一、丙型肝炎患者外周血单个核细胞内HCV感染与干扰素疗效反应（论文文献综述）
马赛[1]（2021）在《血小板生成素受体激动剂艾曲泊帕对Ⅰ型干扰素通路的作用及机制》文中进行了进一步梳理研究背景:血小板减少是慢性病毒性肝炎的常见并发症之一,临床上尤其在慢性丙型肝炎（Chronic hepatitis C,CHC）和慢性乙型肝炎（Chronic hepatitis B,CHB）中发生率较高。未进展至肝硬化的慢性病毒性肝炎阶段患者通常表现为轻至中度的血小板减少（血小板数50-150×109/L）,严重血小板减少（血小板数小于50×109/L）者可出现皮肤黏膜出血、甚至内脏出血等,影响抗病毒治疗的进行,与预后不良相关。免疫性血小板减少症（Immunethrombocytopenia,ITP）可分为原发性和继发性。在许多情况下,原发性和继发性ITP的治疗方法相似。但是,继发于潜在疾病如丙型肝炎病毒（HCV）、乙型肝炎病毒（HBV）感染等,则治疗应更侧重于病毒感染本身。但严重的血小板减少会阻碍或延迟抗病毒药物的使用,因此对于慢性肝炎病毒感染相关血小板减少症的治疗原则主要包括两方面:即基于病原学的抗病毒治疗和基于继发血小板减少的治疗。Ⅰ型干扰素（Interferon,IFN）是抗病毒免疫反应的重要效应分子,通过结合Ⅰ型干扰素受体（Interferon alpha receptor,IFNAR）,激活下游Janus激酶（JAK）-信号转导和转录激活因子（STAT）信号通路,诱导多种干扰素刺激基因（Interferon-stimulatedgenes,ISGs）表达,从而发挥抗病毒作用。因此,聚乙二醇干扰素α（Pegylatedinterferonalpha,Peg-IFNα）作为国内外指南推荐的的一线药物广泛应用于慢性病毒性肝炎（CHC和CHB）的抗病毒治疗。对于不存在肝硬化或肝硬化处于代偿期的慢性肝炎病毒感染相关血小板减少症的患者,目前国内参考ITP的治疗共识,采用糖皮质激素联合抗病毒治疗。然而,糖皮质激素有激活肝炎病毒复制进而加重病情的危险,临床应用具有局限性。鉴于此,迫切需要安全有效的新一代疗法,以增加慢性肝炎病毒感染相关血小板减少症患者的血小板计数。艾曲泊帕（Eltrombopag）是血小板生成素受体（Thrombopoietin receptor,TPO-R）激动剂,目前已成为ITP二线治疗药物。而且,艾曲泊帕也已应用于CHC患者血小板减少症的治疗,使血小板计数低的CHC患者可以启动并维持以干扰素为基础的肝病标准疗法。艾曲泊帕的作用机制类似于内源性血小板生成素（Thrombopoietin,TPO）,通过与TPO-R结合进而刺激血小板生成。除此之外,艾曲泊帕还有一个重要特征就是具有铁离子螯合作用,通过降低细胞内铁离子含量影响造血干细胞的功能。单核细胞可分化为巨噬细胞或树突状细胞,参与肝炎病毒的抗原递呈,有效响应病毒性肝炎的免疫治疗。然而,艾曲泊帕作为慢性肝炎病毒感染相关血小板减少症的潜在治疗药物是否影响单核细胞中Ⅰ型干扰素免疫应答及其机制尚不清楚。此研究对于系统认识艾曲泊帕在慢性肝炎病毒感染相关血小板减少症的治疗中的作用具有参考价值。研究目的:1.探究艾曲泊帕对IFN-α介导的抗病毒免疫反应的影响。2.揭示艾曲泊帕影响单核细胞中Ⅰ型干扰素免疫应答的分子机制。方法与结果:1.艾曲泊帕可通过TPO-R非依赖形式抑制Ⅰ型干扰素通路。1.1艾曲泊帕差异性调控人髓系白血病单核细胞系THP-1细胞和人单核细胞内ISGs活化。收集健康志愿者的外周血,使用Ficoll密度梯度离心法分离出外周血单个核细胞（Peripheral blood mononuclear cells,PBMCs）。再用 CD14 阳选免疫磁珠从PBMCs中分选出CD14阳性单核细胞,流式细胞术检测纯度>95%。用艾曲泊帕刺激CD14阳性单核细胞以及THP-1细胞,CCK-8检测不同浓度的艾曲泊帕对两种细胞活性的影响。结果发现10μM的艾曲泊帕不会影响THP-1细胞和人单核细胞的活性。多项临床试验中检测的艾曲泊帕血药浓度高于10μM,说明本实验中选取的艾曲泊帕作用浓度符合临床药理学。收集体外艾曲泊帕处理后的THP-1细胞,提取RNA后反转录得到cDNA,实时荧光定量PCR（Quantitative Real-time PCR,qPCR）检测ISGs表达水平变化。结果显示艾曲泊帕显着增加THP-1细胞内IFN-α诱导的ISGs（CXCL10、IFIT1、IFIT2、ISG15和MX2）表达。同时,收集在体外使用艾曲泊帕处理后的CD14阳性单核细胞,提取RNA,qPCR检测ISGs表达水平变化。结果显示艾曲泊帕在人单核细胞内抑制ISGs表达,与THP-1细胞中作用相反。1.2艾曲泊帕调控ISGs活化水平与TPO-R有关。鉴于艾曲泊帕TPO-R激动剂的经典功能,为探究其对于THP-1细胞及人单核细胞ISGs调控存在差异的原因,分别提取THP-1细胞和人单核细胞的总蛋白,使用蛋白质免疫印迹试验（Western blotting）检测TPO-R表达水平,结果发现TPO-R在两种细胞中存在显着差异。将含有小干扰RNA（Small interfering RNAs,siRNAs）和转染试剂的转染复合物加入THP-1细胞内,48小时后收集细胞,Western blotting检测干扰效率。使用siRNA转染将THP-1细胞中TPOR基因下调后,qPCR检测艾曲泊帕处理后THP-1细胞内ISGs表达水平变化。结果发现TPOR基因下调显着抑制艾曲泊帕对THP-1细胞中ISGs表达的增强作用。以上结果说明,艾曲泊帕差异性调控THP-1细胞和人单核细胞内ISGs的活化水平可能与TPO-R的表达水平有关。1.3艾曲泊帕可通过TPO-R非依赖形式抑制IFN-α诱导的ISGs表达。由于艾曲泊帕无法激活小鼠的TPO-R,因此小鼠是研究艾曲泊帕TPO-R非依赖作用的理想模型。收集野生型C57BL/6J小鼠骨髓细胞,用小鼠骨髓单核细胞分离液试剂盒提取单核细胞层,种板后2-4小时内贴壁的为单核细胞。收集不同浓度或不同时间的艾曲泊帕处理的小鼠骨髓单核细胞（Bone marrow mononuclearcells,BM-MNCs）,qPCR检测结果显示艾曲泊帕对小鼠BM-MNCs内ISGs表达的抑制呈剂量依赖性和时间依赖性。用艾曲泊帕体外处理小鼠BM-MNCs后,Western blotting检测发现艾曲泊帕抑制小鼠BM-MNCs内IFN-α下游STAT1磷酸化。与艾曲泊帕不同,重组人血小板生成素（Recombinanthumanthrombopoietin,rhTPO）和另外一种血小板生成素受体激动剂罗米斯汀（Romiplostim）均可以与小鼠的TPO-R结合。qPCR和Western blotting检测发现,rhTPO和Romi对小鼠BM-MNCs内IFN-α下游STAT1磷酸化和ISGs表达无明显影响。因此,可以明确艾曲泊帕可通过不依赖于TPO-R的途径抑制Ⅰ型干扰素通路。2.艾曲泊帕通过螯合细胞内铁离子抑制Ⅰ型干扰素通路。2.1艾曲泊帕体外刺激CHB伴血小板减少症患者的单核细胞进行转录组差异基因分析,发现铁代谢在其中具有重要作用。收集CHB伴血小板减少症患者的外周血,免疫磁珠分选出CD14阳性单核细胞后,体外加艾曲泊帕处理。收集细胞,提取RNA,进行转录组测序技术（RNA-seq）测序。使用R及RStudio软件将测序结果进行配对分析,得到矫正后p值小于 0.05 的差异表达基因（Differentially expressed genes,DEGs）91 个,其中铁代谢相关基因BOLA2在艾曲泊帕加药组显着下调。为进一步验证,使用siRNA转染将小鼠BM-MNCs中Bola2基因下调。qPCR结果显示Bola2下调抑制IFN-α诱导的ISGs表达。这些数据表明,艾曲泊帕可通过调节铁代谢相关机制抑制Ⅰ型干扰素信号通路。2.2艾曲泊帕通过螯合单核细胞内铁离子以抑制ISGs表达。去铁胺（Deferoxamine,DFO）是经典的铁离子螯合剂。首先CCK-8检测了不同浓度的DFO对细胞活性的影响。结果发现低于20μM的DFO不会影响单核细胞的活力。之后qPCR和Western blotting检测发现,DFO与艾曲泊帕趋势相同,均可降低小鼠BM-MNCs内IFN-α诱导的STAT1磷酸化水平和ISGs表达。在艾曲泊帕处理组加入硫酸亚铁（Ferroussulfate,FeSO4）后,qPCR结果显示艾曲泊帕的抑制作用被部分恢复。为证明艾曲泊帕的确螯合了细胞内的铁离子,将对活细胞荧光标记的细胞染色试剂钙黄绿素乙酰氧基甲酯（CalceinAM）加入细胞内,再加入艾曲泊帕处理后,流式细胞仪检测平均荧光强度（Mean fluorescence intensity,MFI）以显示细胞内可变铁池（Labile iron pool,LIP）的水平变化。流式结果证明艾曲泊帕处理组的细胞内游离铁减少。以上结果说明,艾曲泊帕通过螯合细胞内的铁抑制ISGs的表达。3.艾曲波帕调控铁离子介导的活性氧生成抑制Ⅰ型干扰素通路。3.1艾曲泊帕抑制细胞内活性氧生成。因为细胞内的铁离子会通过Fenton氧化反应参与活性氧（Reactive oxygen species,ROS）的产生,因此我们检测了艾曲泊帕对人单核细胞内ROS水平的影响。将氧化敏感荧光探针DCFDA（2,7-二氯荧光素二乙酸酯）加入人单核细胞内,再加入艾曲泊帕处理后,酶标仪记录荧光值变化。结果发现H2O2可迅速升高细胞内ROS水平,而艾曲泊帕能够降低内源丰富的ROS水平。3.2艾曲泊帕降低ROS生成从而抑制JAK激酶活化及下游ISGs表达。为了进一步明确ROS是否参与单核细胞内艾曲泊帕介导的IFN-α下游通路抑制,使用qPCR检测艾曲泊帕和过氧化氢（Hydrogenperoxide,H2O2）共同加药组ISGs表达水平,同时使用Western blotting检测ROS参与影响的蛋白质磷酸化水平。结果发现H2O2可逆转艾曲泊帕对ISGs表达的抑制以及对JAK1和STAT1的磷酸化水平的降低。以上结果说明,艾曲泊帕通过螯合细胞内游离铁减少ROS产生,从而抑制IFN-α诱导的JAK的活化及下游ISGs生成。结论:本研究证实艾曲泊帕通过铁离子螯合作用,降低单核细胞内游离铁,导致ROS生成减少,从而抑制了 IFN-α诱导的JAK1和STAT1的磷酸化,最终导致ISGs表达降低,抑制I型干扰素通路。本研究对于系统认识艾曲泊帕在慢性病毒性肝炎伴血小板减少症的治疗中的作用具有参考价值。
周文靖[2]（2019）在《直接抗病毒药物治愈的慢性丙型肝炎患者NK细胞的免疫学特点分析》文中认为研究背景:慢性丙型肝炎（chronic hepatitis C,CHC）是由丙型肝炎病毒（hepatitis C virus,HCV）感染引起的一种严重威胁人类健康的传染性疾病。近年来,直接抗病毒药物（direct-acting antiviral agents,DAAs）的出现,使HCV感染成为可以治愈的疾病。自然杀伤（natural killer,NK）细胞作为机体天然免疫系统的主要成分,不仅在HCV感染早期病毒的自发清除中发挥着重要的作用,还与慢性HCV感染阶段机体的抗病毒治疗效果密切相关。目前,有关DAAs的研究大多集中在其临床疗效方面,对机体免疫系统的影响研究较少,尤其是DAAs治疗对CHC患者NK细胞免疫学特点的影响尚不明确。目的:本研究对接受达拉他韦（daclatasvir,DCV）和阿舒瑞韦（asunaprevir,ASV）治疗的初治型HCV 1b型CHC患者外周血NK细胞的亚群、表型和功能进行研究,以探索DAAs治疗对CHC患者外周血NK细胞免疫学特点的影响。方法:入组13例初治型HCV 1b型CHC患者,使用DCV/ASV治疗24周。同时,入组13例性别和年龄与之相匹配的健康者为健康对照（healthy controls,HC）组。采用流式细胞术分析患者治疗前、治疗第24周、治疗结束后随访第12周、随访第24周时外周血NK细胞的亚群、表型（HLA-DR,CD38,NKp46,NKp30,NKG2A）和功能（CD107a,IFN-γ,TNF-α）的特点。结果:（1）13例CHC患者经DCV/ASV抗病毒治疗24周均达到持续病毒学应答,且肝脏功能恢复正常;（2）与HC组相比,CHC患者抗病毒治疗前外周血NK细胞的亚群分布发生改变,且其表达HLA-DR、NKp46、CD38的水平增高,表达CD107a和分泌TNF-α的能力增强,但产生IFN-γ的能力减弱;（3）经DAAs治愈的CHC患者外周血NK细胞的亚群分布部分恢复,且其表达HLA-DR、NKp46的水平降低,表达CD107a的水平下降,分泌IFN-γ的能力增强。结论:DAAs可有效清除HCV,经DAAs治愈的CHC患者外周血NK细胞的活化程度降低、功能及亚群分布发生恢复。本研究阐明了DAAs治疗不但能直接抑制HCV的复制,而且可以实现CHC患者NK细胞表型和功能的恢复。
王冬耀[3]（2019）在《Ⅰ型干扰素和白细胞介素11在肝脏疾病中的免疫功能及干预研究》文中研究说明慢性感染性疾病以及恶性肿瘤严重威胁着当今世界人类的健康。近年来虽然出现了众多抗感染药物,对肿瘤的发病机制也从细胞水平到分子水平有了更为深入的认识,同时肿瘤靶向药物和小分子抑制剂的应用也取得了一定程度的临床疗效,然而在治疗过程中仍然存在着各种需要改善的问题,如何提高慢性感染性疾病以及恶性肿瘤的临床治疗效果已经成为亟待解决的重要问题之一。慢性乙型肝炎在世界范围内,尤其在亚洲地区,感染者数目仍然很多。目前治疗慢性乙型肝炎的药物主要分为干扰素和核苷或者核苷酸类似物等。然而在临床治疗过程中发现,只有干扰素才能够在部分乙肝患者中达到清除HBsAg及HBeAg的效果,其机理有很多,主要认为可能是通过STAT1分子向下游传递信号,从而诱导干扰素刺激基因的表达。因此对于干扰素应答与不应答患者之间的免疫学机制研究,从而寻找能够提高干扰素疗效的策略,已经成为关注的重要问题。T细胞与自然杀伤细胞（NK细胞）对抗病毒感染等起着至关重要的促进作用,但在慢性感染过程中,T细胞和NK细胞往往处于功能耗竭的状态。细胞因子IL-2对多种免疫细胞有着活化与扩增的作用,而且曾经应用于多种肿瘤的临床治疗。但是对于继干扰素使用后能否再序贯使用IL-2治疗尚未见报道。考虑到干扰素以及IL-2下游均能够通过STAT1分子传递信号,所以针对经过干扰素治疗后无效的慢性乙肝患者,能否序贯使用IL-2从而起到协同提高T细胞和NK细胞的免疫应答能力?该方法是否适合应用于乙肝患者的临床治疗?能否有利于提高临床治疗效果?我们主要针对上述三个问题,对经干扰素治疗无应答的乙肝患者展开临床试验研究。由慢性乙型肝炎逐渐进展,可能发展为肝硬化,最终进展为肝癌。而目前针对肝癌的药物并不多且效果并不理想,无论免疫卡控点治疗还是索拉菲尼,都无法显着延长患者生存期。手术一直是肝癌治疗的主要方式之一,但是手术也存在着很大的风险,即术后易于原位复发。肝脏本身具有强大的术后再生能力,IL-6家族成员均可通过STAT3向下游传递信号,促进肝脏再生,同时有报道认为IL-11与肝切除后肝脏细胞的代偿性增生有关,IL-11-STAT3信号通路对于结直肠癌的发生起到至关重要的作用。因此术后的再生过程是否也伴随或者促进了肿瘤的生长?IL-11-STAT3信号是否起到促进肝癌生长的作用?能否寻找一种行之有效的方式抑制肝癌术后的复发?围绕着这三个问题我们对于肝癌的术后展开了研究。本文主要从寻找提高无应答乙肝患者治疗临床效果和防止肝癌术后复发两个方面展开研究,获得了如下结果。Ⅰ.序贯使用IL-2可提高经干治疗无效的患者抗病毒应答能力通过第一项临床试验,我们选取了 92例HBeAg阳性的慢性乙型肝炎患者。接受48周的标准长效干扰素治疗,并进行24周的随访。我们对入组的患者及正常人对照组的PBMC进行了系统的临床特征及免疫学分析,发现干扰素治疗为IL-2治疗提供了基础。继而我们通过第二项临床试验,对于经干扰素治疗无效的患者进行24周的序贯IL-2治疗。通过使用流式细胞术、ELISA、免疫荧光、western blotting、RTCA及相关性分析等,发现了序贯使用IL-2治疗能够提高临床治疗效果的机制。本研究通过上述研究方案得到了以下结果。1.干扰素治疗后大多数患者为无应答患者,且IL-2Rα在CD4+T细胞表达降低通过分析经干扰素治疗后患者免疫学指标及临床指标,发现经过干扰素标准化治疗后多数患者为无应答患者,HBeAg未能转阴。IL-2R发生了显着变化,尤其IL-2Rα在CD4+T细胞表达显着下降。同时NK细胞表面的IL-2Rβ及IL-2Rα的表达在干扰素治疗后显着升高。总之,IFN-α治疗后,IL-2R主要传递正向免疫信号,从而为序贯IL-2治疗做铺垫。2.体外使用IL-2刺激可提高无应答患者T细胞及NK细胞的效应功能。当体外使用IL-2刺激从无应答患者外周血分离出的PBMC后,发现可以显着提高该部分患者T细胞及NK细胞的抗病毒效应功能,使产生IFN-γ及TNF-α的能力显着增强。CD38、NKG2D等活化分子表达升高,同时并未升高负调分子如PD-1,Tim-3的表达,且Treg细胞比例也未见升高。3.使用IL-2刺激可提高CHB患者肝脏组织淋巴细胞的效应功能。通过从乙肝患者肝穿组织分离的淋巴细胞进行IL-2体外刺激,发现不仅可以上调活化分子CD38、NKp30的表达,同时可以提高IFN-γ在淋巴细胞中的表达。4.体内经IL-2序贯治疗后不升高负调分子表达。通过对无应答患者进行IL-2治疗后检测发现,Treg细胞比例及PD-1分子表达均未见升高,反而有所下降。IL-2Rβ在NK细胞的表达显着升高。5.序贯IL-2治疗后增加p-STAT1表达同时下调p-STAT5表达通过western blotting检测发现对于体外使用IL-2刺激的无应答乙肝患者PBMC,p-STATl表达升高,p-STAT5表达下降。通过流式细胞术检测,经IL-2治疗后的患者,CD4+T细胞中p-STAT5表达下降。通过免疫荧光检测发现,淋巴细胞中的p-STAT1表达呈现出显着增加。6.使用IL-2治疗显着提高CD8+T细胞及NK细胞产生IFN-γ。通过对不同时间点动态检测发现,经干扰素治疗无效的患者在IL-2治疗后,CD8+T细胞及NK细胞产生IFN-y及TNF-α及CD107a的水平显着升高。对患者治疗前后的血清进行比较,发现IFN-γ,IFN-αα水平在治疗后显着升高,而IL-10水平则保持稳定。7.使用IL-2治疗显着提高HBV特异性CD8+T细胞比例及杀伤作用。通过对不同时间点动态检测发现,在IL-2治疗后,pentamer+CD8+T细胞比例显着升高,此外CD44+CD62I-CD8+T细胞比例以及NKp30表达也有着显着升高。pDC细胞及CD80、CD86分子的表达也是呈现出显着增多。继而通过RTCA检测发现,从经IL-2治疗后的患者PBMC中分离出的CD8+T细胞具有更强的杀伤PLC/PRF/5细胞的功能。8.体内IL-2治疗可提高临床治疗效果通过对入组的23例患者临床资料分析发现,HBeAg水平在干扰素治疗前后未发生显着变化;然而经IL-2治疗后,HBeAg水平则显着下降。同时有5位患者HBeAg转阴,此外一位患者HBsAg转阴且伴有抗体的产生。对于免疫学指标与HBeAg进行相关性分析发现,pentamer+CD8+T细胞比例及 IFN-γ+CD107a+CD8+T细胞比例与HBeAg呈现明显负相关关系。9.CD24+CD38hiB细胞负调IFNα治疗效果然而并非所有乙肝患者经干扰素治疗后都适合序贯IL-2治疗,因此对于这部分患者则可能需要其他治疗策略。在研究过程中,除上述结果外,我们还发现了CD24+CD38hiB细胞比例及数目随干扰素的治疗呈现出动态增加,且CD24可作为CD24+CD38hi B细胞的标志分子。CD24+CD38hi B细胞可分泌高水平IL-10从而负调免疫应答。通过分选去除CD24+CD38hi B细胞后,则可以提高T细胞及NK细胞产生IFN-y及TNF-α的能力。最后通过构建的HBV小鼠模型使用anti-CD24抗体联合干扰素治疗,发现与单独干扰素治疗相比,发现可显着促进HBeAg及HBsAg的下降。综上所述,本研究表明虽然CHB患者经干扰素治疗后多数呈现无应答状态,但是CD4+T细胞表面的IL-2Rα表达下降,并且IL-2的高亲和力受体IL-2Rαβy表达降低,从而限制了 IL-2通过其下游STAT5分子磷酸化诱导FOXP3的表达,进而抑制了负向免疫应答。而序贯使用IL-2治疗后,则能够通过升高IL-2中亲和力受体IL-2Rβγ表达、促进STATI分子磷酸化,同时降低STAT5磷酸化,发挥正向免疫应答效应,包括提高CD8+T细胞和NK细胞的效应功能,以及pentαmer+CD8+T细胞比例等。与此同时,并不增加免疫负调分子表达及FOXP3+Treg细胞的比例。这些机制最终促进了抗病毒应答能力,并一定程度上促进了 HBeAg或HBsAg的清除。因此序贯IL-2的治疗对提高临床使用干扰素之后的HBeAg转阴率具有重要意义。而对于不适合序贯使用IL-2治疗的患者,anti-CD24抗体治疗或许又是一个有前景的、可供选择的方案。Ⅱ、肝切除通过IL-11-STAT3信号途经促进肝癌术后复发通过使用原位接种肿瘤模型,化学诱导致癌模型,原位移植瘤模型,研究手术对肿瘤的影响。通过基因芯片分析及基因敲除鼠验证IL-11是否对肿瘤生长起到促进作用。最后通过小分子抑制剂证明其能够有效的防止术后复发。本研究通过上述研究方案得到了以下结果。1.肝癌术后可复发通过对不同国家的不同肿瘤术后五年复发率进行研究,发现肝癌在不同国家中术后复发率都很高。继而通过将肝癌模型小鼠的肿瘤切除后,发现确实可以术后复发。术后存在着更显着的PCNA和CD31的表达。2.肝切手术促进肿瘤生长通过肝损及部分切除后构建小鼠肝癌模型,发现肿瘤生长更为迅速。与对照组相比,手术损伤组小鼠肝脏纤维化程度更为严重,PCNA和CD31的表达更强。通过核磁拍照也同样证明经过手术切除部分肝脏再构建的肝癌模型,肿瘤生长更为致密,更为严重。3.术后肝脏局部IL-11表达升高通过对肝癌患者肿瘤组织及癌旁组织进行基因芯片分析,发现IL-11在肿瘤组织中显着高表达。而IL-6在癌和癌旁中的表达水平均较高。通过对肝切后不同时间点的小鼠肝脏进行组化及ELISA检测,也发现IL-11在肝切后显着升高。最后通过GEO数据库,对374例肝癌组织与50例癌旁组织进行基因分析,发现仍然IL-11在肝癌组织中呈现出显着性高表达。4.IL-11信号对肝癌术后复发是必须的通过对Il-RaαKO鼠研究,我们发现当小鼠敲除IL-11信号后,可显着减缓肝癌术后的复发。无论肿瘤数目、重量,PCNA、AFP及p-STAT3表达均显着低于对照组。说明IL-11信号对肿瘤术后的复发是必要的。5.抑制IL-11信号可促进肿瘤细胞凋亡通过体外使用IL-11刺激Hepa1-6细胞后,发现可以促进细胞增殖。当使用STAT3抑制剂Napabucasin阻断IL-11-STAT3信号后,则细胞发生明显凋亡。通过流式检测发现抑制IL-11信号后,7AAD+细胞比例显着增多;通过免疫荧光检测发现当使用Napabucasin处理细胞后,PCNA的表达显着降低。通过western blot检测发现在使用Napabucasin处理后,无论是否在细胞培养条件中加入IL-11或IL-6,细胞的p-STAT3表达都受到了显着抑制。6.Napabucasin可抑制术后复发通过使用Napabucasin治疗肝内接种肿瘤细胞后的小鼠,发现可以有效抑制肿瘤的生长。且HE染色发现肝脏病理损伤较轻,同时组化染色发现PCNA表达显着降低。继而通过术后复发模型,即手术切除肝脏肿瘤后再给小鼠注射Napabucasin,同样发现肿瘤生长受限。7.IL-6对肝癌术后复发不是必要因素我们发现Il-6KO鼠在接种肿瘤细胞后,可以正常成瘤。当手术切除肿瘤后能够正常复发。但在术后给予Napabucasin治疗则显着抑制复发。无论肿瘤大小、数目、重量以及PCNA表达都显着降低。8.抑制STAT3磷酸化可抑制IL-11对肿瘤生长的促进作用通过对WT鼠接种肝癌细胞系后,再给小鼠注射IL-11则能够显着促进肿瘤生长,而一旦使用Napabucasin治疗,则显着抑制肿瘤。同时发现当小鼠加入使用IL-11后肝脏纤维化程度加重,PCNA及AFP表达升高;而当使用Napabucasin治疗后,则显着抑制肿瘤生长,纤维化程度减弱,PCNA及AFP表达也明显受到抑制。此外,对DEN诱导的自发肝癌组织再经过同种异体移植后,发现经过手术切除肝脏肿瘤后,肿瘤依旧可以复发。然而在术后给予Napabucasin治疗后,则明显该模型中肝癌的术后复发。PCNA及p-STAT3的表达也相应的显着降低。综上所述,本研究表明在肝癌环境下,将肝脏肿瘤切除后,肝脏再生的过程中产生的细胞因子IL-11可通过IL-11-STAT3信号途径促进肿瘤生长,因此肝再生的同时也伴随了肝癌的复发。而对于肝癌患者又无法不进行手术,因此在术后联合使用如STAT3抑制剂Napabucasin可能起到较好的防止肝癌复发的作用,具有潜在的临床意义。
张卫云[4]（2018）在《献血者人群隐匿性乙型肝炎病毒感染分子与细胞免疫特征分析》文中进行了进一步梳理背景和目的慢性乙型病毒性肝炎（CHB）的发生及发展机制与乙肝病毒变异、宿主的免疫状态、宿主性别、年龄、遗传基因和肝脏内炎症活动密切相关。然而,隐匿性HBV感染（OBI）在病毒学特征、合并感染、宿主免疫应答以及表观遗传学等方面尚未阐述清楚,特别是感染宿主的分子与细胞免疫功能少有报道。本研究目的为探讨献血人群的隐匿性HBV感染状态,揭示OBI携带者HBV特异性分子细胞免疫反应特征与OBI发生的作用机制。研究对象2016年8月至2017年12月广州血液中心无偿献血者人群。建立的研究队列包括:OBI 组 37 例,CHB 组 53 例（含 CHB-HBeAg-组 42 例,CHB-HBeAg+组 11例）,HBV感染康复组47例,HBV非感染组56例（含疫苗免疫组33例,正常对照组23例）,合计193例。方法采用化学发光法对研究队列血浆样品进行乙肝表面抗原（HBsAg）检测,核酸检测法（NAT）检测HBVDNA,qPCR定量检测病毒载量,巢式PCR进行病毒基因扩增并测定其核苷酸序列。采用HBV Core和HBV Pol多肽库特异性刺激物,体外刺激研究人群外周血单个核细胞（PBMCs）,采用T细胞增殖试验（CFSE）检测T细胞增殖情况,酶联免疫斑点试验（ELISPOT）检测HBV特异性T细胞分泌IFN-γ的频数,细胞内细胞因子染色（ICS）检测 IFN-γ、TNF-α、IL-2、IL-10、IL-17A、IL-21 和TGF-β的CD4+和CD8+T细胞频数及细胞来源,流式微球试验（CBA）检测PBMCs分泌细胞因子的总体水平。采用SPSS 20.0统计分析软件,正态分布的计量资料采用两独立样本t检验,多组间比较采用One-Way ANOVA分析;非正态资料组间比较采用Mann-Whitney U检验,各组间比较采用Mann-Whitney U检验;相关性检验采用Spearman’s相关分析;P<0.05为差异具有统计学意义。结果1.OBI献血者人群特征。研究发现HBcAb阳性的献血者人群OBI发生率较高,特别是在单独HBcAb 阳性者更高;OBI发生率随年龄增长而增高,男性高于女性;OBI毒株基因型以B型为主。2.T细胞增殖特征。采用CFSE方法,在非特异性刺激物PHA刺激下,以CD8+T淋巴细胞增殖为主,总体比较六组研究对象T淋巴细胞增殖结果差异不显着（P=0.403）,但OBI组和CHB组的增殖率低于正常对照组（74.0%,78.1%vs.82.1%）;在特异性刺激物HBV Core和Pol多肽库刺激下,以CD4+T淋巴细胞增殖为主,总体比较六组研究对象T淋巴细胞增殖结果差异显着（P<0.001）,其中OBI组和CHB组的增殖率显着高于正常对照组（3.0%,3.3%vs.1.7%）,差异显着（3.0%vs.1.7%,P=0.016;3.3%vs.1.7%,P<0.001）。3.特异性IFN-γ分泌T细胞频数测定。采用ELISPOT检测方法,在PHA刺激下,OBI组和CHB组特异性T细胞的免疫应答高于其他三组,差异显着（P=0.004）。在三种重组蛋白（HBcAg,HBsAg-ayw,HBsAg-adw）和多肽库的刺激下,总体比较六组研究对象特异性T细胞应答强度,结果差异显着（P<0.05）。OBI组（160 SFC/106 PBMCs）对HBcAg重组蛋白刺激的应答强度高于正常对照组（95 SFC/106 PBMCs）,低于CHB-HBeAg-组（208 SFC/106 PBMCs）。在HBV Core和Pol多肽库刺激下,OBI组（25 SFC/106 PBMCs）和CHB-HBeAg-组（25 SFC/106 PBMCs）的应答强度均高于正常对照组（5 SFC/106 PBMCs）。比较两种多肽刺激下的总体阳性反应率,HBV Core多肽库显着高于HBV Pol多肽库（44.6%vs.16.1%）,HBV Core多肽库刺激下的T细胞ELISPOT阳性反应率以OBI组（64.0%）最高,其次是HBV感染康复组（53.2%）,显着高于正常对照组（21.7%）。4.胞内细胞因子T细胞频数及胞外分泌型细胞因子水平测定。ICS检测结果显示,在PMA刺激下,分泌IFN-γ、TNF-α、IL-2、IL-10和TGF-β的CD4+和CD8+T细胞频数在OBI组和CHB组中均高于正常对照组（P<0.05）,而分泌IL-17A和IL-21的T细胞频数在OBI组均低于CHB组（P<0.05）。在HBV Core多肽库刺激下,分泌IFN-γ、TNF-α、IL-17A、IL-21 和TGF-β的CD4+和CD8+T细胞频数在HBV感染康复组中高于OBI组和正常对照组（P<0.05）;而分泌IL-2和IL-10的T细胞频数在OBI组和CHB组中高于正常对照组（P<0.05）。在HBV Pol多肽库刺激下,分泌IFN-γ、TNF-α、IL-17A和IL-21的CD4+和CD8+T细胞频数在CHB组显着低于其他组（P<0.05）,而分泌IL-10和TGF-β的CD4+T细胞频数在OBI组显着低于其他组（P<0.05）。胞外分泌型细胞因子水平CBA检测结果显示,在HBV Core多肽刺激下,IFN-γ、IL-2、IL-10和IL-17A在OBI组和CHB组中高于正常对照组（P<0.05）;在HBVPol多肽刺激下,IFN-γ、IL-2和IL-17A在OBI组和CHB组中高于正常对照组（P<0.05）。ICS与CBA实验检测细胞内、外因子结果基本一致。5.MDSCs水平测定。根据细胞亚群计数显示,OBI携带者外周血中M-MDSCs水平显着低于CHB患者（P<0.001）,而与正常对照组差异不显着（P=0.860）;G-MDSCs水平在五组人群中无差别（P=0.914）。OBI携带者和CHB患者外周血中 M-MDSCs 和 G-MDSCs 水平与 ALT、AST、TBIL、DBIL、TBA、ALB、ADA、CHE、γ-GT和TP等肝功能指标无相关性（P>0.05）。结论OBI携带者和CHB患者均呈现显着高于HBV感染康复者及非感染者的HBV特异性T淋巴细胞增殖反应;OBI携带者与HBV感染康复者及CHB患者均呈现显着的特异性分泌IFN-γ的T细胞频数增高,以OBI组阳性反应率最高,HBV感染康复组和CHB-HBeAg-组次之,CHB-HBeAg+组最低;HBV感染康复组特异性分泌IFN-γ、TNF-α、IL-17A和IL-21细胞因子的CD4+和CD8+效应T细胞频数显着增高,而OBI组和CHB组分泌IL-10细胞因子的抑制T细胞频数增高,CHB组效应T细胞频数较低而OBI组分泌IL-2和IL-17A的T细胞频数相对升高;CHB组分泌IL-10细胞因子水平增高,而OBI组分泌IL-17A细胞因子水平相对较高。因此,OBI携带者的HBV特异性T效应细胞反应水平居于HBV感染康复者与CHB患者之间,而CHB患者T抑制细胞反应水平较高,从而导致了三组HBV感染者的不同转归状态。创新之处1.献血者人群通常为未经抗病毒等治疗的健康人群。本论文以HBV感染不同转归状态的献血者为研究对象,排除了抗病毒治疗等干扰;采用新鲜分离的PBMCs进行实验,避免了淋巴细胞由于冻存和复融发生死亡和免疫功能的改变对结果的影响。2.与以往研究选用HBV重叠多肽不同,本研究合成的HBV Core和HBV Pol多肽是经研究证实能刺HBV产生特异性细胞免疫应答的HLA-Ⅰ型和HLA-Ⅱ型限制性多肽,结果更能反应HBV感染后不同转归人群对T淋巴细胞免疫应答状态。3.本研究根据HBV感染献血者不同转归状态,分析了 T细胞亚群分泌的七种特异性细胞因子的频数及分泌型细胞因子的水平,阐明了 OBI携带者、CHB患者及HBV感染康复者的三种转归状态的分子细胞免疫基础。
王方平[5]（2017）在《雌激素与慢性丙型肝炎患者RIG-Ⅰ信号通路关系的研究》文中进行了进一步梳理第一部分慢性丙型肝炎患者体内RIG-Ⅰ信号通路的研究研究背景丙型肝炎病毒（Hepatitis C virus,HCV）是一种单股正链RNA病毒,主要有6种基因型和超过70种亚型。据世界卫生组织估计全球大约有1.85亿人感染HCV,占世界人口的3.2%,同时每年大约有300到400万新发病例。急性丙型肝炎（Acutehepatitis C,AHC）大多是无症状的,其中55%-85%感染者不能清除该病毒并最终发展为慢性丙型肝炎（Chronic hepatitis C,CHC）,经过20～30年的时间大约有10%-20%患者发展为肝硬化,1%-7%患者发展为肝癌（Hepatocellular carcinoma,HCC）。传统的治疗方法是聚乙二醇干扰素联合利巴韦林方案,但是抗病毒疗效不佳并且不良反应较大;新型直接抗病毒药物（Direct-acting antiviral agents,DAAs）仍依赖聚乙二醇联合利巴韦林,且具有副作用及未知禁忌症。CHC的治疗及发病机制的研究,仍然是基础医学和临床医学探讨的热点。有研究表明,人感染HCV后,男性较女性更容易发展为慢性肝炎、肝硬化甚至肝细胞癌。这种性别与HCV感染转归差异的机制仍不清楚。目前,越来越多的证据表明,固有免疫在机体清除病毒或抗病毒治疗中起到非常重要的作用,因此,本文将就性别与固有免疫中RIG-Ⅰ及干扰素信号通路的关系进行探讨。研究目的1.了解CHC患者和健康人RIG-Ⅰ与干扰素基因表达量的差异。2.了解不同性别CHC患者体内RIG-Ⅰ与干扰素基因表达量的差异。研究方法1.研究对象:选择2014年7月至2016年7月在武汉大学人民医院感染科就诊CHC患者作为研究对象。所有患者HCV基因型均为1b型,诊断符合《丙型肝炎防治指南》,排除自身免疫系统疾病,其他系统严重疾病及感染性疾病。并选择同期体检健康人作为对照。2.实时荧光定量PCR检测:本研究所用引物利用美国国立生物技术信息中心（National Center of Biotechnology Information,NCBI）网站中提供的 RIG-Ⅰ、干扰素mRNA序列和BLAST进行引物设计,采用实时荧光定量PCR检测RIG-Ⅰ、IFN-α、IFN-β和 GAPDH mRNA 表达量。3.统计分析:用SPSS 20.0软件对数据进行分析。正态分布的计量资料用均值（标准差）表示,非正态分布的计量资料采用均值（四分位间距）表示,计数资料采用百分数表示。两样本均数间比较采用t检验,多个样本均数间两两比较用SNK检验,计量资料比较采用卡方检验,相关性分析使用Pearson（正态分布）或Spearman法（非正态分布）。以P<0.05为差异有统计学意义。研究结果1.与健康人相比,CHC患者肝功能指标ALT、AST、ALP、GGT、PA、TP、ALB、GLB、TBIL和DBIL明显异常,且hs-CRP升高,PT-act下降,差异有统计学意义。2.CHC患者RIG-Ⅰ、IFN-α和IFN-β基因表达量明显低于健康人,差异有统计学意义。3.RIG-Ⅰ、IFN-α和IFN-β基因表达量在男性和女性CHC患者间比较,差异无统计学意义。4.育龄期女性CHC患者RIG-Ⅰ、IFN-α、IFN-β基因表达量明显高于绝经后CHC患者和男性CHC患者;而绝经后女性CHC患者和男性CHC患者RIG-Ⅰ、IFN-α、IFN-β基因表达量比较,差异无统计学意义。5.CHC患者RIG-Ⅰ基因表达量与IFN-β基因表达量成正相关,与IFN-α基因表达量无相关性。研究结论1.CHC患者RIG-Ⅰ、IFN-α和IFN-β基因表达量明显下降,且RIG-Ⅰ基因可通过调节IFN-β基因表达量发挥抗病毒作用。2.育龄期女性患者IFN-α、IFN-β、RIG-Ⅰ基因表达量较高,抗HCV力强于绝经后女性患者和男性患者。第二部分雌激素对慢性丙型肝炎患者外周血单个核细胞RIG-Ⅰ信号通路的影响研究背景本课题前期研究表明,女性感染HCV后其体内RIG-Ⅰ及干扰素基因与男性相比无明显差异,但育龄期妇女较绝经后妇女和男性患者RIG-Ⅰ及干扰素基因明显升高,差异具有统计学意义。因此本文旨在探讨雌激素对慢性丙型肝炎患者外周血单个核细胞（Peripheral blood mononuclear cell,PBMC）中 RIG-Ⅰ 抗病毒信号通路的影响,为临床寻找新的更有效的CHC治疗方法提供有力证据。研究目的探讨雌激素对慢性丙型肝炎患者PBMC中RIG-Ⅰ及干扰素基因表达量的影响。研究方法1.慢性丙型肝炎患者PBMC提取和培养:选择2014年7月至2016年7月在武汉大学人民医院感染科就诊且未治疗的CHC患者6例,男性和女性患者各3例,诊断符合《丙型肝炎防治指南》。所有患者HCV基因型均为1b型,排除自身免疫系统疾病,其他系统严重疾病及感染性疾病。选择同期体检健康者6名作为对照,男性和女性各3名。采用Ficoll单次密度梯度离心法提取单个核细胞。在37℃ 5%二氧化碳培养箱中培养。2.实时荧光定量PCR检测:利用美国国立生物技术信息中心（National Center of Biotechnology Information,NCBI）网站中提供的 RIG-Ⅰ、干扰素 mRNA 序列和BLAST进行引物设计,采用实时荧光定量PCR检测RIG-Ⅰ、IFN-α、IFN-β和GAPDH mRNA表达量。3.统计分析:用SPSS20.0软件分析雌激素对不同性别组间RIG-Ⅰ、IFN-α和IFN-β基因表达量的影响。正态分布的计量资料用均值（标准差）表示,两样本均数间比较采用t检验,多个样本均数间两两比较用SNK检验,对服从正态分布的数据相关性分析使用Pearson法,不服从正态分布的数据相关性分析使用Spearman法。以P<0.05为差异有统计学意义。研究结果1.在健康对照组中,男性PBMC加入干扰素刺激后RIG-Ⅰ基因表达量较未加干扰素刺激对照增加了 3.07倍;而女性PBMC加干扰素刺激后RIG-Ⅰ基因表达量较未加干扰素刺激对照增加了 5.28倍。2.单独用干扰素刺激男性CHC患者和男性健康对照者PBMC后,RIG-Ⅰ基因表达量比较,差异无统计学意义（t=0.82,P =0.45）。而单独用干扰素刺激女性CHC患者和女性健康对照者PBMC后,RIG-Ⅰ基因表达量比较,差异有统计学意义（t=4.34,P=0.01）。3.在男性CHC患者中,单独用干扰素刺激PBMC后RIG-Ⅰ基因表达量明显增加,是未加干扰素刺激对照的2.58倍;干扰素预刺激PBMC后,再加入雌激素刺激,RIG-Ⅰ基因表达量较单独干扰素刺激对照显着增加（t=7.56,P<0.001）;干扰素预刺激PBMC后,用雌激素拮抗剂ICI182780作用PBMC 4h,再加入雌激素刺激,RIG-Ⅰ基因表达量较未加雌激素拮抗剂作用对照显着下降（t=7.35,P<0.001）。4.在女性CHC患者中,具有与男性患者相同的结果。单独用干扰素刺激PBMC后RIG-Ⅰ基因表达量也明显增加,是未加干扰素对照的2.23倍;干扰素预刺激PBMC后,再加入雌激素刺激,RIG-Ⅰ基因表达量较单独干扰素刺激对照显着增加（t=8.98,P<0.001）;干扰素预刺激PBMC后,用雌激素拮抗剂ICI182780作用PBMC4h,再加入雌激素刺激,RIG-Ⅰ基因表达量较未加雌激素拮抗剂作用对照显着下降（t=7.86,P<0.001）。5.单独干扰素,干扰素加雌激素以及干扰素结合雌激素拮抗剂加雌激素,分别刺激CHC患者PBMC发现,IFN-α、IFN-β基因表达量差异无统计学意义（P均>0.05）。研究结论1.干扰素能增加健康人PBMC中RIG-Ⅰ基因表达量。2.干扰素能增加CHC患者PBMC中RIG-Ⅰ基因表达量,女性患者增加更显着。3.雌激素通过协同干扰素增加RIG-Ⅰ基因表达量机体抗病毒能力。4.雌激素对IFN-α、IFN-β基因表达量无影响。
王阳[6]（2016）在《利巴韦林通过增强浆细胞样树突状细胞活化发挥抗丙型肝炎病毒的作用》文中指出在过去的几十年中,利巴韦林成为治疗慢性丙型肝炎（chronic hepatitis C,CHC）的主要药物。与干扰素单独疗法相比,利巴韦林联合干扰素疗法可使持续病毒学应答（sustained virological response,SVR）显着上升。随着DAAs的出现,HCV的治疗已进入无干扰素时代。目前DAAs临床试验显示,利巴韦林仍不可或缺。然而,利巴韦林抗HCV的作用机制至今尚不明确。最近研究表明,利巴韦林联合DAA-sofosbuvir可恢复HCV患者体内内源性IFNa-2的分泌。但是目前尚不清楚哪种细胞类型使得内源性IFNa-2分泌恢复,利巴韦林是否参与此过程。在感染的肝细胞中,HCV的NS3-4A通过清除MAVS和TRIF而阻断I型干扰素生成。因此,在感染的肝脏中,未感染的肝细胞或其他细胞可能是IFN-I的来源。在这些细胞中,p DCs是人体内IFN-I主要生成细胞。体外研究表明,HCV感染肝细胞可以通过细胞接触的方式启动TLR-7介导的p DCs激活,产生大量IFN-I。在HCV患者接受利巴韦林治疗的过程中,p DCs会受到HCV感染肝细胞及利巴韦林的作用。因此,我们提出假设,利巴韦林通过调节p DCs的活化状态,发挥抗HCV的作用。本课题将从两部分展开研究:第一部分利巴韦林调节p DCs活化状态研究。采用p DC-Gen2.2细胞系,首先使用TLR7或TLR9配体R848、Cp GA/B激活p DCs,然后加入不同浓度的利巴韦林,测定不同时间点IFN-a水平及细胞内IFN-a,IFN-β表达水平,观察利巴韦林对p DCs活化状态的调节;使用FACS检测单个细胞水平IFN-a的变化;使用TLR9配体Cp G A分别作用于PBMCs、p DC-depleted PBMCs,观察IFN-a分泌情况。为了研究利巴韦林调节p DCs活化的作用机制,检测利巴韦林对p DC的IRF-7及其他转录因子（IRF-9和STAT1）及ISGs表达的影响;采用p DC-Gen2.2细胞系,刺激前使用IFNAR-Ab处理细胞,观察IFNAR-Ab对利巴韦林作用的影响;实验结果如下:所有的配体（R848/Cp GA/Cp GB）均可激活p DC-Gen2.2产生IFN-a。利巴韦林单独不能刺激该细胞分泌IFN-a,但可使TLR7、TLR9介导的IFN-a分泌增加1倍,并且该作用具有时间依赖性和浓度依赖性;利巴韦林和Cp GA同时刺激p DC-Gen2.2可使IFN-a、IFN-β表达水平升高,但对IFN-γ、IL-29、IL28B表达无影响。使用FACS检测显示,在单个细胞水平上,利巴韦林可促使Cp GA介导的IFN-a分泌增加。使用Cp G A刺激PBMCs,可以得到与p DC-Gen2.2一致的结果;但p DCdepleted PBMCs对Cp G A反应性显着降低。在p DC-Gen2.2细胞中,与IFNAR-Ab未处理组相比,IFNAR-Ab处理组的IFN-a分泌水平普遍降低,但利巴韦林仍可使Cp GA介导的IFN-a分泌增加。在m RNA水平上,利巴韦林使经Cp GA刺激后的p DC-Gen2.2表达IRF-7、IRF-9和STAT1及TRIM22、PKR 5和OAS-1增加。第二部分利巴韦林通过调节p DCs活化状态抑制HCV的研究本部分使用H77S.3/Gluc2A感染细胞,在该感染细胞内HCV RNA可活跃复制,检测Gluc能反应HCV RNA复制水平。首先检测该细胞系对不同浓度外源性干扰素的反应性;其次,检测H77S.3/Gluc2A感染细胞与p DC-Gen2.2共培养能否激活p DC-Gen2.2分泌IFN-a并抑制HCV RNA复制;最后检测利巴韦林/Cp G A激活的p DC-Gen2.2能否有效抑制H77S.3/Gluc2A感染细胞中HCV RNA的复制,并研究其相关因素。实验结果如下:10u/ml-1000u/ml干扰素均可有效抑制H77S.3/Gluc2A感染细胞中HCV RNA的复制。在第3天,10u/ml干扰素可抑制HCV RNA复制达50%,100u/ml和1000u/ml也可达到同等抑制水平。利巴韦林单独不能抑制HCV RNA复制。在H77S.3/Gluc2A感染细胞与p DC-Gen2.2共培养系统中,Cp G A可有效激活p DC-Gen2.2分泌IFN-a,并抑制HCV RNA复制;加入利巴韦林,可使该系统内IFN-a分泌增加,HCV RNA复制抑制效果更明显。综上所述,我们发现利巴韦林单独不能激活p DC-Gen2.2分泌IFN-a,但是可促使TLR7/TLR9介导的IFN-a表达增加。使用H77S.3/Gluc2A感染细胞,建立H77S.3/Gluc2A感染细胞和p DC-Gen2.2共培养系统,我们发现利巴韦林单独不能抑制HCV RNA复制,但是明显增强了p DCs抑制HCV RNA复制的功能。这些研究证实了利巴韦林通过增强p DCs活化和IFN-a分泌发挥抗HCV的作用。
平玉,李志勤,王盟,胡金星,张震,黄岚,张毅[7]（2016）在《干扰素联合利巴韦林对慢性丙型肝炎患者CD8+T细胞亚群功能的影响》文中研究指明目的:探讨干扰素联合利巴韦林对慢性丙型肝炎患者外周血中CD8+T细胞亚群功能的影响。方法:密度梯度离心法从慢性丙型肝炎患者外周血中获取外周血单个核细胞,体外给予干扰素和（或）利巴韦林处理。用流式细胞术检测外周血单个核细胞中CD8+T细胞分泌干扰素γ和穿孔素（Perforin）的水平;用实时荧光定量聚合酶链反应检测外周血单个核细胞中干扰素相关基因IRF7和IFIT1的表达。结果:细胞内因子检测发现干扰素联合利巴韦林处理能增加CD8+T细胞中效应性T细胞分泌干扰素γ和Perforin的水平（P<0.05）,同时能增加中心记忆性T细胞和效应记忆性T细胞分泌Perforin的水平（P<0.05）;基因转录水平的检测发现干扰素联合利巴韦林处理后干扰素调节基因IFIT1的表达增加（P<0.05）。结论:慢性丙型肝炎患者的外周血单个核细胞体外经干扰素联合利巴韦林处理后,CD8+T细胞的杀伤功能增强。
张曹庚[8]（2016）在《基因1型慢性丙型肝炎代偿期肝硬化PR治疗的疗效和长期随访及血清IL-35、IL-17与慢性丙肝疾病进展的关系》文中认为【目的】探讨基因1型慢性丙型肝炎代偿期肝硬化患者使用聚乙二醇干扰素α-2a联合利巴韦林（PR）抗病毒治疗的疗效和长期获益。研究慢性丙型肝炎不同疾病阶段的患者血清中白细胞介素（IL）-35、IL-17的表达水平与疾病进展的相关性。【方法】1.采用平行对照回顾性队列研究,对54例基因1型慢性丙型肝炎代偿期肝硬化患者予PR治疗,并予集落刺激因子等对症治疗,为期5年的长期随访。评估疗效、复发率,肝脏瞬时弹性超声成像检测肝脏硬度值（Stiffness值）,比较持续病毒学应答（SVR）组和非持续病毒学应答（NSVR）组的临床事件（肝性脑病、腹水、消化道出血、肝癌或者死亡）发生情况。2.31例慢性丙型肝炎（CHC）患者、26例丙型肝炎肝硬化（LC）患者、8例丙型肝炎肝癌（HC）患者及23例健康对照（NC）者,采集外周血。采用ELISA法检测其血清中IL-35、IL-17的水平。所有研究对象均进行血常规、肝功能、AFP检测,患者组检测HCV基因型和HCVC RNA载量。采用Spearman相关性分析研究血清中IL-35、IL-17与各临床指标的相关性。【结果】1.54例基因1型慢性丙型肝炎代偿期肝硬化患者接受了PR治疗,获得SVR的患者有35例（64.81%）。15/23例（65.22%）患者在第一次抗病毒治疗后获得SVR,9/14例（64.29%）、8/13例（76.92%）、2/3例（66.67%）、1/1例（100%）患者分别在第二、三、四、五次抗病毒治疗后获得SVR。仅有1例（2.78%）患者在停药30周后出现复发。抗病毒治疗期间,患者的肝硬度值得到不同程度的改善,其中SVR组的变化有统计学意义（P=0.0004）。结束治疗后的长期随访发现,SVR组患者的肝硬度值有进一步下降的趋势,并能保持在一个较低的水平,NSVR组患者的肝硬度值没有改善。在平均为期60个月的随访中,非SVR组新增3例肝癌患者,SVR组则无人发生。两组的临床事件（腹水、HCC）发生频率的差异有统计学意义[腹水:P=0.0168,RR=0.2353（95%CI 0.039-1.422）],HCC:P=0.0391,RR=0.0000（95%CI infinity）]。2.NC组、CHC组、LC组、HCC组患者血清IL-17的表达水平分别为（36.05±13.69）pg/ml、（54.27±21.73）pg/ml、（50.67±20.43）pg/ml和（40.82±16.23）pg/ml。其中CHC组与NC组、LC组与NC组的差异有统计学意义（P均<0.01）。NC组、CHC组、LC组、HCC组血清IL-35的表达水平分别为（76.96±47.96）pg/ml、（132.9±72.88）pg/ml、（177.2±80.91）pg/ml和（167.00±177.20）pg/ml。各组间的差异有统计学意义（P均<0.05）。Spearman相关性分析发现,LC组血清IL-35表达水平与TBIL呈正相关（r=0.44,P=0.03）。在CHC组和LC组,血清IL-35与IL-17的表达水平呈正相关(rCHC=0.3818,P=0.0410,r LC=0.4364,P=0.0480)。【结论】1.基因1型慢性丙型肝炎代偿期肝硬化使用PR能有效抑制病毒,对症治疗不良反应可提高患者治疗依从性。既往治疗失败患者,多次治疗及延长疗程能提高SVR率。获得SVR后的复发率低,减少肝癌等临床事件的发生,缓解肝硬化进展。2.慢性丙型肝炎和肝硬化患者的血清IL-35和IL-17的表达水平呈正相关。肝硬化患者体内血清IL-35的表达水平与TBIL呈正相关。IL-17可能促进了肝硬化的发展。IL-35可能是影响丙型肝炎肝癌发病的重要因素之一。
韩荔芬[9]（2015）在《慢性丙型肝炎患者中CD4+CD25+CD127-调节性T细胞的表达及意义》文中认为目的:探讨CD4+CD25+CD127-调节性T细胞在慢性丙型肝炎（HCV）患者中的表达及其临床意义。方法:收集慢性丙型肝炎患者67例（其中35例为吸毒丙肝患者,32例为非吸毒丙肝患者）,健康体检人员32例作为对照,采用流式细胞仪检测患者外周血中CD4+CD25+CD127-调节性T细胞的表达;应用实时荧光定量PCR的方法检测其HCV RNA含量。研究HCV感染者和正常人外周血CD4+CD25+CD127-Treg的频率功能,了解CD4+CD25+CD127-Treg对HCV感染的影响;通过对比肝功能正常与异常慢性丙型肝炎患者外周血CD4+CD25+CD127-Treg细胞的表达水平,探讨肝功能对该细胞表达水平的影响;分析CD4+CD25+CD127-Treg细胞与丙肝病毒RNA定量的相关性;通过对比吸毒丙肝患者及非吸毒丙肝患者外周血CD4+CD25+CD127-Treg的频率功能,探讨吸毒对丙肝患者Treg的影响。对比部分非吸毒丙肝患者抗病毒治疗前后外周血CD4+CD25+CD127-Treg细胞的水平变化,了解抗病毒治疗对免疫功能的影响。结果:慢性丙型肝炎患者中的吸毒感染组与非吸毒感染组的外周血中CD4+CD25+CD127-调节性T细胞在CD4+T细胞中所占百分比分别为:3.84±1.95%、4.44±1.67%,均明显低于对照组6.10±1.65%（P<0.01）,结果具有统计学意义;而吸毒组与非吸毒组慢性HCV患者血液CD4+CD25+CD127-调节性T细胞的表达值相比差异无统计学意义。慢性丙型肝炎患者抗病毒治疗前血液CD4+CD25+CD127-调节性T细胞的表达值明显低于治疗后组和正常对照组（P<0.01）,差异有统计学意义。CD4+CD25+CD127-Treg细胞与HCV RNA的表达水平的相关性,拟合模型均未提示有相关性,且按HCVRNA水平分成<1×104copies/ml组（14例）、1×1041×106copies/ml组（27例）及≥1×106 copies/ml组（26例）,通过F检验结果显示,亦没有存在统计学显着性差异。肝功能正常与异常丙肝患者外周血CD4+CD25+CD127-Treg细胞表达值相比,分别采用两样本T检验和Wilcoxon检验,结果均没有存在统计学显着性差异。结论:1.HCV患者治疗前患者外周血CD4+CD25+CD127-调节性T细胞的表达值较正常对照组明显降低,而在治疗有效后升高,说明CD4+CD25+CD127-调节性T细胞参与了HCV患者的机体免疫过程中,而CD4+CD25+CD127-调节性T细胞在外周血中的表达水平可能成为监测HCV患者体内细胞免疫状态和机体抗病毒免疫应答的指标。2.CD4+CD25+CD127-Treg细胞水平与HCV RNA表达水平无显着性差异,与其他研究者结果不一致,具体结论需扩大样本量进一步证实。3.吸毒与否对丙肝患者CD4+CD25+CD127-Treg细胞表达的影响有限,其表达异常主要取决于是否感染丙肝。
陈文林[10]（2014）在《中医辨证治疗难治性丙型肝炎疗效观察及中医证型与T淋巴细胞亚群关系的研究》文中研究指明慢性丙型肝炎是一个严重危害人类健康的公共卫生问题。据WHO统计全球丙型肝炎病毒（HCV）感染率3%,约1.7亿人，每年新发丙肝3.5万例。根据2010年9月国家卫生部公布的最新流行病学调查结果显示，我国抗HCV阳性率为0.43％，大概全国HCV感染者达500多万。HCV自然感染史长，其慢性化率为50%～85%。肝硬化和肝癌是慢性丙型肝炎患者的主要死因，在感染的5～0年后30%～40%将发展为肝硬化，10～20年后5%～7%发展为肝癌。成为现今严重危害人民健康的传染病之一。尽管现代医学在慢性丙型肝炎的治疗上取得一些突破性进展，其三联疗法成为基因1b型等一些难治性丙肝的最新方案。但对于耐药、抗病毒无效者及在治疗中出现药物毒副作用、停药后复发、病毒学突破、部分应答、无效应答或无应答、基因1型或4型HCV感染、高病毒载量（HCV RNA≥1.5×106IU/mL）、合并其他病毒感染,或同时合并其他如糖尿病、甲状腺功能障碍、血友病、器官移植、肾脏疾病及血液透析等自身免疫功能障碍有关的疾病及肝硬化失代偿期等问题的存在，使得丙肝治疗依然是临床难题，即所谓的难治性慢性丙型肝炎。目前由HCV基因1型感染所致的慢性丙型肝炎在我国约占78%,高病毒载量的慢性丙型肝炎约占69%,所以可以说在我国大多数的慢性丙型肝炎属于难治性丙型肝炎。RHC形成复杂，因而其临床表现也多种多样。通过“十一五”对CHC中医症候辨证分型规范研究显示：正虚邪恋、肝郁脾虚、肝肾阴虚三型占所有证型的73%，故虚实夹杂的临床表现是CHC的主要特征，若不实行临床干预，任其进一步发展，必将形成肝硬化等难治性肝病，其预后不佳，对患者生命将形成极大的威胁，对治疗造成巨大的挑战。在RHC治疗方面，并无特别有效的方法。聚乙二醇化a干扰素（PEG-IFN-a）联合利巴韦林进行优化治疗或标准方案联合蛋白酶抑制剂对基因1型的治疗仍然是当前的首要选择。但是由于干扰素、利巴韦林及蛋白酶抑制剂具有难以适应的毒副作用，使RHC治疗更为困惑。因此，进一步探求难治性丙型肝炎免疫发病机制及寻找其治疗的有效方案是医学和临床的迫切需求，中医药以其独特优势，在防治慢性丙型病毒性肝炎方面积累了丰富的经验。从传统的辨证论治、专病专方专药、针灸、单药、民间验方，发展到现在的中西医结合治疗方案，都有中医药作出的贡献。多年的研究也证实，中医药在慢性丙型肝炎的防治中不仅可以缓解患者症状，减轻肝脏炎症，而且能抑制或抗病毒，逆转肝脏早期肝纤维化，减轻西药的毒副作用，延缓其慢性化，增强机体免疫，提高患者生活质量，以达到延长生存期，预防肝硬化、肝癌等终末期肝病，意义重大。目的：本研究在“十一五”慢性丙型肝炎证候规律及中西医结合治疗方案研究的基础上，依托国家“十二五”难治性丙型肝炎的中医药治疗方案，以中药辨证方（益气解毒方、疏肝健脾方、补肾柔肝方）治疗难治性丙型肝炎，观察其临床疗效、转氨酶和HCV RNA转阴率及下降率（HCV RNA下降2log），并对其免疫功能与转氨酶、病毒载量以及中医证型与T淋巴细胞亚群、HCV RNA等相关性进行研究，运用计算机统计学软件进行数据处理和综合分析，以探讨中药辨证方对难治性丙型肝炎的临床疗效以及RHC的病毒载量、肝脏炎症、免疫调节机制与中医证型之间的相关性，以便进一步提高难治性丙型病毒性肝炎的临床治疗水平。方法：实验分三个部分进行第一部分：中医药辨证方治疗难治性丙型肝炎的疗效观察将54例难治性丙型肝炎患者随机、对照分为试验组28例和对照组26例。试验组给予中药辨证方：益气解毒方、疏肝健脾方、补肾柔肝方治疗，对照组给予中药安慰剂治疗。治疗12，24，36，48周后观察并比较2组血HCV RNA阴转率和下降率、肝功能变化及2组中医症状积分变化。第二部分：难治性丙型肝炎患者外周血T细胞亚群分析与病毒载量相关性研究对153例难治性丙型肝炎感染者按基因1b、抗病毒治疗阴转后复发及肝硬化分成3组，分别采用流式细胞术和荧光定量PCR技术分别检测外周血中T淋巴细胞亚群（CD3+T、CD4+T、CD8+T、CD4+T/CD8+T）和HCV RNA载量。另选同期健康体检者150人外周血中T淋巴细胞亚群作为对照组。第三部分：难治性丙型肝炎中医证型与T淋巴细胞亚群及HCV RNA载量等相关性研究对153例RHC患者进行中医证型研究,用流式细胞仪检测其患者和150例正常健康对照者外周血T淋巴细胞亚群变化，荧光定量PCR检测患者RHCRNA含量、基因分型和肝功能检测，观察肝功能、血清RHC RNA载量及T淋巴细胞亚群指标与中医证型之间的关系。结果：第一部分：中医药辨证方治疗难治性丙型肝炎的疗效观察与对照组比较中药辨证方（益气解毒方、疏肝健脾方、补肾柔肝方）组能明显降低转氨酶水平、提高HCV RNA阴转率和下降率（P＜0.05）。第二部分：难治性丙型肝炎患者外周血T细胞亚群分析与病毒载量相关性研究1与对照组相比RHC患者组CD3+T、CD4+T下降有统计学意义（p＜0.05），而CD8+T、CD4+T/CD8+T无统计学意义（p＞0.05）。2高病毒载量患者组与对照组相比较CD3+T、CD4+T下降有统计学意义（P＜0.05），而CD8+T、CD4+T/CD8+T变化无显着差异（P＞0.05），低病毒载量患者组与对照组比较CD8+T下降有统计学意义（P＜0.05）。RHC高病毒载量患者组与低病毒载量患者T淋巴细胞亚群比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。3抗病毒治疗阴转后复发组与对照组比较CD3+T、CD4+T、CD8+T下降明显，差异有统计学意义（P＜0.05）。4肝硬化组与对照组比较CD3+T、CD8+T下降明显，而CD4+T/CD8+T升高明显，差异有统计学意义（P＜0.05）。5基因1b组与对照组相比较CD4+T、CD8+T下降明显，差异有统计学意义（P＜0.05）。6治疗阴转复发组与肝硬化组无统计学意义，与基因1b型比较CD3+T、CD8+T下降明显，差异有统计学意义（P＜0.05）。7肝硬化组与基因1b型组比较CD3+T、CD8+T下降明显、而CD4+T/CD8+T升高明显，差异有统计学意义（P＜0.05）。第三部分：难治性丙型肝炎中医证型与T淋巴细胞亚群及HCV RNA载量等相关性研究1难治性丙型肝炎常见的中医证型依次为正虚邪恋、肝郁脾虚、肝胆湿热、瘀血阻络、肝肾阴虚及脾肾阳虚等六型。2ALT水平与中医证型的关系：即ALT从高到低在各证型中的排列顺序为：湿热中阻型、脾肾阳虚型、肝肾阴虚型、瘀血内阻型、肝郁脾虚型、正虚邪恋型，其湿热中阻型与其他证型相比较ALT明显升高，差异有统计学意义（P＜0.05）； AST水平与中医证型的关系：即AST从高到低在各证型中的排列顺序为：脾肾阳虚型、湿热中阻型、瘀血内阻型、肝肾阴虚型、肝郁脾虚型、正虚邪恋型，其中脾肾阳虚型与与其他类型相比较明显升高，差异有统计学意义（P＜0.05）；ALB与中医证型的关系为：脾肾阳虚型ALB与其他中医类型明显降低，差异有统计学意义（P＜0.05）。3RHC RNA水平与中医证型有一定规律性，即湿热中阻型＞正虚邪恋型＞肝肾阴虚型＞瘀血内阻型＞肝郁脾虚型＞脾肾阳虚型；湿热中阻型与瘀血内阻型、脾肾阳虚型相比较，RHC RNA明显升高，差异有统计学意义（P＜0.05）。4T淋巴细胞亚群指标（CD3+T、CD4+T、CD4+T/CD8+T）与中医辨证分型有一定相关性，与正常对照组相比较湿热中阻型CD8+T明显升高（P＜0.01），CD4+T/CD8+T明显下降（P＜0.05）；脾肾阳虚型和肝郁脾虚型与正常对照组相比较CD3+T、CD4+T明显下降（p＜0.01），CD8+T明显下降（P＜0.05）；正虚邪恋型、瘀血内阻型、肝肾阴虚型与正常对照组相比较（CD3+T、CD4+T、CD4+T/CD8+T）差异无统计学意义（P＞0.05）。5在各证型相比较中脾肾阳虚型T淋巴细胞计数明显下降，与正虚邪恋型、湿热中阻型、瘀血内阻型、肝肾阴虚型差异有统计学意义（P＜0.05）；肝郁脾虚型T淋巴细胞计数明显下降，与湿热中阻型、肝肾阴虚型差异有统计学意义（P＜0.05）；肝胆湿热型T淋巴细胞计数明显升高，与瘀血内阻型、脾肾阳虚型比较差异有统计学意义（P＜0.05）；CD4+T/CD8+T明显下降，与瘀血内阻型比较差异有统计学意义（P＜0.05）。结论：1、中药辨证方能改善难治性丙型病毒性肝炎肝脏炎症，且具有一定的抗病毒作用。2、长期慢性HCV感染会引起机体细胞免疫功能低下和免疫功能紊乱，可能是基因1b型、抗病毒治疗阴转后复发及肝硬化形成难治性的主要原因之一， RHC患者病毒载量高，病毒复制活跃，肝脏炎症亢进，免疫功能低下及免疫紊乱程度随HCV载量增高而逐渐加重。3、RHC中医证型依次为正虚邪恋型、肝郁脾虚型、湿热中阻型、瘀血内阻型、肝肾阴虚型及脾肾阳虚型等六型;4、RHC转氨酶、病毒载量及T淋巴细胞亚群与中医证型有一定相关性。
二、丙型肝炎患者外周血单个核细胞内HCV感染与干扰素疗效反应（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、丙型肝炎患者外周血单个核细胞内HCV感染与干扰素疗效反应（论文提纲范文）
（1）血小板生成素受体激动剂艾曲泊帕对Ⅰ型干扰素通路的作用及机制（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 前言 |
| 材料方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 肝炎病毒感染相关血小板减少的发病机制与治疗 |
| 前言 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 博士期间发表论文 |
| 英文正文一 |
| 英文正文二 |
| 致谢 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
（2）直接抗病毒药物治愈的慢性丙型肝炎患者NK细胞的免疫学特点分析（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 材料与方法 |
| 1 病例入组及相关事宜 |
| 2 实验材料 |
| 3 实验方法 |
| 4 统计学处理 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附录 |
| 附录A:英中文术语和缩略语对照表 |
| 附录B:个人简历 |
| 附录C:攻读硕士学位期间参与的科研项目 |
| 附录D:综述 |
| 参考文献 |
（3）Ⅰ型干扰素和白细胞介素11在肝脏疾病中的免疫功能及干预研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 第一章 绪论乙肝和肝癌治疗研究现状 |
| 1.1 乙肝 |
| 1.1.1 慢性乙型肝炎的诊断及其感染过程 |
| 1.1.2 乙肝病毒特征 |
| 1.1.3 乙型肝炎与STAT信号相关免疫应答 |
| 1.1.4 慢性HBV感染的治疗 |
| 1.1.4.1 核苷类似物的治疗 |
| 1.1.4.2 干扰素的治疗 |
| 1.1.4.3 核苷类似物及干扰素联合治疗 |
| 1.1.4.4 肝炎其他治疗策略及目前肝炎治疗过程中存在的其他问题 |
| 1.1.5 I型干扰素调控免疫细胞功能 |
| 1.1.6. IL-2及其免疫治疗 |
| 1.2 肝癌 |
| 1.2.1 肝癌的分类及诊断 |
| 1.2.2 肝癌的流行病学及发生机制 |
| 1.2.3 肝再生 |
| 1.2.4 肝癌的治疗 |
| 1.2.4.1 手术 |
| 1.2.4.2 肝移植 |
| 1.2.4.3 介入放射 |
| 1.2.4.4 肝癌的化学治疗 |
| 1.2.4.5 免疫治疗 |
| 第二章 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 临床标本 |
| 2.1.2 实验动物 |
| 2.1.3 原代细胞培养相关试剂 |
| 2.1.4 细胞系及培养基 |
| 2.1.5 细菌培养及相关试剂 |
| 2.1.6 质粒及抽提试剂 |
| 2.1.7 RNA体外转录质粒及相关试剂 |
| 2.1.8 细胞因子及小分子抑制剂 |
| 2.1.9 细胞分离和纯化试剂 |
| 2.1.10 总RNA提取和RT-PCR试剂 |
| 2.1.11 核酸序列 |
| 2.1.12 PCR试剂和核酸电泳试剂 |
| 2.1.13 Western blotting试剂 |
| 2.1.14 流式抗体 |
| 2.1.15 免疫荧光及流式细胞术检测相关试剂 |
| 2.1.16 免疫组化及HE染色试剂 |
| 2.1.17 细胞三维立体培养试剂 |
| 2.1.18 抗原特异性T细胞检测试剂 |
| 2.1.19 ELISA检测试剂 |
| 2.2 实验仪器 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 临床试验 |
| 2.3.1.1 临床试验Ⅰ |
| 2.3.1.2 临床试验Ⅱ |
| 2.3.2 人单个核细胞分离及CD8~+T细胞的纯化 |
| 2.3.3 人肝癌组织基因芯片数据分析 |
| 2.3.4 细胞总RNA提取及RT-PCR检测 |
| 2.3.5 荧光定量PCR检测 |
| 2.3.6 流式细胞术检测 |
| 2.3.7 小鼠血清采集 |
| 2.3.8 放射免疫检测 |
| 2.3.9 免疫荧光实验 |
| 2.3.10 免疫组化、HE染色、Masson染色及天狼猩红染色实验 |
| 2.3.11 抗原特异性CD8~+T细胞检测 |
| 2.3.12 ELISA检测细胞因子 |
| 2.3.13 RTCA检测细胞杀伤 |
| 2.3.14 Western blotting |
| 2.3.15 基因缺陷小鼠构建 |
| 2.3.16 小鼠原发肝癌模型构建 |
| 2.3.17 小鼠自发肝癌模型及移植瘤模型构建 |
| 2.3.18 小鼠HBV模型构建 |
| 2.3.19 小鼠肝癌手术切除 |
| 2.3.20 小鼠肝癌模型治疗 |
| 2.3.21 小鼠肝炎模型治疗 |
| 2.3.22 小鼠组织单个核细胞的分离 |
| 2.3.23 统计学分析 |
| 第三章 序贯IL-2治疗有利于提高难治性无应答乙肝患者的免疫功能 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 Peg-IFN-α-2b治疗后多数CHB患者呈现无应答状态 |
| 3.3 Peg-IFN-α-2b治疗后IL-2Rα在CD4~+T细胞表达显着降低 |
| 3.4 体外使用IL-2促进外周T细胞和NK细胞表达IFN-γ及TNF-α |
| 3.5 体外使用IL-2促进人肝脏淋巴细胞表达IFN-γ |
| 3.6 无应答患者序贯使用IL-2治疗可抑制负调免疫应答 |
| 3.7 无应答患者序贯使用IL-2治疗可促进STAT1活化 |
| 3.8 无应答患者序贯使用IL-2治疗可促进分泌IFN-γ及TNF-α |
| 3.9 无应答患者序贯使用IL-2治疗可提高CD8~+T细胞毒性及抗原特异性CD8~+T细胞比例 |
| 3.10 序贯使用IL-2治疗可提高难治性无应答患者临床治疗效果 |
| 3.11 经Peg-IFNα-2b治疗后CHB患者外周血中CD24~+CD38~(hi)B细胞显着增加 |
| 3.12 Peg-IFNα可诱导CD24~+CD38~(hi) B细胞形成并产生大量IL-10 |
| 3.13 CD24~+CD38~(hi)B细胞抑制T细胞及NK细胞抗病毒能力 |
| 3.14 靶向CD24分子可清除CD24~+CD38~(hi)B细胞 |
| 3.15 anti-CD24抗体联合干扰素提高HBV耐受小鼠的治疗效果 |
| 3.16 讨论与总结 |
| 第四章 肝切除通过IL-11-STAT3信号途经促进肝癌术后复发 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 手术后肝癌可复发 |
| 4.3 手术诱导肝癌过度生长 |
| 4.4 手术后IL-11水平升高 |
| 4.5 IL-11信号对术后肝癌生长是必要的 |
| 4.6 抑制IL-11信号可促进肿瘤细胞凋亡 |
| 4.7 Napabucasin可抑制WT鼠肝癌术后复发 |
| 4.8 Napabucasin可抑制Il6~(KO)鼠肝癌术后复发 |
| 4.9 Napabucasin能够抑制同种移植模型中肝癌术后复发 |
| 4.10 Napabucasin可防止IL-11诱导的肝癌过度生长 |
| 4.11 讨论与总结 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读博士学位期间的主要研究成果 |
（4）献血者人群隐匿性乙型肝炎病毒感染分子与细胞免疫特征分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 1. 研究背景 |
| 2. 研究目的与意义 |
| 第一章 隐匿性乙型肝炎病毒感染的鉴定和分析 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 材料与方法 |
| 1.2.1 研究对象 |
| 1.2.2 主要仪器和设备 |
| 1.2.3 主要试剂 |
| 1.2.4 主要溶液的配制 |
| 1.2.5 血清肝功能和HBV血清标志物检测 |
| 1.2.6 血浆HBV DNA提取 |
| 1.2.7 乙肝病毒载量的测定 |
| 1.2.8 BCP/PC、Whole genome、PreS/S片段的扩增 |
| 1.2.9 HBV野毒株全基因参照序列的获取 |
| 1.2.10 OBI样品基因分型 |
| 1.2.11 统计学分析 |
| 1.3 结果 |
| 1.3.1 HBsAg-/DNA+人群的基本特征 |
| 1.3.2 HBsAg-/DNA+样品qPCR的检测 |
| 1.3.3 HBsAg-/DNA+样品Nested-PCR的检测 |
| 1.3.4 HBsAg-/DNA+样品的分类 |
| 1.4 讨论 |
| 第二章 隐匿性乙型肝炎病毒感染T淋巴细胞增殖特征 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 研究对象 |
| 2.2.2 主要仪器和设备 |
| 2.2.3 主要试剂 |
| 2.2.4 主要试剂配制 |
| 2.2.5 外周血单个核细胞的提取 |
| 2.2.6 血清肝功能、HBV血清标志物和病毒核酸检测 |
| 2.2.7 CFSE染色、细胞培养及流式细胞术检测 |
| 2.2.8 统计学分析 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 研究队列基本资料 |
| 2.3.2 PHA刺激下的T淋巴细胞增殖特征 |
| 2.3.3 HBV Core多肽库刺激下的T淋巴细胞增殖特征 |
| 2.3.4 HBV Pol多肽库刺激下的T淋巴细胞增殖特征 |
| 2.4 讨论 |
| 2.4.1 PHA刺激下的非特异性免疫应答 |
| 2.4.2 HBV Core多肽库刺激下的特异性免疫应答 |
| 2.4.3 HBV Pol多肽库刺激下的特异性免疫应答 |
| 第三章 隐匿性乙型肝炎病毒感染特异性分子与细胞免疫反应特征 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 研究对象 |
| 3.2.2 主要仪器和设备 |
| 3.2.3 主要试剂 |
| 3.2.4 主要试剂配制 |
| 3.2.5 ELISPOT检测IFN-γ试验 |
| 3.2.6 ICS检测胞内细胞因子试验 |
| 3.2.7 CBA检测细胞培养液中细胞因子试验 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 ELISPOT检测HBV特异性T细胞分泌IFN-γ |
| 3.3.2 ICS检测T细胞亚群的细胞分泌频数 |
| 3.3.3 CBA检测PBMCs分泌细胞因子水平 |
| 3.4 讨论 |
| 3.4.1 HBV特异性T细胞应答反应 |
| 3.4.2 HBV特异性T细胞亚群分泌频数 |
| 3.4.3 HBV特异性T细胞分泌细胞因子水平 |
| 第四章 隐匿性乙型肝炎病毒感染与髓源抑制性细胞的关系 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 研究对象 |
| 4.2.2 主要仪器和设备 |
| 4.2.3 主要试剂 |
| 4.2.4 血清肝功能、HBV血清标志物和病毒核酸检测 |
| 4.2.5 流式细胞术检测MDSCs |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 研究队列基本资料 |
| 4.3.2 外周血M-MDSCs和G-MDSCs的频数比例 |
| 4.3.3 M-MDSCs和G-MDSCs频数与肝功能指标的相关性 |
| 4.3.4 M-MDSCs和G-MDSCs频数与HBV DNA及HBsAg的相关性 |
| 4.4 讨论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 中英文对照缩略词语表 |
| 攻读学位期间成果 |
| 致谢 |
（5）雌激素与慢性丙型肝炎患者RIG-Ⅰ信号通路关系的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 常用缩略语中英文对照 |
| 前言 |
| 第一部分 慢性丙型肝炎患者体内RIG-Ⅰ信号通路的研究 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 第二部分 雌激素对慢性丙型肝炎患者外周血单个核细胞RIG-Ⅰ信号通路的影响 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 科研成果 |
（6）利巴韦林通过增强浆细胞样树突状细胞活化发挥抗丙型肝炎病毒的作用（论文提纲范文）
| 前言 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 利巴韦林在丙肝治疗中的重要地位 |
| 1.1.1 利巴韦林概述 |
| 1.1.2 利巴韦林联合干扰素是治疗丙型肝炎的标准方案 |
| 1.1.3 干扰素及利巴韦林抗病毒作用机制 |
| 1.1.4 利巴韦林在无干扰素时代仍不可或缺 |
| 1.2 浆细胞样树突状细胞 |
| 1.2.1 浆细胞样树突状细胞概述 |
| 1.2.2 浆细胞样树突状细胞与丙型肝炎 |
| 1.3 本研究使用HCV-1A细胞系-H77S.3/GLUC2A感染细胞 |
| 1.4 本研究的目的和意义 |
| 第2章 利巴韦林调节浆细胞样树突状细胞活化状态的研究 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 细胞株 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 主要仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 利巴韦林增强TLR7/9 介导的pDC-Gen2.2 细胞激活 |
| 2.2.2 pDCs是PBMCs中主要的IFN-a分泌细胞 |
| 2.2.3 利巴韦林增强p DCs活化的作用机制研究 |
| 2.2.4 统计分析 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 利巴韦林增强TLR7/9 介导的pDC-Gen2.2 细胞激活 |
| 2.3.2 pDCs是PBMCs中主要的IFN-a分泌细胞 |
| 2.3.3 利巴韦林增强p DCs活化的作用机制研究 |
| 2.4 讨论 |
| 第3章 利巴韦林调节PDCS活化状态对HCV复制的影响 |
| 3.1 材料和方法 |
| 3.1.1 细胞株 |
| 3.1.2 主要试剂 |
| 3.1.3 主要仪器 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 检测H77S.3/Gluc2A感染细胞对IFN-a及利巴韦林的敏感性 |
| 3.2.2 检测利巴韦林、pDC-Gen2.2 对HCV RNA的影响 |
| 3.2.3 统计分析 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 利巴韦林对Huh7.5 细胞活力的影响 |
| 3.3.2 H77S.3/Gluc2A感染细胞对IFN-a及利巴韦林的敏感性 |
| 3.3.3 利巴韦林/Cp GA、pDC-Gen2.2 对HCV RNA影响 |
| 3.4 讨论 |
| 结论 |
| 本实验创新点 |
| 参考文献 |
| 作者简介及在学期间所取得的科研成果 |
| 致谢 |
（7）干扰素联合利巴韦林对慢性丙型肝炎患者CD8+T细胞亚群功能的影响（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 外周血单个核细胞的分离 |
| 1.3 外周血单个核细胞体外处理及培养 |
| 1.4 细胞内因子检测 |
| 1.5 磁珠分选 |
| 1.6 实时荧光定量聚合酶链反应检测干扰素调节基因IRF7、IFIT1的表达[7-8] |
| 1.7 统计学处理 |
| 2 结果 |
| 2.1 干扰素联合利巴韦林对CD8+T细胞4个亚群比例的影响 |
| 2.2 干扰素联合利巴韦林对CD8+T细胞4个亚群干扰素γ分泌的影响 |
| 2.3 干扰素联合利巴韦林对CD8+T细胞4个亚群Perforin分泌的影响 |
| 2.4 干扰素联合利巴韦林对CD8+T细胞干扰素调节基因IRF7、IFIT1表达的影响 |
| 3 讨论 |
（8）基因1型慢性丙型肝炎代偿期肝硬化PR治疗的疗效和长期随访及血清IL-35、IL-17与慢性丙肝疾病进展的关系（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 缩略词 |
| 绪论 |
| 第一部分 基因1型慢性丙型肝炎代偿期肝硬化PR治疗的疗效和长期随访 |
| 前言 |
| 资料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 第二部分 血清IL-35、IL-17 与慢性丙肝疾病进展的关系 |
| 前言 |
| 资料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 总结 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间取得的学术成果 |
（9）慢性丙型肝炎患者中CD4+CD25+CD127-调节性T细胞的表达及意义（论文提纲范文）
| 附录 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 研究对象和方法 |
| 1. 研究对象 |
| 2. 材料 |
| 2.1 实验主要仪器及器材 |
| 2.2 实验主要试剂 |
| 3. 实验方法 |
| 3.1 采血 |
| 3.2 细胞染色 |
| 3.3 上机检测 |
| 3.4 细胞分析 |
| 3.5 肝功能、抗-HCV和血清HCVRNA定量 |
| 4. 统计学方法 |
| 结果 |
| 1 人口学基本特征比较 |
| 2. 丙肝患者外周血CD4~+CD25~+CD127~-Treg细胞的表达 |
| 3. 非吸毒丙肝患者抗病毒治疗48周前后的比较分析 |
| 4. CD4~+CD25~+CD127~-Treg细胞与HCVRNA定量相关性分析 |
| 5. 肝功能对丙肝患者外周血CD4~+CD25~+CD127~-Treg细胞的影响分析 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（10）中医辨证治疗难治性丙型肝炎疗效观察及中医证型与T淋巴细胞亚群关系的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 中英文缩略词表 |
| 前言 |
| 第一部分 中医药辨证治疗难治性丙型肝炎的疗效观察 |
| 摘要 |
| 1 临床资料 |
| 2 研究方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 第二部分 难治性丙型肝炎患者外周血 T 细胞亚群分析与病毒载量相关性研究 |
| 摘要 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 第三部分 难治性丙型肝炎中医证型与 T 淋巴细胞亚群及 HCV RNA 载量等相关性研究 |
| 摘要 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 讨论 |
| 1 难治性丙型肝炎免疫调节机制及治疗策略 |
| 1.1 难治性丙型肝炎免疫调节机制 |
| 1.2 难治性丙型肝炎的治疗策略 |
| 2 中医及中西医结合对难治性丙型肝炎的认识 |
| 2.1 制定完备的中医辨证分型 |
| 2.2 筛选合理的抗病毒中药作为治疗的切入点 |
| 2.3 加强有效经验方的研究 |
| 2.4 合理的中西医结合治疗 |
| 3 中药辨证方（益气解毒方、疏肝健脾方、补肾柔肝方）来源、组成、功效 |
| 4 本课题的主要研究结果 |
| 4.1 中药辨证方对 RHC 患者临床疗效及数据的建立 |
| 4.2 RHC 患者 T 淋巴细胞亚群免疫特点 |
| 4.3 中医证型与 T 淋巴细胞、病毒载量及转氨酶的相关性 |
| 5 本研究存在的问题 |
| 6 本课题创新点 |
| 7 进一步研究的设想 |
| 结语 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 1 文献综述 |
| 文献参考 |
| 2 附图表 |
| 3 发表文章攻读博士期间发表的论文、科研情况 |
| 3.1 发表论文 |
| 3.2 参与课题 |
| 致谢 |
四、丙型肝炎患者外周血单个核细胞内HCV感染与干扰素疗效反应（论文参考文献）
- [1]血小板生成素受体激动剂艾曲泊帕对Ⅰ型干扰素通路的作用及机制[D]. 马赛. 山东大学, 2021(10)
- [2]直接抗病毒药物治愈的慢性丙型肝炎患者NK细胞的免疫学特点分析[D]. 周文靖. 蚌埠医学院, 2019(01)
- [3]Ⅰ型干扰素和白细胞介素11在肝脏疾病中的免疫功能及干预研究[D]. 王冬耀. 中国科学技术大学, 2019(02)
- [4]献血者人群隐匿性乙型肝炎病毒感染分子与细胞免疫特征分析[D]. 张卫云. 南方医科大学, 2018
- [5]雌激素与慢性丙型肝炎患者RIG-Ⅰ信号通路关系的研究[D]. 王方平. 武汉大学, 2017(06)
- [6]利巴韦林通过增强浆细胞样树突状细胞活化发挥抗丙型肝炎病毒的作用[D]. 王阳. 吉林大学, 2016(08)
- [7]干扰素联合利巴韦林对慢性丙型肝炎患者CD8+T细胞亚群功能的影响[J]. 平玉,李志勤,王盟,胡金星,张震,黄岚,张毅. 郑州大学学报(医学版), 2016(03)
- [8]基因1型慢性丙型肝炎代偿期肝硬化PR治疗的疗效和长期随访及血清IL-35、IL-17与慢性丙肝疾病进展的关系[D]. 张曹庚. 上海交通大学, 2016
- [9]慢性丙型肝炎患者中CD4+CD25+CD127-调节性T细胞的表达及意义[D]. 韩荔芬. 福建医科大学, 2015(02)
- [10]中医辨证治疗难治性丙型肝炎疗效观察及中医证型与T淋巴细胞亚群关系的研究[D]. 陈文林. 湖北中医药大学, 2014(12)