
2.3 结果与分析 |
2.3.1 脂联素高聚体模型设计及制备方法 |
2.3.2 融合蛋白的基因设计 |
2.3.3 基因优化 |
2.3.4 融合蛋白基本性质分析 |
2.4 讨论 |
第三章 脂联素及融合蛋白合成体系构建 |
3.1 前言 |
3.1.1 原核表达系统 |
3.1.2 酵母表达系统 |
3.1.3 哺乳动物细胞表达系统 |
3.1.4 杆状病毒-昆虫细胞表达系统 |
3.2 材料与方法 |
3.2.1 试剂耗材 |
3.2.2 仪器设备 |
3.2.3 培养基及实验试剂配制 |
3.2.4 构建原核表达系统 |
3.2.5 构建酵母表达体系 |
3.2.6 构建哺乳动物细胞表达体系 |
3.2.7 构建杆状病毒-昆虫细胞表达体系 |
3.2.8 检测脂联素及融合蛋白对MCF-7 细胞的作用 |
3.3 结果与分析 |
3.3.1 原核表达结果 |
3.3.2 酵母表达结果 |
3.3.3 哺乳动物细胞表达 |
3.3.4 杆状病毒-昆虫表达结果 |
3.3.5 四种表达体系表达量检测 |
3.3.6 脂联素及融合蛋白对MCF-7 细胞的作用 |
3.4 讨论 |
3.4.1 各表达系统的分析对比 |
3.4.2 目的蛋白生物学活性分析 |
第四章 以微球为载体构建脂联素高聚体模型 |
4.1 前言 |
4.1.1 聚合物微球的常用制备技术 |
4.1.2 聚合物微球在医药领域的应用 |
4.2 材料与方法 |
4.2.1 试验材料与试剂 |
4.2.2 试剂配制 |
4.2.3 仪器设备 |
4.2.4 微球制备方法 |
4.2.5 微球样品透析处理 |
4.2.6 微球的检测 |
4.2.7 场发射扫描电子显微镜检测与分析 |
4.2.8 蛋白样品制备 |
4.2.9 微球-蛋白质复合体的制备及检测 |
4.3 结果与分析 |
4.3.1 单乳液-乳化溶剂挥发法制备微球 |
4.3.2 超声乳化法制备微球 |
4.3.3 优化纳米微球制备条件 |
4.3.4 多种微球载体为核心的脂联素多聚体模型构建 |
4.3.5 场发射扫描电子显微镜检测 |
4.4 讨论 |
4.4.1 粒径检测偏差和原始相关性分析 |
4.4.2 不同微球的分散性和成球性分析 |
4.4.3 复合体的载量和稳定性 |
第五章 脂联素高聚体模型验证及功能研究 |
5.1 前言 |
5.1.1 脂联素与瘦素和胰岛素 |
5.1.2 脂联素与AKT激活 |
5.1.3 瘦素基因敲除小鼠 |
5.2 材料与方法 |
5.2.1 相关材料及试剂 |
5.2.2 样品制备 |
5.2.3 细胞周期检测 |
5.2.4 小鼠饲喂管理 |
5.2.5 敲除小鼠试验前验证 |
5.2.6 小鼠给药方案 |
5.2.7 小鼠各组织材料分离及采集 |
5.2.8 Western Blot检测 |
5.2.9 免疫组化检测 |
5.2.10 Western Blot和免疫组化检测指标 |
5.3 结果与分析 |
5.3.1 基因敲除小鼠的基础验证 |
5.3.2 脂联素高聚体模型的功能验证 |
5.3.3 脂联素高聚体在内皮细胞中的作用 |
5.3.4 脂联素高聚体对肿瘤细胞的作用 |
5.3.5 脂联素高聚体在糖代谢中的作用 |
5.3.6 脂联素高聚体作用下的AKT激活分析 |
5.4 讨论 |
5.4.1 微球载体的生物学影响 |
5.4.2 PLA3-FA的结构和功能分析 |
5.4.3 脂联素高聚体模型间的差异对比 |
5.4.4 脂联素高聚体和T-钙黏蛋白 |
5.4.5 “脂联素”和AKT |
5.4.6 “脂联素”和血糖 |
结论 |
参考文献 |
攻读博士学位期间取得的科研成果 |
致谢 |
作者简介 |
(7)脂联素及其受体介导绵羊肌内、内脏和皮下脂肪细胞生脂基因表达与分子调控机理研究(论文提纲范文)
中文摘要 |
Summary |
缩略语表 |
第一章 文献综述 |
1.1 脂联素 |
1.2 脂联素受体(Adiponectin Receptor) |
1.3 脂联素及其受体在畜禽业的研究进展 |
1.4 脂联素及其受体信号传导 |
1.5 目的及意义 |
第二章 绵羊脂联素及其受体基因全长c DNA基因克隆及其组织特异性表达研究 |
2.1 材料与方法 |
2.2 数据分析 |
2.2.1 信息学分析 |
2.2.2 数据分析 |
2.3 结果 |
2.3.1 RNA完整性检测 |
2.3.2 PCR克隆 |
2.3.3 脂联素及其受体基因结构分析 |
2.3.4 绵羊APN,AdipoR1和AdipoR2 基因组织特异表达研究 |
2.4 讨论 |
2.5 结论 |
第三章 绵羊肌内、内脏及皮下前体脂肪细胞分离培养及诱导分化研究 |
3.1 材料与方法 |
3.2 数据统计 |
3.3 结果 |
3.3.1 前体脂肪细胞的形态学观察 |
3.3.2 前体脂肪细胞的生长曲线 |
3.3.3 前体脂肪细胞的诱导分化 |
3.3.4 前体脂肪细胞在分化期细胞内脂肪含量的变化 |
3.3.5 前体脂肪细胞诱导分化过程中标志基因的表达 |
3.4 讨论 |
3.4.1 前体脂肪细胞体外分离培养体系构建 |
3.4.2 前体脂肪细胞生长特性 |
3.4.3 前体脂肪细胞增殖分化 |
3.5 结论 |
第四章 绵羊脂联素受体对肌内前体脂肪细胞分化的影响 |
4.1 材料与方法 |
4.1.1 试验动物 |
4.1.2 试验方法 |
4.2 数据统计 |
4.3 结果 |
4.3.1 肌内前体脂肪细胞的形态学观察 |
4.3.2 肌内前体脂肪细胞的生长曲线 |
4.3.3 肌内前体脂肪细胞诱导分化 |
4.3.4 脂联素受体1和2 的载体构建与验证 |
4.3.5 重组脂联素受体1 和受体2 转染 |
4.3.6 肌内前体脂肪细胞标志基因的表达 |
4.3.7 脂联素受体基因的沉默表达 |
4.3.8 脂联素受体基因的过表达 |
4.3.9 重组脂联素受体沉默表达和过表达对标志基因的影响 |
4.5 讨论 |
4.6 结论 |
4.6.1 重组脂联素受体基因与标志生脂基因的表达 |
4.6.2 重组脂联受体基因沉默对脂肪沉积效果 |
4.6.3 重组脂联受体基因过表达对脂肪沉积效果 |
4.6.4 重组脂联素受体基因沉默表达对标志基因分化的影响 |
4.6.5 重组脂联素受体基因过表达对标志基因分化的影响 |
第五章 绵羊脂联素受体蛋白表达纯化与互作蛋白的筛选 |
5.1 材料与方法 |
5.1.1 质粒和菌株 |
5.1.2 试验方法 |
5.2 结果与分析 |
5.2.1 小量表达SDS-PAGE检测 |
5.2.2 大量表达SDS-PAGE检测 |
5.2.3 脂肪组织总蛋白提取 |
5.2.4 重组蛋白纯化和复性检测 |
5.2.5 重组蛋白复性验证 |
5.2.6 重组蛋白捕获 |
5.2.7 蛋白检测 |
5.2.8 抗体检测 |
5.2.9 蛋白挂柱率检测 |
5.2.10 蛋白互作效应检测 |
5.2.11 质谱鉴定 |
5.3 讨论 |
5.4 结论 |
5.4.1 重组脂联素受体蛋白 |
5.4.2 脂肪组织总蛋白获取 |
5.4.3 互作蛋白诱饵钓取 |
5.4.4 互作蛋白筛选 |
结论 |
创新点与不足 |
参考文献 |
致谢 |
作者简介 |
导师简介 |
(8)玉米大斑病菌漆酶基因家族鉴定及关键基因的功能解析(论文提纲范文)
摘要 |
abstract |
1 引言 |
1.1 漆酶结构及性质 |
1.1.1 漆酶结构及催化机制 |
1.1.2 漆酶序列特征 |
1.1.3 漆酶的异源表达及酶学性质 |
1.2 漆酶的天然催化底物 |
1.2.1 黑色素相关二元酚类 |
1.2.2 木质素类化合物 |
1.2.3 其他多酚类物质 |
1.2.4 前列腺素等脂类化合物 |
1.3 漆酶基因家族及其功能 |
1.3.1 漆酶样多铜氧化酶多基因家族 |
1.3.2 漆酶基因家族的转录调控 |
1.3.3 漆酶基因功能 |
1.4 代谢组学在基因功能研究中的应用 |
1.4.1 代谢组学的研究方法 |
1.4.2 代谢组学研究基因功能 |
1.4.3 代谢组学活性筛选 |
1.5 本论文的目的及意义 |
2 漆酶样多铜氧化酶家族的全基因组鉴定及表达水平分析 |
2.1 材料和方法 |
2.1.1 供试菌株及植物 |
2.1.2 培养基及培养条件 |
2.1.3 LMCO的全基因组鉴定 |
2.1.4 玉米大斑病菌01-23中DNA提取及LMCO的基因扩增 |
2.1.5 LMCO的生物信息学分析 |
2.1.6 转录组测序鉴定LMCO表达量 |
2.1.7 玉米大斑病菌01-23的不同培养条件对LMCO基因表达的影响 |
2.1.8玉米活体接种玉米大斑病菌01-23 |
2.1.9 胞内、外漆酶粗酶液的制备 |
2.1.10 漆酶酶活的测定 |
2.1.11 RNA提取及cDNA合成 |
2.1.12 实时荧光定量PCR检测LMCO基因相对表达量 |
2.1.13 数据的统计分析 |
2.2 结果与分析 |
2.2.1 玉米大斑病菌01-23中LMCO的鉴定及序列特征 |
2.2.2 玉米大斑病菌中LMCO的同源性及分类 |
2.2.3 LMCO基因启动子区的转录调控元件 |
2.2.4 LMCO家族成员在菌丝中的基因表达水平 |
2.2.5 玉米大斑病菌01-23的LMCO基因表达的时空差异 |
2.2.6 培养基营养成分对LMCO基因表达的影响 |
2.2.7 铜离子及铁离子对LMCO基因表达的影响 |
2.2.8 在玉米大斑病菌01-23侵染玉米致病过程中LMCO基因的表达 |
2.3 讨论 |
3 漆酶家族活性蛋白的鉴定及异源表达 |
3.1 材料和方法 |
3.1.1 供试菌株及质粒 |
3.1.2 培养基及培养条件 |
3.1.3 胞内、胞外粗酶液的制备及胞外粗酶液的浓缩 |
3.1.4 Native-PAGE分离漆酶同工酶 |
3.1.5 ESI-MS/MS鉴定漆酶同工酶 |
3.1.6 RNA提取、c DNA合成 |
3.1.7 重组表达载体构建 |
3.1.8 转化及阳性克隆筛选 |
3.1.9 原核重组蛋白的诱导表达 |
3.1.10 原核诱导条件的优化 |
3.1.11 原核重组蛋白纯化 |
3.1.12 原核重组蛋白Stlac2包涵体复性 |
3.1.13 真核表达体系中Stlac2的诱导表达及验证 |
3.1.14 真核重组蛋白Stlac2糖基化程度、糖基化位点的鉴定及比对 |
3.1.15 蛋白结构的模拟及比对 |
3.1.16 漆酶酶活的测定及蛋白浓度的测定 |
3.1.17 pH对重组蛋白活性的影响 |
3.1.18 温度对重组蛋白活性的影响 |
3.1.19 离子对重组蛋白活性的影响 |
3.2 结果与分析 |
3.2.1 玉米大斑病菌01-23中具有活性的漆酶同工酶 |
3.2.2 漆酶同工酶Stlac1、Stlac2及Stlac6 的原核表达 |
3.2.3 原核表达诱导条件的优化 |
3.2.4 Stlac2 的真核体系P.pastoris KM71H表达 |
3.2.5 真核表达重组漆酶糖基化的影响 |
3.2.6 温度、pH及金属离子对原核重组漆酶活性的影响 |
3.3 讨论 |
4 漆酶基因StLAC6突变体的创制及功能分析 |
4.1 材料和方法 |
4.1.1 供试菌株及质粒 |
4.1.2 培养基及使用溶液 |
4.1.3 pBS-St LAC6 敲除载体酶切验证 |
4.1.4 StLAC6敲除突变体的创制及验证 |
4.1.5 突变体漆酶活性测定 |
4.1.6 StLAC6敲除突变体生长速率、产孢量及形态分析 |
4.1.7 StLAC6敲除突变体超微结构观察 |
4.1.8 突变体脂滴染色 |
4.1.9 突变体细胞壁、细胞膜完整性分析 |
4.1.10 突变体胁迫敏感性的分析 |
4.1.11 突变体菌丝及培养液的总酚含量测定 |
4.1.12 细胞内、外的黑色素提取及含量测定 |
4.1.13 突变体分生孢子萌发及穿透能力的分析 |
4.1.14 突变体致病性分析 |
4.1.15 突变体毒素活性测定 |
4.1.16 组织病理学分析 |
4.1.17 qPCR检测突变体其他LMCO基因的表达 |
4.1.18 StLAC6邻近基因组的确定及相对表达量的检测 |
4.1.19 数据的统计分析 |
4.2 结果与分析 |
4.2.1 StLAC6基因敲除突变体的获得 |
4.2.2 StLAC6不影响病菌菌丝生长及产孢能力 |
4.2.3 StLAC6不影响病菌菌丝及孢子形态 |
4.2.4 StLAC6不影响病菌孢子萌发及穿透能力 |
4.2.5 StLAC6不影响病菌细胞完整性 |
4.2.6 StLAC6影响病菌铜离子及酸碱胁迫响应 |
4.2.7 StLAC6影响病菌致病性 |
4.2.8 StLAC6影响病菌粗毒素的生物活性 |
4.2.9 StLAC6影响病菌黑色素合成 |
4.2.10 StLAC6缺失导致细胞过氧化物酶体异常 |
4.2.11 StLAC6影响病菌产生的芳香类化合物 |
4.2.12 SLAC6 缺失影响漆酶酶活及LMCO家族基因的表达 |
4.2.13 SLAC6缺失影响邻近基因的表达 |
4.3 讨论 |
5 基于代谢组学解析Stlac1和Stlac6功能及天然底物的验证 |
5.1 材料和方法 |
5.1.1 供试菌株、培养、重组蛋白的诱导及纯化 |
5.1.2 样品采集 |
5.1.3 代谢物的提取与LC-MS检测 |
5.1.4 代谢物提取方式的优化 |
5.1.5 质量控制 |
5.1.6 代谢组学数据分析 |
5.1.7 酶联免疫吸附试验(ELISA)检测代谢物含量 |
5.1.8 蛋白结构的模拟及评估 |
5.1.9 分子对接筛选直接作用底物 |
5.1.10 利用重组漆酶光谱学验证漆酶与底物的结合 |
5.1.11 UV-Vis全波长扫描验证漆酶与底物的反应 |
5.1.12 数据的统计分析 |
5.2 结果与分析 |
5.2.1 代谢组物提取方法优化 |
5.2.2 代谢组学检测及分析 |
5.2.3 ΔSt LAC1与ΔSt LAC6影响代谢物变化的差异 |
5.2.4 脂类差异代谢物 |
5.2.5 芳香类及其他差异代谢物 |
5.2.6 部分差异代谢物的验证 |
5.2.7 分子对接筛选差异代谢物中漆酶的直接作用底物 |
5.2.8 漆酶的直接作用底物的荧光淬灭验证 |
5.2.9 漆酶的直接作用底物的全波长扫描验证 |
5.3 讨论 |
6 结论 |
参考文献 |
在读期间发表的学术论文 |
作者简介 |
致谢 |
(9)SIRT2基因对牛前体脂肪细胞分化的作用及其转录调控机制研究(论文提纲范文)
摘要 |
abstract |
第一章 文献综述 |
1.1 研究背景 |
1.2 脂肪组织与脂肪细胞的研究进展 |
1.2.1 脂肪组织的分类、功能及分布 |
1.2.2 脂肪细胞的种类和特点 |
1.2.3 脂肪组织和脂肪细胞的起源 |
1.2.4 脂肪发生 |
1.2.5 研究脂肪细胞分化的细胞模型 |
1.3 前体脂肪细胞分化的转录因子 |
1.3.1 C/EBPs |
1.3.2 PPARγ |
1.3.3 SREBP-1c/ADD |
1.3.4 其他转录因子 |
1.4 Sirt2 与脂肪细胞分化 |
1.4.1 哺乳动物Sirtuins家族简介 |
1.4.2 SIRT2 调控脂肪细胞分化研究进展 |
1.5 SIRT2 基因转录调控研究进展 |
1.6 基因功能的研究方法 |
1.6.1 表达载体系统 |
1.6.2 RNA干扰 |
1.7 基因转录调控分析方法 |
1.7.1 确定转录起始位点的方法 |
1.7.2 缺失和突变 |
1.7.3 电泳迁移率调变动分析 |
1.7.4 染色质免疫共沉淀 |
1.8 本研究的目的、意义和内容 |
1.8.1 研究目的和意义 |
1.8.2 研究内容 |
第二章 牛SIRT2 基因重组腺病毒过表达载体的构建及病毒包装 |
2.1 材料 |
2.1.1 主要仪器 |
2.1.2 主要试剂 |
2.1.3 组织样 |
2.1.4 载体 |
2.1.5 细胞和菌 |
2.2 方法 |
2.2.1 牛脂肪组织总RNA的提取及反转录 |
2.2.2 克隆SIRT2 基因CDS序列引物的设计与合成 |
2.2.3 SIRT2 完整CDS区的克隆 |
2.2.4 胶回收PCR扩增获得的SIRT2 基因CDS区 |
2.2.5 SIRT2 基因的亚克隆 |
2.2.6 重组穿梭载体pAdTrack-CMV-SIRT2 的构建与鉴定 |
2.2.7 pAd-SIRT2 腺病毒骨架载体的构建与鉴定 |
2.2.8 重组腺病毒Ad-SIRT2 的包装、扩繁和病毒滴度测定 |
2.3 结果 |
2.3.1 脂肪组织总RNA的提取 |
2.3.2 牛SIRT2 基因CDS区的克隆与鉴定 |
2.3.3 pAdTrack-CMV-SIRT2 重组质粒的鉴定 |
2.3.4 pAd-SIRT2 重组病毒过表达载体的鉴定 |
2.3.5 重组腺病毒Ad-SIRT2 的包装、扩繁及病毒滴度测定 |
2.4 讨论 |
2.4.1 总RNA的提取 |
2.4.2 牛SIRT2 基因克隆 |
2.4.3 牛SIRT2 基因重组腺病毒过表达载体的构建与病毒包装 |
2.4.4 腺病毒滴度的测定 |
2.5 小结 |
第三章 牛SIRT2 基因sh RNA序列的筛选与干扰腺病毒的包装 |
3.1 材料 |
3.1.1 主要仪器 |
3.1.2 主要试剂 |
3.1.3 载体 |
3.1.4 细胞和菌 |
3.2 方法 |
3.2.1 靶向牛SIRT2 基因的shRNA序列的设计与合成 |
3.2.2 pENTR/CMV-GFP/U6-shRNA的构建与鉴定 |
3.2.3 psi CHECKTM-Ⅱ-SIRT2 表达载体的构建 |
3.2.4 有效干扰SIRT2 基因shRNA序列的筛选 |
3.2.5 pAd-shRNA病毒重组子的构建及鉴定 |
3.2.6 腺病毒的包装、扩增及滴度测定 |
3.3 结果 |
3.3.1 pENTR/CMV-GFP/U6-shRNA表达载体的构建 |
3.3.2 SIRT2 基因的克隆与psiCHECKTM-II-SIRT2表达载体的构建 |
3.3.3 有效sh RNA序列的筛选 |
3.3.4 pAd-shRNA-1002 重组腺病毒载体的鉴定 |
3.3.5 Ad-shRNA-1002 腺病毒的包装、扩增及滴度测定 |
3.4 讨论 |
3.4.1 shRNA的设计与合成 |
3.4.2 有效干扰shRNA序列的筛选 |
3.5 小结 |
第四章 过表达和干扰SIRT2 基因对牛前脂肪细胞分化的影响 |
4.1 材料 |
4.1.1 主要仪器 |
4.1.2 主要试剂 |
4.1.3 组织样 |
4.2 方法 |
4.2.1 牛前体脂肪细胞的分离和培养 |
4.2.2 病毒最佳感染复数(Multiplicity Of Infection,MOI)的确定 |
4.2.3 重组腺病毒Ad-SIRT2和Ad-shRNA-1002 有效性的鉴定 |
4.2.4 过表达和干扰SIRT2 基因对牛前体脂肪细胞分化的影响 |
4.2.5 统计分析 |
4.3 结果 |
4.3.1 牛原代前体脂肪细胞的分离培养 |
4.3.2 MOI值的确定 |
4.3.3 病毒有效性的鉴定 |
4.3.4 油红O染色结果 |
4.3.5 Real-time PCR检测SIRT2、脂肪细胞分化及脂质代谢关键基因m RNA表达情况 |
4.4 讨论 |
4.4.1 Real-time PCR引物的检测 |
4.4.2 过量表达及干扰SIRT2 基因对牛前体脂肪细胞分化的作用 |
4.5 小结 |
第五章 牛SIRT2 基因启动子活性分析 |
5.1 材料 |
5.1.1 主要仪器 |
5.1.2 主要试剂 |
5.1.3 载体 |
5.1.4 细胞和菌 |
5.2 实验方法 |
5.2.1 5'RACE确定牛SIRT2 基因的转录起始位点 |
5.2.2 克隆牛SIRT2 基因5’上游基本启动子区域 |
5.2.3 SIRT2 基因基本启动子序列生物信息学分析 |
5.2.4 牛SIRT2 基因基本启动子序列系列缺失片段的扩增 |
5.2.5 pGL3-SIRT2 promoter重组载体的构建及鉴定 |
5.2.6 启动子系列缺失片段的活性分析 |
5.2.7 统计分析 |
5.3 结果 |
5.3.1 牛SIRT2 基因的转录起始位点 |
5.3.2 PCR扩增牛SIRT2 基因2 KB左右启动子区域 |
5.3.3 SIRT2 基因启动子进化保守序列分析 |
5.3.4 牛SIRT2 启动子区域Cp G岛预测结果 |
5.3.5 牛SIRT2 基因5’调控区系列缺失片段的扩增 |
5.3.6 重组质粒pGL3-SIRT2 promoter的鉴定 |
5.3.7 SIRT2 启动子系列缺失片段活性分析 |
5.3.8 SIRT2 核心启动子序列转录因子结合位点分析 |
5.4 讨论 |
5.4.1 牛SIRT2 基因转录起始位点的确定 |
5.4.2 牛SIRT2 基因启动子序列的扩增及活性分析 |
5.5 小结 |
第六章 转录因子YY1 对牛SIRT2 基因的转录调控作用 |
6.1 材料 |
6.1.1 主要仪器 |
6.1.2 主要试剂 |
6.1.3 质粒 |
6.1.4 细胞和菌 |
6.2 方法 |
6.2.1 生物信息学分析 |
6.2.2 YY1 结合序列定点突变的双荧光素酶报告系统分析 |
6.2.3 电泳迁移率变动分析(Electrophoretic Mobility Shift Assays,EMSA) |
6.2.4 染色质免疫共沉淀(Chromatin Immunoprecipitation,ChIP) |
6.3 结果 |
6.3.1 生物信息学分析预测的保守的YY1 转录因子结合位点 |
6.3.2 YY1 转录因子的生物信息学分析 |
6.3.3 YY1 结合位点突变对SIRT2 启动子活性的影响 |
6.3.4 EMSA验证YY1 体外结合于SIRT2 启动子上 |
6.3.5 ChIP验证YY1 体内结合于SIRT2 启动子上 |
6.4 讨论 |
6.4.1 生物信息学分析YY1 结合位点及YY1 转录因子的保守性 |
6.4.2 YY1 结合位点正向调控SIRT2 基因的转录活性 |
6.4.3 YY1 转录因子结合于SIRT2 基因启动子上 |
6.5 小结 |
第七章 结论及创新点 |
7.1 结论 |
7.2 创新点 |
参考文献 |
附录 |
致谢 |
作者简介 |
(10)油茶种子脂肪酸代谢过程7个关键酶基因的克隆与功能研究(论文提纲范文)
摘要 |
ABSTRACT |
缩略词 |
第一章 绪论 |
1.1 油茶简介 |
1.1.1 油茶的生理特性 |
1.1.2 油茶的生理功能 |
1.1.3 油茶的研究进展 |
1.2 植物脂肪酸代谢 |
1.2.1 脂肪酸的合成 |
1.2.2 脂肪酸的分解 |
1.3 种子发育过程中相关基因的研究进展 |
1.3.1 饱和脂肪酸合成装载酶-丙二酰单酰CoA:ACP转酰酶(MCAT) |
1.3.2 脂肪酸代谢系统中的脱水酶-羟脂酰-CoA脱水酶(HCD) |
1.3.3 线粒体β氧化中的脱氢酶-脂酰CoA脱氢酶(ACAD) |
1.3.4 过氧化物酶体β氧化中的多功能蛋白(MFP) |
1.3.5 脂肪酸β氧化中的辅助酶-脂酰CoA硫酯酶(ACOT) |
1.3.6 醛脱氢酶(ALDH) |
1.3.7 脂氢过氧化物裂解酶(HPL) |
1.4 本研究的意义、主要内容和技术路线 |
1.4.1 本研究目的意义 |
1.4.2 本研究的主要内容 |
1.4.3 本研究的技术路线 |
第二章 油茶种子脂肪酸代谢过程7个关键酶基因的克隆与序列分析 |
2.1 材料与方法 |
2.1.1 材料 |
2.1.2 实验研究方法 |
2.2 结果与分析 |
2.2.1 油茶种子提取的总RNA质量 |
2.2.2 油茶MCAT基因克隆及生物信息学分析 |
2.2.3 油茶HCD基因克隆及生物信息学分析 |
2.2.4 油茶ACAD基因克隆及生物信息学分析 |
2.2.5 油茶MFP基因克隆及生物信息学分析 |
2.2.6 油茶ACOT基因克隆及生物信息学分析 |
2.2.7 油茶ALDH基因克隆及生物信息学分析 |
2.2.8 油茶HPL基因克隆及生物信息学分析 |
2.3 讨论 |
第三章 油茶种子脂肪酸代谢过程7个关键酶基因的原核表达 |
3.1 材料与方法 |
3.1.1 材料 |
3.1.2 实验研究方法 |
3.2 结果与分析 |
3.2.1 表达载体的质粒提取 |
3.2.2 油茶MCAT基因的原核表达 |
3.2.3 油茶HCD基因的原核表达 |
3.2.4 油茶ACAD基因的原核表达 |
3.2.5 油茶MFP基因的原核表达 |
3.2.6 油茶ACOT基因的原核表达 |
3.2.7 油茶ALDH基因的原核表达 |
3.2.8 油茶HPL基因的原核表达 |
3.3 讨论 |
第四章 油茶ACAD、ALDH和HPL基因的时空表达 |
4.1 材料与方法 |
4.1.1 材料 |
4.1.2 实验研究方法 |
4.2 结果与分析 |
4.2.1 油茶不同发育时期种子RNA的提取 |
4.2.2 内参基因及靶基因的克隆 |
4.2.3 qPCR分析油茶ACAD、ALDH和HPL三个基因的表达研究 |
4.3 讨论 |
第五章 油茶种子脂肪酸代谢过程7个基因的真核载体构建及CoALDH、CoHPL基因的转拟南芥的初步研究 |
5.1 材料 |
5.1.1 载体与菌株 |
5.1.2 试剂 |
5.1.3 主要仪器设备 |
5.2 实验方法 |
5.2.1 构建真核表达载体 |
5.2.2. 构建RNA干扰载体 |
5.3 结果与分析 |
5.3.1 真核表达载体的质粒提取 |
5.3.2 真核载体的构建 |
5.3.3 油茶ALDH和HPL基因转拟南芥植株的筛选 |
5.4 讨论 |
第六章 总结 |
6.1 结论 |
6.2 创新点 |
6.3 研究展望 |
参考文献 |
附录A 部分药品配制方法 |
附录B 使用仪器制造单位 |
附录C 硕士期间的主要学术成果 |
致谢 |
四、人过氧化物酶体增殖体激活受体γ2基因克隆及真核表达载体的构建与鉴定(论文参考文献)
- [1]基于mRNA-miRNA分析的牛乳脂代谢功能基因筛选及KLF6基因功能验证[D]. 夏立新. 吉林大学, 2021
- [2]猪圆环病毒2型利用宿主细胞应激反应促进其自身复制的分子机制[D]. 孙仁杰. 浙江大学, 2021(02)
- [3]ATG4B在DHA影响草鱼肾脏细胞脂质代谢中的作用分析[D]. 阳明会. 西北农林科技大学, 2021(01)
- [4]绵羊脂肪细胞分化中miRNAs的鉴定及miR-148a和miR-200b功能研究[D]. 金夏阳. 甘肃农业大学, 2021
- [5]桑树(Morus alba)三个干旱诱导基因的表达规律及MaCDSP32基因的功能分析[D]. 孙红梅. 西北农林科技大学, 2020
- [6]基于纳米微球的脂联素高聚体模型构建及功能研究[D]. 戴佳锟. 西北大学, 2019(04)
- [7]脂联素及其受体介导绵羊肌内、内脏和皮下脂肪细胞生脂基因表达与分子调控机理研究[D]. 张德荣. 甘肃农业大学, 2019
- [8]玉米大斑病菌漆酶基因家族鉴定及关键基因的功能解析[D]. 刘宁. 河北农业大学, 2019(01)
- [9]SIRT2基因对牛前体脂肪细胞分化的作用及其转录调控机制研究[D]. 张亚冉. 西北农林科技大学, 2017(05)
- [10]油茶种子脂肪酸代谢过程7个关键酶基因的克隆与功能研究[D]. 王建勇. 中南林业科技大学, 2014(02)