一、牛卵母细胞去核方法的研究（论文文献综述）
李昊[1]（2019）在《Myostatin基因敲低克隆绵羊的研究》文中研究表明肌肉生长抑制素（Myostatin,MSTN）是一种生长因子,属于TGF-β超家族,主要在骨骼肌细胞中表达,对肌肉的生长具有负调控作用。MSTN基因的过表达可引起肌肉萎缩,而MSTN基因发生突变或被敲除时则会使动物的肌肉量增加,产生双肌现象。本研究利用克隆获得的绵羊MSTN基因构建真核表达载体,同时设计合成MSTN干涉序列并构建RNA干涉载体,共转染293GP细胞后经荧光定量PCR检测获得干涉效率最佳的载体;将其线性化后转染绵羊成纤维细胞后,经G418筛选获得MSTN敲低转基因细胞系;以MSTN敲低转基因细胞为核供体,利用细胞核移植的方法获得MSTN敲低转基因绵羊克隆胚和转基因绵羊,以期建立获得肌肉丰满绵羊新品系的方法。此外,本研究利用CRISPR/Cas9系统,获得了基因编辑胚胎和小鼠,为后续利用CRIISPR/Cas9系统获得基因打靶绵羊奠定基础。本研究的结果与结论如下:1、绵羊MSTN基因RNA干涉载体构建和活性分析（1）绵羊Myostatin基因的克隆:参照GenBank中绵羊MSTN基因序列（AF019622.1）,采用RT-PCR扩增技术,克隆绵羊肌肉生长抑制素基因,将其连接到pcDNA3.1（+）载体,获得肌肉抑制素基因真核表达载体;（2）RNA干涉表达载体的构建:参照绵羊MSTN基因的mRNA序列,设计合成RNA干涉序列并与pRNAT-U6载体连接,获得RNA干涉表达载体。与真核表达载体共转染293GP细胞后,通过实时定量PCR检测干涉效率,获得干涉效果最佳序列。（3）RNA干涉载体表达活性检测:将筛选获得的RNA干涉载体线性化,采用显微注射的方式,注射到小鼠原核时期的胚胎中,注射后的胚胎可以分裂为2细胞,经体外培养最终获得表达绿色荧光蛋白的囊胚,表明所构建的RNA干涉载体可以在胚胎中正常表达并支持胚胎的发育。2、绵羊MSTN敲低转基因成纤维细胞系的建立通过脂质体转染法将线性化的RNA干涉载体转染到绵羊成纤维细胞中,经G418筛选,获得转基因阳性细胞;PCR结果显示,构建的基因已整合到细胞基因组中;对获得的转基因阳性细胞的形态学特征、生长曲线以及冷冻复苏后特征的检测结果表明,转基因细胞具有正常细胞的生物学特征。3、绵羊MSTN敲低转基因胚胎的获得（1）供体细胞的修饰和处理:来源于成纤维细胞的核移植胚胎的卵裂率为44.6%,高于MSTN敲低转基因细胞的33.0%,且差异显着,但两者的桑/囊胚率差异不显着（分别为24.1%和15.6%）;供体细胞不需进行血清饥饿处理,使用接触抑制方法可以达到相同效果。（2）重构胚的融合、激活和培养:采用逐个融合（一次一个）的融合方式能显着提高融合效率,但融合后的胚胎发育能力和批量融合（一次多个）方法比差异不显着;采用A23187+6-DMAP激活卵母细胞与采用Ionomycin+6-DMAP激活方法之间的效果差异不大;重构胚融合后培养34 h后再进行激活可有效提高胚胎卵裂和囊胚发育率。KSOM和SOFaa都可以用来进行绵羊克隆胚的体外培养。4、转基因核移植胚胎的移植和胎儿鉴定（1）重构胚的移植:采用输卵管移植方法,将原核期或2-细胞期的核移植胚胎（242枚）移植到同步发情的受体绵羊（23只）体内,以检验其在体内的发育能力。（2）转基因胎儿鉴定:在23只受体中,最终只有1只受体妊娠,但妊娠期间发生流产,未能获得成活个体,获得流产胎儿1只;对流产胎儿进行PCR鉴定,结果显示,胎儿基因组中整合有目的基因。5、肌肉特异表达Cas9蛋白打靶胚胎的获得（1）Rosa26基因sgRNA的设计和体外验证:根据小鼠Rosa26基因序列设计sgRNA,体外编辑试验表明,所设计的sgRNA可以对Rosa26位点发生编辑作用;（2）肌肉特异打靶载体的构建:通过PCR和同源重组连接,成功构建了肌肉特异表达Cas9蛋白的同源打靶载体Donor-SP-Cas9-DsRed;（3）Rosa26基因编辑胚胎和小鼠的获得:注射Rosa26 sgRNA和Cas9到小鼠胚胎,注射后的胚胎可以正常卵裂并支持囊胚发育,通过PCR和测序结果显示,获得的胚胎为基因编辑胚胎,注射的胚胎经胚胎移植后,获得了 Rosa26基因编辑小鼠;（4）通过将同源打靶载体与Rosa26 sgRNA和Cas9联合注射的方式,获得肌肉特异表达Cas9蛋白的基因打靶胚胎;综上所述,通过构建MSTN基因RNA干涉载体、转染绵羊成纤维细胞建立MSTN敲低转基因细胞系和转基因细胞核移植等程序,可以获得MSTN敲低的绵羊转基因克隆胚,胚胎移植后获得流产胎儿且携带外源基因,表明获得的重构胚具有体内发育能力,可以通过该方法获得MSTN敲低的转基因绵羊。本研究结果为培育MSTN敲低的绵羊新品系提供了依据。此外,通过利用CRISPR/Cas9系统,获得了基因编辑胚胎和小鼠,初步在小鼠上建立了基因编辑和基因打靶体系,为后续利用CRISPR/Cas9系统获得基因打靶绵羊奠定基础。
王士勇,杨月春,郑军军,刘宗岳,方大雨,杨福合[2]（2014）在《秋水仙胺诱导牛卵母细胞显核的研究》文中研究指明为了观察秋水仙胺（demecolcine,DEME）诱导牛卵母细胞的显核效果,从吉林省长春市某屠宰场收集牛卵巢后采用抽吸法获取卵泡液,在体视显微镜下选择卵丘完整、胞质均匀的卵丘-卵母细胞复合体（COCs）,微滴法体外成熟（in vitro mature,IVM）培养1922 h,在0.3%透明质酸酶中旋涡振荡去除卵母细胞周围的卵丘细胞,挑选排出第一极体的卵母细胞随机分组,分别进行DEME浓度和作用时间诱导牛卵母细胞显核的研究。结果表明,DEME处理60、90、120 min组间显核率差异不显着（P>0.05）,但是60、120 min组的显核率显着高于DEME处理30 min组（P<0.05）。当DEME浓度为0.5μg/m L时,显核率最高,为78.9%,显着高于0.3、0.4μg/m L组（P<0.05）,但是与0.6μg/m L组差异不显着（P>0.05）。牛的COCs经IVM培养19、20、21、22 h,结果发现培养22 h组显核率最高,显着高于培养19 h组（P<0.05）,但是与培养20、21 h组差异不显着（P>0.05）。可见牛卵母细胞经IVM培养2022 h后,用0.5μg/m L DEME处理60 min可以有效诱导其显核。
王士勇[3]（2014）在《梅花鹿、水貂、蓝狐及貉—牛异种体细胞核移植技术研究》文中研究指明为了探索梅花鹿-牛异种体细胞核移植技术，为梅花鹿胚胎工程研究奠定技术基础，本论文对其供核细胞的培养和冷冻保存、受体卵母细胞的体外成熟、显微操作、重组胚胎外培养等技术环节进行了探索研究，并在水貂、蓝狐和貉等毛皮动物上验证了建立的异种体细胞核移植技术体系。主要内容如下：（1）梅花鹿、水貂、蓝狐和貉耳皮肤成纤维细胞（Ear Skin Fibriblasts，ESF）经组织块法原代培养，利用酶消化时间差与贴壁时间差法处理3～5次纯化，结果显示细胞生长特点为贴壁生长、呈梭形、具伪足，F5代细胞生长曲线呈“潜伏期-对数生长期-停滞期”的模式。DMSO作为抗冻保护剂时，梅花鹿、水貂、蓝狐和貉ESF解冻复苏后复苏率分别为89.64%、92.44、91.24和91.04，显着高于甘油作为抗冻保护剂。结论：梅花鹿、水貂、蓝狐和貉ESF具有典型的皮肤成纤维细胞生长特点，通过酶消化时间与贴壁时间差的方法对其纯化可行，冷冻保存时可采用10%DMSO作为抗冻保护剂。（2）牛卵丘-卵母细胞复合体（Cumulus Oocyte Complexes，COCs）经22h体外成熟培养之后，LH+FSH和PMSG+HCG组成熟率分别为79.1%和75.2%，差异不显着，但是两组成熟率均显着高于对照组；牛COCs经（Brilliant Cresyl Blue, BCB）染色染色90min后卵母细胞着色率为68.1%，显着高于30、60min组，辨识难度为“中”；牛COCs经39μM的BCB染色后，着色率为64.5%，显着高于13μM组的29.3%；BCB+组和BCB-组的成熟率与对照组比较差异均不显着；在体外成熟培养液中添加50ng/mL表皮生长因子（Epidermal Growth Factor，EGF）后培养牛的COCs，22h后成熟率为77.4%，显着高于0、10、20ng/mL组。结论：在牛卵母细胞体外成熟培养液中添加国产激素10IU/mL PMSG、15IU/mL HCG和50ng/mL的EGF能显着提高其体外成熟率；BCB法筛选优质卵母细胞在本试验体系下不适用。（3）牛COCs经体外成熟20、21、22h后，0.4μg/mL脱羰秋水仙碱（Demecolcine，DEME）诱导显核率分别为61.0%、65.3%和66.7%，差异不显着；经0.4μg/mL DEME处理60、120min后，显核率分别为70.0%和71.9%，显着高于30min组；经0.5μg/mL DEME处理60min之后，显核率为78.9%，显着高于0.3、0.4μg/mL组；DEME辅助法的去核率为100.0%，显着高于挤压法和盲吸法，三种去核方法的去核时间差异不显着；带下注核与全细胞胞质内注核的成功率分别为100%和94.8%，注核时间分别为31.0s和35.1s，与破膜后胞质内注核比较差异均显着；一步操作和两步操作的相同注核方法处理组之间在激活率、卵裂率和囊胚率方面均无显着差异；0、0.25、0.50和1.00μM白藜芦醇对梅花鹿-牛ISCNT胚胎卵裂率没有显着影响，0.50和1.00μM组囊胚发育率分别为38.0%和36.7%，显着高于0、0.25μM组；梅花鹿-牛ISCNT胚胎用体细胞共培养时，水貂ESF组的卵裂率为55.7%，显着高于对照组，牛卵丘细胞组囊胚发育率为59.4%，显着高于对照组和其他两组。结论：梅花鹿-牛ISCNT研究可采用下面的技术程序：牛卵母细胞经IVM20～22h后，用0.5μg/mL DEME处理60min诱导显核，Pizeo辅助破膜胞质内注核的一步显微操作核移植，激活后的重组胚用牛卵丘细胞共培养。（4）采用Pizeo辅助全细胞胞质内注核的方法构建毛皮动物-牛ISCNT胚胎时，水貂、蓝狐和貉ESF作为供核细胞，在注核成功率、卵裂率和囊胚率之间差异不显着；牛卵丘细胞作为共培养细胞时，水貂、蓝狐、貉-牛ISCNT胚胎的囊胚率分别为43.6%、40.1%和42.1%，均显着高于对照组。结论：梅花鹿-牛ISCNT技术程序同样适用于水貂、蓝狐和貉等三种毛皮动物与牛的ISCNT。
任久生[4]（2013）在《化学辅助去核方法对牛卵母细胞MAPK活性及母源基因c-mos表达水平的影响》文中研究指明自从1997年克隆羊多莉成功诞生以来，体细胞核移植技术、转基因技术以及干细胞治疗一直是研究的热点。尽管不断有克隆动物诞生，但克隆成功率仍处于较低水平。克隆是个相对复杂的过程且有多种因素可以影响克隆效率，其中包括不同供体细胞类型、不同的去核方法、不同的激活方法和不同类型培养基等。其中不同的去核方法对克隆效率有直接影响，化学辅助去核方法与其他去核方法比较有去核准确、吸出胞质量少和细胞毒性小的优点，因此化学辅助去核方法在大动物去核上有广泛应用，但具体分子作用机制研究甚少。为了阐明秋水仙素引起卵母细胞的同源染色质凝集形成细胞膜突起的分子机制。本实验探讨了在基础培养基添加中PVA、L-cysteine和不同浓度FSH对牛卵母细胞成熟率的影响并对CB+离子霉素、6-DMAP+离子霉素、CB+6-DMAP+离子霉素化学激活和电激活的卵裂率和囊胚率进行比较。探讨了秋水仙素不同处理浓度、不同处理时间及和蔗糖共同处理对牛卵母细胞细胞膜突起率的影响。然后，利用Western-blot、实时荧光定量PCR和免疫荧光，重点探讨了秋水仙素处理对牛卵母细胞中促分裂原活化蛋白激酶（mitogen-activatedprotein kinase，MAPK）活性及其上游调控基因c-mos表达水平的影响，以及在这一过程中纺锤体和细胞核的位置在牛卵母细胞中的变化。研究结果表明，在培养基中添加FSH可以显着提高牛卵母细胞成熟率，添加L-cysteine能够抑制牛卵母细胞的成熟，在TCM199+10%FBS+50μg/mlFSH+2.2μg/mlpyruvate+1μg/ml17β-estradio+1%penicillin streptomycin的培养基中牛卵母细胞成熟率最高达95.92%。通过对牛卵母细胞不同孤雌激活方法进行比较发现，CB+6-DMAP+离子霉素化学激活效果最佳，卵裂率和囊胚率分别为90.59%和21.17%（P<0.05）。同时，对秋水仙素处理牛卵母细胞的不同浓度和时间比较分析表明，秋水仙素的最适处理浓度为0.6μg/ml，最佳处理时间为1h，秋水仙素和蔗糖共同处理可以提高牛卵母细胞细胞膜突起率。Western-blot结果表明经秋水仙素处理的牛卵母细胞中MAPK的活性升高，并且实时荧光定量PCR结果表明秋水仙素能够上调母源基因c-mos的表达水平，经免疫荧光观察发现纺锤体和细胞核位置位于细胞膜突起处。综上所述，本研究优化了牛卵母细胞的体外培养体系和秋水仙素的处理条件。不仅证明了秋水仙素和蔗糖同时处理可以提高牛卵母细胞细胞膜突起率，而且证明了秋水仙素上调母源基因c-mos的表达水平，并能够使MAPK活性升高。而且在这一过程中，纺锤体和细胞核的位置发生了改变。说明秋水仙素引起卵母细胞膜的突起的原因可能是通过调控母源基因c-mos表达水平，继而影响MAPK的活性，从而导致卵母细胞减数分裂过程中纺锤体的形态及组装发生改变。研究结果为阐明化学辅助去核方法的分子机制提供了理论基础。
柳海星[5]（2013）在《转人血清白蛋白延边奶山羊—绵羊体细胞克隆胚胎生产体系的优化》文中研究指明人血清白蛋白（Human serum albumin, HSA）是迄今为止产量最大、用量最大的蛋白质药物。可是现在的生产方式主要是人的血液通过分级过滤获得,产量有限,而且因为血浆来源复杂,容易导致污染。因此,通过转基因技术构建乳腺表达载体,利用体细胞克隆技术得到分泌含人血清白蛋白乳汁的转基因克隆动物,并从动物乳汁中提取人血清白蛋白,是解决人血清白蛋白供应短缺的有效方法。乳腺生物反应器生产人血清白蛋白具有生产成本低、产品产量高、活性高、易于纯化等优点。制约转基因乳腺生物反应制药的主要因素是体细胞核移植技术效率低下。因此,本研究以延边奶山羊和本地绵羊为研究对象,对卵母细胞体外成熟、延边奶山羊-绵羊重构胚胎的构建及体外发育进行了研究,以期提高核移植效率,为以后得到表达人血清白蛋白的转基因延边奶山羊奠定坚实的基础。本研究共分为三个部分,第一部分进行了不同核成熟抑制剂及抗氧化剂对绵羊卵母细胞体外成熟的影响的研究；第二部分进行了转人血清白蛋白延边奶山羊-绵羊重构胚的构建研究；第三部分是表没食子儿茶素没食子酸酯（Epi-gallocatechin-3-gallate, EGCG）对转人血清白蛋白延边奶山羊-绵羊重构胚体外发育质量的影响。主要研究结果如下：1.在绵羊卵母细胞体外成熟培养过程中,核成熟抑制剂HX、IBMX最适宜的添加浓度分别为2mM和0.2mM,抗氧化剂最佳添加量,除了半胱氨酸为0.6mM、 EGCG为5μM之外,其余三种β-ME、VC、VE最佳添加量均为100μM；2.盲吸去核法或化学辅助去核法去核,重构胚的卵裂率及囊胚率没有显着差异,但化学辅助去核法（0.2μg/mL的Deme处理0.5h）去核率为100%,可以高效快速地去核,且不影响重构胚的早期发育；3.延边奶山羊-绵羊重构胚的适宜电融合参数为2个120V,40μs次的电脉冲,适宜激活方法为Ion预激活5分钟,6-DMAP激活2h；4.重构胚体外培养时EGCG的适宜添加浓度为15μM,适宜添加时间为IVM和重构胚体外培养1-2天。
王中伟[6]（2011）在《HDAC1基因在牛卵母细胞和早期克隆胚胎发育中的作用》文中研究表明通过与转基因技术相结合,体细胞核移植技术已经被广泛的应用于抗病育种以及人类医学动物模型的建立。由于生产克隆动物的效率还很低,限制了这一技术在应用领域的发展。提高核移植效率需要从两个方面入手,一是优化体细胞核移植操作方法；二是从分子和细胞水平研究核移植过程中的重编程机制,从而揭示生产克隆动物效率低的本质原因。本实验对牛体细胞核移植的各个环节进行了系统研究,并且用RNA干扰技术研究了HDAC1在早期胚胎发育中的作用。结果表明：（1）牛卵母细胞成熟培养18h到20h进行去核最佳,脉冲强度180v/mm-250v/mm,脉冲时间10μs,两次脉冲对克隆胚胎进行融合,融合率最高,200mg/ml PHA处理卵母细胞30min以及5mg/ml pronase处理供体细胞5min能显着提高克隆胚胎融合率,饲养层培养体系能有效提高克隆胚胎体外培养发育率,克隆牛多胚胎着床容易导致受体母牛腹腔积水,秋季进行胚胎移植受体牛妊娠率高于冬季移植；（2）si299能有效干扰牛卵母细胞和胚胎中HDAC1的表达,HDAC1下调不会对牛卵母细胞成熟产生影响,但会导致牛孤雌胚胎囊胚率和囊胚细胞数显着降低,组蛋白H3K14在HDAC1下调的孤雌胚胎中表现为乙酰化增强;3) HDAC1的下调并不影响组蛋白H3K14在牛胎儿成纤维细胞中的乙酰化状态,HDAC1持续下调会导致克隆胚胎发育能力下降和囊胚中细胞凋亡,50nM TSA处理牛克隆胚胎12h能显着提高牛克隆胚胎囊胚率。总之,本实验对牛体细胞核移植程序进行了优化,对牛早期胚胎发育过程中HDAC1的作用进行了有益探讨和论述,为研究体细胞核移植过程中重编程机制奠定了坚实基础。
马晓玲[7]（2011）在《牛体细胞核移植技术体系优化的研究》文中研究指明本研究以牛卵母细胞为对象,对卵母细胞体外成熟培养体系和孤雌胚胎体外培养体系进行了优化研究。比较了mTCM-199成熟培养液、SOF成熟培养液以及商品化卵子成熟培养液1600对牛卵成熟效率的影响；对美国Vitrolife和SAGE公司的两种商品化胚胎培养液培养孤雌胚胎的卵裂率和囊胚发育率进行了比较；比较了以牛耳成纤维细胞和克隆幼牛耳成纤维细胞作为供核细胞生产克隆胚胎的效率差异；采用自制的密闭气袋进行胚胎培养,研究取得如下结果：1.比较了三种体外成熟培养液对牛卵成熟以及孤雌胚胎发育的影响,结果表明,在成熟率方面,SOF成熟液培养组明显高于mTCM-199成熟液培养组（77.99% vs64.84%,P<0.05）,但在卵裂率上mTCM-199成熟培养液却高于SOF成熟培养液（81.11%vs 71.13%,P<0.05）,两者在孤雌胚胎囊胚发育率（24.64% vs 24.14%,P>0.05）上无差异；商品化卵子成熟液1600在成熟率（63.69% vs 56.70%,P<0.05）、孤雌激活后卵裂率（87.93% vs 74.36%,P<0.05）和囊胚发育率（25.49% vs 17.24%,P<0.05）上均高于mTCM-199成熟培养液；同时商品化卵子成熟液1600在成熟率（72.37% vs 60.41%,P<0.05）、孤雌激活后卵裂率（91.82% vs 80.95%,P<0.05）和囊胚发育率（30.69% vs22.69%,P<0.05）上也均高于SOF成熟培养液。2.比较了密闭气袋培养体系与培养箱正常培养体系间卵母细胞成熟率（74.79% vs71.69%,P>0.05）、卵裂率（83.07% vs 81.39%,P>0.05）和囊胚率（26.75% vs 22.87%,P>0.05）的差异,结果显示密闭气袋培养体系在统计数据上高于培养箱培养组,但两者无显着差异。3.应用商品化胚胎培养液培养牛孤雌胚胎的研究结果显示,美国Vitrolife公司和SAGE公司的胚胎培养液在卵裂率（86.45% vs 82.30%,P>0.05）上无显着差异,但囊胚发育率（33.45%vs 21.20%,P<0.05）上差异显着,Vitrolife公司的胚胎培养液在囊胚发育率上高于SAGE公司。4.以牛耳成纤维细胞和克隆幼牛耳成纤维细胞作为供核细胞生产克隆胚胎的研究结果表明,克隆幼牛耳成纤维细胞在融合率（92.12% vs 87.68%,P<0.05）、囊胚率（32.68%vs 23.19%,P<0.05）上均高于牛耳成纤维细胞。本研究结果表明：mTCM-199成熟培养液比SOF成熟培养液更有利于胚胎的后期发育,但这两者与商品化的1600成熟培养液相比,还有一定的差距,仍需进一步优化体系。密闭气袋培养系统简单实用,适合在基层生产科研单位推广,有实用价值。两种商品化的胚胎培养液,Vitrolife公司的胚胎培养液在囊胚发育率上高于SAGE公司。在供核细胞选择方面,以克隆幼牛耳成纤维细胞为供核细胞比以成年牛耳成纤维细胞作为供核细胞进行体细胞核移植可以获得更高的克隆囊胚率。
王鹏征[8]（2010）在《全细胞胞质内注射法（WCICI）生产体细胞克隆牛胚胎及质量鉴定的研究》文中研究说明在体细胞核移植技术中,胞质内全细胞注射法与传统的电融合法相比,具有操作简单、快速等优点,同时也可免去电融合仪这一昂贵的开支,有利于体细胞核移植技术的推广。体细胞核移植技术过程复杂,步骤较多,本研究分析了卵巢保存时间、去核方法和胚胎培养液三个因素对生产克隆胚胎效率的影响,以期获得优化的核移植方法。胚胎质量鉴定无论在临床还是理论上都有重要意义,本研究以前人报道的方法为基础,结合本实验室的实际情况,初步建立了胚胎发育速度评定、核型分析和区分染色的方法,为进一步提高胚胎质量奠定了基础。主要的研究结果如下：1.卵巢保存对体细胞核移植胚胎早期发育的影响该试验包括两部分,第一部分研究了卵巢保存时间对胚胎发育的影响,设立了2h、9h、21h三个组,以2h组为对照组。与对照组相比,卵巢20℃下保存9h不会影响卵母细胞成熟率（64.55% vs. 70.41%,P>0.05）以及克隆胚胎的卵裂率（65.92%vs. 66.11%,P>0.05）和囊胚率（34.09% vs. 37.20%,P>0.05）。当卵巢20℃下保存时间达到21h时,成熟率（42.47% vs. 70.41%,P<0.05）、卵裂率（40.44% vs. 66.11%,P<0.05）和囊胚率（13.60% vs. 37.20%,P<0.05）均显着低于对照组和9h组。结果表明,较长时间的卵巢保存会影响牛卵母细胞体外成熟和体细胞核移植胚胎早期发育,而较短时间（9h）的保存不会影响早期胚胎的形成率。第二部分设计了一个对照组和三个不同保存温度的试验组（4℃,20℃,37℃）,对照组采用的是保存2h的卵巢。与对照组相比,37℃下保存明显降低了卵母细胞的成熟率（47.36% vs. 70.41%,P<0.05）,而4℃和20℃组与对照组相比,成熟率之间没有显着差异（55.30% vs. 70.41%,64.55% vs. 70.41%,P>0.05）。在卵裂率和囊胚率方面,20℃组显着高于4℃组（65.92% vs. 46.95%,34.09% vs. 25.78%,P<0.05）,且与对照组之间没有显着差异；4℃组显着高于37℃组（46.95% vs. 24.46%,27.58%vs. 15.56%,P<0.05）；4℃组和37℃组与对照组均存在显着差异。结果说明较高或较低的温度都不利于卵巢保存,室温或略低于室温的保存温度更适合卵巢的保存。2.去核方法对克隆胚胎早期发育的影响去核方法显着影响体细胞核移植胚胎早期发育,荧光辅助去核法可以显着提高胚胎重构率（83.35% vs. 59.09%,P<0.05）；紫外照射10sec以上,显着降低了胚胎的卵裂率和囊胚率,而照射5sec以下组与盲去法组相比,卵裂率（62.44% vs. 66.93%,P>0.05）和囊胚率（30.63% vs.33.57%,P>0.05）没有显着差异。相比较而言,采用照射5sec以下的荧光辅助去核法更适合本试验研究,因为这种方法不仅简化了操作,而且提高了卵母细胞的利用率。3.胚胎培养液对克隆胚胎早期发育的影响试验随机选取完成激活的重构胚,分别用KSOM和SOF培养,发现囊胚率方面KSOM显着高于SOF组（38.24% vs.30.63%,P<0.05）,说明KSOM培养液较SOF更适合体细胞核移植胚胎的早期培养。但是两种培养液的卵裂率没有显着差异（64.21% vs.62.44%,P>0.05）。4.体外胚胎核型分析本研究比较了盲去法和荧光辅助去核法紫外照射小于5sec和紫外照射大于10sec三种情况对胚胎染色体数目的影响,紫外照射10sec以上组的非正常染色体比例（72.33%）显着高于其它两组（39.17%和42.50%）,而其它两组没有显着差异（39.17% vs.42.50%,P<0.05）。试验统计了体细胞核移植胚胎染色体变异的总体情况,发现在非正常的染色体中,混倍体（17.95%）和多倍体（12.82%）的情况多于单倍体（7.69%）。试验以传统的经典遗传学方法为基础,加以改进,成功在本实验室建立起胚胎核型分析的方法。5.胚胎的区分染色将完成激活的胚胎随机分为两组分别用KSOM和mSOF培养液培养后比较细胞数目。两种培养液得到的胚胎滋养层细胞数（59.87 vs.74.83,P<0.01）和总细胞数（81.59 vs.100.16,P<0.01）之间均存在显着差异,但内细胞团细胞数之间没有显着差异（P>0.05）。试验以最近报道的较为高效的区分染色方法为基础,加以改进,在本实验室初步建立了该方法。
唐爽[9]（2010）在《核质相互作用对供体核重编程的影响》文中研究指明在农业生产和生物医学研究中,体细胞核移植都有着极其重要的应用,但是,克隆效率低下一直阻碍着体细胞核移植的进一步应用和发展。核移植的技术步骤较为复杂,很多相关的研究也一直围绕核移植操作流程中的受体卵母细胞的去核方法、融合过程、激活过程以及早期胚胎体外培养体系等方面进行了探讨。然而,由于克隆胚胎发育率的多变性和胎儿发育效率的低下性,除了从核移植的操作流程方面去探讨和改良外,同时还应该从生产重构胚胎的生物材料——即供体细胞和受体卵母细胞的来源、质量及表观遗传状态等——对于重编程的影响及二者之间的相互作用进行探讨和研究。本研究首先优化了牛卵母细胞体外成熟培养体系。本实验对比了四种不同的激素配比对牛卵母细胞体外成熟的作用,结果显示添加人尿促性腺激素（HMG）的成熟实验结果稳定,17β-雌二醇（E2）对牛卵母细胞成熟有一定的促进作用,HMG+E2联合使用可以得到高效稳定的成熟结果;在此基础上,比较了表皮生长因子（EGF）对牛卵母细胞体外成熟和孤雌胚胎发育的影响,结果表明在成熟液中添加30 ng/ml EGF对牛卵母细胞的成熟质量、胚胎发育及降低胚胎细胞凋亡都有明显的促进作用。本研究最终确定的牛卵母细胞体外成熟培养液为:TCM-199中添加0.075 IU/ml HMG,1μg/ml E2,30 ng/ml EGF,10%（v/v）FBS。接下来本研究对比了血清饥饿法与接触抑制法在调整供体细胞周期中对核移植效果产生的作用。结果发现,虽然两种方法在重构胚的融合率、卵裂率和囊胚发育率上并无太大的差异,二者均可以得到较好的结果;但是血清饥饿处理会引起胚胎凋亡率增加,导致核移植胚胎质量下降。细胞的传代会对核移植结果产生影响,以第2-5代细胞的效果最好,但当传代次数过多后则会造成重构胚发育能力的下降;也会引起核移植囊胚凋亡率上升。根据以上结果,本研究在后续实验中均使用接触抑制法处理的第2-5代细胞为供体细胞。随后,本研究分别应用未成熟卵母细胞抽提物、成熟卵母细胞抽提物和孤雌激活的卵母细胞抽提物预处理供体细胞,通过对比处理细胞的全能性基因表达和脱乙酰化程度检测三种胞质抽提物对供体细胞的重编程效果。随后进行核移植实验,以正常核移植胚胎为对照比较了来自于三组不同抽提物预处理供体细胞的重构胚的体外发育情况和囊胚质量,从而分析牛卵胞质抽提物对供体细胞的重编程作用对体细胞核移植的影响。结果如下,三组胞质抽提物都能有效的重编程供体细胞;在三组抽提物中,成熟卵胞质抽提物使得供体核的表观遗传状态与受体胞质更为接近,因此对克隆胚胎发育率和囊胚质量有显着的促进作用。这些结果表明,用牛卵胞质抽提物预处理供体细胞能提高重构胚体外发育能力,相对于将供体核重编程到一个更低的分化状态,将供体核重编程到一个与受体胞质相一致的状态更有利于克隆胚胎的发育。本研究设计使用小鼠和牛两种在基因表达调控和发育程序上有着巨大差异的物种研究早期胚胎中供体核与胞质在指导发育上的作用,构建了小鼠-牛异种克隆胚胎,检测了异种胚胎的体外发育时间、胚胎形态、合子激活基因的表达情况,结果表明异种克隆胚胎在合子基因激活（ZGA）前的发育是由牛的卵胞质控制的,在发育时序和胚胎形态上都表现出牛胚胎的特性,同时小鼠的合子基因激活也受到牛卵胞质的作用而在8-细胞期才得以表达,并且激活是不完全的。小鼠的合子基因激活受到牛卵胞质的影响而延迟和不完全激活是造成小鼠-牛异种克隆胚阻滞在8-细胞期的一个原因。最后,本研究设计使用38.5℃正常培养的孤雌激活胚胎与41℃培养7 h的热激孤雌激活胚胎进行核质置换,分别构建热激核-正常胞质重构胚以及热激胞质-正常核重构胚,检测了核质置换胚胎的体外发育率、合子激活基因的表达和胚胎凋亡情况,以研究早期胚胎核与胞质对热激的应激反应,以及产生应激后二者之间的相互作用。结果如下,当正常核移入热激的卵胞质,重构胚的发育率显着下降;热激后的核质置换胚胎中存在合子基因激活不完全的现象,这种情况主要存在于热激胞质-正常核重构胚中;热激能诱导胚胎发生细胞凋亡,早期胚胎的胞质对热激更敏感并在后期的诱导凋亡中起到主导作用。这些结果表明,虽然热激对核和胞质都有损伤,但胞质对热激损伤更为敏感。早期胚胎受到热激后导致发育能力降低的易感性主要是由于胞质所引起的;早期胚胎受到热激可能会损伤到卵胞质中的母源因子,即使与正常核构成重构胚也依然会导致合子基因表达异常;并且胞质受到热激损伤会在热激诱导的凋亡机制中起到比核更大的作用。
雷安民,马晓玲,高志敏,胡勇策,隋进强,黄伟伟,昝林森,窦忠英[10]（2009）在《牛体细胞核移植显微操作环节的优化》文中进行了进一步梳理本研究从牛卵母细胞去核方法（纺锤体观测仪法&Hoechst33342染色法）、供体细胞核引入去核卵细胞质的方法（卵细胞质注射法和电融合法）和重构胚胎电融合（3组参数）等3个环节对牛体细胞核移植的显微操作过程及相关参数进行了筛选优化。以核移植胚胎的卵裂率、囊胚发育率作为检测指标,对不同的方法所获得的克隆胚胎的卵分裂率与囊胚发育率进行比较,最后筛选获得1个优化的牛体细胞核移植操作程序,即采用Spindle view系统对牛卵母细胞进行去核操作,将供核体细胞注射到卵周隙,然后通过电融合法将供体核引入去核卵细胞质（电融合参数为1.9kV/cm,脉冲时程10μs,方波2次间隔2s）。以此核移植程序进行牛体细胞核移植实验,自获得克隆胚胎中筛选80枚优质囊胚移植到33头受体牛子宫内,最后2头母牛产下2头克隆牛犊,结果表明利用该优化的显微操作环节进行牛体细胞核移植可以获得体细胞克隆牛犊。
二、牛卵母细胞去核方法的研究（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、牛卵母细胞去核方法的研究（论文提纲范文）
（1）Myostatin基因敲低克隆绵羊的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 绪论 |
| 1.1 肌肉生长抑制素(Myostatin,MSTN) |
| 1.1.1 MSTN基因的发现 |
| 1.1.2 MSTN基因和蛋白结构 |
| 1.1.3 MSTN基因的表达 |
| 1.1.4 MSTN的作用机制 |
| 1.1.5 MSTN的表达调控机制 |
| 1.1.6 MSTN基因的应用前景 |
| 1.2 RNA干涉 |
| 1.2.1 RNA干涉现象的发现 |
| 1.2.2 RNA干涉的作用机制 |
| 1.2.3 RNA干涉的作用特点 |
| 1.2.4 siRNA和shRNA技术优缺点 |
| 1.2.5 哺乳动物的RNA干涉 |
| 1.2.6 RNA干涉的应用前景 |
| 1.3 卵母细胞的体外成熟 |
| 1.3.1 卵母细胞的成熟 |
| 1.3.2 卵母细胞的成熟调控机制 |
| 1.3.3 卵母细胞成熟的特征 |
| 1.3.4 卵母细胞成熟的影响因素 |
| 1.4 哺乳动物细胞核移植 |
| 1.4.1 哺乳动物胚胎细胞核移植研究进展 |
| 1.4.2 哺乳动物胚胎干细胞核移植研究进展 |
| 1.4.3 哺乳动物体细胞核移植研究进展 |
| 1.4.4 哺乳动物转基因细胞核移植研究进展 |
| 1.4.5 影响细胞核移植结果的因素 |
| 1.4.6 核移植存在的问题 |
| 1.5 CRISPR/Cas9 |
| 1.5.1 CRISPR/Cas9的发现 |
| 1.5.2 Cas9蛋白的结构 |
| 1.5.3 CRISPR/Cas9的作用机制 |
| 1.5.4 CRISPR/Cas9面临的问题和挑战 |
| 1.6 研究的目的与意义 |
| 2 绵羊Myostatin基因RNA干涉载体构建与活性分析 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 实验动物、细胞和菌株 |
| 2.1.2 实验载体信息 |
| 2.1.3 药品和试剂 |
| 2.1.4 溶液的配制 |
| 2.1.5 主要仪器设备 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 绵羊Myostatin基因克隆与序列分析 |
| 2.2.2 绵羊Myostatin真核表达载体的构建 |
| 2.2.3 绵羊Myostatin基因RNA干涉载体的构建 |
| 2.2.4 293GP细胞的复苏和传代培养 |
| 2.2.5 绵羊Myostatin基因RNA干涉载体效率检测 |
| 2.2.6 绵羊Myostatin基因RNA干涉载体的显微注射 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 绵羊Myostatin基因的克隆与序列分析 |
| 2.3.2 绵羊Myostatin基因真核表达载体的构建 |
| 2.3.3 绵羊Myostatin基因RNA干涉载体测序 |
| 2.3.4 293GP细胞复苏传代与转染 |
| 2.3.5 RNA干涉效率结果与分析 |
| 2.3.6 RNA干涉载体表达活性分析 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 本章小结 |
| 3 绵羊Myostatin基因敲低成纤维细胞系的建立 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 实验动物 |
| 3.1.2 主要药品和试剂 |
| 3.1.3 溶液配制 |
| 3.1.4 主要仪器设备 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 RNA干涉载体的线性化 |
| 3.2.2 绵羊皮肤成纤维细胞的培养 |
| 3.2.3 G418浓度的筛选 |
| 3.2.4 绵羊皮肤成纤维细胞的转染及筛选 |
| 3.2.5 绵羊MSTN敲低转基因细胞系的鉴定 |
| 3.2.6 绵羊MSTN敲低转基因细胞的冷冻保存 |
| 3.2.7 绵羊MSTN敲低转基因细胞的冷冻复苏 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 绵羊皮肤成纤维细胞的原代培养 |
| 3.3.2 最适G418浓度的筛选 |
| 3.3.3 转基因细胞的生物学特征 |
| 3.3.4 转基因阳性细胞的PCR鉴定 |
| 3.3.5 冷冻复苏的转基因细胞的生物学特征 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 本章小结 |
| 4 绵羊Myostatin基因敲低细胞核移植 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.1.1 实验动物 |
| 4.1.2 药品试剂 |
| 4.1.3 溶液配制 |
| 4.1.4 仪器设备 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 绵羊卵母细胞的获取 |
| 4.2.2 绵羊卵母细胞的体外成熟 |
| 4.2.3 绵羊成熟卵母细胞的孤雌激活 |
| 4.2.4 绵羊皮肤成纤维细胞的复苏 |
| 4.2.5 显微操作前的实验准备 |
| 4.2.6 核供体细胞的准备 |
| 4.2.7 核受体卵母细胞的准备 |
| 4.2.8 卵母细胞的去核和注核 |
| 4.2.9 重构胚的融合与激活 |
| 4.2.10 重构胚的体外培养 |
| 4.2.11 转基因胚胎的分子鉴定 |
| 4.2.12 转基因胚胎的移植 |
| 4.2.13 数据统计 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 卵巢的保存和运输对绵羊卵母细胞成熟的影响 |
| 4.3.2 绵羊卵母细胞的采集方法和分级对卵成熟的影响 |
| 4.3.3 卵密度和不同成熟液对绵羊卵母细胞成熟的影响 |
| 4.3.4 绵羊卵母细胞成熟时间对成熟和去核的影响 |
| 4.3.5 不同的激活方法对绵羊卵母细胞孤雌激活的影响 |
| 4.3.6 供体细胞修饰和处理对绵羊重构胚发育的影响 |
| 4.3.7 绵羊重构胚融合方式对核移植胚胎发育的影响 |
| 4.3.8 重构胚激活前培养时间对绵羊重构胚发育的影响 |
| 4.3.9 不同培养液对绵羊核移植重构胚发育的影响 |
| 4.3.10 转基因重构胚的获得和PCR鉴定 |
| 4.3.11 胚胎移植和流产胎儿鉴定 |
| 4.4 讨论 |
| 4.4.1 卵巢的保存和运输 |
| 4.4.2 卵母细胞的采集、分级和培养 |
| 4.4.3 供体细胞的遗传修饰和处理 |
| 4.4.4 重构胚的融合、激活和培养 |
| 4.4.5 转基因动物的生产 |
| 4.5 本章小结 |
| 5 肌肉特异表达Cas9蛋白打靶胚胎的获得 |
| 5.1 实验材料 |
| 5.1.1 实验动物和菌株 |
| 5.1.2 实验载体信息 |
| 5.1.3 药品和试剂 |
| 5.1.4 溶液的配制 |
| 5.1.5 主要仪器设备 |
| 5.2 实验方法 |
| 5.2.1 小鼠Rosa26基因sgRNA的设计与获得 |
| 5.2.2 Rosa26基因sgRNA体外编辑效率检测 |
| 5.2.3 肌肉特异性小鼠Rosa26同源打靶载体的构建 |
| 5.2.4 小鼠胚胎的显微注射 |
| 5.2.5 注射后囊胚的基因分型和检测 |
| 5.2.6 胚胎移植和基因分型检测 |
| 5.3 结果 |
| 5.3.1 sgRNA获得与体外编辑效率检测 |
| 5.3.2 肌肉特异表达同源打靶载体的构建 |
| 5.3.3 小鼠Rosa26基因编辑胚胎的获得 |
| 5.3.4 Rosa26基因编辑小鼠的获得 |
| 5.3.5 肌肉特异表达Cas9蛋白小鼠胚胎的获得 |
| 5.4 讨论 |
| 5.5 本章小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
| 致谢 |
（2）秋水仙胺诱导牛卵母细胞显核的研究（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 药品与试剂 |
| 1.2 卵巢的获取及卵母细胞的收集 |
| 1.3 卵母细胞体外成熟 |
| 1.4 试验设计 |
| 1.5 统计分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 DEME处理时间对牛卵母细胞显核效果的影响 |
| 2.2 DEME浓度对牛卵母细胞显核效果的影响 |
| 2.3 IVM时间对DEME诱导牛卵母细胞显核效果的影响 |
| 3 结论与讨论 |
（3）梅花鹿、水貂、蓝狐及貉—牛异种体细胞核移植技术研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略表 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 梅花鹿的繁殖特点及繁育生物技术 |
| 1.1.1 梅花鹿的繁殖特点 |
| 1.1.2 梅花鹿的繁育生物技术 |
| 1.2 水貂、蓝狐及貉的经济价值与繁育生物技术 |
| 1.2.1 水貂的经济价值与繁育生物技术 |
| 1.2.2 蓝狐和貉的经济价值与繁育生物技术 |
| 1.3 异种体细胞核移植技术研究进展 |
| 1.3.1 ISCNT 研究历史 |
| 1.3.2 ISCNT 关键技术环节 |
| 1.3.3 ISCNT 的研究意义 |
| 1.3.4 ISCNT 研究存在的问题 |
| 1.4 本研究的内容、目的及意义 |
| 1.4.1 梅花鹿、水貂、蓝狐和貉耳皮肤成纤维细胞培养及冷冻保存 |
| 1.4.2 牛卵母细胞体外成熟培养条件的优化 |
| 1.4.3 梅花鹿-牛 ISCNT 技术方法的研究 |
| 1.4.4 水貂、蓝狐及貉-牛 ISCNT 胚胎的制备 |
| 第二章 供核细胞培养及冷冻保存 |
| 2.1 材料和方法 |
| 2.1.1 材料 |
| 2.1.2 方法 |
| 2.1.3 试验设计 |
| 2.1.4 统计分析 |
| 2.2 结果与分析 |
| 2.2.1 梅花鹿、水貂、蓝狐和貉耳皮肤成纤维细胞的生长特性 |
| 2.2.3 DMSO 和甘油对不同供核细胞的冷冻保护效果 |
| 2.3 讨论 |
| 2.3.1 梅花鹿、水貂、蓝狐和貉耳皮肤成纤维细胞的培养 |
| 2.3.2 梅花鹿、水貂、蓝狐和貉耳皮肤成纤维细胞的纯化 |
| 2.3.3 梅花鹿、水貂、蓝狐和貉耳皮肤成纤维细胞的冷冻保存 |
| 2.4 小结 |
| 第三章 牛卵母细胞体外成熟体系的优化 |
| 3.1 材料和方法 |
| 3.1.1 材料 |
| 3.1.2 方法 |
| 3.1.3 测定指标与评定方法 |
| 3.1.4 统计分析 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.2.1 不同激素组合对牛卵母细胞体外成熟的影响 |
| 3.2.2 BCB 染色优选牛卵母细胞体外成熟 |
| 3.2.3 EGF 对牛卵母细胞体外成熟的影响 |
| 3.3 讨论 |
| 3.3.1 激素对牛卵母细胞体外成熟的影响 |
| 3.3.2 BCB 染色对牛卵母细胞体外成熟的作用 |
| 3.3.3 EGF 对牛卵母细胞体外成熟的影响 |
| 3.4 小结 |
| 第四章 梅花鹿-牛 ISCNT 技术研究 |
| 4.1 材料和方法 |
| 4.1.1 材料 |
| 4.1.2 方法 |
| 4.1.4 统计分析 |
| 4.2 结果与分析 |
| 4.2.1 DEME 诱导牛卵母细胞显核的研究 |
| 4.2.2 梅花鹿-牛 ISCNT 显微操作的研究 |
| 4.2.3 梅花鹿-牛 ISCNT 胚胎体外培养的研究 |
| 4.3 讨论 |
| 4.3.1 DEME 处理对牛卵母细胞显核的影响 |
| 4.3.2 梅花鹿-牛 ISCNT 显微操作 |
| 4.3.3 梅花鹿-牛 ISCNT 胚胎体外培养 |
| 4.4 小结 |
| 第五章 水貂、蓝狐及貉-牛 ISCNT 胚胎的制备 |
| 5.1 材料和方法 |
| 5.1.1 材料 |
| 5.1.2 方法 |
| 5.1.3 试验设计 |
| 5.1.4 统计分析 |
| 5.2 结果与分析 |
| 5.2.1 供核细胞对全细胞胞质内注射制备 ISCNT 胚胎的影响 |
| 5.2.2 共培养对毛皮动物-牛 ISCNT 胚胎体外发育的影响 |
| 5.3 讨论 |
| 5.3.1 供核细胞对全细胞胞质内注射制备 ISCNT 胚胎的影响 |
| 5.3.2 共培养对水貂、蓝狐及貉-牛 ISCNT 胚胎体外发育的影响 |
| 5.4 小结 |
| 第六章 全文结论 |
| 6.1 结论 |
| 6.2 研究的创新点 |
| 6.3 后续研究工作 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（4）化学辅助去核方法对牛卵母细胞MAPK活性及母源基因c-mos表达水平的影响（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 英文缩写词表 |
| 前言 |
| 第一篇 文献综述 |
| 第一章 哺乳动物体细胞核移植的概况 |
| 1.1 体细胞核移植发展史 |
| 1.2 影响体细胞移植效率的因素 |
| 1.3 哺乳动物卵母细胞去核方法 |
| 1.4 哺乳动物体细胞核移植意义 |
| 第二章 MAPK 活性及 c-mos 基因对减数分裂的调控 |
| 2.1 Mos-MAPKK-MAPK-p90rsk 信号通路 |
| 2.2 MAPK 活性对减数分裂的重新启动的影响 |
| 2.3 MAPK 活性对纺锤体组装的影响 |
| 2.4 MAPK 与卵母细胞 MII 期阻滞的关系 |
| 2.5 MAPK 活性的变化对受精后合子发育的影响 |
| 2.6 母源基因 c-mos 的生物功能 |
| 第二篇 研究内容 |
| 第一章 牛卵母细胞体外培养体系的建立及孤雌激活方法的比较 |
| 1.1 材料及试剂 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.3 结果 |
| 1.4 讨论 |
| 1.5 小结 |
| 第二章 秋水仙素处理条件的优化 |
| 2.1 材料及试剂 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.3 结果 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 秋水仙素对母源基因c-mos表达水平和MAPK活性的影响 |
| 3.1 材料及试剂 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.3 结果 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 导师简介 |
| 作者简介 |
| 致谢 |
（5）转人血清白蛋白延边奶山羊—绵羊体细胞克隆胚胎生产体系的优化（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 目录 |
| 前言 |
| 第一章 不同核成熟抑制剂及抗氧化剂对绵羊卵母细胞体外成熟的影响 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.2 试验方法 |
| 1.3 试验方案 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 不同核成熟抑制剂对卵母细胞成熟的影响 |
| 2.2 不同抗氧化剂对卵母细胞成熟的影响 |
| 3 讨论 |
| 3.1 不同核成熟抑制剂对卵母细胞成熟的影响 |
| 3.2 不同抗氧化剂对卵母细胞成熟的影响 |
| 4 小结 |
| 参考文献 |
| 第二章 转人血清白蛋白延边奶山羊-绵羊重构胚的构建 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.2 试验方法 |
| 1.3 试验方案 |
| 1.4 统计分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 不同去核法对核移植效率的影响 |
| 2.2 不同电融合方式对核植效率的影响 |
| 2.3 不同激活方法对重构胚体外发育率的影响 |
| 3 讨论 |
| 3.1 不同去核法对核移植效率的影响 |
| 3.2 不同电融合方式对核植效率的影响 |
| 3.3 不同激活方法对重构胚体外发育率的影响 |
| 4 小结 |
| 参考文献 |
| 第三章 EGCG对转人血清白蛋白延边奶山羊-绵羊重构胚体外发育质量的影响 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.2 试验方法 |
| 1.3 试验方案 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 不同浓度EGCG对囊胚率及囊胚细胞数的影响 |
| 2.2 不同浓度EGCG对重构胚囊胚内GSH和ROS水平的影响 |
| 2.3 不同时间添加EGCG对囊胚细胞凋亡的影响 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 参考文献 |
| 结论 |
| 第四章 哺乳动物体细胞核移植研究进展 |
| 1 供体细胞的选择和培养 |
| 1.1 供体细胞的选择 |
| 1.2 供体细胞的培养 |
| 2 受体细胞的选择与去核 |
| 2.1 受体细胞的选择 |
| 2.2 受体细胞去核 |
| 3 细胞核的移植 |
| 3.1 带下注射 |
| 3.2 胞质内注射 |
| 3.3 全细胞胞质内注射 |
| 4 重构胚的融合与激活 |
| 4.1 重构胚的融合 |
| 4.2 重构胚的激活 |
| 5 重构胚的培养与移植 |
| 5.1 重构胚的培养 |
| 5.2 重构胚的移植 |
| 6 异种体细胞核移植的研究进展 |
| 6.1 异种核移植技术的研究历史 |
| 6.2 影响异种核移植技术的因素 |
| 参考文献 |
| 第五章 哺乳动物卵母细胞体外成熟的研究进展 |
| 1 哺乳动物卵母细胞体外成熟的研究概况 |
| 2 哺乳动物卵母细胞成熟及调控机制 |
| 2.1 哺乳动物卵母细胞成熟 |
| 2.2 哺乳动物卵母细胞体外成熟培养形态学变化 |
| 2.3 哺乳动物卵母细胞成熟过程中的分子调控机理 |
| 3 卵母细胞体外成熟培养的影响因素 |
| 3.1 卵母细胞来源 |
| 3.2 培养系统 |
| 3.3 激素和生长因子 |
| 4 蛋白添加物 |
| 4.1 血清 |
| 4.2 卵泡液 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 攻读学位期间发表的论文 |
| 致谢 |
（6）HDAC1基因在牛卵母细胞和早期克隆胚胎发育中的作用（论文提纲范文）
| 内容提要 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一篇 文献综述 |
| 第1章 牛体细胞核移植研究进展 |
| 1.1 牛体细胞核移植的重要性 |
| 1.2 不同类型供体细胞在核移植中的重编程 |
| 1.3 不同时期卵母细胞对体细胞的重编程作用 |
| 1.4 卵母细胞的去核方法 |
| 第2章 哺乳动物卵母细胞和胚胎发育过程中RNA干扰研究进展 |
| 2.1 siRNA设计 |
| 2.2 外源RNA导入卵母细胞和胚胎的方法 |
| 2.3 卵母细胞中的RNA干扰 |
| 2.4 胚胎发育过程中的RNA干扰 |
| 2.5 用RNA干扰技术研究细胞发育命运 |
| 2.6 培养条件对RNA干扰的影响 |
| 第3章 HDAC1在胚胎发育和细胞分化中的作用 |
| 3.1 组蛋白脱乙酰基转移酶概述 |
| 3.2 HDAC1在模式动物中的研究 |
| 3.3 HDAC1在卵母细胞成熟和胚胎发育过程中作用 |
| 3.4 HDAC1在神经系统发生中的作用 |
| 3.5 HDAC1在骨骼肌分化中的作用 |
| 3.6 HDAC1在心脏发育中的作用 |
| 3.7 HDAC1与上皮细胞分化 |
| 3.8 HDAC1在干细胞分化中的作用 |
| 第二篇 实验研究 |
| 第1章 牛体细胞核移植体系建立 |
| 1.1 材料试剂 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.3 结果 |
| 1.4 讨论 |
| 1.5 小结 |
| 第2章 HDAC1在牛卵母细胞及孤雌胚胎发育过程中的作用 |
| 2.1 材料试剂 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第3章 HDAC1在牛胎儿成纤维细胞及克隆胚胎中的作用 |
| 3.1 材料试剂 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 攻读博士期间发表论文情况 |
| 致谢 |
| 导师简介 |
| 作者简介 |
（7）牛体细胞核移植技术体系优化的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 牛体细胞核移植技术与应用进展 |
| 1.1 哺乳动物细胞核移植研究概述 |
| 1.1.1 哺乳动物胚胎细胞核移植研究进展 |
| 1.1.2 哺乳动物体细胞核移植研究进展 |
| 1.2 牛体细胞核移植技术平台的组成 |
| 1.2.1 供体细胞的选择与培养 |
| 1.2.2 卵母细胞体外成熟培养 |
| 1.2.3 卵母细胞去核 |
| 1.2.4 核移植技术 |
| 1.2.5 重构胚激活 |
| 1.2.6 重组胚胎培养和移植 |
| 1.3 牛体细胞核移植技术应用 |
| 1.3.1 在动物育种和转基因方面的作用 |
| 1.3.2 在医药生产方面的价值 |
| 1.3.3 在临床方面的作用 |
| 1.4 提高牛体细胞核移植效率的措施 |
| 1.4.1 受体卵母细胞的处理 |
| 1.4.2 供体细胞的选择 |
| 1.4.3 胚胎培养条件的优化 |
| 第二章 牛卵母细胞体外成熟培养体系的优化 |
| 2.1 材料和方法 |
| 2.1.1 材料 |
| 2.1.2 方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 SOF培养液与mTCM-199培养液的比较 |
| 2.2.2 商品化卵子成熟液1600与mTCM-199培养液的比较 |
| 2.2.3 商品化卵子成熟液1600与SOF培养液的比较 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 第三章 密闭气袋用于牛卵母细胞体外成熟培养的研究 |
| 3.1 材料和方法 |
| 3.1.1 材料 |
| 3.1.2 方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 密闭气袋培养的牛卵母细胞及孤雌胚不同发育阶段的观察 |
| 3.2.2 不同成熟条件下孤雌胚的发育 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 第四章 牛卵母细胞孤雌激活胚胎体外培养体系的优化 |
| 4.1 材料和方法 |
| 4.1.1 材料 |
| 4.1.2 方法 |
| 4.2 结果 |
| 4.3 讨论 |
| 4.4 小结 |
| 第五章 不同来源的供核细胞克隆效率的比较 |
| 5.1 材料和方法 |
| 5.1.1 材料 |
| 5.1.2 方法 |
| 5.2 结果 |
| 5.2.1 不同去核方法的比较 |
| 5.2.2 不同注核方法的比较 |
| 5.2.3 不同来源的供核细胞克隆效率的比较 |
| 5.3 讨论 |
| 5.4 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（8）全细胞胞质内注射法（WCICI）生产体细胞克隆牛胚胎及质量鉴定的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略词表 |
| 前言 |
| 第一章 文献综述 |
| 1 牛体细胞核移植研究进展 |
| 1.1 全细胞胞质内注射法生产体细胞克隆动物研究进展 |
| 1.2 卵巢保存对体细胞核移植效率的影响 |
| 1.3 卵母细胞去核方法的研究进展 |
| 1.3.1 盲去法的研究进展 |
| 1.3.2 荧光辅助去核法的研究进展 |
| 1.4 培养液对体外胚胎发育的影响 |
| 2 体外胚胎质量鉴定研究进展 |
| 2.1 牛体内胚胎的发育阶段 |
| 2.2 体内胚胎质量评价体系 |
| 2.3 体外胚胎质量的鉴定方法 |
| 2.3.1 胚胎质量的形态学观察 |
| 2.3.2 胚胎发育速度 |
| 2.3.3 胚胎的抗冻性 |
| 2.3.4 胚胎的核型分析 |
| 2.3.5 胚胎的细胞计数和区分染色 |
| 2.4 体外胚胎质量鉴定的意义 |
| 2.4.1 胚胎质量鉴定的理论意义 |
| 2.4.2 胚胎质量鉴定的临床意义 |
| 3 小结 |
| 4 本试验研究内容、目的和意义 |
| 4.1 试验研究内容 |
| 4.2 研究的目的和意义 |
| 第二章 全细胞胞质内注射法生产牛体细胞核移植胚胎的相关研究 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.1.1 主要试验设备 |
| 1.1.2 主要试剂和药品 |
| 1.1.3 试验操作液 |
| 1.1.4 显微操作针的制备 |
| 1.2 试验方法 |
| 1.2.1 卵巢的获得 |
| 1.2.2 卵母细胞的收集 |
| 1.2.3 卵母细胞体外成熟 |
| 1.2.4 共培养颗粒细胞单层制备 |
| 1.2.5 供体的制备 |
| 1.2.6 卵母细胞的去核 |
| 1.2.7 体细胞核移植重构胚的构建 |
| 1.2.8 重构胚的激活 |
| 1.2.9 胚胎共培养 |
| 2 试验设计 |
| 2.1 卵巢保存对牛卵母细胞成熟和体细胞核移植胚胎早期发育的影响 |
| 2.2 去核方法对体细胞核移植胚胎早期发育的影响 |
| 2.3 胚胎培养液对细胞核移植胚胎早期发育的影响 |
| 3 数据统计 |
| 4 结果与分析 |
| 4.1 卵巢保存对牛卵母细胞体外成熟和体细胞核移植胚胎早期发育的影响 |
| 4.2 去核方法对体细胞核移植胚胎早期发育的影响 |
| 4.3 胚胎培养液对体细胞核移植胚胎早期发育的影响 |
| 5 讨论 |
| 5.1 卵巢保存时间和保存温度对牛卵母细胞成熟和体细胞核移植胚胎早期发育的影响 |
| 5.2 去核方法对体细胞核移植胚胎早期发育的影响 |
| 5.3 胚胎培养液对体细胞核移植胚胎早期发育的影响 |
| 6 小结 |
| 第三章 体外胚胎质量鉴定方法的研究 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.1.1 试验设备 |
| 1.1.2 主要试剂和药品 |
| 1.1.3 试验操作液 |
| 1.2 试验方法 |
| 1.2.1 胚胎发育速度 |
| 1.2.2 胚胎的核型分析 |
| 1.2.3 区分染色 |
| 2 试验设计 |
| 2.1 卵巢保存时间对体细胞核移植胚胎发育速度的影响 |
| 2.2 去核方法对体细胞核移植胚胎染色体构成的影响 |
| 2.3 胚胎培养液对体细胞核移植胚胎细胞数目的影响 |
| 3 数据统计 |
| 4 结果与分析 |
| 4.1 卵巢保存时间对体细胞核移植胚胎发育速度的影响 |
| 4.2 去核方法对体细胞核移植胚胎染色体构成的影响 |
| 4.3 胚胎培养液对体细胞核移植胚胎细胞数目的影响 |
| 5 讨论 |
| 5.1 卵巢保存时间对体细胞核移植胚胎发育速度的影响 |
| 5.2 去核方法对体细胞核移植胚胎染色体构成的影响 |
| 5.3 胚胎培养液对体细胞核移植胚胎细胞数目的影响 |
| 6 小结 |
| 参考文献 |
| 附表 |
| 附图 |
| 致谢 |
（9）核质相互作用对供体核重编程的影响（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 哺乳动物体细胞核移植研究进展 |
| 1.1 体细胞核移植的方法和程序 |
| 1.1.1 受体胞质的准备 |
| 1.1.2 供体细胞的选择 |
| 1.1.3 重构胚的构建 |
| 1.1.4 重构胚的激活 |
| 1.1.5 重构胚的培养 |
| 1.2 异种核移植研究进展 |
| 1.3 体细胞核移植技术存在的问题及应用前景 |
| 1.3.1 体细胞核移植存在的问题 |
| 1.3.2 体细胞核移植技术的应用 |
| 1.4 结语 |
| 第二章 体细胞重编程研究进展 |
| 2.1 通过核移植重编程体细胞 |
| 2.1.1 早期胚胎发育中的DNA 甲基化模式 |
| 2.1.2 核移植中异常的DNA 甲基化模式 |
| 2.1.3 组蛋白乙酰化修饰的作用 |
| 2.1.4 核移植过程中的组蛋白乙酰化变化 |
| 2.2 通过与干细胞融合重编程体细胞 |
| 2.3 胞质提取物诱导体细胞重编程 |
| 2.4 转录因子诱导体细胞重编程 |
| 2.4.1 Oct3/4（又称Pou5f1） |
| 2.4.2 Sox2 (SRY-related HMG box2) |
| 2.4.3 c-Myc |
| 2.4.4 Klf4 (Kruppel-like factor 4) |
| 2.4.5 Nanog |
| 2.4.6 Lin-28 |
| 2.4.7 iPS 细胞的应用和存在的问题 |
| 第三章 牛卵母细胞体外成熟培养体系的优化 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 实验用品 |
| 3.1.2 卵母细胞的采集 |
| 3.1.3 卵母细胞体外成熟培养 |
| 3.1.4 卵母细胞孤雌激活及体外培养 |
| 3.1.5 凋亡检测 |
| 3.1.6 实验设计 |
| 3.1.7 统计分析 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 不同激素配比对牛卵母细胞体外成熟的影响 |
| 3.2.2 EGF 对牛卵母细胞体外成熟及孤雌激活胚胎发育的影响 |
| 3.3 讨论 |
| 3.3.1 不同激素配比对牛卵母细胞体外成熟的影响 |
| 3.3.2 EGF 对卵母细胞体外成熟和胚胎发育的影响 |
| 3.4 小结 |
| 第四章 供体细胞对核移植胚胎发育的影响 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 实验用品 |
| 4.1.2 卵母细胞采集与体外成熟 |
| 4.1.3 供体细胞制备 |
| 4.1.4 核移植 |
| 4.1.5 凋亡检测 |
| 4.1.6 实验设计 |
| 4.1.7 统计分析 |
| 4.2 结果 |
| 4.2.1 血清饥饿法与接触抑制法对重构胚胎发育的影响 |
| 4.2.2 供体细胞传代对重构胚发育的影响 |
| 4.3 讨论 |
| 4.3.1 血清饥饿法与接触抑制法的比较 |
| 4.3.2 供体细胞传代对核移植的影响 |
| 4.4 小结 |
| 第五章 牛卵胞质抽提物重编程供体细胞对克隆胚胎发育的影响 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.1 卵母细胞采集与成熟 |
| 5.1.2 牛卵胞质抽提物的制备 |
| 5.1.3 牛卵胞质抽提物预处理供体细胞 |
| 5.1.4 处理细胞的RT-PCR 检测 |
| 5.1.5 处理细胞的免疫细胞化学分析 |
| 5.1.6 核移植 |
| 5.1.7 囊胚细胞计数 |
| 5.1.8 实验设计 |
| 5.1.9 统计分析 |
| 5.2 结果 |
| 5.2.1 不耐氧链球菌溶血素处理后供体核DNA 的完整性 |
| 5.2.2 牛卵胞质抽提物对供体细胞的重编程作用 |
| 5.2.3 牛卵胞质抽提物重编程供体细胞对核移植胚胎体外发育的影响 |
| 5.2.4 牛卵胞质抽提物重编程供体细胞对核移植囊胚质量的影响 |
| 5.3 讨论 |
| 5.3.1 牛卵胞质抽提物对供体细胞的重编程作用 |
| 5.3.2 供体核与受体胞质的一致性对体细胞核移植的影响 |
| 5.4 小结 |
| 第六章 小鼠-牛异种核移植胚胎体外发育与合子激活基因的表达 |
| 6.1 材料与方法 |
| 6.1.1 实验用品 |
| 6.1.2 卵母细胞采集与成熟培养 |
| 6.1.3 供体细胞制备 |
| 6.1.4 核移植 |
| 6.1.5 小鼠受精卵采集与培养 |
| 6.1.6 RT-PCR |
| 6.1.7 实验设计 |
| 6.1.8 统计分析 |
| 6.2 结果 |
| 6.2.1 小鼠-牛异种克隆胚的体外发育 |
| 6.2.2 小鼠-牛异种克隆胚的发育形态 |
| 6.2.3 小鼠合子激活基因在异种克隆胚中的表达情况 |
| 6.3 讨论 |
| 6.3.1 小鼠-牛异种克隆胚的体外发育 |
| 6.3.2 异种克隆胚中的合子基因激活 |
| 6.4 小结 |
| 第七章 牛孤雌激活胚胎核质对热激的易感性差异及其相互作用 |
| 7.1 材料与方法 |
| 7.1.1 实验用品 |
| 7.1.2 卵母细胞采集与成熟 |
| 7.1.3 卵母细胞孤雌激活及热激处理 |
| 7.1.4 核置换 |
| 7.1.5 胚胎体外培养 |
| 7.1.6 RT-PCR |
| 7.1.7 凋亡检测 |
| 7.1.8 实验设计 |
| 7.1.9 统计分析 |
| 7.2 结果 |
| 7.2.1 热激后核质置换胚胎的体外发育 |
| 7.2.2 合子激活基因在核质置换胚胎中的表达情况 |
| 7.2.3 热激后核质置换胚胎的凋亡情况 |
| 7.3 讨论 |
| 7.3.1 热激后核与胞质对胚胎发育的影响 |
| 7.3.2 热激后核与胞质对合子基因激活的影响 |
| 7.3.3 热激后核与胞质对胚胎凋亡的调控作用 |
| 7.4 小结 |
| 结论 |
| 本论文的创新点 |
| 参考文献 |
| 附录1 实验用主要溶液的配制 |
| 附录2 实验用常规仪器 |
| 附录3 主要英文缩写检索表（字母顺序） |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（10）牛体细胞核移植显微操作环节的优化（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 牛卵母细胞的采集 |
| 1.2.2 牛卵母细胞的成熟培养 |
| 1.2.3 牛成熟卵母细胞的去核 |
| 1.2.4 牛供体细胞的准备 |
| 1.2.5 牛去核卵母细胞与供体细胞构建核移植胚胎 |
| 1.2.6 克隆重组胚胎的激活 |
| 1.2.7 核移植胚胎的体外培养 |
| 1.2.8 核移植胚胎向受体牛的移植 |
| 1.2.9 克隆牛犊的微卫星分析 |
| 1.2.1 0 实验数据的统计分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 去核方法对克隆效率的影响 |
| 2.2 供体核引入卵母细胞方法对克隆胚胎发育的影响 |
| 2.3 电融合法中融合参数的优化筛选 |
| 2.4 利用优化的克隆程序进行克隆牛的生产 |
| 3 讨论 |
| 3.1 关于去核方法的改进对于核移植效率的影响 |
| 3.2 关于供体核不同引入方法对于克隆胚胎发育的影响 |
| 3.3 融合参数对于核移植胚胎发育的影响 |
| 3.4 移植受体选择及其克隆牛犊的微卫星检测及克隆牛出生异常与产后死亡 |
四、牛卵母细胞去核方法的研究（论文参考文献）
- [1]Myostatin基因敲低克隆绵羊的研究[D]. 李昊. 东北林业大学, 2019(01)
- [2]秋水仙胺诱导牛卵母细胞显核的研究[J]. 王士勇,杨月春,郑军军,刘宗岳,方大雨,杨福合. 江苏农业科学, 2014(11)
- [3]梅花鹿、水貂、蓝狐及貉—牛异种体细胞核移植技术研究[D]. 王士勇. 中国农业科学院, 2014(10)
- [4]化学辅助去核方法对牛卵母细胞MAPK活性及母源基因c-mos表达水平的影响[D]. 任久生. 吉林大学, 2013(08)
- [5]转人血清白蛋白延边奶山羊—绵羊体细胞克隆胚胎生产体系的优化[D]. 柳海星. 延边大学, 2013(12)
- [6]HDAC1基因在牛卵母细胞和早期克隆胚胎发育中的作用[D]. 王中伟. 吉林大学, 2011(09)
- [7]牛体细胞核移植技术体系优化的研究[D]. 马晓玲. 西北农林科技大学, 2011(05)
- [8]全细胞胞质内注射法（WCICI）生产体细胞克隆牛胚胎及质量鉴定的研究[D]. 王鹏征. 华中农业大学, 2010(06)
- [9]核质相互作用对供体核重编程的影响[D]. 唐爽. 西北农林科技大学, 2010(10)
- [10]牛体细胞核移植显微操作环节的优化[J]. 雷安民,马晓玲,高志敏,胡勇策,隋进强,黄伟伟,昝林森,窦忠英. 生物工程学报, 2009(09)