一、兔下颌骨髁状突软骨细胞体外培养及生物学特性的研究（论文文献综述）
徐小杰[1]（2021）在《下颌髁突软骨中Sox9+浅层软骨细胞及Col10+深层软骨细胞对异常咬合刺激的生物学响应》文中研究表明背景颞下颌关节（temporomandibular joint,TMJ）对生物力刺激很敏感,咬合是其主要来源。髁突软骨从浅及深可分为:纤维层、增殖层、成熟层、肥大层和钙化软骨层。前期我课题组建立了异常咬合模型-单侧前牙反（unilateral anterior crossbite,UAC）模型,观察到TMJ软骨退行性改变;双侧前牙咬合抬高模型（bilateral anterior elevation,BAE）,观察到浅层软骨细胞大量增殖现象。本研究拟采取在体基因修饰技术进行研究,进而深入了解下颌髁突软骨浅层及深层细胞对异常咬合UAC及BAE的生物学响应规律,为阐述软骨退变规律提供细胞生物学基础。目的1.利用Cre-loxp基因修饰技术,示踪TMJ软骨细胞,观察UAC和BAE刺激下Sox9+浅层和Col10+深层软骨细胞的不同响应特征;2.利用DTA细胞定向敲除技术,敲除Sox9+浅层或Col10+深层软骨细胞,观察髁突软骨对UAC及BAE刺激的响应变化。方法1.利用Sox9/Col10-CreERT2工具鼠分别与Rosa26/td Tomato工具鼠杂交得到Sox9/Col10-Cre ERT;R26RTd T（54/45只）的6周龄雌性小鼠（n=6/5）,注射Tamoxifen（TAM）后施加UAC或BAE,在第1、4、7周末取髁突软骨,分别记为Sox9-Td T组和Col10-Td T组,通过组织免疫荧光染色,观察Td T标记细胞变化。2.利用Sox9/Col10-CreERT2工具鼠分别与Rosa26/DTA工具鼠杂交得到Sox9/Col10-Cre ERT;R26RDTA（54只、36只）雌性小鼠（6周龄）。施以UAC或BAE,Sox9组于第1、4、7周开始时注射TAM,第3周（n=3）、7周（n=6）末取材;Col10组于第4、7周开始时注射TAM,第7周末（n=6）取材,分别记为Sox9-DTA组和Col10-DTA组。运用Micro-CT成像,冯库萨、HE、番红O、免疫组化染色,透射电镜方法,观察敲除浅层或深层软骨细胞后对UAC、BAE刺激的响应。结果1.在UAC刺激下,Sox9-Td T组荧光双标的Sox9-Td T+Col-X+/OCN+/DMP-1+/Adipo Q+软骨细胞数量明显增加;在BAE刺激下,Sox9-Td T+Col-X+/OCN+/DMP-1+/Adipo Q+软骨细胞数量显着减少。2.在UAC刺激下,Col10-Td T组Col10-Td T+OCN+/DMP-1+/Adipo Q+软骨细胞阳性率显着增加,Col10-Td T+Sox9+明显减少;在BAE刺激下,Col10-Td T+Sox9+/OCN+/DMP-1+/Adipo Q+软骨细胞阳性率均大量减少。3.敲除Sox9+浅层软骨细胞可使软骨细胞丧失增殖能力,加重UAC引起的软骨细胞分化加速、软骨变薄、细胞凋亡等病变;降低BAE促进软骨细胞增殖、软骨增厚作用,使软骨变薄。4.敲除Col10+深层软骨细胞可加剧UAC引起的分化加速、软骨变薄、软骨细胞凋亡等病变;影响BAE促进软骨细胞增殖、软骨增厚作用。结论1.髁突Sox9+浅层软骨细胞具有增殖和成熟分化能力,定向杀死Sox9+浅层软骨细胞将导致深层软骨和软骨下骨发育不良,加剧UAC引起的软骨退变,而使BAE丧失促软骨增殖的作用。2.髁突Col10+深层软骨细胞具有终末分化能力,定向杀死Coll0+深层软骨细胞将破坏软骨下骨的形成和浅层软骨细胞的功能环境,导致髁突变形和浅层软骨细胞凋亡,加剧UAC引起的软骨退变,影响BAE促软骨增殖的作用。
李伟豪[2]（2019）在《炎症微环境下miR-140-5p靶向作用Smad3影响软骨细胞生物学特性的机制研究》文中进行了进一步梳理颞下颌关节（Temporomandibular joint,TMJ）是颌面部唯一同时具备转动和滑动运动的左右联动关节,参与了咀嚼、吞咽、言语、表情和呼吸等精细且复杂的功能活动。骨关节炎（Osteoarthritis,OA）是关节疾病中的典型代表,其发病率高,对人体危害大,严重影响了患者的生活质量。虽有不少学者对这类关节疾病进行了相关研究报道,但目前对骨关节炎,尤其是颞下颌关节骨关节炎（Temporomandibular joint osteoarthritis,TMJ-OA）复杂的病理机制尚缺乏完整认识。以往的研究表明,miR-140-5p在软骨细胞分化和软骨内稳态过程中发挥着重要的作用,miR-140-5p基因敲除鼠会出现增龄性骨关节炎的症状。然而,临床研究却发现骨关节炎患者的关节软骨中miR-140-5p表达显着增加。虽然越来越多的研究认为miR-140-5p与OA关系密切,但其功能作用至今仍存在争议。有关miR-140-5p在OA,尤其在TMJ-OA中的作用机制亟需被阐明。本研究第一部分通过建立炎症微环境体外实验模型,模拟了 TMJ-OA样病损改变。第二部分探索了 miR-140-5p的作用靶点,并在炎症微环境中的髁突软骨细胞进行验证。第三部分通过靶向沉默Smad3,进一步阐明miR-140-5p的信号调控网。研究结果探讨了炎症微环境下miR-140-5p调控软骨细胞增殖、分化相关的机制,为TMJ-OA的发生、发展及临床治疗提供重要的参考。第一部分炎症微环境对下颌髁突软骨细胞及胫骨生长板软骨细胞生物学特性的影响[目 的]建立下颌髁突软骨细胞及胫骨生长板软骨细胞炎症微环境体外实验模型,探索不同类型软骨细胞在炎症微环境中的生物学差异。[方 法]1.通过二步酶消化法提取原代下颌髁突软骨细胞及胫骨生长板软骨细胞,采用HE染色法及Ⅱ型胶原蛋白免疫细胞化学染色进行细胞来源鉴定。2.通过CCK-8检测两种细胞的细胞增殖率并描绘生长曲线。3.利用IL-1β诱导刺激下颌髁突软骨细胞与胫骨生长板软骨细胞0 h至24 h,建立不同类型软骨细胞的炎症微环境体外实验模型。采用qRT-PCR或Western blotting检测miR-140-5p、MMP13、Col2a1的表达变化,验证体外实验模型的可靠性并探索最佳实验条件。4.观测炎症微环境对两种软骨细胞的炎症反应相关蛋白NF-κB1以及软骨形成分化相关蛋白 Smad3/4、p-Akt1、Runx2、p-CREB、Sox9、TGF-β3 蛋白表达水平的影响,并进行对比研究。[结 果]1.所提原代细胞经免疫细胞化学染色,结果显示Ⅱ型胶原蛋白表达阳性,表明所提取的原代细胞具有软骨细胞的特异性表征,原代软骨细胞的提取方法可靠。2.CCK-8检测结果提示,在培养第5天开始胫骨生长板软骨细胞的光密度值较下颌髁突软骨细胞的光密度值大,差异具有统计学意义。3.qRT-PCR检测结果表明,随着IL-1β诱导刺激时间延长,MMP13以及miR-140-5p的表达逐渐升高,且在诱导24小时差异最显着。相反,Col2a1的mRNA表达水平下降。4.Western blotting检测发现,两种软骨细胞在IL-1β诱导的炎症微环境下,Col2a1蛋白表达降低而NF-κB1蛋白表达升高,提示IL-1β可促进软骨细胞的炎症反应;而软骨细胞增殖、分化相关蛋白 Smad3/4、p-Akt1、Runx2、p-CREB、Sox9、TGF-β3的表达降低,提示软骨细胞的增殖、分化、表型维持等受到影响。值得注意的是,当对比研究两种软骨细胞在炎症微环境中软骨形成相关蛋白表达差异时发现,下颌髁突软骨细胞的TGF-β3蛋白减少程度较胫骨生长板软骨细胞更明显,而p-Akt1蛋白水平的表达降低程度则在胫骨生长板软骨细胞内表现更加显着。[结 论]1.二步酶消化法提取的原代软骨细胞来源可靠,重复性好。2.胫骨生长板软骨细胞的增殖能力较髁突软骨细胞强。3.IL-1β诱导刺激24 h是较理想的炎症微环境实验条件。4.IL-1β可促进炎症反应,影响软骨细胞的增殖、分化。5.尽管不同部位关节软骨细胞在炎症微环境中的表现略有差异,但总体上都表现出相似的OA病理改变,提示IL-1β诱导MCCs的体外模型同样可具有类似TMJ-OA样的病损改变。第二部分miR-140-5p在TGF-β通路中的作用靶点验证[目 的]预测miR-140-5p在TGF-β通路中潜在的靶基因结合位点,并进行验证。探索炎症微环境下,IL-1β介导miR-140-5p通过TGF-β信号通路对下颌髁突软骨细胞的增殖、分化、凋亡相关蛋白进行调控的机制。[方 法]1.对miR-140-5p与Smad3、Smad4 的 3’非翻译区（3’-untranslated region,3’UTR）潜在结合位点进行预测。在野生型（wide-type,WT 3,UTR）质粒载体的模板基础上,将靶序列进行突变（mutant-type,MUT3’UTR）后与相应的negative control共同转染HEK293T细胞,通过双荧光素酶试验进行靶基因验证。2.通过miR-140-5p mimics/inhibitors转染下颌髁突软骨细胞,伴有或不伴有IL-1β诱导刺激,建立炎症微环境下的miR-140-5p转染实验模型。采用Western blotting分别检测转染0 h～72 h靶蛋白的表达变化,探索理想的转染条件。3.qRT-PCR检测miR-140-5p miRNA表达变化,验证转染模型的可靠性。4.免疫荧光染色分析目的蛋白Smad3的表达变化,在下颌髁突软骨细胞中验证miR-140-5p对Smad3蛋白表达的靶向调控作用。5.通过所建立的炎症微环境转染模型,使髁突软骨细胞内miR-140-5p过表达。Western blotting检测分析Smad3/4、p-Akt1、Runx2、p-CREB、Sox9、TGF-β3、NF-κB1、NF-κB2、RelA等软骨增殖、分化、凋亡相关蛋白的表达变化,阐明炎症微环境中miR-140-5p与TGF-β通路之间的调控关系。[结 果]1.通过TargetScan及miRTarBase软件进行预测,发现Smad3/4的mRNA3’UTR上含有与miR-140-5p结合的潜在序列。双荧光素酶试验发现,与NC相比,miR-140-5p对Smad3野生型载体报告荧光有所下调,突变型载体的报告荧光有所回复,差异具有统计学意义。而miR-140-5p对Smad4野生型载体报告荧光无明显影响。双荧光素酶验证结果说明Smad3是miR-140-5p的直接作用靶点,而Smad4的3’UTR上的预测位点与miR-140-5p没有明显的相互作用。2.Western blotting 分析结果提示,miR-140-5p mimics 或 miR-140-5p inhibitors 转染下颌髁突软骨细胞可抑制或升高Smad3的蛋白表达水平,且在转染48 h作用最明显。3.qRT-PCR结果显示,miR-140-5p mimics转染后,可明显升高下颌髁髁突软骨细胞内的miR-140-5p表达。miR-140-5p inhibitors可降低miR-140-5p的表达,且能拮抗IL-1β对miR-140-5p的诱导作用,提示所建转染模型可靠。4.通过免疫荧光染色分析结果表明,与对照组（NC）相比,miR-140-5p mimics或IL-1 β均可降低Smad3的荧光强度,联合作用时抑制作用更明显。而miR-140-5p inhibitors可上调Smad3的荧光表达,并拮抗IL-1β对Smad3的抑制作用。5.Western blotting检测结果表明,IL-1β可通过miR-140-5p抑制软骨细胞增殖相关蛋白Smad3/4、p-Akt1,降低了软骨聚集肥大相关蛋白Runx2表达,减少了软骨表型维持相关蛋白Sox9、p-CREB、TGF-β3的表达。miR-140-5p抑制了 NF-κB1、NF-κB2、RelA蛋白表达水平。值得注意的是,与单独的miR-140-5p mimics转染组作对比时,miR-140-5p mimics联合IL-1β作用后并未表现出对Smad3/4、p-CREB和Sox9有更强的抑制效果,这提示IL-1β可能直接通过miR-140-5p对Smad3/4、p-CREB 和 Sox9 进行负向调控。而 miR-140-5p mimics 联合 IL-1β 共同作用于下颌髁突软骨细胞后,对p-Akt1、Runx2、TGF-β3可表现出更加明显的负调节结果,提示了 IL-1β除了通过介导miR-140-5p外,还可能通过其他途径对 p-Akt1、Runx2、TGF-β3 进行调控。[结 论]1.Smad3是miR-140-5p在TGF-β通路中的直接作用靶点之一。2.IL-1β诱导的炎症微环境中,miR-140-5p可对Smad3进行靶向调控。3.炎症微环境下miR-140-5p调控软骨细胞增殖、分化、凋亡相关蛋白的信号机制,可能与TMJ-OA病理机制有关。第三部分miR-140-5p通过TGF-β/Akt/NF-κB信号通路参与调控软骨细胞的增殖、分化、凋亡[目 的]阐明miR-140-5p靶向调控Smad3的信号机制,探索可能参与miR-140-5p调节软骨增殖、分化、凋亡的信号调控网。[方 法]1.建立Smad3表达沉默的软骨细胞体外模型,将Smad3的小干扰RNA 片段（Small interfering RNA,siRNA）分别与 miR-140-5p mimics 以及对应的negative control共转染下颌髁突软骨细胞。Western blotting观测Smad3、p-Smad3蛋白表达变化,以验证转染模型可靠性。2.利用CCK-8检测转染后软骨细胞在24h、48h、72h时的光密度值,评估miR-140-5p通过抑制Smad3的表达对软骨细胞增殖能力的影响。3.利用流式细胞术观测转染各组下颌髁突软骨细胞的凋亡情况。4.通过Western blotting检测软骨细胞增殖相关蛋白Smad3/4、p-Akt1,软骨细胞分化相关蛋白Runx2,软骨细胞表型相关蛋白Sox9、p-CREB、TGF-β3,凋亡及炎症反应相关蛋白NF-κB1、NF-κB2、RelA的表达变化。[结 果]1.Western blotting结果显示,Smad3沉默组以及mimics转染的miR-140-5p过表达组均可抑制Smad3、p-Smad3的蛋白表达,证明转染模型建立可靠。2.CCK-8结果提示Smad3沉默组以及miR-140-5p过表达组的光密度值较对照组低,且差异具有统计学意义,软骨细胞的增殖能力受到抑制。3.流式细胞术结果显示,过表达miR-140-5p或沉默Smad3均可促进下颌髁突软骨细胞发生凋亡,且共转染组细胞凋亡率的升高最为明显。4.miR-140-5p调控机制涉及TGF-β/Akt/NF-κB通路的参与。Western blotting检测分析结果显示,沉默Smad3或过表达miR-140-5p可抑制细胞增殖相关蛋白Smad3/4、p-Akt1,软骨分化相关蛋白Runx2,表型维持相关蛋白Sox9、p-CREB、TGF-β3的表达。值得注意的是,与对照组negative control相比,沉默Smad3对p-CREB的表达并无明显影响,但只要当miR-140-5p过表达时,p-CREB的表达均降低,且差异具有统计学意义。这提示p-CREB可能是miR-140-5p的直接作用位点。沉默Smad3与miR-140-5p过表达联合作用时p-Akt1、Runx2、Sox9、TGF-β3的表达下调更加明显,提示除Smad3外,miR-140-5p可能通过其他途径实现对p-Akt1、Runx2、Sox9、TGF-β3的负向调控。过表达miR-140-5p时,细胞凋亡相关蛋白NF-κB1、NF-κB2、RelA的蛋白表达减少,而沉默Smad3对凋亡相关蛋白的表达并无明显改变,提示miR-140-5p并非通过Smad3影响NF-κB通路的变化。[结 论]1.miR-140-5p可通过靶向抑制Smad3的表达,从而影响下颌髁突软骨细胞的增殖、分化、凋亡相关蛋白的表达。2.miR-140-5p的调控机制错综复杂,诸多信号通路牵涉其中,包括了 TGF-β/Akt/NF-κB信号通路。3.miR-140-5p可能是潜在的TMJ-OA早期病损的指标。
阿孜古丽·阿布都拉,姚志涛,阿地力·莫明[3]（2018）在《羊不同类型下颌骨髁突囊内骨折残端和固定端软骨细胞的成骨能力研究》文中研究表明目的探讨羊不同类型下颌骨髁突囊内骨折残端和固定端软骨细胞增殖及凋亡情况。方法成年山羊20只,随机取17只于闭合式轨道用5kg铅球反复撞击下颌角区域,经CT检查证实成功制备单纯下颌骨髁突囊内骨折或合并其他部位骨折模型15只,其中A型骨折5只,B型骨折6只,C型骨折3只,M型骨折1只;余3只未撞击者为对照组。取A、B、C型骨折羊组和对照组髁突软骨,采用免疫荧光法检测增殖细胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen,PCNA）阳性细胞率,TUNEL染色阳性细胞率了解软骨细胞凋亡情况。结果对照组PCNA阳性细胞率为93.33%,TUNEL阳性细胞率为66.67%;A型骨折组残端PCNA阳性细胞率（42.11%）低于对照组（P<0.05）,固定端（91.30%）与对照组比较差异无统计学意义（P>0.05）;B型骨折组残端、固定端PCNA阳性细胞率（82.92%、85.71%）与对照组比较差异均无统计学意义（P>0.05）;C型骨折组残端PCNA阳性细胞率（48.57%）低于对照组（P<0.05）,固定端（84.44%）与对照组比较差异无统计学意义（P>0.05）;A型骨折组残端TUNEL阳性细胞率（91.30%）高于对照组（P<0.05）,固定端（69.05%）与对照组比较差异无统计学意义（P>0.05）;B型骨折组残端、固定端TUNEL阳性细胞率（72.09%、71.11%）与对照组比较差异无统计学意义（P>0.05）;C型骨折组残端TUNEL阳性细胞率（95.56%）高于对照组（P<0.05）,固定端（70.73%）与对照组比较差异无统计学意义（P>0.05）。结论 A、C型下颌骨髁突囊内骨折残端软骨细胞增殖能力差,凋亡能力强,术中可摘除残端髁突。
孙蕙珺[4]（2018）在《鼻阻塞对大鼠髁突软骨早期影响及干预研究》文中进行了进一步梳理背景与目的:通过幼年大鼠双侧间歇性鼻阻塞的动物模型探究鼻阻塞对髁突成软骨作用的早期影响以及早期去除阻塞因素对髁突软骨发育的影响。方法:（1）32只4周龄SD大鼠随机分为2组,每组16只:NB组:鼻呼吸组,不做处理;MB组:口呼吸组,间歇性鼻阻塞引起张口呼吸16天。鼻阻塞时间为每天8:00-16:00。记录每只大鼠每日体重。在建模第4天、8天、12天、16天分别取2组大鼠髁突标本进行HE染色,测量切片上髁突软骨细胞层厚度以及增殖层所占厚度比重;进一步对大鼠髁突切片进行免疫组织化学检测成软骨标志蛋白（PTHrp,Sox9,Acan,Col2a1）的表达情况;同时进行髁突软骨细胞（mandibular condylar chondrocytes,MCCs）体外培养并鉴定,RT-PCR法检测2组MCCs成软骨标志基因（PTHrp,Sox9,Acan,Col2a1）表达的差异。（2）64只4周龄SD大鼠随机分为4组,每组16只:A组:对照组,不做处理;B组:间歇性鼻阻塞引起张口呼吸4天后去除阻塞器;C组:间歇性鼻阻塞引起张口呼吸8天后去除阻塞器;D组:间歇性鼻阻塞引起张口呼吸16天。鼻阻塞时间为每天8:00-16:00。记录每只大鼠每日体重。同样在建模第4天、8天、12天、16天取材进行上述指标监测。采用Graphpad Prism7.0软件包对实验数据进行统计学分析以及图表绘制。结果:（1）在建模第4,8,12及16天时,与NB组（鼻呼吸组）相比,MB组（口呼吸组）大鼠髁突软骨层厚呈现先下降后略微升高,最终下降的趋势;髁突标本免疫组化以及动物模型来源的MCCs检测显示成软骨标志因子也呈现降低-升高-降低的改变;（2）在建模第4,8,12及16天时,与A组（对照组）及D组（鼻阻塞16天）相比,B组（鼻阻塞4天后去除阻塞）和C（鼻阻塞8天后去除阻塞）大鼠髁突软骨层厚呈现阻塞期下降,去除阻塞后明显升高的趋势,髁突标本免疫组化以及动物模型来源的MCCs检测显示成软骨标志因子也呈现降低-升高-降低的改变。结论:幼年大鼠在早期双侧间歇性鼻阻塞致开口呼吸的情况下,髁突软骨成软骨能力发生改变,出现代偿性抗损伤反应,但最终成软骨能力仍然是降低的;早期去除鼻阻塞因素可以短期内促进软骨的增生修复,且越早去除阻塞,髁突软骨修复反应出现越早,修复效应更强。
高国杰,沈绍莹,胡江天[5]（2017）在《小鼠颅底软骨联合细胞的体外原代培养》文中进行了进一步梳理目的探讨小鼠颅底软骨联合细胞体外原代培养的方法并了解其基本生物学特征.方法显微手术采集小鼠颅底蝶枕软骨联合组织;用胰蛋白酶和胶原酶联合消化软骨基质,获取软骨细胞;用含血清的DMEM培养基进行原代和传代细胞培养;通过显微光学成像、生长曲线描记及免疫组织化学染色观测细胞形态、活力及II型胶原合成能力.结果培养细胞在一定传代次数内稳定保持软骨细胞的典型形态和功能特征.结论手术分离配合酶联合消化是小鼠颅底软骨联合细胞体外原代培养实验的一条可靠途径.
陈秋秋[6]（2017）在《大鼠髁突软骨细胞的培养鉴定及静水压力下凋亡蛋白的变化》文中进行了进一步梳理目的:探索大鼠颞下颌关节髁突软骨细胞的培养方法;研究细胞在不同静水压力作用下TRPM7和Fas蛋白的表达变化规律,探讨Fas通道和TRPM7途径是否在MCCs凋亡中发挥作用。方法:分离Wistar大鼠髁突软骨,用II型胶原酶消化法结合组织块法获取干细胞,MTT检测其生长曲线,甲苯胺蓝染色、II型胶原免疫组化法和II型胶原免疫荧光法鉴定软骨细胞来源。取生物学性能最佳的一代细胞,随机分为2组。实验组给予细胞不同大小和时长的静水压力;对照组除不加压外其余培养条件相同。加压结束后,立即通过Western Blot检测每组TRPM7和Fas的蛋白量。结果:II型胶原酶消化法结合组织块法消化髁突软骨组织1820小时可获得最大量细胞;形态学观察软骨细胞主要呈多角形,第14代细胞具有稳定的生物学特性,5代及以后逐渐出现衰老细胞;MTT测第3代细胞最快达对数生长期;甲苯胺蓝染色、II型胶原免疫组化染色及II型胶原免疫荧光染色均表达阳性,提示MCCs来源于软骨的可靠性。加压时间为1h/2h时,6Kpa、8Kpa、10Kpa实验组的Fas蛋白量均低于对照组,P<0.05;当压力值为20Kpa/2h、30Kpa/1h、30Kpa/2h时,实验组蛋白高于对照组,P<0.05。当压力为20KPa/1h时,对照组蛋白与实验组无差异,P>0.05。加压时间分别为1h/2h时,6Kpa、8Kpa、10Kpa、20Kpa实验组的TRPM7蛋白量均低于对照组,P<0.05。当压力值为30Kpa/2h时,实验组蛋白高于对照组,P<0.05。当压力值为30Kpa/1h时,两组蛋白无差异,P>0.05。结论:II型胶原酶联合组织块消化法获取的干细胞来源可靠。较小压力值和时间作用下凋亡蛋白表达下降,提示可能对软骨细胞的凋亡有抑制作用。压力值超过一定界值或延长加压时间后,细胞凋亡蛋白增加,提示此条件可能对软骨细胞的凋亡有促进作用。两通道均有可能参与异常压力下MCCs的凋亡,为进一步研究TMD病因机制提供思路。
陈秋秋,肖朋,刘海霞,张永富[7]（2017）在《大鼠髁突软骨细胞培养及生物学特性研究》文中认为目的探讨大鼠颞下颌关节髁突软骨细胞的培养方法,观察细胞的生物学特性。方法分离3只Wistar大鼠髁突软骨,采用Ⅱ型胶原酶消化法联合组织块法获取髁突软骨干细胞,采用MTT法检测细胞生长曲线,采用甲苯胺蓝染色、Ⅱ型胶原免疫组织化学法和Ⅱ型胶原免疫荧光法鉴定细胞来源。结果Ⅱ型胶原酶消化法联合组织块法消化髁突软骨组织1820h可获得最大量细胞;体外培养软骨细胞主要呈多角形,第14代细胞具有稳定生物学特性,5代及5代以后逐渐出现老化细胞;MTT检测结果显示第3代细胞可最快达指数生长期;髁突软骨细胞经甲苯胺蓝染色、Ⅱ型胶原免疫组织化学染色及免疫荧光染色鉴定,结果均为阳性表达,细胞来源于软骨。结论Ⅱ型胶原酶消化法联合组织块法可作为髁突软骨细胞获取方法;4代以内细胞具有稳定的生物学特性,可用于其他实验。
李妙然,黄林剑,余优成,丁小军[8]（2014）在《细胞冻存对髁突软骨细胞去分化特性的影响研究》文中研究说明目的研究细胞冻存处理对髁突软骨细胞去分化特性的影响。方法分离并体外培养2周龄新西兰大白兔双侧髁突软骨细胞,将P1代冻存处理15 d后传代培养。采用倒置相差显微镜观察比较正常传代培养的P2代髁突软骨细胞（对照组）和经冻存处理后传代的P2代髁突软骨细胞（实验组）间的细胞形态;通过荧光定量PCR和Western免疫印迹技术检测和分析两组间软骨细胞标志物COL2、COL10、Sox9和Aggrecan基因和蛋白水平的表达差异,并使用SPSS13.0软件包对数据进行统计学分析。结果倒置相差显微镜观察发现实验组P2代髁突软骨细胞会出现一定程度的形态学改变;但是并未发现实验组和对照组之间COL2、COL10、Sox9和Aggrecan的表达有统计学意义的差异;实验组和对照组软骨标志基因的表达均会较P1代出现降低。结论体外培养髁突软骨细胞存在去分化现象,但细胞冻存处理并不会加速其去分化进程,所以体外培养的髁突软骨细胞可以通过冻存技术来实现髁突软骨细胞的暂存。
刘文,王燕,宋玲,张春艳,张月,袁晓[9]（2014）在《周期性张应力促进兔髁状突软骨细胞的增殖》文中研究说明背景:髁状突是下颌最重要的生长区之一,终生具有生长改建能力。在体内条件下,细胞力学的功能研究因其所处生理环境的复杂性、刺激因素传导的不定向性、实验条件的不易控制性而很难得到满意结果,应力刺激对髁状突软骨细胞的直接影响需要进一步行体外研究。目的:观察周期性张应力对体外培养兔髁状突软骨细胞生长增殖的影响。方法:体外分离培养及鉴定兔髁状突软骨细胞,在细胞培养至第3代时使用细胞加力装置对细胞施加强度为10%,频率为6循环/min的周期性张应力,作用时间分别为1,6,12和24 h,并设置未加力组作为对照。应用流式细胞仪检测细胞生长周期,应用MTT法分析细胞的增殖活性。结果与结论:在周期性张应力下,髁状突软骨细胞流式细胞仪检测结果显示在加力6 h和12 h,加力组细胞生长周期开始有显着性变化,在24 h达到实验最大值,差异有显着性意义（P<0.01）。MTT检测结果示细胞生长活跃,在6,12 h与对照组有明显变化,在24 h达到实验最大值,差异有显着性意义（P<0.01）。提示周期性张应力可明显促进髁状突细胞增殖,在24 h内具有持续促进作用。
孟韡[10]（2014）在《TGF-β2对SD大鼠髁突软骨细胞表型维持作用的研究》文中认为[目的]观察单层培养的大鼠髁突软骨细胞连续传代中表型的变化,研究TGF-β2作用后Ⅱ型胶原、聚集蛋白多糖表达的变化,对细胞表型的维持作用。探讨TGF-β2对于去分化软骨细胞的活化作用,为髁突生长发育及软骨细胞源性组织工程研究提供依据。[方法]选用新生SD大鼠的髁突软骨作为原代培养的组织来源,建立髁突软骨细胞有限细胞系。髁突软骨细胞连续传代培养,通过观察细胞形态,Ⅱ型胶原的免疫组化染色,实时荧光定量PCR（real time quantitative polymerase chain reaction, RT-PCR）方法检测软骨细胞外基质中Ⅱ型胶原和聚集蛋白多糖mRNA的表达,观察单层培养的大鼠髁突软骨细胞连续传代细胞表型的变化；在相同培养条件下,加入80ng/ml TGF-β2,以相同方法研究TGF-β2对髁突软骨细胞表型的维持和对于去分化软骨细胞的活化作用。[结果]髁突软骨细胞表型随着细胞传代逐渐降低,软骨细胞逐渐由多角形变为长梭形,至第五代时软骨细胞表型基本完全丧失。第三至五代加入80ng/ml TGF-β2组体外培养的髁突软骨细胞Ⅱ型胶原及聚集蛋白多糖的表达较对照组增强。TGF-β2对于一、二代细胞Ⅱ型胶原及聚集蛋白多糖的表达增强不明显。对于第三代开始去分化的软骨细胞,TGF-β2有较强的活化作用。[结论]髁突软骨在连续传代培养中,细胞表型逐渐丧失；传代至第三代时细胞表型开始丧失,至第五代时细胞表型基本完全丧失。一定浓度的TGF-β2对髁突软骨细胞的Ⅱ型胶原和聚集蛋白多糖合成具有维持作用,特别是对三、四、五代软骨细胞作用明显；同时对开始去分化的髁突软骨细胞TGF-β2也有一定的活化作用,但活化作用相对有限。
二、兔下颌骨髁状突软骨细胞体外培养及生物学特性的研究（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、兔下颌骨髁状突软骨细胞体外培养及生物学特性的研究（论文提纲范文）
（1）下颌髁突软骨中Sox9+浅层软骨细胞及Col10+深层软骨细胞对异常咬合刺激的生物学响应（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 实验材料 |
| 实验方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述:下颌髁突软骨响应异常咬合力刺激的生物学表现 |
| 参考文献 |
| 附录 缩写词中英文对照表 |
| 攻读学位期间发表文章情况 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（2）炎症微环境下miR-140-5p靶向作用Smad3影响软骨细胞生物学特性的机制研究（论文提纲范文）
| 缩略词表 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 第一部分 炎症微环境对下颌髁突软骨细胞及胫骨生长板软骨细胞生物学特性的影响 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 miR-140-5p在TGF-β通路中的作用靶点验证 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 第三部分 miR-140-5p通过TGF-β/Akt/NF-KB信号通路参与调控软骨细胞的增殖、分化、凋亡 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 全文总结 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间获得的学术成果 |
| 致谢 |
（3）羊不同类型下颌骨髁突囊内骨折残端和固定端软骨细胞的成骨能力研究（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 一般材料 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 试剂与仪器 |
| 1.2.2 模型制备 |
| 1.2.3 髁突囊内骨折分型 |
| 1.2.4 手术摘除髁突 |
| 1.2.5 切片制作 |
| 1.2.6 免疫荧光化学法检测PCNA阳性细胞数 |
| 1.2.7 TUNEL法染色阳性细胞观察细胞凋亡情况 |
| 1.3 统计学处理 |
| 2 结果 |
| 2.1 手术情况 |
| 2.2 组织学观察 |
| 2.3 髁突软骨细胞 |
| 2.4 各组PCNA阳性细胞率比较 |
| 2.5 各组TUNEL阳性细胞率比较 |
| 3 讨论 |
（4）鼻阻塞对大鼠髁突软骨早期影响及干预研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略语表 |
| 前言 |
| 第一部分 :间歇性双侧鼻阻塞对幼年大鼠髁突软骨的早期影响 |
| 1.材料与方法 |
| 1.1 实验动物与饲养环境 |
| 1.2 实验材料 |
| 1.3 实验方法 |
| 1.4 数据分析 |
| 2.实验结果 |
| 2.1 大鼠体重变化结果 |
| 2.2 大鼠髁突HE染色及测量结果 |
| 3.讨论 |
| 3.1 大鼠体重变化 |
| 3.2 张口呼吸对髁突软骨生长发育产生的早期影响 |
| 4.结论 |
| 第二部分 :间歇性双侧鼻阻塞对幼年大鼠髁突软骨早期影响的机制研究 |
| 1.材料与方法 |
| 1.1 实验动物与饲养环境 |
| 1.2 实验材料 |
| 1.3 实验方法 |
| 1.4 数据统计 |
| 2.实验结果 |
| 2.1 大鼠髁突软骨细胞细胞的观察养及鉴定 |
| 2.2 大鼠髁突软骨细胞成软骨标志基因的表达以及髁突软骨组织成软骨标志蛋白的表达 |
| 3.讨论 |
| 3.1 幼年大鼠髁突软骨细胞的培养及鉴定结果分析 |
| 3.2 鼻阻塞对大鼠髁突软骨生长发育早期影响的可能机制 |
| 4.结论 |
| 第三部分 :间歇性双侧鼻阻塞对幼年大鼠髁突软骨发育影响的早期干预研究 |
| 1.材料与方法 |
| 1.1 实验动物与饲养环境 |
| 1.2 实验材料 |
| 1.3 实验方法 |
| 1.4 数据统计 |
| 2.实验结果 |
| 2.1 大鼠体重变化结果 |
| 2.2 大鼠髁突HE染色及测量结果 |
| 2.3 大鼠髁突软骨细胞成软骨标志基因的表达以及髁突软骨组织成软骨标志蛋白的表达 |
| 3.讨论 |
| 3.1 早期干预对大鼠体重变化的影响 |
| 3.2 早期干预对大鼠髁突软骨生长发育的影响 |
| 3.3 早期干预对大鼠髁突软骨生长发育影响的可能机制 |
| 4.结论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 附录 病例汇报 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间的学术成果 |
（5）小鼠颅底软骨联合细胞的体外原代培养（论文提纲范文）
| 1 材料和方法 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 主要试剂和仪器 |
| 1.3 蝶枕软骨联合细胞采集和原代培养 |
| 1.4 传代培养 |
| 1.5 II型胶原表达检测 |
| 1.6 细胞生长曲线描记 |
| 2 结果 |
| 2.1 细胞形态和生长情况 |
| 2.2 细胞免疫组织化学染色 |
| 3 讨论 |
（6）大鼠髁突软骨细胞的培养鉴定及静水压力下凋亡蛋白的变化（论文提纲范文）
| 中英文缩略词对照表 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 内容与方法 |
| 1. 研究对象 |
| 2. 实验内容与方法 |
| 3. 质量控制 |
| 4. 统计学分析 |
| 5. 技术路线图 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 攻读硕士学位期间发表的学位论文 |
| 导师评阅表 |
（7）大鼠髁突软骨细胞培养及生物学特性研究（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 一般材料 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 MCCs的分离、培养、传代 |
| 1.2.2 MTT法检测软骨细胞生长曲线 |
| 1.2.3 软骨细胞鉴定 |
| 2 结果 |
| 2.1 MCCs形态学观察结果 |
| 2.2 MCCs甲苯胺蓝染色结果 |
| 2.3 MCCsⅡ型胶原免疫组织化学结果 |
| 2.4 MCCsⅡ型胶原免疫荧光结果 |
| 2.5 MTT法检测MCCs生长曲线 |
| 3 讨论 |
（8）细胞冻存对髁突软骨细胞去分化特性的影响研究（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 实验仪器 |
| 1.3 主要试剂 |
| 1.4 细胞培养及解冻、复苏方法 |
| 1.4.1 软骨细胞培养 |
| 1.4.2 髁突软骨细胞的冻存和复苏 |
| 1.5 COL2、COL10、Sox9和Aggrecan基因和蛋白水平的检测 |
| 1.5.1 荧光定量PCR检测 |
| 1.5.2 免疫印迹检测 |
| 1.6 统计学分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 冻存髁突软骨细胞形态学观察 |
| 2.2 冻存髁突软骨细胞COL2、COL10、Aggrecan和Sox9的荧光定量PCR检测 |
| 2.3 冻存髁突软骨细胞COL2、COL10、Aggrecan和Sox9的免疫印迹检测 |
| 3 讨论 |
（9）周期性张应力促进兔髁状突软骨细胞的增殖（论文提纲范文）
| 文章亮点: |
| 0引言Introduction |
| 1 材料和方法Materials and methods |
| 设计: |
| 时间及地点: |
| 材料: |
| 实验动物: |
| 实验设备: |
| 方法: |
| 细胞培养[13-14]: |
| 应力加载装置[15]: |
| 周期性张应力加载[16]: |
| 流式细胞术测定髁状突软骨细胞增殖活性的变化[17-18]: |
| MTT法检测应力加载对髁状突软骨细胞增殖的影响[19]: |
| 主要观察指标: |
| 统计学分析: |
| 2 结果Results |
| 2.1 兔髁状突软骨细胞的生长状态 |
| 2.2兔髁状突软骨细胞的甲苯胺蓝染色结果 |
| 2.3 兔髁状突软骨细胞的透射电镜观察结果 |
| 2.4 兔髁状突软骨细胞S期细胞比率 |
| 2.5 MTT染色结果 |
| 3 讨论Discussion |
| 作者贡献: |
| 利益冲突: |
| 伦理要求: |
| 学术术语: |
| 作者声明: |
（10）TGF-β2对SD大鼠髁突软骨细胞表型维持作用的研究（论文提纲范文）
| 英文缩写词表 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 第一部分 髁突软骨细胞的建立及TGF-β2对髁突软骨细胞表型维持作用 |
| 1. 材料 |
| 2. 方法 |
| 3. 结果 |
| 4. 讨论 |
| 5. 结论 |
| 第二部分 TGF-β2对于去分化髁突软骨细胞的活化作用 |
| 1. 材料 |
| 2. 方法 |
| 3. 结果 |
| 4. 讨论 |
| 5. 结论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 发表文章 |
| 致谢 |
四、兔下颌骨髁状突软骨细胞体外培养及生物学特性的研究（论文参考文献）
- [1]下颌髁突软骨中Sox9+浅层软骨细胞及Col10+深层软骨细胞对异常咬合刺激的生物学响应[D]. 徐小杰. 新乡医学院, 2021(01)
- [2]炎症微环境下miR-140-5p靶向作用Smad3影响软骨细胞生物学特性的机制研究[D]. 李伟豪. 昆明医科大学, 2019(05)
- [3]羊不同类型下颌骨髁突囊内骨折残端和固定端软骨细胞的成骨能力研究[J]. 阿孜古丽·阿布都拉,姚志涛,阿地力·莫明. 中华实用诊断与治疗杂志, 2018(05)
- [4]鼻阻塞对大鼠髁突软骨早期影响及干预研究[D]. 孙蕙珺. 上海交通大学, 2018(05)
- [5]小鼠颅底软骨联合细胞的体外原代培养[J]. 高国杰,沈绍莹,胡江天. 昆明医科大学学报, 2017(07)
- [6]大鼠髁突软骨细胞的培养鉴定及静水压力下凋亡蛋白的变化[D]. 陈秋秋. 新疆医科大学, 2017(01)
- [7]大鼠髁突软骨细胞培养及生物学特性研究[J]. 陈秋秋,肖朋,刘海霞,张永富. 中华实用诊断与治疗杂志, 2017(02)
- [8]细胞冻存对髁突软骨细胞去分化特性的影响研究[J]. 李妙然,黄林剑,余优成,丁小军. 口腔医学, 2014(10)
- [9]周期性张应力促进兔髁状突软骨细胞的增殖[J]. 刘文,王燕,宋玲,张春艳,张月,袁晓. 中国组织工程研究, 2014(20)
- [10]TGF-β2对SD大鼠髁突软骨细胞表型维持作用的研究[D]. 孟韡. 昆明医科大学, 2014(12)