一、RNAi及其实验技术进展（论文文献综述）
温婷梅[1]（2021）在《基于CRISPR/Cas9技术的飞蝗突变体构建优化及LmdsRNase2突变体功能研究》文中指出转基因昆虫获得的关键是高效的基因编辑工具、有效的递送技术和稳定的杂交遗传体系。CRISPR/Cas9系统包含Cas9蛋白和sgRNA,具有切割高效、结构简单和操作方便等优势,已经应用于果蝇（Drosophila melanogaster）、家蚕（Bombyx mori）和飞蝗（Locusta migratoria）的转基因品系构建,但CRISPR/Cas9效率的提高,仍然是构建转基因飞蝗首要解决的难题。本文以构建对饲喂双链RNA（dsRNA）敏感的飞蝗品系为目的,选取中肠高表达且降解dsRNA的Lmds RNase2基因为靶标,通过在体内外筛选高效sgRNA位点、优化体内显微注射系统和建立有效杂交策略,建立并优化基于CRISPR/Cas9技术的高效转基因飞蝗构建体系;最终获得稳定的LmdsRNase2-/-转基因品系,通过dsRNA饲喂实验,分析LmdsRNase2-/-飞蝗中不同组织对饲喂不同基因的沉默效率差异,阐明中肠ds RNase2降解饲喂途径dsRNA的机制,同时也提供了一种能够通过饲喂dsRNA进行基因功能研究的新型飞蝗模型。本文主要研究结果如下:一、体内外CRISPR/Cas9基因编辑系统的构建及有效sgRNA筛选首先基于飞蝗Lmds RNase2基因设计了三个sgRNA（sgRNA-545,sgRNA-685和sgRNA-726）,构建表达sgRNA和Cas9的表达载体p Ac-sgRNA-Cas9和含有靶标序列的报告载体p IE4-Rep.e GFP。利用双荧光报告载体系统在细胞水平筛选出高效工作的sgRNA-545和sgRNA-726;分别将两个位点的sgRNA和Cas9蛋白的混合物（RNP）在体外与靶基因片段进行孵育,证实了其在体外具有高效的切割效率。其次通过将RNP注射受精卵确定体内切割效率,将RNP-sgRNA-545和RNP-sgRNA-726分别注射到飞蝗受精卵中,在卵期第5 d通过PCR获得靶位点序列,利用T7核酸内切酶1（T7E1）酶切检测和DNA测序检测,发现RNP-sgRNA-545和RNP-sgRNA-726均能在靶位点处产生典型的插入和缺失突变（indels）。二、体内显微注射卵筛选及注射系统优化提高显微注射后卵的孵化率是获得突变体飞蝗的关键。飞蝗新生卵被卵囊包裹,若产卵后即刻取卵,则卵囊被破坏,未鞣化卵呈现黄色;若经卵囊包裹20 min左右后再取卵,则卵壳发生鞣化变为棕色。分别显微注射未鞣化的黄色卵和鞣化后的棕色卵,发现棕色卵孵化率较高,突变体获得效率增加,其所产生的突变体能够有效遗传至下一代,表明显微注射鞣化后的棕色卵可以提高突变体飞蝗获得效率。对飞蝗胚胎进行细胞核染色发现,早期合胞体分裂发生在产卵4 h后,远长于卵鞣化的时间,这是注射棕色卵能够产生高效可遗传突变的原因。进一步通过抗压能力测试和电镜观察发现,鞣化卵孵化率高的原因是卵壳变硬,卵壳致密度增加,抗感染能力增强。因此,基因编辑飞蝗构建时,应选择产卵20 min后鞣化的棕色卵进行显微注射,并在4 h内完成显微注射操作,可有效提高转基因飞蝗突变体的获得效率。三、转基因飞蝗杂交体系建立及LmdsRNase2-/-纯合品系的获得选取RNP-sgRNA-726进行飞蝗鞣化卵显微注射,卵期检测后继续饲养至成虫,通过剪取触角进行扩增测序,在G0代筛选出12个突变个体,将每个个体单独与野生型进行配对杂交获得G1代卵囊;之后再进行卵囊内测序检测,将有突变的卵囊继续孵化,待5龄时进行取样检测突变个体,将来自同一个卵囊的突变个体进行杂交获得G2代卵囊;同样进行G2代卵囊内测序检测,将有突变的卵囊继续孵化,待5龄时进行取样检测纯合突变个体。将同一突变类型的纯合突变个体进行自交,最后获得了G3代纯合子品系。因此有效的突变品系获得方法为:G0代突变体与野生型杂交获得G1代;G1代中阳性个体自交以获得G2代,G2纯合突变个体自交以扩大种群数量。通过该杂交体系,本研究获得了缺失5 bp的LmdsRNase2-/-飞蝗品系。四、LmdsRNase2-/-飞蝗对饲喂dsRNA敏感性验证取LmdsRNase2-/-飞蝗中肠液与dsRNA进行体外孵育,结果发现dsRNA能够稳定存在于中肠液中而不被降解,表明ds RNase2是中肠中降解dsRNA的关键酶。通过饲喂靶向几丁质关键基因Lm Cht10的ds Lm Cht10,发现其可在表皮、前肠、中肠和后肠有效沉默靶标基因Lm Cht10的表达,且能导致飞蝗蜕皮困难致死,进一步表明LmdsRNase2-/-飞蝗提高了对饲喂dsRNA的敏感性。此外,饲喂飞蝗几丁质脱乙酰基酶Lm CDA2的ds Lm CDA2也能有效沉默靶标基因Lm CDA2的表达,说明LmdsRNase2-/-飞蝗饲喂dsRNA的敏感性具有普遍性。综上所述,成功构建的LmdsRNase2-/-飞蝗能够有效提高饲喂dsRNA的RNA干扰（RNA interference,RNAi）效率,可作为飞蝗基因功能研究的新模型。
刘春艳[2]（2021）在《棉花GhCEN基因调控根系发育的功能初步研究》文中提出棉花是世界范围内天然纤维的主要来源之一,亦是我国重要的大田经济作物,其种植遍及全国多个省、市、自治区,其中最重要的棉花产区是新疆地区。为了降低生产成本提高植棉效益,新疆地区大面积推广机械化采收,在此背景下对利用遗传手段改良棉花株型的重要性的认识日益加深。但是,优良的株型结构需要健壮的根系来保证。CEN（CENTRORADIALIS）基因是棉花株型的关键调控基因,迄今为止,对CEN基因的研究主要集中于其在植物地上部分的功能解析,对其调控根系发育的相关报道鲜有所见。本研究从CEN这一关键基因入手,利用已创制完成的RNAi转基因材料与受体棉花HM-1号组成CEN近等基因系,将地上部分与地下部分结合,通过形态学、转录组比较分析,系统解析CEN基因在棉花根系发育中的调控功能。本项目着眼于解决棉花株型育种中的关键问题,聚焦解析CEN基因在棉花根系发育中的调控功能,为棉花株型育种提供理论支持和技术支撑。主要结果如下:1.观察田间6个RNAi转基因株系表型,发现与对照相比株高显着降低,茎顶端由无限生长变为有限生长,表明CEN基因可调控植株株型;纤维品质检测结果显示GhCEN基因经RNAi后会对衡量品质的4项指标产生影响,即断裂比强度和马克隆值变小,而纤维上半部平均长度和整齐度指数的变化规律与RNA干扰程度有关。2.室内棉花表型鉴定结果显示,与对照HM-1相比,生长32天（6叶龄）的RNAi转基因棉株不在产生新的茎节,现蕾提前,铃柄直接着生在主茎顶端形成顶花,由无限生长变为有限生长。3.对根系的形态学指标测定结果进行分析,发现GhCEN基因经RNA干扰后能使棉花的侧根总长、侧根长变短,GhCEN基因对棉花根系的侧根长起正调控作用。根系表型鉴定结果和地下生物量统计结果显示,GhCEN基因RNA干扰后会对根系发育产生影响,表现为侧根的数目减少、侧根长度变短,地下物质积累变少。4.对RNAi-GhCEN转基因株系RNAi-3和对照HM-1的根和茎组织进行转录组测序,测序共产生了77.11Gb高质量碱基（Clean Data）,每个样品的Clean Data不低于5.81Gb,碱基质量值大于或等于Q30的占93.36%～94.28%。将测序数据与指定的参考基因组（TM-1）进行序列比对的比对效率在94.22%～96.66%之间。在RNAi-3和HM-1的根和茎中筛选出3153个差异表达基因（Differentially expressed genes,DEG）,其中98.7%得到了功能注释。5.对HM-1和RNAi-3根和茎中都表达的DEGs进行分析。GO富集分析结果显示这些DEGs主要富集了氧的结合与运输,氧化还原酶、双加氧酶、2-烯烃还原酶的催化活性,膜（类囊体）和肽酶复合物（线粒体）的组成,固氮作用等;通过KEGG富集分析发现根和茎中都表达的DEGS主要参与了萜类化合物和脂肪酸的生物合成,植物与病原体的互作,内质网中蛋白质的加工,氨基糖、核苷酸糖、氮素等的代谢,RNA的转运与降解,核苷酸剪切修护等过程。6.GhCEN基因（GH＿D07G1075）参与以DNA为模板的转录调控过程,与NAC014、ERF017、ERF1A基因拥有同样的注释功能,编码产物为SCR-like蛋白,可能是通过调节根分生组织细胞的不对称分裂来调控棉花侧根的形成。
温宁[3]（2021）在《RNAi抗虫水稻Csu260-16对靶标害虫二化螟的抗性评价》文中指出水稻是我国最重要的粮食作物之一,二化螟是我国主要水稻产区的重要鳞翅目害虫之一,每年给我国的水稻生产造成严重损失。RNA干扰（RNA interference,RNAi）是一种通过降解或抑制靶标信使RNA（m RNA）的翻译来抑制基因表达的生物学过程。随着RNAi技术的不断发展,基于RNAi的抗虫基因工程作物（Insect-Resistant Genetically Engineered,IRGE）逐渐成为一种害虫治理的有效手段。microRNA（miRNA）通路是三种RNAi信号通路中的一种,因其高效率、精准作用靶点等优点,被认为是一种极具潜力的控制农作物害虫的新策略。表达二化螟内源miRNA Csu-novel-260的IRGE水稻通过抑制disembodied（dib）基因的表达对二化螟具有显着的抗性,从而为控制二化螟提供了一种有价值的策略。在RNAi转基因抗虫作物大规模商业化应用之前,我们要对其进行系统性的抗性评价。本研究以RNAi转基因抗虫水稻转化体Csu260-16和其对照亲本中花11（ZH11）为材料,系统开展了其对靶标害虫二化螟的抗性评价,研究结果可为制定RNAi作物环境安全评价指南提供理论依据和科学数据,为政府监管提供技术支撑。本文主要研究结果如下:1、RNAi抗虫水稻转化体Csu260-16中Csu-novel-260的时空表达分析。qRT-PCR分析表明,Csu260-16转化体叶片中Csu-novel-260水平在苗期表达量最高,分蘖期和孕穗期的表达量显着下降,而在成熟期则再次上升,呈先下降后上升的趋势。与叶片相反,茎秆中Csu-novel-260水平在苗期表达量最低,分蘖期表达量显着增加,之后保持稳定。由此可知,Csu-novel-260在RNAi抗虫水稻不同生育期和不同组织器官中均呈现显着的时空表达特性。为明确靶标害虫在田间对Csu-novel-260的最大暴露量,确定二化螟饲料取食生测中Csunovel-260的剂量梯度,同时又通过绝对qRT-PCR测定了Csu260-16水稻中苗期叶片Csu-novel-260表达量为233.70±68.39 fmol/g鲜重。2、二化螟饲料取食生测和离体水稻组织生测及靶基因表达量测定。采用饲料涂表法对二化螟1龄幼虫进行饲料取食生测。生测前,我们通过qRT-PCR明确了化学合成的Csu-novel-260agomir在二化螟人工饲料中的稳定性,结果表明:Csu-novel-260在人工饲料中超过24 h后,含量显着下降,由此确定:在饲料取食生测中,每隔24 h更换一次涂有Csu-novel-260 agomir的人工饲料。设定7个不同的Csu-novel-260 agomir浓度梯度,分别以添加Csu-novel-260无义序列和蒸馏水处理作为阴性对照和空白对照,对二化螟1龄幼虫进行整个生活史的处理。结果表明:不同浓度处理的二化螟幼虫死亡率显着高于两对照组,但不同浓度Csu-novel-260 agomir处理间没有显着差异。在200 fmol/g Csu-novel-260 agomir浓度处理下,二化螟蛹畸形率最高,且显着高于空白对照组;相应的,在该浓度处理下,二化螟羽化率最低。但Csu-novel-260 agomir不同浓度梯度处理对二化螟幼虫虫重和蛹重无显着影响。采用离体水稻茎秆生测法对二化螟分别进行了为期7 d和28 d的短、长期生测。结果表明:二化螟Cry1C抗性品系和敏感品系在Csu260-16水稻上取食7 d后,与亲本ZH11相比,两品系幼虫存活率均显着下降,同时也说明二化螟Cry1C抗性品系与Csu260-16水稻中表达的Csu-novel-260不存在交互抗性。离体水稻茎秆28 d的长期生测结果表明,Csu260-16水稻上二化螟的死亡率显着高于亲本对照ZH11,且处理28 d后,二化螟死亡率高达87.05%,Csu260-16水稻表现了良好的抗性效果。通过qRT-PCR分析可知,与对照相比,取食Csu260-16水稻的二化螟Csdib基因的表达水平显着下降,说明RNAi抗虫水稻中表达的Csu-novel-260能显着抑制二化螟靶基因的表达。
张文硕[4]（2021）在《转录因子Apontic抑制肿瘤转移的机理研究》文中认为恶性肿瘤是危及人类生命健康的一种严重的疾病,其最大的特点就在于恶性肿瘤细胞会出现扩散和转移现象,进而危及到全身的器官和组织,恶性肿瘤的转移往往是肿瘤治疗失败的主要原因,因此,解析肿瘤细胞转移的机制已经成为国内外研究的热点。近年来,黑腹果蝇由于其具有生活周期短,容易饲养,繁殖力强,染色体少,突变体多等优点,其已经成为研究肿瘤细胞迁移的一个非常重要的生物学模型,有研究表明肿瘤细胞的迁移是一个机制复杂且由多种基因及信号通路参与的过程。越来越多的以果蝇为细胞迁移模型的研究表明,JNK信号通路不仅与细胞凋亡有着极大关系,它还能在发育过程中调控细胞移动和粘附,JNK信号通路的激活往往会导致肿瘤细胞的迁移,所以JNK信号通路在肿瘤细胞的迁移过程中发挥重要作用。在果蝇中Apontic是一个bZIP类转录因子,由于它可以调控多个靶基因的表达,所以在果蝇气管、头、心脏、眼睛、边界细胞等器官发育过程中都扮演着重要角色。此外,Apt在进化上高度保守,其在人类中的同源蛋白FSBP在人体心脏、肝脏、肺、骨骼肌等组织器官中均有表达,但是目前为止,转录因子Apt在细胞迁移运动方面的机制和功能尚不清楚。本研究在果蝇中以转录因子Apt为研究对象,综合运用特异性组织表达系统、免疫荧光抗体染色、Western Blot、实时荧光定量PCR、原核蛋白表达、小鼠抗体制作、双荧光素酶报告实验等技术和方法,探究了Apt对肿瘤细胞迁移的影响并进一步解析了其中的调节机制。本研究获得的主要实验结果如下:（1）在果蝇翅原基中利用RNA干涉技术敲降apt后会发生细胞迁移的现象,我们然后在果蝇翅原基中敲降细胞极性因子scrib来构建了肿瘤细胞迁移模型,随后在此肿瘤模型基础上分别过表达和敲降apt后,发现肿瘤细胞的迁移能力分别被抑制和促进,由此表明转录因子Apt可以抑制肿瘤细胞的迁移。（2）通过免疫荧光抗体染色发现将apt敲降之后JNK信号通路的靶基因puc、mmp1的表达水平都显着升高并且磷酸化的JNK水平也有所上升,由此表明,敲降apt可以激活JNK信号通路。通过体内挽救实验发现转录因子Apt调控细胞迁移是通过JNK信号通路来实现的,并且通过遗传学上下游关系实验我们发现Apt是通过调控JNK信号通路中的元件基因msn来影响JNK信号通路的。（3）通过原核诱导表达、注射小鼠等实验我们获得了Msn的抗体,然后结合免疫荧光抗体染色、实时荧光定量PCR以及双荧光素酶报告实验发现Msn可以负调控JNK信号通路,并且Apt对msn的调控是直接的正调控关系。（4）敲降apt可以引发细胞凋亡,并且当凋亡被抑制后,由敲降apt引起的细胞迁移被抑制,然后进一步发现敲降jnk可以抑制由敲降apt导致的细胞迁移和细胞凋亡,由此表明,敲降apt可以通过JNK信号通路引发细胞凋亡并导致细胞迁移。（5）在果蝇翅原基中过表达人类同源基因fsbp不仅可以抑制由敲降apt引起的细胞迁移也可以抑制由敲降scrib引起的肿瘤细胞迁移,并且过表达fsbp可以抑制由敲降apt引起的JNK信号通路的激活。由此表明,Apt在调控细胞迁移及JNK信号通路方面具有进化上的保守性。综上所述,我们解析了转录因子Apt、JNK信号通路、细胞凋亡三者之间相互作用调节肿瘤细胞转移的可能机制,并初步表明了Apt在调控细胞转移及JNK信号通路方面具有进化保守性。本研究不但进一步拓展了转录因子Apt的生物学功能,而且对于预测和防治恶性肿瘤细胞转移具有重要意义,同时也为临床上对于恶性肿瘤的治疗提供了新的理论依据和研究思路。
刘爱学[5]（2021）在《帕金森病路易小体可视化工具开发和基因治疗初探》文中指出帕金森病（PD）是以投射到纹状体的黑质多巴胺能神经元进行性死亡缺失,导致纹状体中多巴胺水平下降,从而引起以运动障碍为典型临床症状和以α-突触核蛋白发生病理性聚集为特征病变的神经退行性疾病,PD的特征性病变是细胞内路易小体（Lewybodies,LBs）和路易突起（Lewyneurites,LNs）的形成。然而,一直以来,这种特征性病变只能在PD患者或PD模型的死后尸检中,通过病理染色的方法得以确认。目前尚无能够在活细胞或活体状态下,报告路易病小体的分子工具,用于实时观测细胞由健康状态转变成病理状态的发生发展过程,以及在单细胞水平,研究α-突触核蛋白的病理性聚集和细胞状态之间的关系,因此,极大的限制了 PD的研究进程。为此,在该研究中,我们通过融合表达α-突触核蛋白和荧光蛋白（EGFP或tdTomato）,同时结合α-Syn PFFs,开发出在活细胞或活体状态下实时报告α-突触核蛋白病理性聚集的工具,并准备借助单细胞前沿技术,比如脑片电生理技术,单细胞测序技术和单细胞代谢组技术,可以深入比较分析形成α-突触核蛋白病理性聚集的细胞和未形成病理性聚集的细胞,在生理性质,基因表达和代谢小分子方面的差异。为深入探究路易小体的形成和细胞在基因分子水平的变化提供了强有力的工具,同时也为PD的研究工作开辟了新的路径。此外,α-突触核蛋白在散发性和家族性PD的病理进程中都扮演着重要作用。遗传学研究发现,编码α-突触核蛋白的基因拷贝数增加,引起的内源性α-突触核蛋白水平升高,是导致早发性家族性PD的直接原因。α-突触核蛋白基因突变也是导致家族性PD的另一直接原因。病理学研究发现,PD的特征性病理变化,即路易小体（Lewy bodies,LBs）和路易突起（Lewy neurites,LNs）,包含α-突触核蛋白的病理性聚集。因此,靶向α-突触核蛋白是一种潜在的PD治疗手段。在该研究中,我们借助一种强大的中枢神经系统基因投递工具,即跨血脑屏障AAV/PHP.eB病毒,同时结合RNAi和CRISPR/Cas9技术分别靶向α-突触核蛋白的转录和编码基因,成功实现全脑范围内α-突触核蛋白表达水平的下调,进而达到延缓和改善PD模型的运动症状和病理变化,为将来临床开展,以靶向α-突触核蛋白为靶标的基因疗法奠定重要基础。因此,在该研究中,通过聚焦α-突触核蛋白,我们不仅开发了 PD路易小体的可视化工具,同时开创了非侵入式基因治疗在PD小鼠模型中的应用,为PD的基础研究和临床治疗提供了新的视角。
赵志平[6]（2020）在《GDF-15通过孤儿受体GFRAL促进胰腺癌增殖及侵袭转移的机制研究》文中指出研究背景胰腺导管腺癌（Pancreatic ductal adenocarcinoma,PDAC）是消化系统中恶性程度极高、疗效及生存预后极差的肿瘤之一。流行病学研究表明,全世界每年有超过33万人死于胰腺导管腺癌,其总体5年生存率约6%（2%-9%）。由于胰腺癌起病隐匿,进展迅速,大多数患者就医时已经处于中晚期并出现局部浸润及远处转移,因此只有约10%-15%的胰腺癌患者有机会接受根治性手术切除。大多数患者只能采用姑息性手术、化疗、放疗、免疫治疗等疗法,临床疗效收获甚微。因此,深入研究胰腺癌细胞增殖及侵袭转移的分子调控机制,对防治PDAC的增殖及侵袭转移,研发新的早期诊断肿瘤标志物,提高临床患者的生存预后具有重要意义。转化生长因子-β超家族（Transforming growth factor-βsuperfamily,TGF-βs）是一类具有多种生物学功能的多肽类细胞因子,目前研究发现共有33种不同的亚型（TGF-β1,TGF-β2,TGF-β3,Inhibinα,InhibinβA,InhibinβB,InhibinβC,InhibinβE,Nodal,Myostatin,BMP-2,BMP-3,BMP-4,BMP-5,BMP-6,BMP-7,BMP-8A,BMP-8B,BMP-9,BMP-10,GDF-1,GDF-3,GDF-5,GDF-6,GDF-7,GDF-9,GDF-9B,GDF-10,GDF-11,GDF-15,MIS,Lefty A,Lefty B）,能够在细胞形态维持以及细胞分化、增殖、凋亡、衰老、迁移等生物学过程中发挥重要作用。生长分化因子-15（Growth differentiation factor 15,GDF-15）,是转化生长因子-β超家族中生长分化因子亚家族的成员,又称作巨噬细胞抑制因子-1（MIC-1）、非甾体抗炎药物活化基因-1（NAG-1）、前列腺源性生长因子（PDF）、胎盘转化生长因子β（PTGFβ）、胎盘骨形态发生蛋白（PLAB）以及PL74。最早由澳大利亚Bootcov MR等学者在1997年从人源U937骨髓单核细胞c DNA文库中分离出GDF-15。作为TGF-β家族中的一员,GDF-15跟家族中其它成员的氨基酸序列相似性仅为15%-29%。GDF-15基因位于人类19号染色体GRCh38.p13,含有两个外显子和一个内含子,长为7007bp DNA。经转录翻译合成含有308个氨基酸的GDF-15前体蛋白（无活性）,在细胞内经Furin-like蛋白酶切割加工后形成具有生物学活性的分泌型GDF-15,分子量约为30k Da。在生理状况下,GDF-15在除胎盘组织以外的其他组织中不表达或者少量表达;然而在病理状况下,如炎症、应激、损伤、缺血再灌注、心衰、II型糖尿病等,受累的组织器官中GDF-15的表达量显着增多,相应的血浆中GDF-15表达量亦升高。研究报道,在多种类型肿瘤如恶性胶质瘤、睾丸癌、卵巢癌、口腔鳞状细胞癌、葡萄膜黑色素瘤、肺癌、前列腺癌、乳腺癌、结直肠癌、胃癌以及肝细胞癌中GDF-15异常高表达,可以作为检测和判断肿瘤预后的潜在生物学标志物。GDF-15主要由活化的巨噬细胞以及肿瘤细胞分泌,在肿瘤的发生发展过程中扮演重要角色。在胰腺癌中,GDF-15基因受Twist1调控而持续表达,增强胰腺癌细胞增殖及侵袭转移,并诱导细胞对化疗药物产生耐药性,但其具体分子机制有待进一步阐明。胶质细胞源性神经营养因子家族α样受体（Glial-derived neurotrophic factor receptor alpha-like,GFRAL）是胶质细胞源性神经营养因子（GDNF）受体α家族的孤儿受体。研究报道,GDNF蛋白家族有四个成员,即GDNF家族受体-α1（GFR-α1）,GDNF家族受体-α2（GFR-α2）,GDNF家族受体-α3（GFR-α3）和GDNF家族受体-α4（GFR-α4）。其中GFRAL基因定位于人6号染色体,包含有9个外显子,且存在可变剪切体。GFRAL蛋白由395个氨基酸残基组成,在其C-末端有20-30个可伸缩的疏水性氨基酸,N-末端存在一个信号肽。GFRAL蛋白通过糖基磷脂酰肌醇（GPI）锚定在细胞膜上。作为一种单次跨膜蛋白,GFRAL位于细胞内的结构域较短,缺乏向细胞内传导信号的能力,因此在发挥生物学作用时,需要酪氨酸激酶辅助受体Ret来协助GFRAL受体进行信号的传导。来自四个不同的医学研究团队Emmerson PJ,Yang L,Mullican SE和Hsu JY在Nature Medicine和Nature刊文报道,GFRAL局限地表达于小鼠脑干最后区（Area postrema,AP）以及孤束核（Nucleus tractus solitarius,NTS）中的神经细胞膜表面;GFRAL能够与GDF-15特异性结合,其结合率跟GDF-15的浓度呈正相关。在神经细胞膜上形成GDF-15/GFRAL/Ret复合物,激活胞内PI3K-Akt,Erk1/2,MAPK和磷脂酶C（PLC）γ信号通路,从而抑制小鼠的摄食行为,调节新陈代谢,降低体重,改善血糖,能作为严重肥胖、2型糖尿病以及厌食/恶病质治疗的潜在靶标。然而,GFRAL在肿瘤中尚未见相关研究报道。为深入研究GDF-15与孤儿受体GFRAL在胰腺癌中的临床意义及其具体的分子机制,结合前期研究工作基础,我们提出如下研究设想:胰腺导管腺癌细胞能够自分泌分化生长因子GDF-15,作用于胰腺癌细胞自身膜上受体GFRAL,通过GDF-15/GFRAL信号通路,促进胰腺癌细胞增殖及侵袭转移。研究目的1.通过收集临床胰腺癌病例,检测胰腺癌组织及血浆样本中GDF-15、GFRAL的表达情况,分析二者之间表达的相关性,明确其异常表达对PDAC患者临床病理因素及生存预后的影响,为后续的机制研究提供依据。2.检测GDF-15及GFRAL在胰腺癌细胞系中的表达情况,分析二者在细胞水平表达的相关性。3.阐明胰腺癌自分泌GDF-15,可直接与细胞膜受体GFRAL结合,通过GDF-15/GFRAL信号通路,促进胰腺癌细胞增殖及侵袭转移的分子机制。4.构建裸鼠皮下成瘤模型,在动物水平探讨GDF-15及GFRAL对胰腺癌体内成瘤的影响,为开发新的胰腺癌诊治策略提供新思路。研究方法1.采用酶联免疫吸附实验（ELISA）,检测正常人与胰腺癌患者血浆中GDF-15的表达情况,并用Graph Pad Prism 5软件分析GDF-15在正常人及胰腺癌患者血浆中的表达水平。同时,采用免疫组化（IHC）实验在正常人及胰腺癌组织中对GDF-15的表达进行验证。根据胰腺癌患者血浆中GDF-15表达的高低将PDAC病例分为高表达组和低表达组（区分高、低表达组的依据为GDF-15在所有胰腺癌血浆病例中表达的均值）,分别统计上述两组病例间PDAC患者年龄、性别、肿瘤临床分期分级、肿瘤大小以及术后生存预后等临床资料的差异性。2.通过ELISA实验,检测正常胰腺导管上皮细胞系HPDE以及四株胰腺癌细胞系（As PC-1,Bx PC-3,Panc-1和Hs766t）中GDF-15的表达情况,并用Graph Pad Prism 5软件分析GDF-15在正常及胰腺癌细胞系中的表达水平,从而在体外细胞系水平,对GDF-15在临床组织及血浆样本中的表达情况进行验证。3.采用免疫组化（IHC）实验在正常人及胰腺癌组织检测GFRAL的表达情况。根据免疫组化评分的高低将PDAC病例分为高表达组和低表达组,分别统计上述两组病例间PDAC患者术后生存预后等临床资料的差异性;同时,采用WB实验在正常胰腺导管上皮细胞株HPDE以及六株胰腺癌细胞系As PC-1,Bx PC-3,CFPAC-1,Panc-1,SW1990和Hs766t中检测GFRAL蛋白的表达情况。4.采用Graph Pad Prism 5软件,分别在胰腺癌临床样本以及胰腺癌细胞系中,统计分析GDF-15和GFRAL表达量之间的相关性。5.通过免疫荧光（IF）、激光扫描共聚焦（CLSM）等实验技术,在胰腺癌组织石蜡切片以及细胞系中行免疫荧光双标记GDF-15和GFRAL,在激光扫描共聚焦仪器上观察GDF-15及GFRAL在胰腺癌组织及细胞系中表达的共定位情况。采用免疫共沉淀（Co-IP）实验,在胰腺癌细胞系中,从分子水平上来验证GDF-15蛋白与GFRAL蛋白的直接相互作用。6.构建干扰慢病毒Lv-GDF15-RNAi和合成人重组GDF-15（Recombinant human GDF-15）细胞因子,分别下调和模拟上调GDF-15在胰腺癌细胞中的下调和上调表达,并采用CCK-8、Transwell、划痕实验等技术观察GDF-15对胰腺癌细胞增殖、侵袭转移的影响。7.构建过表达慢病毒Lv-EGFP-GFRAL（+）以及其阴性对照慢病毒Lv-EGFP-GFRAL（-）,感染胰腺癌细胞,采用流式细胞筛选出稳定上调表达GFRAL蛋白的细胞,并采用WB实验检测GFRAL蛋白的过表达效率。使用人重组GDF-15细胞因子刺激Lv-EGFP-GFRAL（+）和Lv-EGFP-GFRAL（-）细胞,观察细胞增殖以及侵袭转移能力的改变情况。8.使用4周大小的BALB/c雌性裸鼠作为研究对象,通过接种带有干扰慢病毒Lv-GDF15-RNAi稳定下调表达GDF-15的As PC-1细胞（2×106个/只）构建胰腺癌裸鼠皮下成瘤模型,30天后采用小动物成像系统（IVIS?Spectrum系统）观察GDF-15在裸鼠体内对胰腺癌细胞成瘤的影响。研究结果1.与正常人胰腺组织（7例）以及正常血浆（20例）相比较,GDF-15在胰腺癌肿瘤组织（21例）以及胰腺癌血浆（34例）中显着高表达（P<0.0001）;GDF-15高表达组中胰腺癌患者术后5年生存率明显低于GDF-15低表达组（P=0.0120）。2.在细胞系水平验证GDF-15的表达情况,不同胰腺癌细胞系中的表达水平不一致,其中在As PC-1中表达最高,在Hs766t中表达最低。3.与正常胰腺组织（13例）相比较,GFRAL在胰腺癌组织（117例）中明显高表达;GFRAL高表达组中胰腺癌患者术后5年生存率明显低于GFRAL低表达组（P=0.0272）。且GFRAL在胰腺癌细胞系中的表达情况与临床样本相一致。4.GDF-15及GFRAL在胰腺癌样本中表达的相关性,采用Graph Pad Prism 5软件统计分析发现,GDF-15与GFRAL的表达呈正相关（r2=0.6501,P=0.0009）。5.激光扫描共聚焦显示GDF-15与GFRAL在胰腺癌组织中共定位表达,且免疫共沉淀实验证明GDF-15与GFRAL蛋白能通过直接相互结合来发挥生物学作用。6.人重组GDF-15细胞因子能促进胰腺癌细胞的增殖、侵袭转移;下调GDF-15的表达后,胰腺癌细胞系的增殖及侵袭转移能力显着减弱。慢病毒上调GFRAL表达后,GDF-15对胰腺癌细胞的增殖及侵袭转移能力显着增强。7.在胰腺癌裸鼠皮下成瘤模型体内,与阴性对照组（Lv-GDF15-NC）比较,接种干扰慢病毒Lv-GDF15-RNAi As PC-1细胞组裸鼠皮下的肿瘤质量及体积明显较小（P=0.0286）。研究结论1.胰腺癌患者血浆及组织中GDF-15、GFRAL显着高表达,且与患者临床预后密切相关;可以作为胰腺癌患者临床诊疗的肿瘤标志物。2.在胰腺癌临床样本和细胞系中,GDF-15及GFRAL表达皆呈正相关。3.GDF-15及GFRAL在胰腺癌中共定位表达,且二者能直接相互结合。4.胰腺癌细胞可以自分泌GDF-15。5.GDF-15通过GFRAL受体促进胰腺癌细胞的增殖及侵袭转移。本研究通过深入探讨GDF-15/GFRAL通路对胰腺癌发生发展的影响。首次提出并证实胰腺癌细胞高表达孤儿受体GFRAL,并自分泌GDF-15,通过与PDAC细胞膜受体GFRAL直接相互结合,从而促进胰腺癌增殖及侵袭转移。进一步丰富了PDAC增殖及侵袭转移机制研究的理论宝库,并为临床PDAC增殖及侵袭转移的防治提供了新的潜在靶点。
项园[7]（2020）在《LncRNA CASC2/MiR-124-3p/MKL-1/NFATC1信号通路调控巨核细胞的成熟分化》文中研究指明目的:巨核细胞成熟分化与血小板相关疾病的发生密切相关,转录因子在巨核细胞成熟分化中起着非常重要的作用。先前已有研究表明在小鼠的巨核细胞分化过程中转录因子MKL-1的表达上调。在巨核细胞成熟分化过程中NFATC1是参与调控的又一重要转录因子。目前对转录因子MKL-1及NFATC1如何影响巨核细胞发育的具体分子机制不清楚。本研究旨在找到亟待解决的与巨核细胞成熟分化相关疾病的基础理论的突破点,将从细胞水平和分子水平探讨LncRNA CASC2和hsa-miR-124-3p调控MKL-1与NFATC1的相互作用及其信号通路进而影响巨核细胞成熟分化的作用及机制。方法:本论文使用RNAi技术构建稳定敲降内源基因的巨核细胞系;利用qPCR技术结合免疫印迹实验检测目的基因的mRNA水平和蛋白水平;利用荧光素酶活性实验检测目的基因对荧光素酶报告基因质粒的转录活性的影响;利用染色质免疫共沉淀技术分析MKL-1与巨核细胞成熟分化标记基因启动子的结合情况;通过免疫荧光共定位技术检测MKL-1、NFATC1在巨核细胞中的分布;利用截短突变技术和蛋白免疫共沉淀技术及检测MKL-1、NFATC1蛋白的相互作用的区域;利用RNA IP实验检测目的蛋白与hsa-mi R-124-3p的结合情况;使用吉姆萨染色分析巨核细胞的形态与数目;流式细胞术分析巨核细胞的DNA倍型及检测凋亡率;利用CCK-8技术检测目的基因的表达对巨核细胞增殖的影响。通过上述实验技术从细胞水平和分子水平证明LncRNA CASC2、hsa-miR-124-3p、MKL-1和NFATC1的在巨核细胞成熟分化的作用及机制。结果:通过上述研究得到以下结果:1:干扰内源性的MKL-1和阻断RhoA-MKL-1信号通路可以显着降低巨核细胞成熟分化标记基因的转录与表达,进而影响巨核细胞的成熟分化。MKL-1通过结合到巨核细胞成熟分化标记基因CD41/CD61/C-KIT启动子的CAr G box上促进其转录与表达。而NFATC1能够促进巨核细胞的增殖。2:MKL-1与NFATC1共定位于巨核细胞核中且存在直接的蛋白与蛋白相互作用;NFATC1抑制MKL-1的入核,促进MKL-1核转出。MKL-1不影响NFATC1的转录水平,但是抑制NFATC1的蛋白水平;MKL-1与NFATC1相互作用削弱MKL-1-SRF结合到CD41/CD61/C-KIT启动子的CArG box的能力;MAPK1磷酸化NFATC1进而影响巨核细胞的成熟分化。3:Hsa-miR-124-3p抑制巨核细胞的增殖。Hsa-mi R-124-3p结合到NFATC1和MAPK1启动子的3’UTR上抑制NFATC1和MAPK1的表达。MKL-1通过结合到hsa-miR-124-3p启动子的CArG box上促进hsa-miR-124-3p启动子的转录激活。4:在巨核细胞系中LncRNA CASC2的表达与hsa-mi R-124负相关。LncRNA CASC2促进巨核细胞成熟分化标记基因CD41/CD61/C-KIT的转录与表达。LncRNA CASC2与hsa-miR-124-3p结合发挥海绵作用抑制hsa-miR-124-3p的功能。hsa-miR-124-3p抑制Lnc RNA CASC2的表达。MKL-1通过结合到LncRNA CASC2启动子的CAr G box上促进LncRNA CASC2的转录激活。结论:本论文证明了Lnc RNA CASC2/mi R-124-3p/MKL-1/NFATC1反馈环路调控巨核细胞的成熟分化,为巨核细胞成熟分化异常的相关疾病提供了理论支撑。
陈湘婷[8]（2020）在《CKAP2在增殖型糖尿病视网膜病变中的作用及机制研究》文中指出目的通过增殖型糖尿病视网膜病变（proliferative diabetic retinopathy,PDR）患者组织标本以及体外建立的人视网膜血管内皮细胞（human retinal capillary endothelial cell,HRCECs）在高糖、高糖联合VEGF刺激的细胞模型,逐步探讨CKAP2在PDR模型中的表达情况及其对视网膜血管内皮细胞生物学行为的影响,CKAP2与VEGF的相互作用关系以及CKAP2与p53的相互作用关系,以期初步明确CKAP2参与PDR的分子机制,为PDR的治疗提供新的思路和科学依据。方法1.从无伴视网膜病变的2型糖尿病（T2DM）患者（DM组）、非增生性糖尿病视网膜病变患者（NPDR组）、增殖性视网膜病变患者（PDR组）或年龄、性别、民族匹配的健康人（CON组）共收集36份血样本。分别收集外周血单个核细胞和单核细胞,采用Western blot和q PCR实验分别检测CKAP2和p53的蛋白和m RNA水平。从进行玻璃体切除术的PDR患者（PDR组）和特发性黄斑前膜患者的视网膜前膜患者（IMEM组）收集眼内组织。进行手术时,每组收集9份未稀释的玻璃体样本和3份增殖膜或前膜样本,采用q PCR和组织免疫荧光实验用以检测CKAP2、p53的m RNA和蛋白表达。2.内皮细胞培养基加高糖（30 m M D-葡萄糖,HG组）或人内皮细胞培养基加高糖和VEGF（30 m M D-葡萄糖+30 ng/ml VEGF,VEGF+HG组）培养的HRCECs作为实验组,正常的人内皮细胞培养基加甘露醇（8.3 m M D-葡萄糖+21.7+m M D-甘露醇,HM组）或人内皮细胞培养基加VEGF（8.3 m M D-葡萄糖+30 ng/ml VEGF,VEGF组）作为对照组,分别采用MTT、细胞划痕和内皮细胞管腔形成实验检测细胞的生物学行为。采用Western blot和q PCR实验检测CKAP2蛋白及m RNA表达情况。在HG或/和VEGF组加入CKAP2 RNAi阻断其表达,并检测细胞生物学行为。3.在HG或/和VEGF培养组中,将106μg/ml浓度的Lucentis加入细胞中阻断VEGF,并采用Western blot技术检测CKAP2蛋白表达水平。进一步采用MTT、细胞划痕和内皮细胞管腔形成实验比较阻断CKAP2和VEGF对细胞生物学行为的改变。4.体外阻断p53和CKAP2,观察二者蛋白的表达水平以明确p53与CKAP2的相互作用关系,并阐明CKAP2参与PDR发生的作用机制。结果1.在人外周血和玻璃体液标本中,PDR组的CKAP2蛋白和m RNA表达较其他组显着增高。高糖或高糖联合VEGF培养的内皮细胞增殖、迁移和血管形成能力增强,阻断CKAP2后,HRCECs的增殖、迁移和血管形成能力明显减弱。（P<0.05）。2.雷珠单抗阻断VEGF后会引起CKAP2蛋白的下调。阻断CKAP2和VEGF均能引起HRCECs的增殖、迁移和血管形成能力减弱,但是阻断CKAP2引起细胞增殖和迁移能力减弱程度更明显。3.在外周血及玻璃体液标本中,PDR患者的p53 m RNA表达较其他组显着增高,高糖或高糖联合VEGF刺激HRCECs能引起p53蛋白的明显上调。相对于IMEM患者的视网膜前膜,p53和CKAP2的共定位染色在PDR患者的视网膜增殖膜表现出明显的强荧光共定位。在HRCECs中阻断p53后,VEGF或者高糖+VEGF组的CKAP2蛋白表达下调,阻断CKAP2后未观察到p53蛋白的下调。结论1.高表达的CKAP2通过影响视网膜血管内皮细胞的增殖、迁移和成管能力参与PDR的发生发展;2.CKAP2在参与PDR进展过程中可能受到VEGF的不完全调控;3.CKAP2在参与PDR进展过程中具有比VEGF更强的促进视网膜血管内皮细胞增殖和迁移的能力;4.CKAP2在参与PDR发生过程中同时受p53信号通路的调控。
李瑞敏[9]（2020）在《转录因子dMyc调控果蝇Imd通路先天免疫稳态的分子机制》文中提出果蝇（Drosophila melanogaster）先天免疫主要包括Toll和Imd两条信号通路,它们分别与哺乳动物的TLR（Toll-like Receptor）和TNFR（Tumor Necrosis Factor Receptor）通路高度相似。因此,果蝇是研究人类先天免疫的重要模式生物,它为研究昆虫与人类先天免疫之间的关系架起了桥梁。系统地开展果蝇先天免疫响应的机制研究,不仅有助于揭示果蝇免疫稳态的维持机制,而且对哺乳动物免疫调控机制的深入研究也具有非常重要的科学意义。果蝇的先天免疫是抵抗外来病原微生物入侵的第一道防线。然而,免疫响应的过度激活或不足都会对机体造成不同程度的损伤。因此,为了避免免疫稳态的失衡,果蝇主要是通过精确地激活和有效地抑制Toll或Imd信号通路中的关键因子的表达来实现。当前,除了发现各种激活子和抑制子等参与免疫响应调控外,还发现micro RNA（mi RNA）可以通过靶向免疫信号通路中的基因参与果蝇的免疫响应,但在免疫响应过程中参与免疫调控的mi RNA自身表达是如何被调控的?至今仍不清晰,还需进一步深入研究。众所周知,Myc是生物体中极其重要的转录因子,在多种基本的细胞活动过程中起着至关重要的作用,包括细胞周期、细胞生长、增殖、凋亡等细胞过程。然而,果蝇Myc（Drosophila Myc,dMyc）是否与果蝇的先天免疫反应有关,dMyc是否可以通过调控某个或某几个mi RNA的表达进而参与果蝇先天免疫响应?为此,本论文围绕以上几个重要的科学问题开展了一系列的研究,具体内容如下:1.为确定dMyc在果蝇Imd免疫通路中的功能,利用Gal80ts-tub-Gal4系统构建多种dMyc突变果蝇品系:dMyc高表达果蝇品系、dMyc敲低型果蝇品系以及dMyc和dMyc-RNAi共高表达果蝇品系。在感染大肠杆菌E.coli后,分别检测果蝇Imd通路下游标志性抗菌肽Diptericin的表达。实验结果表明高表达dMyc可以下调Diptericin的表达,暗示其可能是负调控果蝇Imd通路的免疫响应。2.借助多种生物信息学分析手段获得dMyc潜在调控的果蝇Imd通路免疫相关mi RNAs。利用依据Targetscan和mi Randa预测结果的交集获得了可能靶向63个果蝇Imd通路相关基因的mi RNA;进一步利用PROMO网站和Transmi R 2.0数据库得到dMyc潜在调控的mi RNA,再并与本实验室之前的small RNA-seq获得的差异表达mi RNA（DEmi RNA）取交集,结果发现dMyc能够调控12个mi RNA（mi R-10、mi R-1012、mi R-184、mi R-275、mi R-276a、mi R-277、mi R-278、mi R-279、mi R-2b-2、mi R-965、mi R-996和mi R-998）靶向果蝇Imd通路免疫相关的基因。3.通过高表达mi RNA免疫相关筛选,以及dMyc和mi RNA之间的表达正相关性筛选,发现只有dMyc调控的mi R-277能够参与果蝇Imd通路免疫响应。进一步采用双荧光素酶报告系统实验分析mi R-277基因的启动子活性,染色质免疫共沉淀-q PCR实验技术证实dMyc可以通过与mi R-277启动子区直接结合激活mi R-277的转录。4.通过生物信息学分析发现mi R-277的潜在靶基因编码Imd通路中两个关键信号因子imd和Tab2。果蝇S2细胞中双荧光素酶报告实验进一步表明:mi R-277可以直接靶向imd和Tab2-Ra/b的3’UTR,而不是靶向Tab2-Rc的3’UTR。研究结果揭示mi R-277通过抑制imd和Tab2-Ra/b的表达进而负调控果蝇Imd通路免疫响应的分子机制。5.构建了dMyc和mi R-277 sponge（mi R-277 SP）共高表达果蝇品系,在果蝇体内对dMyc和mi R-277在Imd信号通路免疫响应中的作用进行研究。结果发现在dMyc和mi R-277 sponge共高表达果蝇中mi R-277水平恢复至正常水平的背景下,抗菌肽Diptericin、靶基因imd和Tab2均得到一定的恢复。这表明dMyc确实能通过激活mi R-277转录实现对关键免疫信号因子imd和Tab2的抑制,进而抑制抗菌肽Diptericin的表达,从而负调控果蝇Imd信号通路的免疫响应。6.通过对野生型果蝇感染大肠杆菌后Diptericin、dmyc、mi R-277及靶基因imd和Tab2随时间的动态表达模式研究,发现dMyc在免疫响应的中后期阶段发挥其负调控功能,表明为避免果蝇的免疫过度对自身的伤害,dMyc的负调控在果蝇免疫稳态的恢复中起重要的作用。此外,进一步对革兰氏阴性致死菌E.cloacae感染的dMyc高表达果蝇生存进行分析,发现dMyc的高表达提高了果蝇的生存能力。本论文的研究结果表明,dMyc在维持果蝇Imd免疫稳态中发挥着至关重要的作用。一方面,在大肠杆菌感染的早期阶段,下调的dMyc可以进一步下调mi R-277表达,进而上调靶基因imd和Tab2的表达;同时上调imd和Tab2促进抗菌肽Dpt的表达继而有效抵抗病原微生物的入侵。另一方面,在大肠杆菌感染的中后阶段,为了防止Imd免疫响应的过度激活,抗菌肽Dpt的过度表达会诱导dMyc的上调表达,进而增加mi R-277的表达,而上调的mi R-277会进一步下调imd和Tab2的表达继而抑制Dpt的表达。总之,本论文的研究结果揭示了转录因子dMyc在果蝇的先天免疫响应中起着重要的调控作用,是防止免疫反应过度激活的关键调控因子。本文的研究结果不仅阐明了dMyc和mi R-277的新功能和调控模式,而且也为深刻揭示果蝇先天免疫稳态维持的复杂调控机制提供了新的见解和思路。
张建红[10]（2020）在《SmAP2/ERF82调控丹参酮生物合成及丹参生长发育的功能研究》文中研究表明丹参作为传统中草药,其活性成分丹参酮类化合物在治疗心脑血管等疾病方面均有显着活性。因此,丹参酮类化合物生物合成及调控研究一直是研究的热点。本研究基于实验室前期筛选丹参转录组数据获得一个在丹参根部特异性高表达的转录因子SmAP2/ERF82。在本研究中,利用实时荧光定量PCR方法验证了SmAP2/ERF82在丹参根和根韧皮部表达量极高。蛋白亚细胞定位实验表明SmAP2/ERF82定位于细胞核。转录因子自激活活性实验表明SmAP2/ERF82不具有自激活活性。本研究通过构建SmAP2/ERF82的RNAi和过表达重组质粒,转化发根农杆菌ACCC10060,侵染丹参叶片,获得了丹参转基因毛状根。通过检测转基因毛状根中SmAP2/ERF82基因抑制和过表达效率,筛选出三个RNAi株系（82i-1/5/9）和三个过表达株系（82oe-3/5/7）。UPLC检测了转基因毛状根中丹参酮类化合物和RNAi株系中丹酚酸类化合物的含量,结果表明:与对照株系相比,在RNAi株系中,二氢丹参酮I和丹参酮I的含量降低,而在过表达株系中,二者的含量显着升高,表明SmAP2/ERF82具有正向调控丹参酮生物合成的作用;而丹酚酸类化合物在RNAi株系中无明显变化,表明SmAP2/ERF82对丹酚酸合成和代谢不具调控作用。为进一步解析SmAP2/ERF82参与丹参酮类化合物合成的调控机制,通过实时荧光定量PCR分析转基因毛状根中丹参酮生物合成途径关键酶基因表达量的变化。与对照株系相比,SmAP2/ERF82-RNAi株系中柯巴基焦磷酸合酶1（Copalyl diphosphate synthase l,CPS1）和细胞色素P450 CYP76AH3的表达量均显着下降,而SmAP2/ERF82-oe（过表达）株系中（除了 82oe-7）,异戊烯基焦磷酸异构酶（Isopentenyl pyrophosphate isomerase,IDI1）和 CPS1关键酶基因的表达量上升。通过酵母单杂交实验发现SmAP2/ERF82与IDI1、CPS1和CYP76AH3这三个关键酶基因的启动子区结合,说明丹参SmAP2/ERF82转录因子可能通过调控丹参酮生物合成途径关键酶基因的表达调节丹参酮的生物合成。本研究将SmAP2/ERF82-RNAi和SmAP2/ERF82-oe过表达重组质粒,转化根癌农杆菌EH105,侵染丹参叶片,获得丹参转基因组培苗,共获得一个RNAi株系（82i-6）和三个过表达株系（82oe-1/15/16）。观察发现:与对照株系（pki）相比,RNAi株系生长正常,且根系较发达;而与对照株系（pkoe）相比,过表达株系生长矮小,叶片小而皱缩,根系较稀疏。表明SmAP2/ERF82可能参与调控丹参株形发育。为进一步验证SmAP2/ERF82在植物生长发育中的功能,将SmAP2/ERF82过表达重组质粒转化根癌农杆菌GV3101,通过花芽浸蘸法获得了过表达SmAP2/ERF82的拟南芥。观察发现,对照株系生长正常,而过表达株系生长矮小,较少抽薹,说明在拟南芥中过表达SmAP2/ERF82基因影响了拟南芥的抽薹过程,进而影响了拟南芥的生长发育。将SmAP2/ERF82转基因毛状根分化获得的丹参苗进行RNA-Seq测序,分析转基因株系与对照株系的差异基因情况,结果发现:在RNAi株系中,赤霉素合成途径的关键酶基因GA 20-氧化酶（Gibberellin 20-oxidase,GA20ox）和GA 3-氧化酶（Gibberellin 3-oxidase,GA3ox）的表达量上调,在过表达株系中,关键酶基因GA20ox 和 GA 2-氧化酶（Gibberellin 2-oxidase,GA2ox）表达量下调。推测SmAP2/ERF82可能负调控赤霉素的生物合成。以上结果表明SmAP2/ERF82通过调控丹参酮生物合成途径中关键酶基因IDI1、CPS1和CYP76AH3的表达正调控丹参酮类化合物的生物合成;同时,还可能通过负调控赤霉素的生物合成来调控植物的生长发育过程。本研究通过鉴定SmAP2/ERF82转录因子的功能,表明该基因可能作为一个关键调节因子,调控丹参中以GGPP为共同底物的丹参酮和赤霉素这两类二萜类化合物的竞争性生物合成途径,发挥其在调控丹参酮生物合成和调节丹参生长发育过程中的重要作用,对进一步解析丹参活性成分的合成与调控机制具有重要意义。
二、RNAi及其实验技术进展（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、RNAi及其实验技术进展（论文提纲范文）
（1）基于CRISPR/Cas9技术的飞蝗突变体构建优化及LmdsRNase2突变体功能研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 CRISPR/Cas9系统的工作原理 |
| 1.2 CRISPR/Cas9系统在昆虫中的应用进展 |
| 1.2.1 CRISPR/Cas9在多种昆虫中有效使用 |
| 1.2.2 不同Cas9/sgRNA形式及sgRNA位点影响转基因昆虫构建效率 |
| 1.2.3 显微注射卵的选择是转基因昆虫获得的关键步骤 |
| 1.2.4 合理的杂交体系设置是稳定纯合品系获得的关键 |
| 1.3 昆虫dsRNase研究进展 |
| 1.3.1 昆虫dsRNase类型与功能 |
| 1.3.2 中肠dsRNase对饲喂RNAi效率的影响 |
| 1.4 研究目的及意义 |
| 1.5 技术路线图 |
| 第二章 体外CRISPR/Cas9基因编辑系统的构建及有效sgRNA筛选 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验材料、试剂及设备 |
| 2.2.1 实验材料 |
| 2.2.2 实验试剂 |
| 2.2.3 主要设备和仪器 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 飞蝗LmdsRNase2基因组结构分析及sgRNA位点设计 |
| 2.3.2 双荧光报告载体构建及Sf9细胞系共转染 |
| 2.3.3 Cas9/sgRNA体外酶切系统的优化和验证 |
| 2.3.4 卵期突变效率验证 |
| 2.4 实验结果 |
| 2.4.1 LmdsRNase2 基因组结构以及sgRNA位点分布 |
| 2.4.2 利用双荧光报告载体在细胞水平筛选sgRNA |
| 2.4.3 体外酶切效率的验证及酶切体系的优化 |
| 2.4.4 卵期突变检测及TA克隆测序 |
| 2.5 讨论 |
| 第三章 体内显微注射卵筛选及基因编辑系统优化 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验材料、试剂及设备 |
| 3.2.1 实验材料 |
| 3.2.2 实验试剂 |
| 3.2.3 试剂配制 |
| 3.2.4 主要设备与仪器 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 飞蝗卵壳鞣化观察 |
| 3.3.2 鞣化的棕色卵和未鞣化的黄色卵显微注射孵化率统计 |
| 3.3.3 显微注射未鞣化的黄色卵和鞣化的棕色卵基因编辑效率统计 |
| 3.3.4 飞蝗胚胎染色 |
| 3.3.5 卵壳透射电子显微镜样品制备 |
| 3.3.6 质构仪检测卵壳硬度 |
| 3.4 实验结果 |
| 3.4.1 飞蝗卵壳在产卵后20min完成鞣化 |
| 3.4.2 显微注射鞣化卵提高了孵化率及突变效率 |
| 3.4.3 显微注射鞣化卵产生的突变可以有效遗传 |
| 3.4.4 飞蝗卵的合胞体分裂发生在产卵4h后,保证鞣化卵的有效编辑 |
| 3.4.5 卵壳鞣化后的卵抗感染能力增强 |
| 3.4.6 卵壳鞣化后增加了卵壳硬度 |
| 3.4.7 鞣化后致密的卵壳结构具有更强的抗压能力 |
| 3.5 讨论 |
| 第四章 LmdsRNase2突变飞蝗纯合品系的构建 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验材料、试剂及设备 |
| 4.2.1 实验材料 |
| 4.2.2 实验试剂 |
| 4.2.3 主要设备和仪器 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 飞蝗卵LmdsRNase2基因编辑 |
| 4.3.2 虫卵及个体的培养 |
| 4.3.3 突变检测 |
| 4.3.4 杂交策略 |
| 4.4 实验结果 |
| 4.4.1 G_0代卵期及个体测序结果 |
| 4.4.2 G_1代突变检测 |
| 4.4.3 G_2代突变检测 |
| 4.4.4 G_3代纯合突变体测序验证 |
| 4.5 讨论 |
| 第五章 LmdsRNase2~(-/-)飞蝗功能验证 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 实验材料、试剂及设备 |
| 5.2.1 实验材料 |
| 5.2.2 实验试剂 |
| 5.2.3 主要设备和仪器 |
| 5.3 实验方法 |
| 5.3.1 特异性dsRNA合成引物设计 |
| 5.3.2 dsRNA合成 |
| 5.3.3 LmCht10和LmCDA2 基因dsRNA的注射和饲喂 |
| 5.3.4 中肠液体外降解dsRNA实验 |
| 5.3.5 RT-q PCR检测LmCht10 基因和LmCDA2 基因的表达情况 |
| 5.4 实验结果 |
| 5.4.1 LmdsRNase2~(-/-)飞蝗中肠液失去体外降解dsRNA的能力 |
| 5.4.2 LmdsRNase2~(-/-)飞蝗对饲喂dsRNA的敏感性增加 |
| 5.4.3 LmdsRNase2~(-/-)飞蝗饲喂dsRNA敏感性增加具有普遍性 |
| 5.4.4 LmdsRNase2~(-/-)飞蝗饲喂dsLmCht10 后影响飞蝗正常蜕皮 |
| 5.5 讨论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
| 个人简况及联系方式 |
（2）棉花GhCEN基因调控根系发育的功能初步研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 植物根系 |
| 1.2 常见植物根系发育相关基因研究进展 |
| 1.2.1 水稻根系发育基因 |
| 1.2.2 油菜根系发育调基因 |
| 1.2.3 拟南芥根系发育基因 |
| 1.2.4 棉花根系发育基因 |
| 1.3 植物CENTRORADIALIS基因研究进展 |
| 1.3.1 PEBP基因家族 |
| 1.3.2 CEN/CEN-like基因研究进展 |
| 1.4 棉花CEN同源基因研究进展 |
| 1.5 研究目的和意义 |
| 第2章 试验材料与方法 |
| 2.1 试验材料 |
| 2.1.1 植物材料 |
| 2.1.2 试验药品 |
| 2.1.3 试剂的配制 |
| 2.1.4 试验主要仪器设备 |
| 2.1.5 试验使用引物 |
| 2.2 测定项目与方法 |
| 2.2.1 田间表型鉴定与纤维品质测定 |
| 2.2.2 根系形态观察及指标测量 |
| 2.2.3 室内表型鉴定 |
| 2.2.4 数据处理与分析 |
| 2.3 试验方法 |
| 2.3.1 基因组DNA的提取与检测 |
| 2.3.2 基因组RNA的提取与检测 |
| 2.3.3 cDNA合成 |
| 2.4 转基因株鉴定 |
| 2.5 CEN基因表达量测定 |
| 2.5.1 材料处理 |
| 2.5.2 qRT-PCR反应体系 |
| 2.5.3 qRT-PCR数据处理 |
| 2.6 转录组测序 |
| 2.6.1 材料处理 |
| 2.6.2 样品检测 |
| 2.6.3 测序文库构建 |
| 2.6.4 聚类和测序 |
| 2.6.5 数据分析 |
| 第3章 结果与分析 |
| 3.1 田间试验 |
| 3.1.1 田间RNAi-GhCEN转基因株鉴定 |
| 3.1.2 RNA干扰转基因材料田间表现 |
| 3.1.3 CEN基因对纤维品质的影响 |
| 3.1.4 CEN基因在主茎尖的表达量分析 |
| 3.2 室内试验 |
| 3.2.1 RNAi-GhCEN转基因株鉴定 |
| 3.2.2 幼苗根系形态指标结果分析 |
| 3.2.3 蕾期表型性状指标调查 |
| 3.2.4 GhCEN基因表达模式分析 |
| 3.3 转录组分析 |
| 3.3.1 测序数据和比对效率统计 |
| 3.3.2 样品重复相关性评估和表达量PCA分析 |
| 3.3.3 差异表达基因数目统计 |
| 3.3.4 DEGs功能注释 |
| 3.3.5 根、茎中都表达的 DEGs的 GO分析 |
| 3.3.6 根、茎中都表达的 DEGs的 KEGG富集分析 |
| 3.3.7 GhCEN基因的功能 |
| 第4章 结论与讨论 |
| 4.1 全文结论 |
| 4.1.1 表型性状鉴定 |
| 4.1.2 品质性状分析 |
| 4.1.3 转录组分析 |
| 4.2 讨论分析 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 附表1 农业农村部棉花品质监督检验测试中心检验报告 |
| 附表2 根、茎中都表达的 DEGS的 GO富集分析结果 |
| 附表3 根、茎中都表达的 DEGS的 KEGG富集分析结果 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（3）RNAi抗虫水稻Csu260-16对靶标害虫二化螟的抗性评价（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 主要符号对照表 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 水稻害虫二化螟 |
| 1.2.1 二化螟为害现状 |
| 1.2.2 二化螟防治现状 |
| 1.3 RNA干扰 |
| 1.3.1 RNA干扰的基本概况 |
| 1.3.2 RNA干扰途径和机制 |
| 1.3.3 RNA干扰技术的应用 |
| 1.4 基于RNAi技术的转基因抗虫作物的研发 |
| 1.5 基于RNAi技术的害虫防治的优点与风险 |
| 1.5.1 基于RNAi技术的害虫防治的优势 |
| 1.5.2 基于RNAi技术的转基因抗虫作物的生态安全性 |
| 1.6 本研究目的与意义 |
| 第二章 RNAi抗虫水稻中Csu-novel-260 的表达分析 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 供试材料 |
| 2.1.2 主要试剂耗材及仪器设备 |
| 2.1.3 RNAi抗虫水稻中Csu-novel-260 的时空表达分析 |
| 2.1.4 RNAi抗虫水稻中Csu-novel-260的表达量分析 |
| 2.2 结果与分析 |
| 2.2.1 RNAi抗虫水稻中Csu-novel-260 时空表达 |
| 2.2.2 RNAi抗虫水稻中Csu-novel-260 绝对表达量 |
| 2.3 讨论 |
| 第三章 二化螟的生物测定及靶基因表达量分析 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 供试材料 |
| 3.1.2 主要试剂耗材及仪器设备 |
| 3.1.3 二化螟饲料取食生测 |
| 3.1.4 二化螟离体水稻组织生测 |
| 3.1.5 二化螟靶基因Csdib的表达分析 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.2.1 Csu-novel-260 agomir在人工饲料中的稳定性 |
| 3.2.2 二化螟饲料取食生测 |
| 3.2.3 二化螟离体水稻组织生测 |
| 3.2.4 二化螟靶基因Csdib的表达分析 |
| 3.3 讨论 |
| 第四章 全文结论 |
| 4.1 主要结论 |
| 4.2 展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
（4）转录因子Apontic抑制肿瘤转移的机理研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 1 前言 |
| 1.1 模式生物果蝇概述 |
| 1.1.1 果蝇发育过程简介 |
| 1.1.2 果蝇在肿瘤学研究中的优势 |
| 1.1.2.1 果蝇和人类在信号传导通路上具有保守性 |
| 1.1.2.2 果蝇相对缺乏基因冗余 |
| 1.1.2.3 果蝇在肿瘤学研究中的应用前景 |
| 1.2 果蝇中常用的研究方法 |
| 1.2.1 特异性组织表达系统 |
| 1.2.2 RNA干涉技术 |
| 1.2.3 嵌合体克隆技术 |
| 1.3 转录因子Apt研究进展 |
| 1.3.1 Apt概述 |
| 1.3.2 Apt在果蝇翅发育中的功能 |
| 1.3.3 Apt在卵室发育中的功能 |
| 1.3.4 Apt在眼睛发育中的功能 |
| 1.3.5 Apt在心脏发育中的功能 |
| 1.3.6 Apt的其它功能 |
| 1.4 JNK信号通路的研究进展 |
| 1.4.1 JNK信号通路简介 |
| 1.4.2 应激反应中JNK信号通路的相关功能 |
| 1.4.2.1 对细胞自我保护的影响 |
| 1.4.2.2 对细胞凋亡的影响 |
| 1.4.2.3 对个体寿命的影响 |
| 1.4.3 JNK信号通路的负调控 |
| 1.4.4 JNK信号通路与恶性肿瘤的侵袭转移 |
| 1.5 恶性肿瘤转移研究进展 |
| 1.6 果蝇中的肿瘤转移研究模型 |
| 1.6.1 果蝇成虫中的肿瘤转移模型 |
| 1.6.2 果蝇幼虫中的肿瘤转移模型 |
| 1.6.3 果蝇翅原基中的肿瘤转移模型 |
| 1.7 本课题研究的目的和意义 |
| 1.8 本课题的研究思路 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 所用果蝇品系及培养条件 |
| 2.1.2 抗体及荧光染料 |
| 2.1.3 试剂耗材 |
| 2.1.4 主要仪器设备 |
| 2.1.5 信息检索分析网站及数据处理软件 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 实验过程中所用引物 |
| 2.2.2 相关试剂的配置 |
| 2.2.3 DNA片段扩增及载体的构建 |
| 2.2.3.1 DNA片段的扩增 |
| 2.2.3.2 DNA片段的酶切 |
| 2.2.3.3 琼脂糖凝胶电泳实验 |
| 2.2.3.4 胶回收 |
| 2.2.3.5 DNA片段的酶连 |
| 2.2.3.6 载体转化及扩增 |
| 2.2.3.7 小量提取质粒 |
| 2.2.3.8 大量提取质粒 |
| 2.2.3.9 同源重组及定点突变 |
| 2.2.4 果蝇翅原基解剖及抗体染色 |
| 2.2.5 果蝇S2 细胞实验相关操作 |
| 2.2.6 双荧光素酶报告基因分析实验 |
| 2.2.7 荧光定量PCR |
| 2.2.7.1 果蝇翅原基总RNA的提取 |
| 2.2.7.2 RNA质量的测定及逆转录合成cDNA |
| 2.2.7.3 实时荧光定量PCR体系及反应条件 |
| 2.2.8 Western blot实验 |
| 2.2.8.1 果蝇组织蛋白的提取 |
| 2.2.8.2 SDS凝胶电泳 |
| 2.2.8.3 转膜 |
| 2.2.9 鼠抗Msn多克隆抗体的制备 |
| 2.2.9.1 蛋白的原核表达 |
| 2.2.9.2 SDS-PAGE电泳及考马斯亮蓝染色 |
| 2.2.9.3 小鼠免疫 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 敲降apt诱导细胞发生迁移 |
| 3.2 Apt抑制肿瘤细胞迁移 |
| 3.3 Apt抑制JNK信号通路的表达 |
| 3.3.1 Apt与 JNK信号通路协同调控背板发育 |
| 3.3.2 敲降apt激活puc-Lac Z的表达 |
| 3.3.3 敲降apt激活mmp1 的表达 |
| 3.3.4 敲降apt使磷酸化的JNK水平升高 |
| 3.4 Apt通过JNK信号通路调控细胞迁移 |
| 3.5 Apt在 JNK信号通路中的作用位置 |
| 3.6 Msn负调控JNK信号通路 |
| 3.7 Msn抗体检验 |
| 3.8 Apt直接正调控msn的表达 |
| 3.9 Apt介导的细胞迁移与细胞凋亡的关系 |
| 3.10 Apt影响细胞迁移具有进化保守性 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（5）帕金森病路易小体可视化工具开发和基因治疗初探（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第1章 研究背景 |
| 1.1 PD的历史简介 |
| 1.2 PD患者的临床症状 |
| 1.3 PD的特征性病理变化 |
| 1.4 散发性PD患者的病理分期 |
| 1.5 α-突触核蛋白 |
| 1.5.1 α-突触核蛋白的发现 |
| 1.5.2 α-突触核蛋白的结构 |
| 1.5.3 α-突触核蛋白的功能 |
| 1.6 α-突触核蛋白和神经退行性疾病 |
| 1.7 α-突触核蛋白的传播 |
| 1.8 PD实验动物模型简介 |
| 1.8.1 6-OHDA诱导的PD模型 |
| 1.8.2 MPTP诱导的PD模型 |
| 1.8.3 Rotenone诱导的PD模型 |
| 1.8.4 α-突触核蛋白过表达转基因动物PD模型 |
| 1.8.5 AAV过表达α-突触核蛋白诱导的PD模型 |
| 1.8.6 α-Syn PFFs诱导的PD模型及相关研究进展 |
| 1.9 PD的临床诊断 |
| 1.10 PD的临床治疗 |
| 1.10.1 药物疗法 |
| 1.10.2 手术疗法 |
| 1.11 PD治疗的研究进展 |
| 1.11.1 靶向α-突触核蛋白的表达水平 |
| 1.11.2 调控底丘脑核的神经活动 |
| 1.12 单细胞技术在神经科学研究中的应用 |
| 1.12.1 单细胞转录组学研究技术 |
| 1.12.2 单细胞代谢组学研究技术 |
| 1.13 RNAi干扰技术 |
| 1.14 腺相关病毒基因投递技术 |
| 1.15 CRISPR/Cas9基因编辑技术 |
| 1.16 本论文主要关注的科学问题 |
| 1.16.1 路易小体可视化工具的开发 |
| 1.16.2 靶向α-突触核蛋白的基因治疗探索 |
| 第2章 实验材料和实验方法 |
| 2.1 实验动物 |
| 2.2 实验仪器和耗材 |
| 2.3 实验试剂 |
| 2.4 实验方法 |
| 2.4.1 小鼠基因型鉴定 |
| 2.4.2 α-Syn PFFs的制备 |
| 2.4.3 原代神经元培养 |
| 2.4.4 慢病毒包装和感染 |
| 2.4.5 免疫印迹实验 |
| 2.4.6 细胞免疫化学 |
| 2.4.7 小鼠脑立体定位注射 |
| 2.4.8 小鼠尾静脉注射 |
| 2.4.9 小鼠心脏灌流 |
| 2.4.10 冰冻切片 |
| 2.4.11 免疫组织化学 |
| 2.4.12 脑片电生理 |
| 2.4.13 行为学测试 |
| 第3章 实验结果 |
| 3.1 路易小体可视化工具的开发 |
| 3.1.1 α-Syn PFFs的制备和效率验证 |
| 3.1.2 α-Syn-EGFP载体构建和表达验证 |
| 3.1.3 α-Syn PFFs在in vitro条件下诱导融合蛋白中α-突触核蛋白聚集并伴随绿色荧光蛋白荧光增强 |
| 3.1.4 α-Syn PFFs在in vivo条件下诱导融合蛋白中α-突触核蛋白聚集并伴随绿色荧光蛋白荧光增强 |
| 3.1.5 LSL-α-Syn-6H-EGFP转基因小鼠的构建及验证 |
| 3.1.6 LSL-α-Syn-6H-tdT转基因小鼠的构建及验证 |
| 3.2 靶向α-突触核蛋白的基因疗法 |
| 3.2.1 α-突触核蛋白是路易小体和路易突起形成的必要条件 |
| 3.2.2 病理性PD小鼠模型 |
| 3.2.3 设计特异性靶向α-突触核蛋白的shRNA及效率验证 |
| 3.2.4 全脑范围内敲低α-Syn水平显着改善PD模型的运动障碍和病理变化 |
| 3.2.5 设计特异性靶向α-突触核蛋白基因的gRNA及效率验证 |
| 3.2.6 全脑范围内编辑α-Syn基因显着改善PD模型的运动障碍和病理变化 |
| 第4章 讨论和展望 |
| 4.1 利用膜片钳技术分析路易小体阳性细胞和路易小体阴性细胞的电生理性质差异 |
| 4.2 利用单细胞测序技术分析路易小体阳性细胞和路易小体阴性细胞的转录组差异 |
| 4.3 利用单细胞代谢组技术分析路易小体阳性细胞和阴性细胞的代谢小分子差异 |
| 4.4 利用双光子成像技术分析路易小体阳性细胞和阴性细胞的生理活动 |
| 第5章 参考文献 |
| 致谢 |
| 附件 |
（6）GDF-15通过孤儿受体GFRAL促进胰腺癌增殖及侵袭转移的机制研究（论文提纲范文）
| 缩略语表 |
| Abstract |
| 摘要 |
| 第一章 前言 |
| 第二章 GDF-15在胰腺癌中的表达情况及与临床的相关性 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 第三章 GDF-15对胰腺癌细胞增殖及侵袭转移的影响 |
| 3.1 材料和方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 第四章 GFRAL在胰腺癌中表达情况、临床意义及其与GDF-15 表达的相关性 |
| 4.1 材料和方法 |
| 4.2 结果 |
| 4.3 讨论 |
| 4.4 小结 |
| 第五章 GDF-15 通过与孤儿受体GFRAL直接结合促进胰腺癌进展 |
| 5.1 材料和方法 |
| 5.2 结果 |
| 5.3 讨论 |
| 5.4 小结 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 文献综述 生长分化因子GDF-15的研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间的研究成果 |
| 致谢 |
（7）LncRNA CASC2/MiR-124-3p/MKL-1/NFATC1信号通路调控巨核细胞的成熟分化（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 第1章 MKL-1与NFATC1 影响巨核细胞成熟分化 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 材料与方法 |
| 1.2.1 材料 |
| 1.2.2 方法 |
| 1.3 结果 |
| 1.3.1 MKL-1在Dami、MEG-01和HEL中的表达情况 |
| 1.3.2 NFATC1在Dami、MEG-01和HEL中的表达情况 |
| 1.3.3 MKL-1对巨核细胞成熟分化的标记基因的表达及对巨核细胞成熟分化的影响 |
| 1.3.4 Y27632处理对巨核细胞成熟分化的标记基因的表达及对巨核细胞成熟分化的影响 |
| 1.3.5 MKL-1对巨核细胞的凋亡的影响 |
| 1.3.6 Y27632处理对巨核细胞的凋亡的影响 |
| 1.3.7 MKL-1 结合到CD41、CD61和C-KIT的启动子的CAr G box上促进巨核细胞成熟分化的标记基因的转录与表达 |
| 1.3.8 NFATC1抑制巨核细胞成熟分化促进其增殖 |
| 1.3.9 MKL-1与NFATC1 存在直接的蛋白蛋白相互作用 |
| 1.4 讨论 |
| 第2章 NFATC1与MKL-1 相互作用进而影响巨核细胞的成熟分化 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 材料 |
| 2.2.2 方法 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 NFATC1对MKL-1 的表达影响 |
| 2.3.2 NFATC1 抑制MKL-1 的入核并促进核转出 |
| 2.3.3 NFATC1与MKL-1 相互作用削弱MKL-1-SRF结合到CD41/CD61/C-KIT启动子的CAr G box的能力 |
| 2.3.4 MKL-1对NFATC1 的转录与表达的影响作用 |
| 2.3.5 MAPK1对MKL-1 的表达与磷酸化的影响作用 |
| 2.3.6 MAPK1对NFATC1 的表达和磷酸化影响作用 |
| 2.4 讨论 |
| 第3章 MiR-124-3p影响巨核细胞的成熟分化 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 材料 |
| 3.2.2 方法 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 mi RNA特异性定量PCR技术检测hsa-mi R-124-3p的内源性表达 |
| 3.3.2 hsa-mi R-124-3p抑制巨核细胞增殖 |
| 3.3.3 hsa-mi R-124-3p通过结合到NFATC1-3’UTR上抑制NFATC1 的表达 |
| 3.3.4 MKL-1 结合到hsa-mi R-124 启动子的CAr G box上促进hsa-mi R-124 的转录激活 |
| 3.3.5 hsa-mi R-124-3p对 MAPK1 的抑制作用 |
| 3.4 讨论 |
| 第4章 Lnc RNA CASC2 调节hsa-mi R-124-3p影响巨核细胞的成熟分化 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 材料 |
| 4.2.2 方法 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 Lnc RNA CASC2 的表达与hsa-mi R-124 负相关 |
| 4.3.2 Lnc RNA CASC2 促进巨核细胞的成熟分化 |
| 4.3.3 Lnc RNA CASC2与hsa-mi R-124-3p结合抑制hsa-mi R-124-3p的功能 |
| 4.3.4 hsa-mi R-124-3p抑制Lnc RNA CASC2 的表达 |
| 4.3.5 MKL-1 促进Lnc RNA CASC2 的转录激活 |
| 4.4 讨论 |
| 第5章 结论与展望 |
| 5.1 结论 |
| 5.2 展望 |
| 参考文献 |
| 附录1 攻读博士学位期间取得的科研成果 |
| 附录2 攻读博士学位期间参加的科研项目 |
| 附录3 缩写表 |
| 附录4 基因序列表 |
| 致谢 |
（8）CKAP2在增殖型糖尿病视网膜病变中的作用及机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略词表 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 研究背景 |
| 1.2 课题组前期研究工作 |
| 1.3 CKAP2的研究进展 |
| 1.4 本课题研究内容及意义 |
| 第二章 CKAP2在PDR患者组织及高糖培养的人视网膜血管内皮细胞中的表达及功能 |
| 2.1 研究目的 |
| 2.2 材料和方法 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 本章小结 |
| 第三章 高糖环境下CKAP2与VEGF的相互作用关系 |
| 3.1 研究目的 |
| 3.2 材料和方法 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 本章小结 |
| 第四章 p53在高糖环境下的表达及其对CKAP2的作用 |
| 4.1 研究目的 |
| 4.2 材料和方法 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 本章小结 |
| 总结与展望 |
| 参考文献 |
| 攻读硕士学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
| 附录 |
（9）转录因子dMyc调控果蝇Imd通路先天免疫稳态的分子机制（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 转录因子简介 |
| 1.1.1 转录因子的结构 |
| 1.1.2 转录因子的分类 |
| 1.1.3 转录因子及其motif相关数据库 |
| 1.1.4 转录因子靶基因预测工具 |
| 1.2 miRNA简介 |
| 1.2.1 miRNA的生物发生 |
| 1.2.2 miRNA诱导基因沉默的模式 |
| 1.2.3 miRNA诱导基因沉默的机制 |
| 1.2.4 miRNA的生物学功能 |
| 1.2.4.1 miRNA与组织发育 |
| 1.2.4.2 miRNA与细胞增殖、分化和凋亡 |
| 1.2.4.3 miRNA与疾病 |
| 1.2.4.4 miRNA与癌症 |
| 1.3 转录因子Myc与miRNA |
| 1.3.1 转录因子Myc的发现 |
| 1.3.2 转录因子myc基因家族 |
| 1.3.3 转录因子Myc的基本结构 |
| 1.3.4 转录因子Myc的生物学功能 |
| 1.3.4.1 Myc与癌症 |
| 1.3.4.2 Myc与发育 |
| 1.3.4.3 Myc与细胞增殖、分化和凋亡 |
| 1.3.4.4 Myc与新陈代谢 |
| 1.3.4.5 Myc与基因组不稳定性 |
| 1.3.4.6 Myc与细胞竞争 |
| 1.3.5 转录因子Myc与miRNA |
| 1.3.5.1 miRNA调节Myc |
| 1.3.5.2 Myc调节miRNA |
| 1.3.5.3 Myc调节miRNA的反馈循环 |
| 1.4 果蝇先天免疫及调控研究进展 |
| 1.4.1 细胞免疫反应 |
| 1.4.2 体液免疫反应 |
| 1.4.2.1 Toll免疫信号通路 |
| 1.4.2.2 Imd免疫信号通路 |
| 1.4.3 果蝇Toll和 Imd通路免疫调控研究 |
| 1.4.3.1 Toll免疫信号通路调控研究 |
| 1.4.3.2 Imd免疫信号通路调控研究 |
| 1.5 本论文的研究目的及意义 |
| 1.6 本论文的创新点 |
| 1.7 本论文的技术路线 |
| 第2章 dMyc是果蝇Imd通路免疫响应的负调节子 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料、试剂和仪器 |
| 2.2.1 实验材料 |
| 2.2.2 实验试剂 |
| 2.2.3 实验仪器 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 果蝇的培养 |
| 2.3.2 果蝇的注射 |
| 2.3.3 果蝇的总RNA提取 |
| 2.3.4 果蝇基因的实时荧光定量PCR反应(qRT-PCR) |
| 2.4 实验结果 |
| 2.4.1 构建不同的dMyc突变果蝇品系 |
| 2.4.2 大肠杆菌感染后dMyc高表达果蝇品系中抗菌肽Dpt的表达水平 |
| 2.4.3 大肠杆菌感染前后dMyc其它突变型果蝇品系中抗菌肽Dpt的表达水平 |
| 2.5 讨论 |
| 第3章 dMyc调控果蝇免疫相关miR-277的转录 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料、试剂和仪器 |
| 3.2.1 实验材料 |
| 3.2.2 实验试剂 |
| 3.2.3 实验仪器 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 生物信息学分析 |
| 3.3.2 果蝇总RNA的提取 |
| 3.3.3 果蝇基因的实时荧光定量PCR反应(qRT-PCR) |
| 3.3.4 果蝇miRNA的实时荧光定量PCR |
| 3.3.5 重组质粒构建 |
| 3.3.6 果蝇S2细胞培养和免疫刺激 |
| 3.3.7 果蝇S2细胞转染 |
| 3.3.8 双荧光素酶报告系统(Dual-luciferase reporter system)检测 |
| 3.3.9 染色质免疫共沉淀-荧光定量PCR(Ch IP-qPCR) |
| 3.4 实验结果 |
| 3.4.1 生物信息学综合分析dMyc潜在调控的果蝇Imd通路免疫相关miRNA |
| 3.4.2 筛选果蝇Imd通路免疫相关的miRNA |
| 3.4.3 筛选dMyc潜在调控的果蝇Imd通路免疫相关的miRNA |
| 3.4.4 miR-277基因的启动子区序列分析 |
| 3.4.5 miR-277基因的启动子活性分析 |
| 3.4.6 dMyc通过直接与miR-277基因的启动子序列结合激活其转录 |
| 3.5 讨论 |
| 第4章 miR-277抑制imd和Tab2-Ra/b负调控Imd通路 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料、试剂和仪器 |
| 4.2.1 实验材料 |
| 4.2.2 实验试剂 |
| 4.2.3 实验仪器 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 果蝇组织的总RNA提取 |
| 4.3.2 果蝇基因的实时荧光定量PCR反应(qRT-PCR) |
| 4.3.3 果蝇miRNA的实时荧光定量PCR |
| 4.3.4 果蝇细胞培养 |
| 4.3.5 果蝇重组质粒构建与点突变 |
| 4.3.6 果蝇S2细胞转染 |
| 4.3.7 双荧光素酶报告系统检测 |
| 4.4 实验结果 |
| 4.4.1 miR-277负调控果蝇Imd免疫信号通路 |
| 4.4.2 生物信息学分析miR-277的潜在结合位点 |
| 4.4.3 miR-277靶向imd和Tab2的体内验证 |
| 4.4.4 miR-277靶向imd和Tab2的体外验证 |
| 4.5 讨论 |
| 第5章 dMyc激活miR-277抑制imd/Tab2负调控Imd通路 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 材料、试剂和仪器 |
| 5.2.1 实验材料 |
| 5.2.2 实验试剂 |
| 5.2.3 实验仪器 |
| 5.3 实验方法 |
| 5.3.1 果蝇的总RNA提取 |
| 5.3.2 果蝇基因的实时荧光定量PCR反应(qRT-PCR) |
| 5.3.3 果蝇miRNA的实时荧光定量PCR |
| 5.4 实验结果 |
| 5.4.1 构建dMyc和miR-277sponge共高表达突变型果蝇 |
| 5.4.2 dMyc和miR-277sponge共高表达的果蝇感染E.coli后 Dpt的表达水平 |
| 5.4.3 dMyc和miR-277sponge共高表达果蝇中靶标imd和 Tab2 的表达水平 |
| 5.5 讨论 |
| 第6章 dMyc调控果蝇Imd先天免疫稳态的分子机制 |
| 6.1 引言 |
| 6.2 材料、试剂和仪器 |
| 6.2.1 实验材料 |
| 6.2.2 实验试剂 |
| 6.2.3 实验仪器 |
| 6.3 实验方法 |
| 6.3.1 果蝇的总RNA提取 |
| 6.3.2 果蝇基因的实时荧光定量PCR反应(qRT-PCR) |
| 6.3.3 果蝇感染后的存活观察 |
| 6.4 实验结果 |
| 6.4.1 果蝇Imd通路激活前后各基因的动态表达模式分析 |
| 6.4.2 dMyc异位表达影响果蝇的生存 |
| 6.5 讨论 |
| 第7章 结论 |
| 附录 |
| 参考文献 |
| 在读期间发表的学术论文及研究成果 |
| 致谢 |
（10）SmAP2/ERF82调控丹参酮生物合成及丹参生长发育的功能研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 第一章 前言 |
| 1 丹参研究概述 |
| 1.1 丹参来源 |
| 1.2 丹参药理活性 |
| 1.3 丹参“组学”研究 |
| 1.4 丹参临床应用 |
| 2 丹参活性成分生物合成及调控研究进展 |
| 2.1 丹参活性成分生物合成途径研究进展 |
| 2.2 丹参活性成分生物合成的调控机制研究进展 |
| 3 AP2/ERF转录因子研究进展 |
| 3.1 AP2/ERF转录因子概述 |
| 3.2 AP2/ERF转录因子调控植物次生代谢 |
| 3.3 AP2ERF转录因子调控植物生长发育 |
| 4 研究SmAP2/ERF82的理论意义和应用前景 |
| 第二章 研究材料与方法 |
| 1 材料、试剂与设备 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 试剂 |
| 1.3 仪器设备 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 基因的组织部位表达分析 |
| 2.2 基因克隆与进化分析 |
| 2.3 SmAP2ERF82亚细胞定位实验 |
| 2.4 自激活活性实验 |
| 2.5 SmAP2/ERF82转基因毛状根的获得 |
| 2.6 丹参转基因毛状根基因表达量检测 |
| 2.7 丹参转基因毛状根中有效成分化学含量检测 |
| 2.8 酵母单杂交实验 |
| 2.9 转录组测序 |
| 2.10 SmAP2/ERF82转基因组培苗的获得 |
| 2.11 丹参转基因组培苗基因表达量检测 |
| 2.12 SmAP2/ERF82转基因拟南芥的获得 |
| 第三章 实验结果 |
| 1 SmAP2/ERF82基因筛选与克隆 |
| 2 SmAP2/ERF82的表达谱及系统进化分析 |
| 3 SmAP2/ERF82亚细胞定位分析 |
| 4 SmAP2/ERF82转录自激活活性分析 |
| 5 SmAP2/ERF82转基因毛状根的获得和基因表达量鉴定 |
| 6 SmAP2/ERF82对丹参酮和丹酚酸合成的影响 |
| 7 SmAP2/ERF82调控丹参酮生物合成的分子机制 |
| 7.1 丹参酮生物合成关键酶基因表达量变化 |
| 7.2 SmAP2ERF82靶基因的筛选 |
| 8 SmAP2/ERF82转基因组培苗 |
| 8.1 转基因毛状根分化获得丹参苗 |
| 8.2 SmAP2/ERF82转基因组培苗的获得 |
| 8.3 SmAP2/ERF82转基因组培苗的基因表达量检测 |
| 8.4 SmAP2/ERF82转基因组培苗的盆栽表型 |
| 9 SmAP2/ERF82对拟南芥生长发育的影响 |
| 10 SmAP2/ERF82可能参与的调控网络 |
| 第四章 结论与讨论 |
| 1 SmAP2/ERF82具备转录因子的基本特征 |
| 2 丹参SmAP2/ERF82转录因子通过激活丹参酮生物合成途径关键酶基因的表达正向调控丹参酮的生物合成 |
| 3 SmAP2/ERF82可能调控激素途径调节丹参的株型发育和拟南芥抽薹过程 |
| 4 SmAP2/ERF82可能作为一个关键调节因子调控植物中的二萜合成途径 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 怍者简介 |
四、RNAi及其实验技术进展（论文参考文献）
- [1]基于CRISPR/Cas9技术的飞蝗突变体构建优化及LmdsRNase2突变体功能研究[D]. 温婷梅. 山西大学, 2021(12)
- [2]棉花GhCEN基因调控根系发育的功能初步研究[D]. 刘春艳. 塔里木大学, 2021
- [3]RNAi抗虫水稻Csu260-16对靶标害虫二化螟的抗性评价[D]. 温宁. 中国农业科学院, 2021
- [4]转录因子Apontic抑制肿瘤转移的机理研究[D]. 张文硕. 山东农业大学, 2021(01)
- [5]帕金森病路易小体可视化工具开发和基因治疗初探[D]. 刘爱学. 北京协和医学院, 2021(02)
- [6]GDF-15通过孤儿受体GFRAL促进胰腺癌增殖及侵袭转移的机制研究[D]. 赵志平. 中国人民解放军陆军军医大学, 2020(07)
- [7]LncRNA CASC2/MiR-124-3p/MKL-1/NFATC1信号通路调控巨核细胞的成熟分化[D]. 项园. 武汉科技大学, 2020
- [8]CKAP2在增殖型糖尿病视网膜病变中的作用及机制研究[D]. 陈湘婷. 华南理工大学, 2020(02)
- [9]转录因子dMyc调控果蝇Imd通路先天免疫稳态的分子机制[D]. 李瑞敏. 南京师范大学, 2020(02)
- [10]SmAP2/ERF82调控丹参酮生物合成及丹参生长发育的功能研究[D]. 张建红. 北京协和医学院, 2020(05)