一、用连续长片段RT-PCR扩增HCV结构基因（论文文献综述）
高庆华[1]（2021）在《云南地区艾滋病患者中预存耐药基因流行特征及HIV-1新重组型的命名》文中提出高效抗病毒逆转录疗法（HAART）在临床广泛的应用显着降低了HIV-1的感染率、发病率及其死亡率。然而,在长期的药物选择压力下HIV-1药物作用位点发生基因突变导致了药物的耐药性,为HIV-1的有效治疗带来了巨大挑战。近年来,全球HIV-1耐药人群有逐年增加趋势,WHO呼吁全球关注HIV-1耐药。云南位于我国西南边陲,毗邻东南亚国家,具有4060公里的边境线,自1989年德宏首次发现HIV-1以来,云南省一直受到HIV-1的危害,是目前我国HIV-1感染人数较多,艾滋病人群经HAART治疗最早的省份之一。基于云南的特殊地理位置,随着云南和东南亚国家的贸易往来和频繁的人口流动,致使云南地区HIV-1的流行呈现出变异速度快、基因型和重组型复杂多样的流行特征。然而,近年来云南地区未经治疗的HIV-1患者中预存耐药的比例如何?耐药基因突变特征与基因型和重组型之间的相关性如何?缺少系统和大样本的研究报道。基于此,本论文针对2017-2020年间1411例未经HAART治疗的艾滋病患者,研究该人群HIV-1预存耐药,以及耐药基因突变与基因型、重组型的相关性研究。首先,我们随机筛选2017-2020四年间的未经治疗的1411例艾滋病患者的血液样本。利用巢氏PCR技术对HIV-1的蛋白酶区和逆转录酶区进行扩增,其中1319例扩增成功并完成测序,成功率达93.5%。该人群中存在预存高度耐药突变比例为2.34%（32例）,耐药基因突变为K103N和G190A,对应的耐药性为非核苷类逆转录酶抑制剂依非韦伦和奈韦拉平产生高度耐药。此外,非高度耐药相关突变比例为19.1%,相关基因突变位点为V179D/T/E、E138A/G和V106I,对应的耐药性为非核苷类逆转录酶抑制剂利匹韦林低度影响。以上HIV-1预存耐药比例在2017-2020年间呈现出较为平稳的低流行特征。其次,为了进一步研究耐药突变和基因型之间的相关性,我们对云南地区2017-2020年HIV-1的基因型和重组型的流行进行分析。研究发现1319例HIV-1感染者中CRF08＿BC占40.3%、CRF01＿AE（21.7%）、CRF07＿BC（12.3%）、B（2.6%）、C（1.4%）、CRF55＿01B（0.45%）、CRF62＿BC（0.15%）及URF（21%）。URF中主要以B和C亚型的重组为主（20.5%）。从年度变化分析,CRF07＿BC比例呈现出由41%到20.5%的逐年减少,CRF08＿BC从20.9%增加到35.7%,URF从14.9%增加到44.9%。进一步经耐药突变特征和基因型、重组型相关性分析发现,CRF08＿BC中的预存耐药比例为2.83%,其耐药突变基因以K103N（1.32%）为主,对应的耐药性为奈韦拉平,其耐药率1.86%;其次为CRF01＿AE预存耐药比例为2.81%,其耐药突变基因以K103N（1.75%）为主,对应的耐药性为奈韦拉平2.81%和依非韦伦2.46%;CRF07＿BC预存耐药比例为1.86%,其耐药突变基因以Y181C（1.24%）为主,对应的耐药性为奈韦拉平1.86%。最后,基于上述云南地区HIV-1基因型和重组型研究,我们发现三组潜在HIV-1新的流行重组型（CRF）。为了进一步验证这三组序列为新的CRF。我们对这些样本分别进行了HIV-1全长序列同源关系进化树分析、基因重组模式分析、基因重组位点分析以及基于重组基因片段亚基因进化树分析。经过以上分析这三组HIV-1基因组符合HIV-1新重组型命名的规则,我们命名为CRF110＿BC、CRF118＿BC和一组待命名的以C为骨架插入了B片段的重组模式。为了进一步研究这三种新重组型毒株预存耐药特征,我们利用Sanger测序探究了其预存耐药性。研究结果发现,CRF110＿BC存在M184V（34%）/N（66%）、K103N（62%）/S（38%）、G190A（71%）、P225H（98%）四个位点突变,会对拉米夫定、奈韦拉平和依非韦伦产生高度耐药。CRF118＿BC存在M184V、V106A、V179D三个耐药相关突变位点,这些位点的突变会对恩曲他滨（FTC）、拉米夫定（3TC）、奈韦拉平（NVP）和依非韦伦（EFV）这四种药物产生高度耐药。未命名的CRF用NGS检测到E138A（6%）和S147G（6%）位点低频预存耐药基因突变,耐药性为利匹韦林低度耐药。综上所述,本论文总结了2017-2020年间云南地区HIV-1的预存耐药比率、耐药基因突变特征以及耐药性、耐药基因突变与基因型和重组型的相关性分析。此外,我们还发现和命名了三种新的HIV-1的重组型。该研究为云南地区艾滋病患者临床精准救治提供了重要科学数据,对于我国艾滋病治疗达到“三个90%”的目标具有重要的科学意义。
张旭[2]（2020）在《HIV-1病毒Nef蛋白抑制剂的筛选及其作用机制研究》文中指出研究目的艾滋病是由人类免疫缺陷病毒（HIV）感染引起的一种慢性传染病,主要传播途径包括血液接触,母婴传播和性传播三种,因其具有致命性,且尚无彻底治愈药物的特点,成为威胁人类健康的主要疾病之一。艾滋病未能得以根治的主要原因是有病毒储藏库的存在。目前的联合抗逆转录病毒治疗方法（cART）主要靶向艾滋病毒编码蛋白中的三种酶活性蛋白。但15种HIV编码蛋白中还有许多潜在的病毒机制及可能的药物靶点仍未得到充分研究。为了清除HIV-1的病毒储藏库,已经开发出各种治疗策略,其中包括“HIV-1病毒储藏库的震和杀”（“shock and kill”）。“shock and kill”研究的关键问题之一是如何修复HIV-1感染受损的免疫系统,恢复宿主的免疫监控,以达到清除病毒的效果。长期以来HIV-1的Nef蛋白可以通过介导细胞表面MHC-I的下调,帮助HIV-1逃避免疫系统的监控。寻找一种新型的特异性拮抗Nef下调MHC-1的抗病毒药物具有重大的学术价值和应用价值。本研究试图从FDA批准已经在临床上使用的化合物库中希望筛选一个能够特异性拮抗Nef蛋白的抗病毒药物,从而恢复细胞表面的MHC-I的表达,增加免疫系统对HIV-1感染细胞的应答反应,为临床上增强对HIV-1的免疫监控提供一种新的治疗策略。研究内容和方法首先,本研究利用分子克隆技术构建HIV-1 Nef-GFP蛋白稳定表达的荧光载体系统,通过细胞转染,流式细胞术等方法,在HEK293T细胞中验证Nef-GFP表达载体能够有效抑制细胞表面MHC-I的表达。进一步再通过高通量药物筛选,筛选出Nef抑制MHC-I表达的拮抗剂洛伐他汀。其次,通过病毒的包装和体外扩增,过表达Nef和SERINC5,ELISA等实验方法,验证洛伐他汀是否能够抑制同样被Nef下调的CD4和SERINC5,并抑制由Nef引起的病毒复制能力。通过病毒体外感染,共培养等实验来检测洛伐他汀是否促进自体的细胞毒性T淋巴细胞通过免疫杀伤反应清除感染细胞,并进一步测试洛伐他汀抑制从HIV-1感染者中分离出的CD4+T淋巴细胞的病毒反弹,验证洛伐他汀的抗病毒效果。最后,通过分子对接实验、位点突变、和免疫共沉淀方法,探讨洛伐他汀特异性拮抗Nef蛋白恢复MHC-I表达的分子机制。研究成果本研究通过流式高通量药物筛选系统对FDA批准已在临床上广泛使用的的药物库进行药物筛选工作,我们发现一种他汀类药物洛伐他汀,不仅可以显着拮抗Nef蛋白下调MHC-I的表达,还可以拮抗Nef抑制的CD4和SERINC5的表达,并在野生型HIV-1病毒感染的CD4+T细胞中验证了洛伐他汀对MHC-1和CD4的下调有抑制作用,抑制作用呈现剂量依赖性。体外CD4+T细胞自体感染实验和自体CD8+T细胞共培养实验中,加入特定组合的HIV-1抗原肽模拟体内病毒感染情况,发现洛伐他汀处理后,感染细胞中病毒复制被有效并持续的抑制,说明洛伐他汀能有效抑制病毒颗粒的内源性感染性。通过细胞杀伤实验检测结果,发现洛伐他汀处理后,感染的CD4+T细胞的CTLs杀伤毒性显着增加,表明洛伐他汀还可以促进自体CTLs,并且有效抑制从HIV-1感染者中分离出的CD4+T淋巴细胞的病毒反弹。另外,我们通过分子对接实验,计算洛伐他汀可能与Nef-MHC-I复合物作用的位点,并通过分子突变实验加以证实。我们还发现洛伐他汀通过直接与Nef蛋白作用,干扰Nef-MHC-AP-1复合物的形成,从而抑制Nef蛋白对MHC-I的下调。结论本研究筛选出一种有前景的抗HIV-1病毒药物洛伐他汀。洛伐他汀可以拮抗Nef介导的MHC-I、CD4和SERINC5的下调,增强CD8+T细胞的CTLs反应,抑制病毒的复制,有助于临床上增强抗HIV-1的免疫监控呼吸道合胞体病毒（RSV）是最常见的呼吸道病毒,它与儿童肺炎、细支气管炎和婴幼儿死亡率显着相关。Micro RNAs（mi RNAs）是一种内源性非编码小RNAs,在基因调控中发挥作用,并与宿主免疫反应和疾病进展相关。在本研究中,为了识别儿童肺炎相关潜在的生物标志物,同时研究RSV相关儿童肺炎的分子机制,我们分析了患RSV轻症肺炎和重症肺炎儿童全血样本的全转录组和微小RNA组。我们发现RSV重症肺炎患儿全血mi RNAs和编码RNA（m RNA）表达谱发生改变,差异明显。在RSV重症肺炎患儿中,hsa-mi R-1271-5p、hsa-mi R-10a-3p、hsa-mi R-125b-5p和hsa-mi R-30b-3p这四种mi RNAs被显着上调。进一步,我们对RSV重症肺炎的特异性mi RNA的靶标基因进行了比较。利用基因功能富集分析法（GO分析）对这些靶基因进行分析,发现大多数靶基因参与炎症和免疫反应,包括NF-k B信号通路、MAPK信号通路和T细胞受体信号通路。我们的发现将有助于识别重症肺炎的生物标志物和新的药物设计策略,并用用以治疗的RSV重症肺炎儿童。
刘化禹[3]（2019）在《蓝果忍冬花色苷合成bHLH转录因子筛选及LcTT8功能验证》文中认为蓝果忍冬（Lonicera caerulea L.）具有极高的花色苷含量,是提取可食用天然色素的良好资源,更是极具发展潜力的经济保健型果实。蓝果忍冬果实着色是花色苷积累的过程,bHLH蛋白是调控着花色苷生物合成的重要转录因子。然而,关于蓝果忍冬花色苷合成的分子调控机理未见有研究报道。研究蓝果忍冬花色苷合成的调控机制,既能为培育保健型植物品种提供理论基础,同时也可为植物抗逆分子机理的研究提供参考。本研究以蓝果忍冬品种“蓓蕾”为材料,通过转录组测序、生物信息学分析、构建LcTT8-EGFP绿色荧光载体和pBI121-LcTT8过表达载体、转基因、亚细胞定位、实时荧光定量PCR、ELISA酶联免疫吸附、pH示差法、高效液相色谱法（HPLC）等方法,筛选出了参与蓝果忍冬果实花色苷生物合成的bHLH转录因子LcTT8,并进行了基因功能验证。主要研究结果如下:（1）蓝果忍冬bHLH转录因子家族鉴定分析通过NCBI CDD、MEME方法结合蓝果忍冬bHLH家族进化树分析了蓝果忍冬bHLH转录因子蛋白保守结构域和保守基序进行鉴定,结果表明:有43个bHLH转录因子都包含bHLH家族保守结构域HLH（PF00010）或bHLH-MYCN（PF14215）。几乎所有43个蓝果忍冬bHLH蛋白都含有Motif 1或Motif 2,Motif 1和Motif 2共同构成了蓝果忍冬bHLH转录因子的basic helix-loop-helix保守结构域。并且,研究结果表明,含有类似保守基序的bHLH转录因子之间具有更近的进化关系。（2）蓝果忍冬花色苷生物合成相关的bHLH转录因子的筛选通过blastx将43条蓝果忍冬bHLH家族序列比对到蛋白数据库Nr、Swiss-Prot、KEGG、COG（evalue<0.00001）,得到这些序列的蛋白功能注释信息,结果表明:CL484.Contig3All、Unigene21245All、Unigene38564All和Unigene7373All与花色苷生物合成相关。将43条蓝果忍冬bHLHs和225条拟南芥bHLHs合并构建进化树预测蓝果忍冬转录因子的功能,结果表明:蓝果忍冬bHLHs可分成14个亚族,CL484.Contig3All和Unigene21245All聚类在主要调控花色苷合成的Ⅲ f亚族。利用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）分析了43个蓝果忍冬bHLHs基因在不同组织部位、不同果实发育期的表达模式,结果表明:果实中的CL484.Contig3All表达量显着高于根、茎、叶、花;且当果实发育到转色期时CL484.Contig3All表达量剧烈增高。最终筛选出蓝果忍冬果实中调节花色苷生物合成的转录因子CL484.Contig3All。（3）蓝果忍冬TT8基因的克隆和生物信息学分析通过对蓝果忍冬转录组数据装配得到CL484.Contig3All的CDs区,命名为LcTT8。将LcTT8基因与克隆载体连接,转入大肠杆菌测序,得到LcTT8核苷酸序列长度为2049bp。LcTT8蛋白质为酸性蛋白（等电点pI为5.09）,含有682个氨基酸,分子量为75928.12。预测LcTT8定位在细胞核,可能包含2个蛋白跨膜螺旋结构域,无信号肽位点。同时对LcTT8进行了蛋白三维结构建模预测。将LcTT8与其他植物TT8进行多重序列比对,发现它们具有相似的保守序列。进化树显示蓝果忍冬TT8和甜樱桃（Prunus avium）TT8进化关系最近。（4）蓝果忍冬TT8的亚细胞定位和基因表达分析利用拟南芥原生质体转化法进行了亚细胞定位分析,在转入空载体的拟南芥原生质体中核、膜、质均可见明亮的绿色荧光,而在转入LcTT8-EGFP融合表达载体绿色荧光只富集在细胞核中。通过qRT-PCR分析LcTT8在蓝果忍冬不同组织和不同果实时期的表达模式,结果发现,LcTT8在根、茎、叶、花中表达量低,在果实中表达量极高,是其他部位的4-23倍;果实发育期间,LcTT8表达量先增后减,在果实转色初期达到峰值。（5）蓝果忍冬TT8基因的功能验证构建pBI121-LcTT8重组载体,利用烟草遗传转化体系对LcTT8基因进行功能验证,结果表明,LcTT8转基因烟草的叶片、种皮颜色出现不同程度的加深。pH示差法测量花色苷含量发现,转基因烟草叶片的花色苷含量上升。通过对LcTT8转基因烟草叶片的花色苷合成基因CHS、CHI、F3H、DFR、ANS进行qRT-PCR分析,结果表明,相比野生烟草,LcTT8转基因烟草叶片的F3H、DFR、ANS基因表达量大幅上调。检测LcTT8转基因烟草叶片花色苷合成相关酶活性,结果表明,LcTT8转基因烟草的DFR、ANS酶活性上调最为明显。通过花色苷含量检测和HPLC分析花色苷组分,结果表明,转基因烟草叶片花色苷含量比野生烟草高,且主要是矢车菊素-3-O-葡萄糖苷高于野生烟草。
张海花[4]（2019）在《丹参miRNA对连作障碍的响应及其在次生代谢调控中的作用研究》文中提出丹参连作障碍已成为制约药用植物丹参生产的一大因素,丹参连作障碍不仅影响丹参的产量,而且降低丹参主要药用成分丹酚酸B和丹参酮的含量。miRNA是一类非编码小分子RNA,主要通过与靶基因互作,在转录后水平负调控靶基因的表达。为了从miRNA角度探讨丹参miRNA在丹参连作障碍及次生代谢合成调控中的作用,本研究通过miRNA高通量测序技术及分子生物学实验技术,对响应丹参连作的miRNA进行系统分析,进而利用转基因技术验证miR164a对化感自毒物质的耐受性及其在丹参次生代谢合成中的作用展开深入地分析,取得如下主要结果:（1）通过高通量测序获得了丹参连作和非连作两个miRNA库,第一年种植丹参根miRNAs（FPR）和连作丹参根miRNAs（SPR）。从两个库中鉴定了110条已知的miRNAs和7条新的miRNAs,其中39条已知的和两条新的miRNA在两个库中差异表达,通过生物信息学软件和降解组数据分析它们的靶基因,并经qRT-PCR对这些差异miRNA及靶基因进行进一步分析。同时对第一年种植和连作丹参的丹酚酸和丹参酮含量进行测定,最终确定了miR160a和miR164a极可能参与了丹参连作障碍的应答以及对丹参酚酸和丹参酮的调控。（2）为了验证miR164a在丹参中的生物学功能及作用机制,我们构建了miR164a的过表达载体并获得了miR164a过表达转基因毛状根,用终浓度为5-100μg/mL的对羟基肉桂酸（模拟连作障碍中的化感物质）处理,与野生型毛状根相比,miR164a过表达转基因植株对对羟基肉桂酸具有显着的耐受性。此外,我们还发现,miR164a过表达的毛状根中生物量仅为野生型的32.43-47.84%;丹参酮IIA（T-IIA）的含量也降为野生型的53%-66%。但是丹酚酸B的含量在过表达毛状根中明显高于野生型。这些结果表明miR164a可能通过负调控SmNAC2和SmNAC3,促进植物对连作障碍的抗性及丹酚酸B的合成。（3）利用psRNAtarget预测miR164a的靶基因为SmNAC2和SmNAC3,通过遗传转化方法分别获得了SmNAC2和SmNAC3的过表达（OE-NAC2和OE-NAC3）及沉默表达（RNAi-NAC2和RNAi-NAC3）转基因丹参毛状根,与野生型相比,OE-SmNAC2-1,2两个株系中丹参酮Ⅰ（T-Ⅰ）分别下降到野生型的59.31%和52.68%,T-ⅡA含量下降到65.4%和59.28%,丹酚酸B含量没有明显变化;而RNAi-NAC2-1和RNAi-NAC2-2的T-Ⅰ分别增加为野生型的4.22和3.14倍,T-ⅡA分别增加为野生型的3.10和5.09倍,丹酚酸B含量增加了2.43和3.21倍。OE-SmNAC3转基因毛状根中OE-NAC3-2和OE-NAC2-3的T-Ⅰ分别增加为野生型的5.68和5.11倍,T-ⅡA分别增加为野生型的10.03和7.54倍,而丹酚酸B的含量降低到54.5%和75.26%;RNAi-NAC3-1和RNAi-NAC3-2的T-Ⅰ则分别降低为野生型的24.56%和23.34%,T-ⅡA为野生型的46.15%和30.5%,而丹酚酸B的含量增加了1.47和1.25倍。以上结果显示SmNAC3对T-ⅡA正调控而对丹酚酸B是负调控根据miRNA对靶基因的负调控原理,由于miR164a对丹酚酸B是正调控而对T-IIA是负调控,它的靶基因应该对T-ⅡA正调控而对丹酚酸B是负调控,因此SmNAC3可能在miR164a的两个靶基因中发挥着主要作用。（4）为了验证miR160a在丹参酮、丹酚酸合成通路中的调控作用,构建了miR160a的过表达载体并获得了miR160a过表达转基因毛状根。与野生型毛状根相比,miR160a过表达转基因毛状根生物量显着增加,是野生型的1.5-1.9倍;丹参酮含量显着降低,甚至有的株系未检测到丹参酮,丹参酮合成通路关键酶基因的表达也被显着抑制;而丹酚酸B的含量增加了1.3-1.9倍。进一步检测生长素（Indoleacetic acid,IAA）、茉莉酸（Jasmonic acid,JA）和水杨酸（Alicylic acid,SA）含量,结果显示,过表达转基因毛状根中IAA含量增加,而JA和SA含量降低,推测miR160a也许通过影响植物激素含量而负调控了丹参酮的生物合成。综上所述,本研究通过高通量测序技术分析了丹参连作和非连作下miRNA的表达谱,并对筛选出的响应连作障碍的miRNAs进行了深入系统的分析,验证了miR164a及其靶基因和miR160a可能的生物学功能及其作用机制,研究结果为进一步研究丹参的miRNA的生物学功能提供基础数据,为进一步阐明丹参连作障碍和次生代谢物合成调控机制提供重要线索。
任静强[5]（2014）在《美洲型、欧洲型PRRSV及PCV2基因工程疫苗构建及实验免疫研究》文中认为当前，美洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒（NA-type PRRSV）已经在我国广泛流行，但近年来的数据分析表明，欧洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒（EU-typePRRSV）也已经传入我国，且有证据表明两种基因型不同毒株之间可以发生内部重组。因此，根据当前形势，我国不仅要考虑美洲型PRRSV的预防，同时又要加强欧洲型PRRSV的防控。另外，临床上PRRSV与2型猪圆环病毒（PCV2）混合感染十分普遍，现已证明PCV2和PRRSV均能感染单核细胞系细胞，PRRSV可增强PCV2的复制能力，使血液中PCV2含量的增加，增强IL-10的表达量，抑制了T细胞的免疫反应，导致PCV2逃避宿主的免疫应答。目前商业化的疫苗尚不能有效的防治PRRSV和PCV2的混合感染。本实验以美洲型PRRSV CC株的ORF3、ORF5基因，欧洲型代表株LV株ORF3、ORF5基因及PCV2ORF2基因为基础，构建了欧洲型PRRSV重组核酸苗（pVAX1-EU-ORF3-ORF5）、欧洲型PRRSV和美洲型PRRSV二价重组核酸苗（pVAX1-NA-ORF3-ORF5-EU-ORF3-ORF5）、欧洲型PRRSV和PCV2二联重组核酸苗（pVAX1-ORF2-EU-ORF3-ORF5），同时利用同源重组的理论和技术，以痘苗病毒天坛株（E3L）作为改造对象，构建TK基因缺失型天坛株痘苗病毒减毒疫苗，成功构建了欧洲型PRRSV重组痘苗病毒（rVV-EU-ORF3-ORF5）、欧洲型PRRSV和美洲型PRRSV二价重组痘苗病毒（rVV-NA-ORF3-ORF5-EU-ORF3-ORF5）、欧洲型PRRSV和PCV2二联重组痘苗病毒（rVV-ORF2-EU-ORF3-ORF5）。利用筛选标记对重组痘病毒进行筛选、鉴定，最后通过小鼠和猪体动物实验，分析其免疫特性，检测这些疫苗诱导动物机体产生的特异性体液和细胞免疫应答能力，筛选出具有良好应用前景的治疗性疫苗，并建立有效的免疫策略。结果得出所构建的核酸疫苗和重组痘病毒疫苗具有良好免疫原性和反应原性，能诱导小鼠和猪体特异性体液和细胞免疫应答，猪体用PRRSV（LV株和NM12株）和PCV2攻毒后能够提供有效的免疫保护。另外证明prime-boost疫苗免疫策略可以增强体液和细胞免疫应答，尤其是用重组痘病毒疫苗rVV-EU-ORF3-ORF5首次免疫，DNA疫苗（pVAX1-EU-ORF3-ORF5）加强免疫的方法可以更好的抵抗PRRSV的感染，并能在体内抑制病毒的复制。最后，通过实验动物表明选择适宜的佐剂和合适DNA递送系统可以增强prime-boost的免疫反应。QuilA疫苗佐剂在PRRSV疫苗产生的免疫反应和保护效率方面具有良好的前景，DNA疫苗用壳聚糖包裹，以DNA-壳聚糖纳米粒的递送方式进行免疫可能是个很好的选择。总之，未来的PRRSV和PCV2疫苗在抵抗病毒感染方面必须更安全，更有效，更有潜力。
韩学敏[6]（2014）在《杨树phi GST基因家族的功能分化研究》文中提出谷胱甘肽转移酶（Glutathione S-transferases, GSTs, EC2.5.1.18）是由大型基因家族编码的蛋白质超家族,在胁迫应激反应中发挥重要的作用。本研究从毛白杨中克隆到toGSTF4、PtoGSTF5和PtoGSTF73个phi类GST基因,分析了它们的序列特征、基因表达模式、蛋白质结构与生化功能等,主要结果如下：1、对三个phi类GSTs的序列分析显示PtoGSTF4、PtoGSTF5和PtoGSTF7的cDNA序列包括642bp、642bp和654bp的开放阅读框,分别编码213、213和217个氨基酸,预测分子量分别为23.7kDa、23.1kDa124.6kDa。蛋白质三维结构模拟发现,其均具有典型的GST结构特征,三维结构比较保守,仅在部分loop区域有微小的结构差异。2、正常生长条件以及莠去津和H202胁迫处理条件下,PtoGSTF4、 PtoGSTF5和PtoGSTF7基因表达模式分析显示,其在茎、叶和茎的韧皮部均表达,说明这三个基因是组成型表达基因。3、大肠杆菌重组蛋白及酶活性分析发现,三个基因表达产物均为可溶蛋白,其对底物CDNB、NBD-Cl、NBC和Cum-OOH均具有催化活性,而对HED、DCNB和DHA均没有活性。不同的蛋白对同一底物的活性有较大的差异,PtoGSTF4对底物CDNB的活性分别是PtoGSTF5和PtoGSTF7的2.6和38.7倍,而PtoGSTF5对底物NBD-Cl的活性分别是PtoGSTF4和PtoGSTF7的7.3和150.8倍。动力学分析显示,PtoGSTF5对GSH和CDNB的亲和力均高于PtoGSTF4,分别是PtoGSTF4的12.3和4.8倍。温度依赖性及pH依赖性分析显示PtoGSTF4和PtoGSTF5具有一定的差异,PtoGSTF5在70℃时还保持着最高活性的94%,而PtoGSTF4仅保持着最高活性的18%; PtoGSTF5在pH6.0时其活性为最高活性的68%,而PtoGSTF4仅为18%。综合基因结构、系统进化、表达模式和蛋白结构与生化功能数据,本文对毛白杨中三个phi类GST进行了系统分析,结果表明三个GST基因间可能发生功能分化。
朱云霞[7]（2014）在《新型抗生素Bagremycin生物合成基因的相关研究》文中指出抗生素的广泛应用导致许多病原菌产生严重的耐药性,而新型抗生素的不断筛选及其生物合成机制的不断揭示,能够为组合生物合成和代谢途径工程策略的实施提供丰富的物质资源和信息资源。bagremycin A和B是由Streptomyces sp. Tu4128生产的两种新型的次级代谢产物,具有抗真菌、细菌和肿瘤细胞的生物活性,在医药和农业领域具有潜在的应用价值。本研究中,首先,建立了大肠杆菌-Streptomyces sp. Tii4128间高效的属间接合转移系统,考察并优化了培养基组分、培养基中添加的MgC12浓度、接合温度等相关的影响因素。其次,根据bagremycin的结构,从Streptomyces sp. Tu4128染色体上分别克隆了醛缩酶和3-脱氢奎尼酸合成酶的同源编码基因bagB和bagC,基因敲除实验证明两者与bagremycin生物合成相关。同时,在bagB基因的上游,通过染色体走读获得bagA基因,其蛋白产物与芳香族氨基酸解氨酶高度同源,在大肠杆菌中体外表达bagA基因并测活,鉴定为新型的微生物来源的酪氨酸解氨酶,基因中断实验证实bagA基因负责p-香豆酸和bagremycin的生物合成,且p-香豆酸为bagremycin生物合成的前体物质之一。然后采用Solexa/Illumina技术对bagremycin生产菌Itreptomyces sp. Tu4128进行全基因组测序并绘制草图。一方面,解析菌株Streptomyces sp. Tu4128基因组的基本特征,另一方面,利用生物信息学的方法进行基因组挖掘候选的其他次级代谢产物相关的生物合成基因簇。同时,还分析了bagremycin潜在的生物合成基因簇结构和抗性基因、途径特异性调控基因和生物合成基因的功能。
郭恒[8]（2011）在《利用减毒鼠沙门氏菌构建口服狂犬病疫苗的研究》文中研究指明狂犬病（Rabies）是由狂犬病毒（Rabies virus,RV）引起的可导致高致死率的危害严重的人兽共患病。我国人的狂犬病主要由患病犬咬伤或通过粘膜接触所致,对犬群的大规模免疫接种是控制狂犬病的最佳途径。目前我国使用的兽用狂犬病疫苗主要弱毒活疫苗及灭活细胞培养疫苗两种,前者在使用过程中存在毒力返祖的安全隐患,国际上对家养动物禁用狂犬病活疫苗;而后者主要依靠进口,供应量不足、价格昂贵,无法满足我国目前大规模免疫接种的需求。2010年我国农业部虽然批准首个灭活国产兽用狂犬病疫苗可以进行生产,但目前尚无价格低廉的产品上市。同时上述两种疫苗采用多次注射进行免疫,免疫程序繁冗,使用不便,限制在野生动物及犬群中的使用。沙门氏菌（Salmonella）血清型繁多,是人兽共患病原菌,其中鼠伤寒菌（Salmonella Typhimurium）对小鼠及犬类动物均易感。沙门氏菌为细胞内寄生菌,具有黏膜组织或抗原提呈细胞的亲嗜性,可经口服粘膜自然感染途径将重组基因直接呈送给抗原递呈细胞,有刺激抗原特异性体液和细胞免疫、诱导细胞凋亡的功能,含自身佐剂CpG基序,是最早用作活疫苗载体实验模型的工具菌之一,也是目前遗传背景最清楚、应用最广泛的活菌疫苗载体。减毒沙门氏菌携带异种抗原运送效率高、免疫方法简单、激发免疫应答全面,至今已介导40余种的病毒、细菌、寄生虫和与肿瘤治疗相关基因的表达。狂犬口服免疫具有简便、易行、群众易接受的特点,适合对犬群及野生动物的大规模免疫,口服免疫也是世界各国学者推崇的有效接种途径。狂犬病毒糖蛋白（glycoprotein,GP）是激发中和抗体的唯一有效抗原,而核蛋白（nucleoprotein,NP）可激发细胞免疫应答,促进中和抗体的产生。为此,本研究构建了以沙门氏菌为运载体携带狂犬病毒GP基因和NP基因的新型口服疫苗新型口服疫苗,进行了如下系列实验研究:1.为增强构建质粒的稳定性,PCR方法扩增pBR322克隆载体中rop基因调控片段定向插入pVAX1载体中,构建中低拷贝真核表达载体pR。Realtime PCR显示改造后的pR载体较pVAX1拷贝数降低约13倍。RT-PCR法扩增中国狂犬病毒人用疫苗株CTN-1的GP和NP基因,基因重组技术分别克隆至pVAX1载体中构建单基因表达载体pV-G和pV-N;重叠PCR法将破伤风毒素C片段（Tetanus Toxin Fragment C,TTc）与GP基因串联,两基因间设（G4S）2柔性linker,构建双基因串联融合表达载体pV-GT和pR-GTTc。构建的2个串联表达载体转染BHK-21细胞,间接免疫荧光及Western blot检测到融合蛋白的表达。2.构建的pV-G、pV-N、pV-GT、pR-GT真核表达质粒电转化入鼠伤寒沙门氏菌phoP/phoQ疫苗株（简称PQ）中,分别构建重组沙门氏菌PQ-VG、PQ-VN、PQ-VGT和PQ-RGT。重组菌体外无抗生素下连传100代,PQ-RGT中质粒滞留率较PQ-VGT高18%。于第1、3、14天以1x1010CFU剂量重组菌口服免疫11-13g雌性昆明鼠,末次免疫35天后发现PQ-RGT和PQ-VN联合免疫组可抵抗12 LD50的CVS-24脑内致死性攻击,小鼠的保护率为65%,明显优于PQ-VG、PQ-VGT、PQ-RGT的单一细菌免疫组（保护率分别为25.0%、33.3%和43.8%）及PQ-VGT、PQ-VN混合免疫组（53.3%）。所有接种PQ的对照鼠CVS-24脑内攻击后3-14天内均出现典型狂犬病症状并最终死亡。3.为增强外源蛋白在沙门氏菌中表达的稳定性,以原核低拷贝克隆载体pGB2为基础进行构建重组表达载体。选取GP中含多个线性表位的179-281aa肽段（命名为Gepi）化学合成沙门氏菌偏嗜性密码子优化后的肽段Gopt。克隆丁香假单胞菌的冰核蛋白的N端截短区（INPn）和沙门氏菌PQ的体内厌氧诱导启动子PnirB及强转录终止子序列rrnbT1T2,根据特异酶切位点的粘性末端体外按PnirB、INPn、Gopt和rrnbT1T2顺序连接构建重组表达载体pGnirB-I-Gopt及未进行密码子优化的重组载体pGnirB-I-Gepi。重组质粒经电转化转入PQ中并分别命名为PQ-IGO和PQ-IG。菌落印迹和间接免疫荧光显示重组菌可经厌氧诱导肽段的表达,并可将其展示于细菌表面。重组菌PQ-IGO用于PQ-RGT和PQ-VN联合免疫组的第3次的prime-boost,小鼠保护率为75.0%,略低于商品化疫苗腹腔注射prime-boost加强组,优于之前的非prime-boost免疫组及未进行密码子优化组。4.重组菌联合免疫激发的抗狂犬病毒中和抗体、抗破伤风毒素及沙门氏菌IgG,细胞因子IL2、INFγ以及Treg调节T细胞和CD4+CD8+T细胞含量等被检测,结果表明三种质粒联合应用可有效诱发针对狂犬、破伤风毒素及沙门氏菌的多价体液和细胞免疫应答,并可对75%以上的小鼠产生保护。本实验成功构建了以减毒伤寒菌为运载体的兼顾破伤风梭菌及鼠伤寒沙门氏菌免疫防治的多价狂犬病口服疫苗的实验模型。我国犬数量庞大,种群增殖快,并且交易频繁。由于目前狂犬病流行的自然宿主还不十分清楚,野生动物狂犬病疫情病原流行病学调查数据还不详实,新型口服狂犬病疫苗的研发将对深化我国狂犬病免疫防治现状具有重要意义。本课题以减毒伤寒菌为运载体,为安全有效的适合犬、猫及野生动物使用的新型暴露前预防性口服疫苗的研究奠定了基础。国内相关研究多为病毒活载体疫苗及基于反向遗传技术的弱毒活疫苗,本研究的成功可为狂犬口服疫苗的研制提供一种成本更加低廉的备选方案。
芦晓立[9]（2010）在《羊痘病毒P32基因与羊CD58基因共表达质粒的构建及其表达产物免疫活性分析》文中研究表明羊痘是由羊痘病毒引起的羊的一种急性、热性、接触性传染病,是所有动物痘病中最为重要的一种。由该病毒引起的疾病在1997年被世界动物卫生组织（OIE）列为93种必须报告的动物疫病之一,我国也将其列为一类动物疾病。羊痘病毒P32蛋白是位于羊痘病毒囊膜表面的主要结构蛋白,含有主要的抗原表位。CD58即淋巴细胞功能相关抗原-3,与CD2结合既可使免疫系统处于激活状态。本文旨在将羊痘病毒抗原基因和CD58基因构建在同一载体上,发挥CD58的免疫佐剂作用,以增强表达P32蛋白的免疫效果,为进一步开发高效的DNA疫苗奠定基础。本实验从健康的羊的血液中分离淋巴细胞,用RT-PCR扩增羊致敏淋巴细胞中的CD58基因,将CD58基因插入pGEX-4T-1载体,构建了能够表达CD58的原核表达载体pGEX-CD58。经ITPG诱导,目的基因在大肠杆菌中得到表达,表达蛋白质分子量为53ku。经鉴定能与羊CD58的单克隆抗体发生反应,说明表达产物具有反应原性。从羊痘组织病变中扩增得到P32基因,与pBudCE4.1载体连接,构建的质粒pBudCE4.1 /P32 ,与此前获得的CD58基因共同构建重组质粒pBudCE4.1/CD58/P32。质粒提纯后,在脂质体作用下转染BHK-21细胞,通过直接免疫荧光试验和间接免疫荧光试验分别检测P32和CD58在BHK-21中的表达。结果显示,P32和CD58在BHK-21细胞中都得到表达。以BALB/c小鼠为动物模型,通过肌肉注射接种免疫BALB/c小鼠,定期采血用ELISA法检测免疫抗体水平;用MTT法检测细胞免疫情况,结果表明,共表达载体可诱导机体产生体液免疫和细胞免疫。
贾鹏[10]（2009）在《Ⅳ型HEV real-time RT-PCR方法的建立及重组病毒样颗粒抗原的真核表达》文中研究表明本研究针对基因Ⅳ型HEV基因组ORF3设计特异性的引物和探针,建立了从猪粪便中定量检测基因Ⅳ型HEV的real-time RT-PCR方法。该方法标准曲线的相关系数和斜率分别为0.994和-3.312,并且具有较好的重复性、特异性和灵敏性。所建立的real-time RT-PCR方法能够准确的从阳性基因Ⅳ型HEV毒株中检测到病毒核酸。为基因Ⅳ型戊型肝炎病毒的分子生物学检测奠定基础。在参考相关文献的基础上,通过生物信息学软件分析了基因Ⅳ型HEV CH-S-1毒株基因序列和氨基酸序列,结果表明基因Ⅳ型HEV CH-S-1毒株与CH-87毒株核苷酸和氨基酸同源性最高,分别为92.5%和100%。基因进化树分析结果发现CH-S-1毒株与CH-87毒株在同一分支上,属于基因Ⅳ型Ⅳa亚型。HEV优势抗原表位的预测结果表明HEV ORF2 424563aa和613674aa区段绝大部分位于该蛋白表面,而235372aa区段有部分包裹在所分析蛋白内部。因此本研究初步将ORF2蛋白382674aa区域（p293）作为HEV优势抗原表位相对集中的区域做进一步研究。通过设计特异性的引物,扩增了ORF2基因截短体293（6286bp7167bp）并且成功构建了毕赤酵母分泌表达重组质粒pPIC9K-293。重组菌经Muts表型筛选和PCR鉴定后,成功筛选到了阳性重组酵母菌GS115/pPIC9k-293。目的蛋白SDS-PAGE的检测结果可见与预期大小一致的目的带,目的蛋白p293占培养物上清中可溶蛋白的15.7%。Western Blot结果表明目的蛋白具有较好的抗原性。在对诱导表达条件优化后发现,目的蛋白的表达量显着提高。硫酸铵沉淀、透析纯化浓缩目的蛋白,SDS-PAGE分析表明,纯化浓缩后的目的蛋白占总蛋白的85%,约为80mg/L。在透射电镜下观察目的蛋白p293,可见大小为30nm左右的病毒样颗粒。研究结果为HEV血清学诊断方法以及疫苗的相关研究奠定了基础。
二、用连续长片段RT-PCR扩增HCV结构基因（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、用连续长片段RT-PCR扩增HCV结构基因（论文提纲范文）
（1）云南地区艾滋病患者中预存耐药基因流行特征及HIV-1新重组型的命名（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩写词表 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 艾滋病病毒(HIV)与艾滋病(AIDS) |
| 1.1.1 HIV的起源 |
| 1.1.2 HIV与艾滋病(AIDS) |
| 1.1.3 HIV病毒学特征及其基因组结构 |
| 1.1.4 HIV病毒的复制 |
| 1.2 HIV的感染与流行 |
| 1.2.1 HIV的感染 |
| 1.2.2 HIV在全球,中国及云南的流行情况 |
| 1.3 HIV-1 的耐药与耐药检测 |
| 1.3.1 HIV-1 的临床治疗 |
| 1.3.2 HIV-1 的临床药物 |
| 1.3.3 HIV-1 的耐药相关突变 |
| 1.3.4 HIV-1 的预存耐药 |
| 1.3.5 HIV-1 的耐药性检测 |
| 1.4 HIV-1 的基因型与重组 |
| 1.4.1 HIV-1 的基因型 |
| 1.4.2 HIV-1 的重组及其流行 |
| 1.5 下一代测序技术在HIV-1 的耐药性检测中的应用 |
| 1.6 本论文研究内容及目的和意义 |
| 1.7 本论文技术路线 |
| 第二章 云南地区2017-2020 年预存耐药研究 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验对象和材料 |
| 2.2.1 实验对象 |
| 2.2.2 实验材料和试剂 |
| 2.2.3 实验仪器和设备 |
| 2.2.4 实验数据分析 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 引物设计和合成 |
| 2.3.2 病毒RNA的提取 |
| 2.3.3 HIV-1 样本的pol区(1.2kb)进行巢式扩增 |
| 2.3.4 PCR扩增结果进行琼脂糖凝胶电泳检测 |
| 2.3.5 样本纯化及送测序 |
| 2.3.6 双峰样品TA克隆 |
| 2.3.7 耐药位点分析方法 |
| 2.4 实验结果 |
| 2.4.1 2017-2020 年未经治疗的 HIV-1 感染患者人口学特征 |
| 2.4.2 1411 例未经治疗的 HIV-1 患者的 PR、RT 区扩增 |
| 2.4.3 1411 例未治疗的 HIV-1 患者中高度耐药相关突变位点及其耐药性 |
| 2.4.4 2017-2020 年未经治疗的 HIV-1患者的非高度耐药相关突变及其耐药性 |
| 2.5 讨论 |
| 2.6 结论 |
| 第三章 云南地区2017-2020 年HIV-1耐药相关突变与基因型流行关系 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验对象及材料 |
| 3.2.1 实验对象 |
| 3.2.2 实验材料 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.4 实验结果 |
| 3.4.1 2017-2020 年总体HIV-1 基因型分子流行特征 |
| 3.4.2 2017-2020 年间基因型流行变化 |
| 3.4.3 高度耐药相关突变和基因型流行关系 |
| 3.4.4 非高度耐药相关突变和基因型流行关系 |
| 3.5 讨论 |
| 3.6 结论 |
| 第四章 云南地区新的HIV-1 重组型的发现和命名 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验对象及材料 |
| 4.2.1 实验对象 |
| 4.2.2 实验材料 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 引物设计和合成 |
| 4.3.2 病毒RNA的提取 |
| 4.3.3 进行巢式PCR扩增 |
| 4.3.4 PCR扩增结果进行琼脂糖凝胶电泳检测 |
| 4.3.5 样本纯化及送测序 |
| 4.3.6 双峰样品TA克隆 |
| 4.3.7 基因型重组分析方法 |
| 4.4 实验结果 |
| 4.4.1 HIV-1 2.6kb(gag-pol区)序列分析结果 |
| 4.4.2 全长样品扩增结果 |
| 4.4.3 CRF110_BC重组的结果分析 |
| 4.4.4 CRF118_BC重组的结果分析 |
| 4.4.5 一组新的B和C重组的结果分析 |
| 4.5 讨论 |
| 4.6 结论 |
| 第五章 总结与展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录 A攻读硕士期间发表论文目录 |
（2）HIV-1病毒Nef蛋白抑制剂的筛选及其作用机制研究（论文提纲范文）
| 缩略词和中英文对照表 |
| 第一部分 :HIV-1 病毒Nef蛋白抑制剂的筛选和及其作用机制研究 |
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 第1章 前言 |
| 1.1 HIV的研究背景 |
| 1.2 Nef蛋白的研究进展 |
| 1.2.1 Nef蛋白的基本特征 |
| 1.2.2 Nef介导的HIV病毒躲避免疫监控的机制 |
| 1.3 抗HIV-1药物的研究进展 |
| 1.3.1 抗HIV-1的治疗方法 |
| 1.3.2 抗病毒药物的种类 |
| 1.3.3 开发抗病毒药物的靶标 |
| 第2章 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 实验菌株 |
| 2.1.3 实验主要质粒和小分子 |
| 2.1.4 主要试剂耗材 |
| 2.1.5 实验仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 受试者临床样本入排标准及医学伦理 |
| 2.2.2 细胞培养 |
| 2.2.3 外周血单个核细胞(PBMCs)的分离 |
| 2.2.4 人原代T淋巴细胞的分离培养 |
| 2.2.5 贴壁细胞系的传代 |
| 2.2.6 酶联免疫吸附实验(ELISA) |
| 2.2.7 HEK293T细胞转染实验 |
| 2.2.8 流式细胞术 |
| 2.2.9 单轮感染试验 |
| 2.2.10 病毒体外扩增和感染实验 |
| 2.2.11 自体CD4~+和CD8~+T细胞共培养实验 |
| 2.2.12 细胞毒性杀伤实验 |
| 2.2.13 分子对接 |
| 2.2.14 Western Blot实验 |
| 2.2.14 免疫共沉淀 |
| 2.2.15 蛋白纯化实验 |
| 2.2.16 表面等离子体共振实验 |
| 2.3 技术路线 |
| 第3章 实验结果 |
| 3.1 高通量筛选Nef抑制MHC-I表达的拮抗剂,恢复MHC-I的表达 |
| 3.2 洛伐他汀有效抑制Nef介导的MHC-I下调 |
| 3.3 洛伐他汀拮抗Nef介导的CD4和SERINC5 的下调以及抑制病毒颗粒的内源性感染性 |
| 3.4 在野生型HIV-1 感染期间,洛伐他汀可以抑制MHC-I和 CD4 分子的下调 |
| 3.5 洛伐他汀的预处理可增强HIV-1 感染者对重新激活的潜伏库的自体CTL应答 |
| 3.6 洛伐他汀直接作用于Nef,阻断Nef与 AP-1 的相互作用 |
| 第4章 讨论 |
| 第5章 展望 |
| 第6章 结论 |
| 第二部分 :通过整合微小RNA组(mi RNAome)和转录组分析鉴定呼吸道合胞体病毒(RSV)引起的小儿肺炎中mi RNA与 m RNA的互作关系 |
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 第1章 前言 |
| 第2章 实验材料与方法 |
| 2.1 病人样本收集 |
| 2.2 RNA提取实验 |
| 2.3 高通量测序 |
| 2.4 实时荧光定量PCR(q RT-PCR) |
| 2.5 数据分析 |
| 第3章 实验结果 |
| 3.1 利用高通量测序分析RSV轻症肺炎和RSV重症肺炎患儿全血标本中mi RNA和mRNA差异表达 |
| 3.2 对选定的mi RNA进行验证,鉴定潜在的诊断性mi RNA生物标志物 |
| 3.3 差异表达miRNA靶基因的预测与鉴定 |
| 第4章 讨论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 附录 细胞株来源 |
| 个人简介 |
| 攻读学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
（3）蓝果忍冬花色苷合成bHLH转录因子筛选及LcTT8功能验证（论文提纲范文）
| 摘要 |
| 英文摘要 |
| 1 前言 |
| 1.1 蓝果忍冬概述 |
| 1.2 花色苷概述 |
| 1.3 植物花色苷的生物合成途径 |
| 1.4 花色苷生物合成相关转录因子研究进展 |
| 1.4.1 bHLH转录因子 |
| 1.4.2 MYB转录因子 |
| 1.4.3 WD40 转录因子 |
| 1.4.4 MBW(MYB-bHLH-WD40)复合蛋白 |
| 1.5 转录组测序加快新基因的发现 |
| 1.6 本研究的主要内容和技术路线 |
| 1.6.1 主要内容 |
| 1.6.2 技术路线 |
| 1.7 目的意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 植物材料 |
| 2.1.2 试验试剂及菌株 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 De novo转录组测序 |
| 2.2.2 bHLH蛋白的基因功能注释与鉴定 |
| 2.2.3 蓝果忍冬bHLH蛋白进化树分析 |
| 2.2.4 蛋白保守基序鉴定 |
| 2.2.5 RNA提取与cDNA第一链的合成 |
| 2.2.6 蓝果忍冬bHLH家族基因qPCR分析 |
| 2.2.7 总花色苷含量测定 |
| 2.2.8 LcTT8 基因的克隆 |
| 2.2.9 LcTT8 基因的序列分析 |
| 2.2.10 LcTT8 表达模式分析 |
| 2.2.11 LcTT8 亚细胞定位分析 |
| 2.2.12 LcTT8 基因对烟草的遗传转化 |
| 2.2.13 转基因烟草叶片花色苷合成酶活性及基因表达量分析 |
| 2.2.14 转基因烟草的花色苷含量及组分分析 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 蓝果忍冬bHLH转录因子鉴定与注释 |
| 3.2 蓝果忍冬bHLH转录因子进化树和基序分析 |
| 3.3 蓝果忍冬和拟南芥bHLH转录因子进化关系对比 |
| 3.4 蓝果忍冬总RNA的提取 |
| 3.5 蓝果忍冬bHLH家族基因表达分析 |
| 3.6 LcTT8 基因的克隆与鉴定 |
| 3.7 LcTT8 基因的序列分析 |
| 3.7.1 LcTT8 序列分析 |
| 3.7.2 系统进化树分析 |
| 3.8 LcTT8 基因表达模式分析 |
| 3.8.1 LcTT8 在蓝果忍冬上的组织特异性表达分析 |
| 3.8.2 LcTT8 在蓝果忍冬果实不同发育时期的表达 |
| 3.9 LcTT8 转录因子亚细胞定位 |
| 3.9.1 LcTT8-EGFP融合表达载体的鉴定 |
| 3.9.2 LcTT8-EGFP在拟南芥原生质体中的定位 |
| 3.10 LcTT8 转录因子功能分析 |
| 3.10.1 植物过量表达载体pBI121-LcTT8 的构建 |
| 3.10.2 pBI121-LcTT8 植物过量表达载体转入根癌农杆菌 |
| 3.10.3 转基因烟草抗性植株的筛选 |
| 3.10.4 转基因烟草的PCR鉴定 |
| 3.10.5 LcTT8 转基因烟草的表型分析 |
| 3.10.6 转基因烟草花色苷合成酶活性及基因表达量分析 |
| 3.10.7 转基因烟草的花色苷组分分析 |
| 4.讨论 |
| 4.1 蓝果忍冬bHLH家族功能预测 |
| 4.2 参与蓝果忍冬果实花色苷合成的bHLH基因 |
| 4.3 LcTT8 基因调控蓝果忍冬花色苷合成模式 |
| 4.4 LcTT8 是核主效蛋白 |
| 4.5 LcTT8 对花色苷合成酶基因表达及活性的调控 |
| 4.6 LcTT8 对花色苷含量变化的影响 |
| 5 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 攻读硕士学位期间发表的学术论文 |
（4）丹参miRNA对连作障碍的响应及其在次生代谢调控中的作用研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 植物中miRNA概述 |
| 1.1.1 药用植物中miRNA研究 |
| 1.1.2 miRNA与药用植物的次生代谢 |
| 1.2 miRNA与激素信号 |
| 1.3 丹参中miRNA的研究进展 |
| 1.4 丹参连作障碍 |
| 1.4.1 丹参连作障碍的研究现状 |
| 1.4.2 miRNA与丹参连作障碍 |
| 1.5 丹参次生代谢物合成路径及调控 |
| 1.6 本项目研究的目的与意义 |
| 第二章 响应丹参连作障碍miRNAs的鉴定 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料、试剂与仪器 |
| 2.2.1 实验材料 |
| 2.2.2 主要试剂 |
| 2.2.3 主要仪器 |
| 2.2.4 引物 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 丹参根总RNA的提取 |
| 2.3.2 丹参miRNA的鉴定 |
| 2.3.3 响应丹参连作障碍miRNA鉴定 |
| 2.3.4 miRNA靶基因的预测和评价 |
| 2.3.5 Quantitative RT-PCR analysis |
| 2.3.6 HPLC检测丹参酮、丹酚酸含量 |
| 2.4 实验结果 |
| 2.4.1 丹参根中s RNA的深度测序 |
| 2.4.2 丹参中已知miRNAs的鉴定 |
| 2.4.3 丹参中新miRNA的鉴定 |
| 2.4.4 响应丹参连作障碍miRNAs的筛选 |
| 2.4.5 差异miRNAs靶基因分析 |
| 2.4.6 连作障碍对丹参植株生长发育的影响 |
| 2.4.7 连作障碍对丹参次生代谢产物合成的影响 |
| 2.5 讨论与小结 |
| 2.5.1 药用植物miRNA响应丹参的连作障碍 |
| 2.5.2 miRNA响应丹参连作障碍及其对丹参次生代谢产物合成的影响 |
| 2.5.3 小结 |
| 第三章 Smi-miR164a过表达提高丹参对化感物质的耐受及对次生代谢产物合成的影响 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料、试剂与仪器 |
| 3.2.1 实验材料 |
| 3.2.2 主要试剂 |
| 3.2.3 主要仪器 |
| 3.2.4 引物 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 总RNA提取及反转录 |
| 3.3.2 Smi-miR164a的组织特异性表达及靶基因分析 |
| 3.3.3 Smi-miR164a过表达转基因毛状根的获得 |
| 3.3.4 Smi-miR164a转基因毛状根对化感物质的耐受实验 |
| 3.3.5 Smi-miR164a对毛状根生物量及次生代谢产物合成的影响 |
| 3.4 实验结果 |
| 3.4.1 Smi-miR164a组织表达特异性分析 |
| 3.4.2 Smi-miR164a靶基因分析 |
| 3.4.3 miR164a转基因毛状根的获得 |
| 3.4.4 miR164a过表达植株对化感物质的耐受研究 |
| 3.4.5 过表达miR164a转基因毛状根生长受到抑制 |
| 3.4.6 过表达miR164a转基因毛状根对丹参次生代谢物合成的影响 |
| 3.5 讨论与小结 |
| 3.5.1 讨论 |
| 3.5.2 小结 |
| 第四章 SmNAC2和SmNAC3的分子克隆及对丹参次生代谢物合成的影响 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料、试剂与仪器 |
| 4.2.1 菌株及载体 |
| 4.2.2 主要仪器及试剂 |
| 4.2.3 引物 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 植物材料获得 |
| 4.3.2 SmNAC2和SmNAC3基因的分子克隆与序列分析 |
| 4.3.3 SmNAC2和SmNAC3原核表达研究 |
| 4.3.4 SmNAC2和SmNAC3过表达和RNAi载体的构建 |
| 4.4 实验结果 |
| 4.4.1 SmNAC2和SmNAC3基因的克隆与生物信息学分析 |
| 4.4.2 SmNAC2和SmNAC3蛋白原核表达 |
| 4.4.3 SmNAC2和SmNAC3组织特异性表达 |
| 4.4.4 SmNAC2和SmNAC3过表达及RNAi沉默转基因毛状根分析 |
| 4.4.5 SmNAC2和SmNAC3对丹酚酸积累的影响 |
| 4.4.6 SmNAC2和SmNAC3对丹参酮积累的影响 |
| 4.5 讨论与小结 |
| 4.5.1 讨论 |
| 4.5.2 小结 |
| 第五章 Smi-miR160a过表达促进丹酚酸B的积累抑制丹参酮的合成 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 实验材料、仪器与试剂 |
| 5.2.1 植物材料、试剂与仪器 |
| 5.2.2 引物 |
| 5.3 实验方法 |
| 5.4 实验结果 |
| 5.4.1 miR160a靶基因分析及组织特异性表达 |
| 5.4.2 过表达miR160a转基因毛状根的获得 |
| 5.4.3 Smi-miR160a过表达促进毛状根生物量增长 |
| 5.4.4 过表达smi-miR160a基因抑制丹参酮的积累 |
| 5.4.5 Smi-miR160a基因过表达促进毛状根中酚酸的积累 |
| 5.4.6 Smi-miR160a基因过表达改变了丹参酮和丹酚酸生物合成途径基因的表达水平 |
| 5.4.7 Smi-miR160a基因过表达影响IAA、SA和JA的积累 |
| 5.5 讨论与小结 |
| 5.5.1 miR160a通过其靶基因ARF影响IAA积累导致丹参毛状根生物量增加 |
| 5.5.2 miR160a通过影响IAA、SA和JA导致生物量增加,丹参酮降低 |
| 结论 |
| 创新点 |
| 参考文献 |
| 附录A |
| 附录B |
| 致谢 |
| 作者简历 |
（5）美洲型、欧洲型PRRSV及PCV2基因工程疫苗构建及实验免疫研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 Abstract 英文缩略词表 绪论 第一篇 文献综述 |
| 第1章 美洲型、欧洲型 PRRSV 分子生物学特性和免疫学研究进展 |
| 第2章 PCV 分子生物学特性及免疫学研究进展 第二篇 研究内容 |
| 第一章 欧洲型、美洲型 PRRSV ORF3、ORF5 基因及 PCV2 ORF2基因的克隆与序列分析 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第二章 欧洲型、美洲型 PRRSV 二价核酸疫苗的构建及小鼠实验免疫研究 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第三章 欧洲型PRRSV及PCV2二联核酸疫苗的构建及小鼠实验免疫研究 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第四章 欧洲型、美洲型 PRRSV 二价核酸疫苗和欧洲型 PRRSV、PCV2 二联核酸疫苗猪体实验免疫研究 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第五章 欧洲型、美洲型 PRRSV 二价重组痘病毒疫苗和欧洲型PRRSV、PCV2 二联重组痘病毒疫苗的构建及猪体实验免疫研究 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 结论 参考文献 攻读学位期间发表的学术论文及取得的科研成果 导师及作者简介 致谢 |
（6）杨树phi GST基因家族的功能分化研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略语表 |
| 1 引言 |
| 1.1 GSTs家族的分类与命名 |
| 1.2 GSTs家族的功能 |
| 1.2.1 Phi和tau类GSTs |
| 1.2.2 Zeta和theta类GSTs |
| 1.2.3 DHAR和lambda类GSTs |
| 1.2.4 TCHQD类GSTs |
| 1.2.5 微粒体类GSTs |
| 1.3 GSTs的系统进化关系 |
| 1.4 GSTs的定位和调节 |
| 1.5 GSTs的蛋白结构和催化机制 |
| 1.6 研究意义与展望 |
| 2 毛白杨phi类GSTs分子克隆与结构分析 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 实验材料 |
| 2.1.2 毛白杨cDNA的合成 |
| 2.1.3 设计克隆引物 |
| 2.1.4 目的基因PCR扩增 |
| 2.1.5 割胶回收PCR产物 |
| 2.1.6 构建克隆载体及测序 |
| 2.1.7 序列相似性分析 |
| 2.1.8 系统发生关系及蛋白质结构域分析 |
| 2.1.9 蛋白质三维结构模拟 |
| 2.2 结果与分析 |
| 2.2.1 毛白杨总RNA的提取 |
| 2.2.2 目的基因的扩增 |
| 2.2.3 克隆载体的构建与鉴定 |
| 2.2.4 目的基因的测序结果及序列分析 |
| 2.2.5 蛋白质保守结构域分析 |
| 2.2.6 多序列比对分析 |
| 2.2.7 系统发生关系分析 |
| 2.2.8 蛋白质三维结构模拟 |
| 2.3 讨论 |
| 3 毛白杨phi类GSTs基因表达模式分析 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 实验材料 |
| 3.1.2 RT-PCR引物的设计 |
| 3.1.3 各组织总RNA的提取 |
| 3.1.4 cDNA的合成 |
| 3.1.5 RT-PCR反应 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.2.1 毛白杨总RNA的提取 |
| 3.2.2 毛白杨cDNA的检测 |
| 3.2.3 RT-PCR结果检测 |
| 3.3 讨论 |
| 4 毛白杨phi类GSTs蛋白质的功能研究 |
| 4.1 实验方法 |
| 4.1.1 表达引物的设计 |
| 4.1.2 PCR扩增目的基因 |
| 4.1.3 PCR产物割胶回收 |
| 4.1.4 克隆载体的构建和测序 |
| 4.1.5 表达载体的构建 |
| 4.1.6 重组蛋白的原核表达 |
| 4.1.7 蛋白质的纯化 |
| 4.1.8 蛋白质酶学活性测定 |
| 4.2 结果与分析 |
| 4.2.1 克隆载体构建 |
| 4.2.2 表达载体的构建 |
| 4.2.3 重组蛋白的体外诱导表达和纯化 |
| 4.2.4 蛋白活性的测定 |
| 4.3 讨论 |
| 5 总结 |
| 参考文献 |
| 个人简介 |
| 导师简介 |
| 获得成果目录 |
| 致谢 |
（7）新型抗生素Bagremycin生物合成基因的相关研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第1章 前言 |
| 1.1 链霉菌 |
| 1.1.1 链霉菌简介 |
| 1.1.2 链霉菌生产的丰富的次级代谢产物产物及其作用 |
| 1.2 抗生素生物合成基因簇克隆策略 |
| 1.2.1 互补克隆 |
| 1.2.2 抗性基因克隆 |
| 1.2.3 直接克隆 |
| 1.2.4 人工合成寡核苷酸作为探针的方法 |
| 1.2.5 利用同源性较高的异源DNA作为探针的杂交法 |
| 1.2.6 利用PCR的方法 |
| 1.2.7 基因组扫描(Genome scanning) |
| 1.2.8 基因组挖掘(Genome mining) |
| 1.2.9 “不可培养微生物(Uncultured microorganisms)”的培养与宏基因组学 |
| 1.3 测序技术及应用 |
| 1.3.1 测序技术 |
| 1.3.2 应用 |
| 1.4 bagremycin |
| 1.4.1 bagremycin简介 |
| 1.4.2 bagremycin的结构 |
| 1.4.3 bagremycin的生物学活性 |
| 1.4.4 bagremycin生物合成途径的推测 |
| 1.5 本课题的研究目的和意义 |
| 第2章 材料和方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 菌株 |
| 2.1.2 质粒 |
| 2.1.3 培养基 |
| 2.1.4 试剂和缓冲液 |
| 2.1.5 引物 |
| 2.1.6 实验仪器和设备 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 菌株培养和保藏 |
| 2.2.2 大肠杆菌质粒DNA的提取 |
| 2.2.3 链霉菌原生质体的制备 |
| 2.2.4 链霉菌基因组DNA的提取 |
| 2.2.5 链霉菌总RNA的提取 |
| 2.2.6 大肠杆菌感受态细胞的制备 |
| 2.2.7 大肠杆菌CaCl_2法转化质粒 |
| 2.2.8 大肠杆菌-链霉菌属间接合转移 |
| 2.2.9 DNA片段的回收(GenClean柱式琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒,捷瑞) |
| 2.2.10 DNA的纯化 |
| 2.2.11 载体的去磷酸化 |
| 2.2.12 高效-热不对称交错聚合酶链式反应(HE-TAIL PCR) |
| 2.2.13 逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR) |
| 2.2.14 DNA琼脂糖凝胶电泳 |
| 2.2.15 聚丙烯酰胺凝胶电泳 |
| 2.2.16 重组BagA'蛋白和BagA蛋白的酶活测定 |
| 2.2.17 Southern blot杂交(DIG DNA Labeling and Detection Kit,Roche) |
| 2.2.18 链霉菌的发酵及次级代谢产物的分离提取 |
| 2.2.19 高压液相色谱(HPLC)分析 |
| 2.2.20 全基因组测序 |
| 2.2.21 生物信息学分析 |
| 第3章 大肠杆菌-Streptomyces sp.Tu 4128属间接合转移系统的建立 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 结果与讨论 |
| 3.2.1 大肠杆菌-链霉菌属间接合转移影响因素的优化 |
| 3.2.2 接合转移子的鉴定 |
| 3.2.3 attB位点的克隆和分析 |
| 3.3 小结 |
| 第4章 bagremycin生物合成基因bagB和bagC的克隆和体内功能研究 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 结果和讨论 |
| 4.2.1 bagremycin生物合成途径的推测 |
| 4.2.2 bagB基因的克隆、测序和序列分析 |
| 4.2.3 bagC基因的克隆、测序和序列分析 |
| 4.2.4 bagB和bagC基因的RT-PCR分析 |
| 4.2.5 bagB和bagC基因的敲除 |
| 4.2.6 bagB和bagC基因突变株的代谢产物分析 |
| 4.3 小结 |
| 第5章 bagremycin生物合成基因bagA的克隆、体外和体内功能研究 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 结果和讨论 |
| 5.2.1 bagremycin生物合成途径的推测 |
| 5.2.2 bagA’基因的克隆、测序、体外表达和测活 |
| 5.2.3 bagA基因的克隆、测序和序列分析 |
| 5.2.4 bagA基因在大肠杆菌系统中的体外表达和测活 |
| 5.2.5 bagA基因的敲除 |
| 5.2.6 bagA基因中断突变株和p-香豆酸回补的代谢产物分析 |
| 5.3 小结 |
| 第6章 Streptomyces sp.Tu 4128全基因组扫描以及bagremycin生物合成相关基因的生物信息学分析 |
| 6.1 引言 |
| 6.2 结果和讨论 |
| 6.2.1 Streptomyces sp.Tu 4128全基因组扫描的数据组装分析 |
| 6.2.2 基因组的基本特征 |
| 6.2.3 染色体基因的功能分类 |
| 6.2.4 次级代谢生物合成基因簇预测 |
| 6.2.5 bagremycin生物合成基因簇的生物信息学分析 |
| 6.3 小结 |
| 第7章 结论与展望 |
| 7.1 结论 |
| 7.2 创新点 |
| 7.3 展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读硕士学位期间发表的学术论文 |
（8）利用减毒鼠沙门氏菌构建口服狂犬病疫苗的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩写表 |
| 引言 |
| 第一篇 文献综述 |
| 第1章 狂犬病毒和狂犬病 |
| 1.1 病毒结构 |
| 1.2 病原学特点 |
| 1.3 流行病学 |
| 1.4 发病机理 |
| 1.5 狂犬病毒的生活史 |
| 1.6 宿主细胞对狂犬病毒感染的应答 |
| 1.7 结语 |
| 第2章 狂犬病疫苗的研究进展 |
| 2.1 疫苗生产使用毒株简介 |
| 2.2 人用疫苗发展概况 |
| 2.3 兽用疫苗发展概况 |
| 2.4 新型狂犬病实验室疫苗模型研究进展 |
| 2.5 结语 |
| 第3章 沙门氏菌活载体疫苗研究进展 |
| 3.1 基于沙门氏菌的疫苗诱发保护性免疫应答的方法 |
| 3.2 沙门氏菌作为异源抗原的运载体研究进展 |
| 3.3 沙门氏菌作为DNA 疫苗运载体研究进展 |
| 3.4 沙门氏菌作为高级免疫调节单元研究进展 |
| 3.5 结语 |
| 第二篇 研究内容 |
| 第1章 狂犬CTN 株抗原基因的克隆及真核表达载体的构建 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第2章 重组沙门氏菌的构建及免疫组合方式的筛选 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 5. 小结 |
| 第3章 GP 线性表位肽段表面展示载体的构建及效果评价 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第4章 异源PRIME-BOOST 免疫策略的评价 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 攻读博士期间发表的学术论文及其它成果 |
| 致谢 |
（9）羊痘病毒P32基因与羊CD58基因共表达质粒的构建及其表达产物免疫活性分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Summary |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 羊痘的研究进展 |
| 1.1.1 羊痘的流行概况 |
| 1.1.2 羊痘病毒的基本特征 |
| 1.1.3 羊痘病毒基因组结构 |
| 1.1.4 羊痘病毒的P32 结构蛋白 |
| 1.1.5 羊痘诊断技术研究 |
| 1.1.6 羊痘免疫技术研究 |
| 1.2 DNA疫苗免疫佐剂的研究进展 |
| 1.2.1 共刺激分子 |
| 1.2.2 细胞因子 |
| 1.2.3 CpG DNA 基序 |
| 1.2.4 脂质体 |
| 1.2.5 研究目的和意义 |
| 第二章 羊 CD58 的克隆与表达 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 菌种和载体 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 采样动物 |
| 2.1.4 引物 |
| 2.1.5 溶液和试剂 |
| 2.1.6 仪器与设备 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 淋巴细胞的分离 |
| 2.2.2 细胞总RNA 抽提 |
| 2.2.3 RT-PCR 扩增CD58 基因 |
| 2.2.4 CD58 基因的纯化回收 |
| 2.2.5 目的基因的克隆 |
| 2.2.6 重组表达载体的构建 |
| 2.2.7 重组表达质粒的诱导表达 |
| 2.2.8 表达产物的检测 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 绵羊CD58 基因克隆 |
| 2.3.2 重组表达载体pGEX-CD58 的PCR 及酶切鉴定 |
| 2.3.3 羊CD58 表达产物的SDS-PAGE |
| 2.3.4 羊CD58 表达产物的Western-bloting 检测 |
| 2.4 讨论 |
| 第三章 羊痘 P32基因与羊 CD58基因共表达质粒的构建 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 菌种和载体 |
| 3.1.2 主要试剂 |
| 3.1.3 实验毒株 |
| 3.1.4 引物 |
| 3.1.5 溶液与试剂 |
| 3.1.6 仪器与设备 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 羊痘病毒P32 基因的克隆 |
| 3.2.2 共表达载体的构建 |
| 3.2.3 共表达载体在BHK 细胞中的表达 |
| 3.2.4 共表达载体的动物试验 |
| 3.2.5 间接ELISA 试验检测体液免疫 |
| 3.2.6 MTT 试验检测细胞免疫 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 羊痘病毒P32 基因的克隆 |
| 3.3.2 pBudCE4.1/CD58/P32 重组质粒的酶切鉴定 |
| 3.3.3 共表达载体质粒的大量提取 |
| 3.3.4 共表达载体在BHK 细胞中的表达 |
| 3.3.5 共表达载体的动物实验 |
| 3.4 讨论 |
| 3.4.1 关于共表达载体构建的问题 |
| 3.4.2 关于动物实验的问题 |
| 第四章 全文结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
| 导师简介 |
（10）Ⅳ型HEV real-time RT-PCR方法的建立及重组病毒样颗粒抗原的真核表达（论文提纲范文）
| 内容提要 |
| 绪论 |
| 第一篇 文献综述 |
| 1.1 HEV 生物学特性 |
| 1.1.1 HEV 研究史 |
| 1.1.2 HEV 理化特性 |
| 1.1.3 HEV 分类 |
| 1.1.4 HEV 基因结构 |
| 1.1.5 HEV 基因型 |
| 1.1.6 HEV 遗传与变异 |
| 1.2 戊型肝炎流行病学 |
| 1.2.1 传染源 |
| 1.2.2 传播途径 |
| 1.2.3 易感人群 |
| 1.3 戊型肝炎流行状况及其影响因素 |
| 1.4 临床症状及病理变化 |
| 1.4.1 影响HEV 致病力的因素 |
| 1.4.2 戊型肝炎临床症状及病理变化 |
| 1.5 戊型肝炎免疫学反应 |
| 1.6 戊型肝炎人兽共患性质 |
| 1.6.1 HEV 在人和家猪间的传播 |
| 1.6.2 HEV 在人和野生动物间的传播 |
| 1.6.3 HEV 在人和猫间的传播 |
| 1.6.4 HEV 在人和其他动物间的传播 |
| 1.6.5 HEV 在人和动物跨种间实验性感染 |
| 1.7 戊型肝炎的诊断方法 |
| 1.7.1 HEV 抗原表位分析 |
| 1.7.2 戊型肝炎的诊断 |
| 1.8 HEV 的培养、复制和表达 |
| 1.8.1 细胞培养体系 |
| 1.8.2 HEV 体外拯救 |
| 1.8.3 复制与表达 |
| 1.9 HEV 的预防 |
| 第二篇 研究内容 |
| 第1章 基因Ⅳ型HEV real-time RT-PCR方法的建立 |
| 1.1 材料与方法 |
| 1.2 结果 |
| 1.3 讨论 |
| 1.4 小结 |
| 第2 章 HEV CH-S-1 株抗原表位基因的筛选及其克隆与鉴定 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 第3章 HEV抗原表位基因在毕赤酵母中的分泌表达及鉴定 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
| 致谢 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
四、用连续长片段RT-PCR扩增HCV结构基因（论文参考文献）
- [1]云南地区艾滋病患者中预存耐药基因流行特征及HIV-1新重组型的命名[D]. 高庆华. 昆明理工大学, 2021(02)
- [2]HIV-1病毒Nef蛋白抑制剂的筛选及其作用机制研究[D]. 张旭. 广州医科大学, 2020(01)
- [3]蓝果忍冬花色苷合成bHLH转录因子筛选及LcTT8功能验证[D]. 刘化禹. 东北农业大学, 2019(09)
- [4]丹参miRNA对连作障碍的响应及其在次生代谢调控中的作用研究[D]. 张海花. 西北农林科技大学, 2019(08)
- [5]美洲型、欧洲型PRRSV及PCV2基因工程疫苗构建及实验免疫研究[D]. 任静强. 吉林大学, 2014(09)
- [6]杨树phi GST基因家族的功能分化研究[D]. 韩学敏. 北京林业大学, 2014(01)
- [7]新型抗生素Bagremycin生物合成基因的相关研究[D]. 朱云霞. 华东理工大学, 2014(06)
- [8]利用减毒鼠沙门氏菌构建口服狂犬病疫苗的研究[D]. 郭恒. 吉林大学, 2011(05)
- [9]羊痘病毒P32基因与羊CD58基因共表达质粒的构建及其表达产物免疫活性分析[D]. 芦晓立. 甘肃农业大学, 2010(02)
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