一、L-海因酶与D-海因酶的序列及结构比较研究（论文文献综述）
谢露露[1]（2021）在《利用Tag-Catcher构建自组装双酶复合物高效制备D-氨基酸》文中认为氨基酸以不同的手型为分类依据,可分为D型和L型。D-氨基酸最初被认为是非天然且无用的氨基酸,但是随着科技的发展,D-氨基酸的应用越来越广泛。生物酶法制备D-氨基酸的方法已经成为重点研究方向。本实验室利用已构建一菌两酶（D-海因酶和N-氨甲酰-D-氨基酸酰胺水解酶）法制备D-氨基酸,但其被N-氨甲酰-D-氨基酸酰胺水解酶（CAB）的酶活和稳定性所限制。若想优化现有工艺,则需采取提高CAB的活力与稳定性以及降低中间产物的扩散效应等手段。本文通过对CAB抗氧化相关位点:M5L,M31L,M239L,M244L;增溶相关位点:A18E,Y30D,K34E以及耐热相关位点:Q12L,Q23L,Q207E,H58Y,P204E,V237A,N242G,H248Q,T262A,T263S,E266D,T271I,A273P采用定向组合突变的办法,对CAB进行优化,人工合成其突变基因cab（ATO）序列。将cab（ATO）克隆至E.coli BL21（DE3）进行重组表达后发现同原始序列相比,其可溶性表达提高了17%,酶活提高了127%,并且抗氧化性和耐热性均有显着提高。源自于酿脓链球菌S.pyogenes纤连蛋白的SpyTag肽段和SpyCatcher肽段被证实可以自发形成异肽键。可利用这一特性制备自组装多酶复合物。为了研究SpyTag/SpyCatcher标签是否会对酶活产生影响,我们将SpyTag和SpyCatcher分别融合到D-海因酶的N端和C端得到SPT-SL-HYD-LL-SPC,将SnoopTag和SpyCatcher分别融合到D-海因酶的N端和C端得到SNT-SL-HYD-LL-SPC。SDS-PAGE分析表明,SPT-SL-HYD-LL-SPC中的SpyTag与SpyCatcher之间在细胞内自发形成了异肽键,得到了稳定的环化蛋白。SPT-SL-HYD-LL-SPC的表观分子量为66kDa,略小于未环化的SNT-SL-HYD-LL-SPC（71k Da）。两种海因酶的底物特异性都发生了改变且两者的酶活分别降低了77%和71%。虽然此次重组使得海因酶的酶活有一定的损失,但由于在一菌两酶系统中D-海因酶的活力要远高于CAB,因此该酶活的变化对一菌两酶工艺的转化效率并无影响。在上述实验基础上,我们分别构建表达了N端带有His-SpyTag标签和His-SnoopTag标签的重组D-海因酶SPT-SL-HYD和SNP-SL-HYD以及C端融合有SpyCatcher-His标签的CAB（ATO）重组酶CAB（ATO）-LL-SPC。结果显示D-海因酶和CAB（ATO）在胞内自组装形成双酶复合物后相比无胞内自组装的一菌两酶系统菌体活力高了35%,且比原有的工艺高了1.62倍。经过镍柱亲和纯化后,分别制备蛋白SPT-SL-HYD、SNT-SL-HYD和CAB（ATO）-LL-SPC。将CAB（ATO）-LL-SPC分别与SPT-SL-HYD、SNT-SL-HYD等摩尔混合,在42℃时自组装效率最高。实验表明,CAB（ATO）-LL-SPC与SPT-SL-HYD形成了双酶复合物,而与SNT-SL-HYD则没有。通过比较双酶复合物CAB（ATO）-LL-SPC-SPT-SL-HYD和无自组装双酶混合物CAB（ATO）-LL-SPC/SNT-SL-HYD的酶活与稳定性,发现双酶复合物的酶活比无自组装双酶混合物高了31%,且稳定性更佳。
刘亚菲[2]（2020）在《D-氨甲酰水解酶的挖掘改造，结构解析及催化机制研究》文中进行了进一步梳理D-氨基酸作为一种重要的手性平台化合物,广泛应用于医药,食品及农业等行业。海因酶过程是一个由海因消旋酶,D/L-海因酶以及D/L-氨甲酰水解酶组成的级联反应,是一种高效、经济且绿色的合成手性氨基酸的方法。目前,在海因酶过程的应用中,存在D-氨甲酰水解酶的酶活性低和稳定性差等问题,限制了其工业应用。为获得具有高催化活力和稳定性的D-氨甲酰水解酶,本研究通过基因数据库挖掘筛选获得分别来源于Arthrobacter crystallopoietes CGMCC 1.1926和Nitratireductor indicus CGMCC 1.10953的具有较高酶活力和稳定性的D-氨甲酰水解酶,AcHyuC和NiHyuC,并应用于海因酶过程的构建及优化。为进一步提高氨甲酰水解酶的催化效率,以NiHyuC为主要研究对象,对其进行催化活性改造,晶体结构解析及催化机制研究。主要结论如下:（1）D-氨甲酰水解酶的基因挖掘与酶学性质表征:AcHyuC和NiHyuC对底物N-氨甲酰-D-色氨酸（3a）的比活力分别为0.84和1.94 U·mg–1,均为非金属离子依赖的D-氨甲酰水解酶。最适p H分别为p H 8.5和p H 8.0,最适温度为30°C和35°C,在30°C的t1/2为12 h和72 h,且均对具有大位阻的N-氨甲酰氨基酸底物表现出偏好性。其中,AcHyuC对3a的kcat为39.5 min–1,Km为1.4 m M,kcat/Km为30.4 min–1·m M–1,NiHyuC对3a的kcat为209.9 min–1,Km为8.9 m M,kcat/Km值为25.7 min–1·m M–1。（2）构建了海因酶过程级联反应:将AcHyuC和NiHyuC分别与来源于Arthrobacter aurescens DSM 3747的海因消旋酶（Aa Hyu A）和来源于Agrobacterium tumefaciens BQL9的D-海因酶（At Hyu H）串联构建级联反应。在0.5 L反应体系中,添加10 k U·L–1Aa Hyu A、5 k U·L–1At Hyu H和10 k U·L–1AcHyuC催化80 m M L-吲哚甲基海因（1a）,24 h时D-色氨酸（D-Trp）得率为98.4%,时空产率为36.6 g·L–1·d–1。级联反应Aa Hyu A/At Hyu H/AcHyuC和Aa Hyu A/At Hyu H/NiHyuC催化100 m M 1a,24 h时的产物得率分别为81.4%和79.1%。为进一步提高级联反应的反应性能,选取了具有更高比活力和稳定性的NiHyuC进行催化效率改造。（3）NiHyuC野生型晶体结构解析及其分子改造:通过蛋白质结晶获得WT（2.80?）的晶体结构,通过随机突变和基于晶体结构的半理性设计对NiHyuC进行改造。基于九个单突变体,通过组合突变获得最优突变体M4（D187N/A200N/S207A/R211G）。M4的kcat/Km为1135.0 min–1·m M–1,是WT的44.2倍;Km值为0.4 m M,是WT的4.5%。在0.5 L反应体系中,添加10 k U·L–1Aa Hyu A,10 k U·L–1At Hyu H和60 k U·L–1 NiHyuC催化160 m M 1a,在12 h时D-Trp得率为99.3%,时空产率为64.9 g·L–1·d–1。（4）NiHyuC突变酶晶体结构与催化机制解析:通过蛋白质结晶获得突变体R211G（2.37?）、M3-1（2.70?）和M4（2.14?）的晶体结构。基于晶体结构和分子动力学模拟揭示了loop 200–207在调控底物通道中的重要作用:M4中loop 200–207的灵活性增强且向外摆动,有利于底物进入催化中心。通过预反应状态模型和结合自由能计算证明M4与底物3a更易处于预反应状态,且具有较低的结合自由能,解释了其催化效率提高和Km值降低的原因。
张丹平[3]（2020）在《多酶级联催化L-氨基酸立体异构反转合成D-氨基酸》文中指出D-氨基酸是医药和精细化学品中的一种重要手性砌块,常用于合成β-内酰胺类抗生素,生育类药物,抗凝剂和农药。因此,对D-氨基酸的生物合成方法进行研究具有重大的意义。利用海因酶过程、酶法拆分、酶水解以及酶不对称催化潜手性底物等生物方法可以合成D-氨基酸。但是这些方法需要特定的底物,并且底物昂贵不易获得,不适用于工业化的生产。因此,建立一种通用的生物方法从廉价易得的前体出发合成D-氨基酸是具有挑战性的。设计多酶级联的生物催化路线,从廉价易得的起始底物出发,一锅法合成相应的D-氨基酸具有催化成本低,催化效率高,节省操作准备步骤和资源等优点。本论文设计和优化了一条包含氧化脱氨模块（L-氨基酸脱氨酶）和还原氨化模块（D-氨基酸脱氢酶）的级联催化路线,催化廉价易得的L-氨基酸立体异构反转合成D-氨基酸。并利用体外级联和体内级联两种级联催化方式逐步提高级联催化反应的催化效率,实现多种天然和非天然D-氨基酸的合成。主要研究结果如下:（1）基于多酶级联催化,设计了一条包含氧化脱氨模块和还原氨化模块的级联催化路线,催化L-氨基酸立体异构反转合成D-氨基酸。以底物和产物为目标导向,通过文献检索和基因挖掘筛选,确定组成各催化模块的生物催化剂分别为Pm LAAD（氧化脱氨模块,来源于Proteus mirabilis的L-氨基酸脱氨酶）、St DAPDH/H227V（还原加氨模块,来源于Symbiobacterium thermophilum的二氨基庚二酸脱氢酶）和Bs FDH（辅酶循环,来源于Burkholderia stabilis的甲酸脱氢酶）。并对各模块的催化性质进行探究,评价所选催化剂的最适催化条件。Pm LAAD全细胞催化剂在Tris-HCl缓冲溶液（50 m M,p H 7.0-10.0）和45℃下活性更高,最适全细胞催化剂浓度为80 mg/m L。St DAPDH/H227V对苯丙酮酸（PPA）的酶活为0.46 U/mg,kcat值为1.13 s-1。p H值为9.5时St DAPDH/H227V酶活最高,在37-45℃时酶能够保持较高的活性,催化30 m M的PPA,6 h后转化率为100%,产物ee值大于99%。当p H值为7.5,温度为45℃时,Bs FDH酶活最高为2.89U/mg。与St DAPDH/H227V级联组成辅因子循环系统,能够以NADP+作为辅因子而不影响催化效率。并且,Pm LAAD和St DAPDH/H227V在催化过程中无副产物产生,反应始终向产物生成的方向进行。因此,所选择的催化剂能够用于级联催化路线各模块的组装。（2）将氧化脱氨模块、还原氨化模块和辅酶循环系统进行组装,构建了Pm LAAD-St DAPDH/H227V-Bs FDH体外级联催化体系。为了提高级联催化系统的催化效率,对级联催化反应的最适反应条件进行探索。体外级联催化系统的最适催化条件为50 m M Tris-HCl缓冲（p H 9.0）,温度30℃。当Pm LAAD全细胞催化剂浓度为40 mg/m L,St DAPDH/H227V的浓度为4.5 mg/m L,Bs FDH的浓度为0.35 mg/m L时,体外级联催化系统能够催化80 m M的L-苯丙氨酸（L-Phe）完全立体异构反转合成D-苯丙氨酸（D-Phe）,转化率以及光学纯度均可达到100%。此外,该级联催化路线能够高效催化多种天然和非天然的L-氨基酸立体异构反转合成相应的D-氨基酸,如L-Phe、L-高苯丙氨酸、2-氯-L-苯丙氨酸、3-氯-L-苯丙氨酸、L-谷氨酸和L-正缬氨酸。（3）为促进Pm LAAD的蛋白的可溶性表达,提高其整体催化效率,对膜蛋白Pm LAAD的可溶性表达进行了研究。通过与麦芽糖结合蛋白（MBP）标签的融合表达,Pm LAAD成功的解除了膜结合状态,并实现了可溶性活性表达。随后对Pm LAAD粗酶液、MBP-Pm LAAD粗酶液、MBP-Pm LAAD纯酶、Pm LAAD纯酶的酶活进行分析。以L-Phe为底物时,MBP-Pm LAAD纯酶的酶活最低为0.025μmol/（mg Pm LAAD·min）,MBP-Pm LAAD粗酶液的酶活最高为0.17μmol/（mg Pm LAAD·min）,是Pm LAAD粗酶液酶活的2.2倍。对MBP-Pm LAAD的催化特性进行分析发现,酶的最适催化条件为37℃和p H 8.5,在此条件下存储10 h酶活仍保持稳定,并且外源添加FAD对酶活无影响。与MBP标签融合后,MBP-Pm LAAD粗酶液的活性远高于膜结合的Pm LAAD全细胞。MBP-Pm LAAD粗酶液能够催化100 m M的底物L-Phe在6 h内完全转化为PPA。因此MBP不仅能够促进膜蛋白Pm LAAD的可溶性表达,同时能够促进其催化活性的提高。（4）设计和构建了包含Pm LAAD、St DAPDH/H227V和Bs FDH的体内级联细胞工厂。为了构建体内级联系统,评估了三种调节酶表达水平的策略,分别为单质粒多基因共表达策略、双质粒多基因共表达策略和双质粒MBP融合的多基因共表达策略。通过探究表达条件对共表达菌株蛋白表达以及催化活性的影响,筛选出具有最高催化效率的双质粒MBP融合共表达菌株E.coli p ET-21a-MBP-pmlaad/p ET-28a-stdapdh/H227V-bsfdh。随后对最适催化条件进行探究,在最佳条件下,75 mg/m L的E.coli p ET-21a-MBP-pmlaad/p ET-28a-stdapdh/H227V-bsfdh全细胞催化剂,通过添加0.1倍底物浓度的NADP+和2倍底物浓度的甲酸铵能够催化150m M的L-Phe完全转化为D-Phe,24 h产率和光学纯度可达99%以上,与体外级联催化体系相比,底物浓度提高了1.9倍。此外,利用体内级联细胞工厂能够高效地将多种廉价易得的芳香族和脂肪族L-氨基酸（如L-酪氨酸、L-Phe、L-高苯丙氨酸、2-氯-L-苯丙氨酸、3-氯-L-苯丙氨酸、4-氯-L-苯丙氨酸、L-亮氨酸、L-正缬氨酸、L-谷氨酸和L-甲硫氨酸）立体转化为相应的D-氨基酸,转化率为45.3%-100%,光学纯度大于99%。（5）通过100 m L制备级转化实验,进一步验证了本研究所构建的体内多酶级联催化体系合成D-氨基酸的潜力。通过对放大反应条件的优化,E.coli p ET-21a-MBP-pmlaad/p ET-28a-stdapdh/H227V-bsfdh全细胞催化剂在100 m L放大反应规模中能够催化200 m M的底物L-Phe,48 h后产物转化率和光学纯度均达到100%,分离产率为91%。最后通过MS、1H-NMR和13C-NMR对纯化产物进行分析和鉴定,鉴定结果表明产物结构正确,进一步证明了本研究所构建的体内级联细胞工程的准确性和普遍适用性。
马师师[4]（2019）在《两种D-氨基酸的酶法制备工艺研究》文中研究表明氨基酸广泛存在于自然界之中,是构成蛋白质的基本单位,也是人类摄取的重要营养素之一,有D型和L型氨基酸两种异构体,它们在生物体内发挥着不同的生理功能。D-对羟基苯甘氨酸可用于合成β-内酰胺类半合成抗生素,D-缬氨酸是一种重要的有机手性源,主要应用于手性药物、添加剂等领域。本文将探索两种D-氨基酸的酶法生产工艺,为工业化生产提供理论基础。本文首先构建两种海因消旋酶工程菌,其一为从红球菌R04中克隆得到,通过在NCBI网站GenBank中进行序列比对确定该基因为一个新基因;其次对两种D-氨基酸生产工艺进行优化,工程菌HC01发酵过程中选用玉米浆培养基培养,其表达N-氨甲酰-D-氨基酸酰胺水解酶（CAB）的比活力是LB（安琪）培养基的0.6722倍,是LB（Oxide）培养基的1.1860倍,培养基成本分别降低1.33元/L和4.97元/L,D-对羟基苯甘氨酸提取过程中加入适量活性炭可去除反应液颜色,简化了提取步骤,新工艺降低了培养基成本,减少了酸用量、废水排放量等,为工业化生产提供了理论基础;在D-缬氨酸转化过程中使用上述两种海因消旋酶基因工程菌,结果表明当以DL-5’-异丙基海因作为底物时,初始反应只包含工程菌HC01,转化率接近50%后,分别加入两种可表达重组海因消旋酶的基因工程菌,反应速度呈现先降后升的趋势,产率不变,pMAL-s-hyu2/BL21（DE3）工程菌可以使整个酶促反应速度提升12.12%,pRSET-hyu1/BL21（DE3）工程菌可加速18.18%,含海因消旋酶基因工程菌的加入在不影响产率的前提下提高了转化速率;在研究过程中还发现酶促反应中的D-海因酶不仅可以催化海因及其5′-单替代产物制备D-氨基酸,其还具有环酰亚胺水解酶活性。利用含有该D-海因酶基因的工程菌pET3a-hyd/BL21（DE3）分别转化底物为2,3-吡啶二甲酰亚胺（PDI）和邻苯二甲酰亚胺（PI）,利用高效液相色谱检测（HPLC）的方法进行检测,检测条件为HypersilTMM GOLD C18（4.6mm×250 mm,5μm）,流动相为H2O-乙腈（体积比为90:10,含0.1%（体积分数）三氟乙酸）,流速为1 mL/min,PDI及PI反应检测波长分别为254 nm和220 nm,柱温为室温,研究结果显示当底物PDI和PI达到饱和浓度时,测得工程菌pET3a-hyd/BL21（DE3）的比活力分别为0.61U/(mL·10 OD600nm)和0.15 U/(mL·10OD600nm),产物为3-氨基甲酰基-α-吡啶甲酸（3-carbamoyl-α-picolinic acid,α-3-CP）和邻甲酰胺苯甲酸（phthalamic acid,PA）,该研究为今后利用生物法制备复杂半酰胺有机物提供了坚实的理论基础。综上所述,本研究从红球菌R04中克隆得到了一个新的海因消旋酶基因,利用基因重组方法构建得到了能够对其进行可溶表达的基因工程菌,对两种D-氨基酸的酶法生产工艺进行了改进,为D-氨基酸的工业化生产打下坚实的理论基础,并利用HPLC法对D-海因酶的环酰亚胺水解酶活性进行了检测。
李法彬,刘露,杜燕,班睿[5]（2019）在《构建重组枯草芽孢杆菌催化制备D-对羟基苯甘氨酸》文中研究说明目的:在Bacillus subtilis中表达异源D-海因酶基因（hyd）和D-氨甲酰水解酶基因（adc）,构建重组细胞作为催化剂,用于生产D-对羟基苯甘氨酸（D-HPG）。方法:构建hyd表达质粒,考察培养基中二价金属离子对D-海因酶活性的影响。过表达acoR基因,考察AcoR蛋白胞内水平与PacoA-hyd基因拷贝数的关系。筛选表达adc基因的启动子,构建hyd和adc基因共表达质粒,考察双酶活性菌株的催化特性。结果:成功构建了海因酶表达质粒pHPS和pUBS,培养基中添加0. 8mmol/L的MnCl2·4H2O,使168N/pUBS菌株的D-海因酶活性达到956U/gDCW。整合表达Pcdd-acoR基因,使LSL02/pUBS菌株的D-海因酶活性达到1 470U/gDCW。单拷贝PAE-adc基因的表达水平相对最高。双酶共表达质粒pUBSC被成功构建,菌株LSL02/pUBSC的最适催化温度为40℃～45℃,催化活性能够持续12h,当底物起始浓度为20g/L时,反应12h生成的D-HPG达到14. 32g/L,转化率达到95%,收率超过80%。结论:构建具有D-海因酶和D-氨甲酰水解酶双酶活性的重组Bacillus subtilis作为全细胞催化剂,用于海因酶法生产D-HPG,具有技术上的可行性和优势。
李法彬[6]（2018）在《构建重组枯草芽孢杆菌催化合成D-对羟基苯甘氨酸》文中研究指明D-对羟基苯甘氨酸（D-HPG）是生产羟氨苄青霉素、头孢羟氨苄和头孢哌酮等半合成抗生素的中间体,市场需求量大。海因酶法指利用D-海因酶和D-氨甲酰水解酶为催化剂,催化D-对羟基苯海因（D-HPH）经中间物N-氨甲酰基-D-对羟基苯甘氨酸,生成D-HPG的生化反应方法,是最有潜力的D-HPG生产方法。本文研究在Bacillus subtilis中表达异源D-海因酶和D-氨甲酰水解酶,构建具有双酶活性的重组Bacillus subtilis,作为海因酶法生产D-HPG的全细胞催化剂。以Bacillus subtilis 168N为出发菌,用羟基丁酮诱导表达系统,整合表达Bacillus stearothermophilus SD-1的D-海因酶（hyda基因）,构建重组菌株LS10,进而构建了hyda基因表达质粒pHPS和pUBS,以及具有D-海因酶活性的菌株168N/pHPS和168N/pUBS。培养基中的Mn2+显着提高168N/pUBS菌株的D-海因酶活性,用含有0.16 g/L MnCl2·4H2O的LB培养基诱导培养168N/pUBS菌株,其全细胞的D-海因酶活性达到956 U/gDCW。在sigL基因组成型表达背景下,不同程度过表达acoR基因。结果显示,当acoR基因转录水平提高302.33倍,严重降低带有单拷贝hyda基因的LSL13菌株的D-海因酶活性;当acoR基因转录水平提高2.11倍,LSL01/pHPS的D-海因酶活性达到1230 U/gDCW;当acoR基因转录水平提高63.56倍,LSL02/pUBS的D-海因酶活性达到1470 U/gDCW。结果表明,AcoR蛋白的胞内水平影响高拷贝hyda基因的表达。在Bacillus subtilis中,表达来自Agrobacterium sp.KNK712的D-氨甲酰水解酶（adc基因）。启动子筛选和优化结果显示,启动子PAE2的表达水平相对最高。带有adca2基因的LSL04s菌株,经培养基优化后D-氨甲酰水解酶活性达到22.1 U/gDCW;而adca2基因点突变菌株的D-氨甲酰水解酶酶活性均显着下降。高拷贝hyda和adca2基因共表达质粒pUBSC,以及具有双酶活性的菌株LSL02/pUBSC被构建。采用烘焙豆粉和酵母粉作为迟效氮源,诱导培养22 h,使LSL02/pUBSC的全细胞催化活性达到64.6 U/gDCW。在40℃、pH 8.0,底物初始浓度为20 g/L的最适反应条件下,LSL02/pUBSC全细胞催化活性能够持续12 h,使HPH的转化率达到95%,D-HPG产量为14.32 g/L,收率达到82.4%,产率为1.19 g/L/h。
王亚盟[7]（2016）在《异源D-海因酶和N-氨甲酰水解酶共表达重组枯草芽孢杆菌的构建》文中指出D-对羟基苯甘氨酸是半合成β-内酰胺类抗生素的重要原料,海因酶法是普遍采用的D-对羟基苯甘氨酸工业生产方法。海因酶法就是采用D-海因酶和N-氨甲酰水解酶催化D,L-对羟基苯海因,转化为D-对羟基苯甘氨酸的生物化学方法。本文以枯草芽孢杆菌为受体菌,共表达异源的D-海因酶和N-氨甲酰水解酶,作为海因酶法合成D-对羟基苯甘氨酸的全细胞催化剂。本文对于D-海因酶的选择、重组菌的构建和影响全细胞催化活性的一些重要因素进行了研究。采用Paco表达盒诱导表达D-海因酶基因（sd1或hyd）,采用PAE表达盒表达N-氨甲酰水解酶基因（adc）。以质粒pHP13为载体,分别构建PAE-adc-Paco-sd1基因和PAE-adc-Paco-hyd基因共表达质粒pHCY和pHCS。枯草芽孢杆菌168/pHCY和168/pHCS的全细胞催化活性,分别为0.25 U/mL和0.36 U/mL。在枯草芽孢杆菌168N的染色体上,整合表达acoR基因和sigL基因,构建了重组菌株WD-3。qRT-PCR分析显示,WD-3菌株胞内acoR和sigL基因的mRNA水平平均提高了248.2倍和80.7倍,表明acoR和sigL基因在WD-3菌株中被过表达。WD-3/pHCS菌株的全细胞催化活性达到0.56 U/m L,比168/pHCS提高了80%。结果表明,提高激活蛋白AcoR和σL因子的胞内水平,对于维持多拷贝Paco表达盒的正常转录功能是必要的。以pUB110质粒为基础,构建了adc-sd1共表达重组质粒pUCS。WD-3/pUCS全细胞催化活性达到0.98 U/mL,比WD-3/pHCS的0.56 U/mL提高了75%。结果表明,提高adc和sd1基因剂量,对于提高重组菌的全细胞催化活性是有效的。敲除WD-3菌株的sdp和skf基因,构建双缺陷株WD-5。WD-5/pUCS菌株与WD-3/pUCS相比,全细胞催化活性相当;但是在培养体系和催化反应体系中,芽孢量会高一个数量级;在反应体系中,全细胞催化活性的衰减速率显着降低。因此,sdp和skf基因缺陷,虽然导致更多的细胞形成芽孢,但是由于消除了姊妹细胞之间的自相残杀,而有利于全细胞催化活性的维持。敲除WD-5菌株的kinA和kinB基因,构建重组菌WD-7。WD-7/pUCS完全不形成芽孢,同时具有与WD-5/pUCS菌株相当的全细胞催化活性和衰减特征。
李亚东[8]（2016）在《D-对羟基苯甘氨酸生物合成酶的优化及固定化研究》文中指出目的1对海洋沉积物进行系列性筛选,以获得全新来源并具有潜在高性能的海因酶,并提供一种全新的海因酶阳性菌筛选体系和一种全新的酶优化手段。2构建快速筛选模型,筛选性能更优的海因酶突变体,并为同类酶的优化提供依据。3对海因酶工程菌进行固定化研究,获得全细胞固定海因酶产生菌的最优配方,为D-对羟基苯甘氨酸的工业化生产奠定基础。方法1以实验室保存的链霉菌库为筛选对象,利用唯一氮源法、双层琼脂法、微孔快速筛选法和分子生物学筛选法对其进行系列性筛选,获得可表达海因酶的阳性链霉菌;从筛选获得阳性菌中扩增目的片段,分析基因序列并进行工程菌构建;测定海因酶的酶活和动力学参数;利用Swiss-model在线软件对海因酶进行在线同源建模和Caver Analyst软件对其的催化通道进行结构模拟分析;2利用易错PCR构建海因酶突变库;构建快速筛选模型进行突变酶筛选;对突变酶的酶学性质进行测定;3利用海藻酸钠作为固定载体,对海因酶工程菌进行全细胞固定化研究;优化海藻酸钠浓度、硅藻土浓度、戊二醛浓度、Ca Cl2浓度和Mn Cl2浓度;测定固定化小球的最适直径和最适添加浓度;测定固定化全细胞小球的批次实验次数;测定固定化全细胞小球的机械强度。结果1筛选获得四株阳性菌,分别命名为S1、S14、S29和S145菌株,随后对不同菌株来源的海因酶的酶动力学参数进行测定,结果显示,S145菌株来源的海因酶活性最高,为9.7 U/mg,催化动力学常数Kcat=3.2×10-6/s,Km=9.5 mmol/L;海因酶结构的同源模建和催化通道模拟分析,结果显示其主要催化通道Tunnel1长度为9.1?,瓶颈氨基酸残基为50位的组氨酸、181位的组氨酸和313位的谷氨酸,瓶颈半径为2.18?;潜在催化通道Tunnel2长度为13.6?,瓶颈氨基酸为62位的苏氨酸、93位的天冬酰胺和107位的色氨酸,瓶颈半径为1.52?;2筛选出七株阳性突变菌,突变位点主要集中在181位和286位;181位突变菌的酶活为11.5 U/mg,对产物的耐受力提高10%;286位突变菌的酶活为11.0 U/mg,对底物的耐受力提高11%;3获得固定化细胞的最优配方为:3.0%海藻酸钠、1.5%硅藻土、0.05%Ca Cl2和1.0 m M Mn Cl2;固定化小球最适直径位2.6 mm,所占浓度最适为20%;固定化全细胞小球可重复使用12批次,其催化生产产物的产率为88%以上。结论1开发了一种海因酶系列筛选策略,获得潜在的酶优化位点,为后期酶的优化提供理论基础;2筛选获得了性能更优的突变海因酶;3制备了高性能固定化细胞的固定化配方,从而为酶法工业生产D-对羟基苯甘氨酸成为可能。
李亚东,汪康游,樊帅,杨兆勇,田喜凤,许乐幸,金媛媛[9]（2016）在《海洋来源的D-海因酶产生菌的分离及酶催化通道模拟分析》文中研究指明为获取全新来源并具有潜在高性能的海因酶,本研究通过对海洋沉积物进行以D-对羟基苯海因作为唯一氮源的选择培养基对潜在菌株进行初步筛选,然后通过双层琼脂法和微孔快速筛选法对初筛菌株进行复筛,并结合分子生物学筛选方法进行终筛,最终得到桔橙小单胞菌（Micromonospora aurantiaca,Gen Bank登录号:FJ547135.1）、金色链霉菌（Streptomyces aureofaciens,Gen Bank登录号:AB326923.1）、桑氏链霉菌（Streptomyces sampsonii,Gen Bank登录号:GU238264.1）和链霉菌7-145（Streptomyces sp.7-145,Gen Bank登录号:JQ782979.2）4株产D-海因酶的阳性链霉菌。用兼并引物扩增4株阳性菌中的D-海因酶表达序列,转化大肠杆菌（Escherichia coli）,并构建表达相应D-海因酶的工程菌株E.coli S1、E.coli S14、E.coli S29和E.coli S145,提纯4种D-海因酶,并测定酶的酶活和动力学参数。结果显示,链霉菌7-145菌株中表达的海因酶活性最高,比活力为9.7 U/mg,催化速度常数Kcat=3.2×10-6/s,Km=9.5 mmol/L。最后利用Swiss-model软件对其进行在线同源模建和Caver Analyst软件对链霉菌7-145菌株来源的海因酶的催化通道进行结构模拟分析。模拟分析结果显示,本研究中D-海因酶的主要催化通道Tunnel1长度为9.1?,瓶颈氨基酸残基为59位的组氨酸、181位的组氨酸和313位的谷氨酸,瓶颈半径为2.18?;潜在的催化通道Tunnel2长度为13.6?,瓶颈氨基酸为62位的苏氨酸、93位的天冬酰胺和107位的色氨酸,瓶颈半径为1.52?。如果对Tunnel2通道中的62位的苏氨酸、93位的天冬酰胺和107位的色氨酸进行定点突变,有望开发出一种性能更优的D-海因酶。本研究提供了一种全新的海因酶阳性菌筛选体系,通过计算机模拟手段能够更直观了解海因酶的催化机制,为进一步获得性能更优的海因酶奠定基础。
佘雪莲[10]（2009）在《芽孢杆菌MV0658海因氧化酶基因B的克隆及表达研究》文中提出以本实验室保存的一株地衣芽孢杆菌MV0658的染色体DNA为模板,设计一对引物,通过PCR方法,获得一段与Bacillus lichenformis ATCC14580中Hydantoin utilization protein B基因相同的特异性扩增主带。分离纯化后,与pUC19载体通过T4 DNA连接酶平端连接,CaCl2转化法转化大肠杆菌（E.coli）JM109。经α-互补实验筛选出阳性菌落,通过对重组菌株的质粒分离纯化,限制性酶酶切和测序等一系列鉴定实验,得到六个重组质粒,分别命名为pMV1000- pMV1005,均含有地衣芽孢杆菌Hydantoin utilization protein B的PCR扩增片段。其中,pMV1000与pMV1001为正向插入,pMV1002、pMV1003、pMV1004为反向插入。我们将重组子pMV1000进行测序,并把克隆到的基因片段命名为海因氧化酶（HyuQ）。用测序后的序列在NCBI的GenBank中搜索,采用Blast、ClustalW软件进行核苷酸序列、氨基酸序列分析及同源性比较。结果表明该基因全长1740bp,编码579个氨基酸,G+C含量为51.72%,理论分子量为63KD,理论等电点为5.49,其中疏水性氨基酸占35.8%。将目的片段从pMV1000中分离出来,与表达载体pET28a连接后转化大肠杆菌Rostta,经过菌落PCR验证和一系列酶切鉴定实验,表明重组质粒pMV1006中含有PCR扩增片段,且为正向插入。加入IPTG进行诱导表达,得到预期大小的HyuQ基因表达蛋白。将HyuQ核苷酸序列与Bacillus lichenformis ATCC14580中Hydantoin utilization protein B核苷酸序列进行同源性比对,发现在HyuQ核苷酸序列的1740bp中有8个核苷酸发生改变,其中5个核苷酸发生转换,3个核苷酸发生颠换,两个序列相同性达99%;又将HyuQ推测的氨基酸序列与Bacillus lichenformis ATCC14580中Hydantoin utilization protein B（YP079153.1）氨基酸序列进行同源性比对,发现在HyuQ推测的氨基酸序列中有6个位置发生了改变,序列相同性达99%。利用生物信息学软件对HyuQ推测的氨基酸进行结构分析及功能预测,结果表明在64-72位, 293-299位, 339-343位,411-417位氨基酸处有4个较明显的疏水性区域;在第22、76、540和570个氨基酸处有较强的形成α螺旋的倾向,在第55、265、380和468个氨基酸处有较强的形成β折叠片的倾向,有较多随机螺旋结构;HyuQ推测的氨基酸序列无N端信号肽,不形成跨膜结构;并对其氨基酸进行了三级结构的预测。
二、L-海因酶与D-海因酶的序列及结构比较研究（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、L-海因酶与D-海因酶的序列及结构比较研究（论文提纲范文）
（1）利用Tag-Catcher构建自组装双酶复合物高效制备D-氨基酸（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 综述 |
| 1.1 D-氨基酸 |
| 1.1.1 D-氨基酸概述 |
| 1.1.2 D-氨基酸的制备 |
| 1.2 多酶复合物 |
| 1.2.1 多酶复合物的简介 |
| 1.2.2 多酶复合物的组装策略 |
| 1.2.3 多酶复合物自组装 |
| 1.3 SpyTag/SpyCatcher 体系与SnoopTag/SnoopCatcher 体系 |
| 1.3.1 异肽键分子粘合剂 |
| 1.3.2 SpyTag/SpyCatcher 体系与SnoopTag/SnoopCatcher 体系的简介 |
| 1.3.3 SpyTag/SpyCatcher体系与SnoopTag/SnoopCatcher体系的应用 |
| 1.4 本论文研究的目的及意义 |
| 第二章 N-氨甲酰-D-氨基酸酰胺水解酶(CAB)的重组表达及酶活分析 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 实验材料 |
| 2.2.1 仪器与试剂 |
| 2.2.2 质粒与菌株 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 CAB(ATO)的合成 |
| 2.3.2 酶活检测底物的制备 |
| 2.3.3 CAB(ATO)的酶活 |
| 2.3.4 CAB(ATO)的性质 |
| 2.4 结果与分析 |
| 2.4.1 CAB(ATO)的合成 |
| 2.4.2 酶活分析 |
| 2.4.3 CAB(ATO)的性质 |
| 2.5 讨论 |
| 第三章 D-海因酶(HYD)的重组表达与性质研究 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 实验材料 |
| 3.2.1 仪器 |
| 3.2.2 质粒与菌株 |
| 3.2.3 酶和试剂 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 重组D-海因酶质粒的构建 |
| 3.3.2 重组D-海因酶的诱导表达与纯化 |
| 3.3.3 重组D-海因酶的酶活 |
| 3.3.4 重组D-海因酶的性质分析 |
| 3.4 结果与分析 |
| 3.4.1 重组质粒的构建 |
| 3.4.2 重组质粒的表达与纯化 |
| 3.4.3 重组D-海因酶的酶活 |
| 3.4.4 重组D-海因酶的性质变化 |
| 3.5 讨论 |
| 第四章 体内与体外双酶复合物组装的表达纯化及性质分析 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 实验材料 |
| 4.2.1 仪器 |
| 4.2.2 质粒与菌株 |
| 4.2.3 酶和试剂 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 重组D-海因酶和重组CAB的构建 |
| 4.3.2 重组D-海因酶和CAB(ATO)的诱导表达 |
| 4.3.3 重组D-海因酶和CAB(ATO)的纯化 |
| 4.3.4 酶活检测 |
| 4.3.5 自组装双酶复合物的胞外构建 |
| 4.3.6 自组装双酶复合物的性质分析 |
| 4.4 结果与分析 |
| 4.4.1 重组质粒的构建 |
| 4.4.2 重组D-海因酶、重组CAB、共转化双酶的表达与纯化 |
| 4.4.3 重组D-海因酶、重组CAB、共转化双酶的酶活 |
| 4.4.4 自组装双酶复合物的胞外构建 |
| 4.4.5 自组装双酶复合物的性质分析 |
| 4.5 讨论 |
| 参考文献 |
| 缩略词表 |
| 攻读学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
| 个人简况及联系方式 |
（2）D-氨甲酰水解酶的挖掘改造，结构解析及催化机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 D-氨基酸的应用及研究进展 |
| 1.1.1 D-氨基酸的分布及应用 |
| 1.1.2 D-氨基酸的生物合成方法 |
| 1.1.3 D-色氨酸的研究进展及应用 |
| 1.2 D-氨甲酰水解酶 |
| 1.2.1 D-氨甲酰水解酶的性质和结构 |
| 1.2.2 D-氨甲酰水解酶的反应机理 |
| 1.2.3 D-氨甲酰水解酶的分子改造 |
| 1.3 蛋白质结晶 |
| 1.3.1 X射线衍射技术的原理 |
| 1.3.2 蛋白质结晶的原理 |
| 1.3.3 蛋白质结晶技术 |
| 1.3.4 晶体解析方法 |
| 1.4 计算机模拟 |
| 1.4.1 分子对接 |
| 1.4.2 分子动力学模拟 |
| 1.4.3 预反应状态 |
| 1.5 本课题立题依据及主要研究内容 |
| 1.5.1 研究目的及意义 |
| 1.5.2 主要研究内容 |
| 第二章 D-氨甲酰水解酶的基因挖掘与克隆表达 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 实验材料 |
| 2.2.2 实验仪器 |
| 2.2.3 N-氨甲酰-L-色氨酸及L-吲哚甲基海因的合成方法 |
| 2.2.4 底物配制及反相液相检测条件 |
| 2.2.5 底物配制及正相液相方法检测条件 |
| 2.2.6 基因数据库筛选方法 |
| 2.2.7 野生菌基因组提取方法 |
| 2.2.8 重组菌的构建 |
| 2.2.9 重组菌的发酵产酶 |
| 2.2.10 D-氨甲酰水解酶的酶活力测定方法 |
| 2.2.11 标准曲线的绘制 |
| 2.2.12 D-氨甲酰水解酶的重力柱蛋白纯化 |
| 2.2.13 D-氨甲酰水解酶的酶学性质表征 |
| 2.2.14 D-氨甲酰水解酶的动力学参数测定 |
| 2.3 结果与讨论 |
| 2.3.1 底物L-吲哚甲基海因及N-氨甲酰-L-色氨酸的液相检测 |
| 2.3.2 海因底物的正相检测条件 |
| 2.3.3 D-氨甲酰水解酶的克隆与表达 |
| 2.3.4 D-氨甲酰水解酶酶活力的测定 |
| 2.3.5 D-氨甲酰水解酶的亲和层析重力柱纯化 |
| 2.3.6 D-氨甲酰水解酶的选择性分析 |
| 2.3.7 D-氨甲酰水解酶的酶学性质表征 |
| 2.3.8 D-氨甲酰水解酶的底物谱测定 |
| 2.3.9 D-氨甲酰水解酶的动力学参数测定 |
| 2.4 本章小结 |
| 第三章 海因酶过程级联反应的构建与优化 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 实验材料 |
| 3.2.2 实验仪器 |
| 3.2.3 获取海因消旋酶与海因酶 |
| 3.2.4 AaHyuA的酶活力测定方法 |
| 3.2.5 AaHyuA的酶学性质表征及动力学参数测定 |
| 3.2.6 AtHyuH的酶活力测定方法 |
| 3.2.7 AtHyuH的酶学性质表征及动力学参数测定 |
| 3.2.8 制备冻干酶粉 |
| 3.2.9 优化级联反应的最适pH |
| 3.2.10 单酶添加量优化及级联反应的验证 |
| 3.2.11 级联反应的优化 |
| 3.2.12 级联反应放大反应制备D-Trp |
| 3.3 结果与讨论 |
| 3.3.1 海因消旋酶(AaHyuA)与海因酶(AtHyuH)的重组表达 |
| 3.3.2 AAHYUA的酶学性质表征及动力学参数测定 |
| 3.3.3 ATHYUH的酶学性质表征及动力学参数测定 |
| 3.3.4 重组菌E.coli BL21(DE3)/pET28a-Athyuh发酵制备AtHyuH |
| 3.3.5 重组菌E.coli BL21(DE3)/pET20b-Aahyua发酵制备AaHyuA |
| 3.3.6 上罐发酵E.coli BL21(DE3)/pET28a-Achyuc |
| 3.3.7 上罐发酵E.coli BL21(DE3)/pET28a-Nihyuc |
| 3.3.8 级联反应的最适PH和助溶剂 |
| 3.3.9 优化单酶添加量 |
| 3.3.10 优化底物浓度与酶添加量 |
| 3.3.11 优化反应转速及反应温度 |
| 3.3.12 探究级联反应转化受阻的原因 |
| 3.3.13 克级制备D-Trp |
| 3.4 本章小结 |
| 第四章 随机突变及半理性设计提高NiHyuC催化效率 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 实验材料 |
| 4.2.2 实验仪器 |
| 4.2.3 构建高通量筛选方法 |
| 4.2.4 构建随机突变文库 |
| 4.2.5 基于晶体结构的半理性设计 |
| 4.2.6 测定突变体的动力学参数 |
| 4.2.7 验证突变体用于级联反应的转化效果 |
| 4.2.8 构建迭代组合突变库 |
| 4.2.9 突变体M4温度稳定性的测定 |
| 4.2.10 突变体M4的底物谱测定 |
| 4.2.11 突变体M4的放大反应 |
| 4.3 结果与讨论 |
| 4.3.1 验证高通量筛选方法 |
| 4.3.2 优化96孔板筛选条件 |
| 4.3.3 随机突变文库的筛选结果 |
| 4.3.4 NiHyuC的蛋白质纯化 |
| 4.3.5 NiHyuC的晶体培养 |
| 4.3.6 NiHyuC的结构解析与分析 |
| 4.3.7 基于晶体结构和MD进行突变位点选取与筛选 |
| 4.3.8 迭代组合突变筛选结果 |
| 4.3.9 突变体应用于级联反应催化200mM1a效果的比较 |
| 4.3.10 M4应用于级联反应的优化 |
| 4.3.11 M4的温度稳定性测定 |
| 4.3.12 M4的底物谱测定 |
| 4.3.13 M4应用于海因酶过程放大反应制备D-Trp |
| 4.4 本章小结 |
| 第五章 NiHyuC突变体的晶体结构与机制解析 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 材料与方法 |
| 5.2.1 实验材料 |
| 5.2.2 实验仪器 |
| 5.2.3 突变体的培养与蛋白质纯化 |
| 5.2.4 突变体的晶体培养与筛选 |
| 5.2.5 突变体的晶体捞取与X-射线衍射 |
| 5.2.6 突变体的晶体解析与精修 |
| 5.2.7 分子对接 |
| 5.2.8 预反应状态(Pre-reaction states,PRS) |
| 5.2.9 结合自由能计算 |
| 5.3 结果与讨论 |
| 5.3.1 突变体R211G、M3-1和M4的镍柱与凝胶柱纯化 |
| 5.3.2 突变体的晶体培养与条件优化 |
| 5.3.3 防冻液的优化 |
| 5.3.4 突变体的X射线衍射与晶体结构解析 |
| 5.3.5 突变体的晶体结构分析与机制猜想 |
| 5.3.6 WT和M4的预反应状态分析统计 |
| 5.3.7 WT和M4与底物的3a的结合稳定性分析 |
| 5.3.8 结合结构解释M4底物专一性提高的原因 |
| 5.4 本章小结 |
| 主要结论与展望 |
| 主要结论 |
| 展望 |
| 论文主要创新点 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录A:图表 |
| 附录B:作者在攻读博士期间发表的论文 |
（3）多酶级联催化L-氨基酸立体异构反转合成D-氨基酸（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 D-氨基酸概述 |
| 1.1.1 D-氨基酸的分布 |
| 1.1.2 D-氨基酸的工业应用 |
| 1.2 D-氨基酸的合成方法 |
| 1.2.1 化学法合成D-氨基酸 |
| 1.2.2 生物发酵法生产D-氨基酸 |
| 1.2.3 酶水解酰胺和肽生产D-氨基酸 |
| 1.2.4 海因酶过程催化合成D-氨基酸 |
| 1.2.5 酶法手性拆分外消旋体合成D-氨基酸 |
| 1.2.6 酶催化潜手性底物合成相应的D-氨基酸 |
| 1.3 多酶级联催化研究进展 |
| 1.3.1 多酶级联反应简介 |
| 1.3.2 多酶级联催化体系的设计原则 |
| 1.3.3 体外多酶级联催化 |
| 1.3.4 多酶体内级联催化 |
| 1.3.5 多酶催化合成D-氨基酸研究进展 |
| 1.4 L-氨基酸脱氨酶研究进展 |
| 1.5 meso-二氨基庚二酸脱氢酶(meso-DAPDH)的研究进展 |
| 1.6 本研究的目的和意义 |
| 1.7 主要研究内容 |
| 第二章 L-氨基酸立体异构反转体外多酶级联催化体系的设计与模块构建 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 菌株与质粒 |
| 2.2.2 试剂和仪器 |
| 2.2.3 培养基与溶液 |
| 2.2.4 重组菌株构建 |
| 2.2.5 重组质粒测序验证 |
| 2.2.6 重组菌株的蛋白表达 |
| 2.2.7 重组蛋白的纯化 |
| 2.2.8 酶活及动力学参数测定 |
| 2.2.9 PPA浓度检测 |
| 2.2.10 D,L-Phe检测方法 |
| 2.2.11 催化剂形式和反应条件对Pm LAAD催化效率的影响 |
| 2.2.12 单步催化反应 |
| 2.3 结果与讨论 |
| 2.3.1 体外多酶级联催化路线设计 |
| 2.3.2 氧化脱氨模块的设计与构建 |
| 2.3.3 PmLAAD催化特性研究 |
| 2.3.4 还原氨化模块的设计与构建 |
| 2.3.5 DAPDH的筛选 |
| 2.3.6 St DAPDH/H227V催化特性的研究 |
| 2.3.7 辅酶循环系统构建 |
| 2.4 本章小结 |
| 第三章 体外多酶级联催化体系组装合成D-氨基酸 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 试剂和仪器 |
| 3.2.2 菌株培养 |
| 3.2.3 蛋白纯化 |
| 3.2.4 体外级联催化路线组装 |
| 3.2.5 pH值和温度对级联催化反应的影响 |
| 3.2.6 级联催化反应中各催化剂的组合 |
| 3.2.7 级联催化体系催化L-Phe合成D-Phe |
| 3.2.8 级联催化体系催化多种L-氨基酸不对称合成D-氨基酸 |
| 3.2.9 PPA浓度测定 |
| 3.2.10 D,L-Phe浓度测定 |
| 3.2.11 多种氨基酸检测方法 |
| 3.3 结果与讨论 |
| 3.3.1 体外级联催化路线的组装 |
| 3.3.2 pH和温度对级联催化系统的影响 |
| 3.3.3 催化剂配比对体外多酶级联系统的影响 |
| 3.3.4 体外级联催化系统催化L-Phe立体异构反转合成D-Phe |
| 3.3.5 体外多酶级联催化体系底物适应性研究 |
| 3.4 本章小结 |
| 第四章 MBP促进Pm LAAD在重组大肠杆菌中可溶性表达 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 试剂和仪器 |
| 4.2.2 表达质粒p ET-21b-MBP-pmlaad的构建 |
| 4.2.3 MBP-Pm LAAD融合蛋白的表达与纯化 |
| 4.2.4 酶活分析 |
| 4.2.5 温度、p H值和储藏时间对MBP-Pm LAAD活性的影响 |
| 4.2.6 FAD对 MBP-Pm LAAD催化活性的影响 |
| 4.2.7 MBP-Pm LAAD融合蛋白催化L-Phe转化为PPA |
| 4.3 结果与讨论 |
| 4.3.1 MBP-Pm LAAD重组蛋白表达质粒的构建 |
| 4.3.2 MBP-Pm LAAD的表达与纯化 |
| 4.3.3 温度和p H对 MBP-Pm LAAD融合酶的影响 |
| 4.3.4 FAD对 MBP-Pm LAAD催化活性的影响 |
| 4.3.5 催化剂浓度对MBP-Pm LAAD催化效率的影响 |
| 4.3.6 MBP-Pm LAAD细胞裂解液催化L-Phe合成PPA |
| 4.4 本章小结 |
| 第五章 体内级联细胞工厂合成高选择性D-氨基酸 |
| 5.1 前言 |
| 5.2 材料与方法 |
| 5.2.1 试剂和仪器 |
| 5.2.2 多酶级联系统的构建 |
| 5.2.3 共表达体系表达水平以及催化活性检测 |
| 5.2.4 共表达条件对催化效率的影响 |
| 5.2.5 反应组分对催化效率的影响 |
| 5.2.6 甲酸铵对全细胞催化剂催化活性的影响 |
| 5.2.7 体内级联催化体系不对称催化L-Phe合成D-Phe |
| 5.2.8 体内级联催化体系催化合成D-氨基酸 |
| 5.2.9 体内级联细胞工厂放大反应体系中催化L-Phe合成D-Phe |
| 5.2.10 D-Phe产物回收和鉴定 |
| 5.2.11 PPA检测方法 |
| 5.2.12 L-Phe和 D-Phe检测方法 |
| 5.2.13 多种氨基酸检测方法 |
| 5.3 结果与讨论 |
| 5.3.1 体内级联催化系统的设计 |
| 5.3.2 体内多酶级联催化系统的构建 |
| 5.3.3 共表达条件对催化效率的影响 |
| 5.3.4 反应组分对体内级联系统催化效率的影响 |
| 5.3.5 甲酸铵浓度对体内级联催化效率的影响 |
| 5.3.6 体内级联系统不对称催化L-Phe合成D-Phe |
| 5.3.7 体内级联系统催化L-氨基酸立体异构反转合成D-氨基酸 |
| 5.3.8 体内级联细胞工厂摇瓶放大反应体系催化L-Phe合成D-Phe |
| 5.3.9 体内级联细胞工厂反应釜放大反应体系内催化L-Phe合成D-Phe |
| 5.3.10 D-Phe产物回收和鉴定 |
| 5.4 本章小结 |
| 主要结论与展望 |
| 主要结论 |
| 展望 |
| 论文主要创新点 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录 :表 |
| 附录 :图 |
| 附录 :作者在攻读博士学位期间发表论文 |
（4）两种D-氨基酸的酶法制备工艺研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 综述 |
| 1.1 氨基酸概述 |
| 1.1.1 两种D-氨基酸概述 |
| 1.1.2 D-氨基酸生物酶法制备法 |
| 1.2 海因消旋酶酶学性质及应用 |
| 1.3 两种D-氨基酸酶法生产工艺 |
| 1.3.1 D-对羟基苯甘氨酸酶法生产工艺 |
| 1.3.2 D-缬氨酸酶法生产工艺 |
| 1.4 D-海因酶酶学性质及应用 |
| 1.5 本课题研究的目的及意义 |
| 第二章 两种海因消旋酶的克隆及表达 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 实验材料 |
| 2.2.1 仪器 |
| 2.2.2 试剂 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 重组海因消旋酶质粒的构建 |
| 2.3.2 重组海因消旋酶的诱导表达 |
| 2.4 结果与分析 |
| 2.4.1 重组质粒的构建 |
| 2.4.2 重组质粒的表达 |
| 2.4.3 红球菌R04 中海因消旋酶基因序列分析 |
| 2.5 结论 |
| 第三章 两种D-氨基酸的生产工艺研究 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 实验材料 |
| 3.2.1 仪器 |
| 3.2.2 试剂 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 D-HPG生产工艺优化研究方法 |
| 3.3.2 D-Val生产工艺优化研究方法 |
| 3.4 结果与分析 |
| 3.4.1 D-HPG生产工艺优化结果 |
| 3.4.2 .D-Val的生产工艺优化结果 |
| 3.5 结论 |
| 第四章 D-海因酶的环酰亚胺水解酶活性分析 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 实验材料 |
| 4.2.1 仪器 |
| 4.2.2 试剂 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 色谱条件 |
| 4.3.2 样品处理 |
| 4.4 结果与讨论 |
| 4.4.1 标准色谱图 |
| 4.4.2 工作曲线的制作 |
| 4.4.3 D-海因酶水解PDI及PI的色谱分析 |
| 4.5 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 红球菌海因消旋酶基因序列 |
| 攻读学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
| 个人简况及联系方式 |
（5）构建重组枯草芽孢杆菌催化制备D-对羟基苯甘氨酸（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 菌株和质粒 |
| 1.2 培养基及菌株培养方法 |
| 1.3 基因操作方法 |
| 1.4 qRT-PCR分析方法 |
| 1.5 胞内蛋白提取和SDS-PAGE分析 |
| 1.6 D, L-HPH转化反应及全细胞催化活性测定方法 |
| 2 结果和分析 |
| 2.1 D-海因酶基因在Bacillus subtilis中的表达 |
| 2.2 二价金属离子对D-海因酶活性的影响 |
| 2.3 acoR基因表达水平与D-海因酶活性的关系 |
| 2.4 D-氨甲酰水解酶基因在Bacillus subtilis中的表达 |
| 2.5 双酶共表达及培养基组分对催化活性的影响 |
| 2.6 菌株LSL02/p UBSC的催化特性 |
| 3 讨论 |
（6）构建重组枯草芽孢杆菌催化合成D-对羟基苯甘氨酸（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第1章 文献综述 |
| 1.1 海因酶法制备D-对羟基苯甘氨酸 |
| 1.1.1 D-对羟基苯甘氨酸及其用途 |
| 1.1.2 合成D-氨基酸的海因酶法 |
| 1.1.3 海因酶法合成D-对羟基苯甘氨酸的研究现状 |
| 1.2 微生物来源的D-海因酶和消旋酶 |
| 1.2.1 D-海因酶的基本特点 |
| 1.2.2 D-海因酶的晶体结构特点 |
| 1.2.3 海因的消旋 |
| 1.2.4 海因消旋酶 |
| 1.3 微生物来源的D-氨甲酰水解酶 |
| 1.3.1 Agrobacterium sp.KNK712的DCase |
| 1.3.2 Ralstonia pickettii CGMCC1596的DCase |
| 1.3.3 Sinorhizobium morelens S-5的DCase |
| 1.3.4 Pseudomonas sp.KNK003A的 DCase |
| 1.4 羟基丁酮诱导表达系统及其应用 |
| 1.4.1 acoABCL操纵子的表达调控机制 |
| 1.4.2 acoR基因与转录激活蛋白AcoR |
| 1.4.3 sigL基因及σL因子 |
| 1.4.4 羟基丁酮诱导表达系统的应用 |
| 1.5 Bacillus subtilis的几种常见启动子 |
| 1.6 本文的研究目的、内容和意义 |
| 第2章 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 菌株 |
| 2.1.2 PCR引物 |
| 2.1.3 主要药品 |
| 2.1.4 主要试剂 |
| 2.1.5 培养基 |
| 2.1.6 主要仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 B.subtilis染色体DNA的提取 |
| 2.2.2 质粒的提取-CTAB法 |
| 2.2.3 常规PCR扩增 |
| 2.2.4 重叠PCR反应 |
| 2.2.5 琼脂糖凝胶电泳 |
| 2.2.6 B.subtilis感受态转化[68] |
| 2.2.7 E.coli感受态转化 |
| 2.2.8 B.subtilis基因的无标记修饰方法[69] |
| 2.2.9 菌种的保藏 |
| 2.2.10 DNA片段的酶切与连接 |
| 2.2.11 细菌总RNA的提取 |
| 2.2.12 c DNA的合成 |
| 2.2.13 实时荧光定量PCR |
| 2.2.14 摇瓶发酵培养 |
| 2.2.15 中间物D-CpHPG的定性检测方法 |
| 2.2.16 胞内蛋白的提取 |
| 2.2.17 HPLC测定HPH和 D-HPG |
| 2.2.18 全细胞催化活性的测定 |
| 第3章 结果与分析 |
| 3.1 D-海因酶在B.subtilis中的表达 |
| 3.1.1 D-海因酶整合表达菌株及表达质粒的构建 |
| 3.1.2 D-海因酶表达菌株的表征 |
| 3.2 D-海因酶表达菌株培养条件的优化 |
| 3.2.1 二价金属离子对D-海因酶活性的影响 |
| 3.2.2 羟基丁酮浓度对D-海因酶活性的影响 |
| 3.2.3 反应过程中底物消耗 |
| 3.3 sigL及 acoR基因的过表达对D-海因酶活性的影响 |
| 3.3.1 sigL基因过表达菌株的构建 |
| 3.3.2 acoR基因过表达菌株的构建 |
| 3.3.3 胞内AcoR水平与D-海因酶活性的关系 |
| 3.4 D-氨甲酰水解酶在B.subtilis中的表达 |
| 3.4.1 不同启动子D-氨甲酰水解酶表达菌株的构建 |
| 3.4.2 不同启动子表达D-氨甲酰水解酶活性比较 |
| 3.4.3 修饰PAE启动子表达D-氨甲酰水解酶菌株的构建 |
| 3.4.4 PAE2 启动子表达D-氨甲酰水解酶活性测定 |
| 3.4.5 培养基对D-氨甲酰水解酶活性的影响 |
| 3.5 双酶共表达及其催化特性 |
| 3.5.1 双酶整合表达菌株的构建 |
| 3.5.2 双酶整合表达菌株催化活性的测定 |
| 3.5.3 双酶共表达质粒的构建 |
| 3.5.4 培养基组分对LSL02/pUBSC催化活性的影响 |
| 3.5.5 LSL02/pUBSC菌株的催化特性 |
| 第4章 结论与展望 |
| 4.1 主要结论 |
| 4.2 创新点 |
| 4.3 展望 |
| 参考文献 |
| 发表论文和参加科研情况说明 |
| 致谢 |
（7）异源D-海因酶和N-氨甲酰水解酶共表达重组枯草芽孢杆菌的构建（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 细菌来源的D-海因酶及酶学特性 |
| 1.1.1 D-海因酶的结构和性质 |
| 1.1.2 不同来源的D-海因酶的特点 |
| 1.2 N-氨甲酰水解酶 |
| 1.3 海因酶法制备D-对羟基苯甘氨酸 |
| 1.3.1 海因酶法 |
| 1.3.2 海因酶法制备D-对羟基苯甘氨酸 |
| 1.4 羟基丁酮诱导表达系统 |
| 1.4.1 acoABCL操纵子的结构 |
| 1.4.2 acoR基因与AcoR激活蛋白 |
| 1.4.3 sigL基因 |
| 1.4.4 acoABCL操纵子的表达调控机制 |
| 1.5 影响枯草芽孢杆菌芽孢形成的关键基因 |
| 1.5.1 枯草芽孢杆菌的芽孢形成机制 |
| 1.5.2 枯草芽孢杆菌的芽孢形成的关键基因 |
| 1.6 本文的研究目的和意义 |
| 第二章 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 菌株和质粒 |
| 2.1.2 PCR引物与合成片段 |
| 2.1.3 主要药品 |
| 2.1.4 主要试剂 |
| 2.1.5 培养基 |
| 2.1.6 主要仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 B. subtilis染色体DNA的提取 |
| 2.2.2 CTAB法提取质粒 |
| 2.2.3 DNA片段的PCR扩增 |
| 2.2.4 重叠PCR反应 |
| 2.2.5 琼脂糖凝胶电泳 |
| 2.2.6 DNA的切胶纯化与回收 |
| 2.2.7 DNA的酶切反应 |
| 2.2.8 DNA的连接反应 |
| 2.2.9 B. subtilis的感受态转化 |
| 2.2.10 E. coli感受态的转化 |
| 2.2.11 超声法细胞破碎方法 |
| 2.2.12 茚三酮法检测D-对羟基苯甘氨酸 |
| 2.2.13 PDAB定性检测N-氨甲酰基-D-对羟基苯甘氨酸 |
| 2.2.14 高压液相色谱测定D-对羟基苯甘氨酸 |
| 2.2.15 海因酶和氨甲酰水解酶总酶活的测定 |
| 2.2.16 DNA片段的合成与测序 |
| 2.2.17 基因的无标记修饰方法 |
| 2.2.18 菌种的保藏 |
| 2.2.19 细胞总RNA的提取 |
| 2.2.20 cDNA的合成和实时荧光定量PCR |
| 2.2.21 活菌计数及芽孢计数方法 |
| 第三章 结果与分析 |
| 3.1 D-海因酶的比较和选择 |
| 3.1.1 D-海因酶的比较 |
| 3.1.2 重组质粒pHCY和pHCS的构建 |
| 3.1.3 重组质粒的转化和海因酶活性比较 |
| 3.2 acoR和sigL基因过表达菌株的构建及对总酶活性的影响 |
| 3.2.1 acoR过表达菌株的构建 |
| 3.2.2 sigL过表达菌株的构建 |
| 3.2.3 acoR和sigL过表达菌株的构建 |
| 3.2.4 WD-3菌株acoR和sigL基因的相对表达水平 |
| 3.2.5 acoR和sigL基因过表达对总酶活性的影响 |
| 3.3 增加adc和sd1基因拷贝数对总酶活性的影响 |
| 3.3.1 高拷贝重组质粒pUCS的构建及转化 |
| 3.3.2 重组菌株的胞内聚丙烯酰胺凝胶电泳分析 |
| 3.4 sdp和skf的敲除及其对全细胞催化活性的影响 |
| 3.4.1 sdp基因的敲除 |
| 3.4.2 skf基因的敲除 |
| 3.4.3 sdp和skf基因的敲除对总酶活性的影响 |
| 3.5 芽孢形成缺陷对全细胞催化活性的影响 |
| 3.5.1 kinA基因的敲除 |
| 3.5.2 kinB基因的敲除 |
| 3.5.3 kinA和kinB基因缺陷的效应 |
| 第四章 结论与展望 |
| 4.1 主要结论 |
| 4.2 创新点 |
| 4.3 展望 |
| 参考文献 |
| 发表论文和参加科研情况说明 |
| 致谢 |
（8）D-对羟基苯甘氨酸生物合成酶的优化及固定化研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略表 |
| 引言 |
| 第1章 实验研究 |
| 1.1 材料与方法 |
| 1.1.1 材料 |
| 1.1.2 方法 |
| 1.2 结果 |
| 1.2.1 菌种的分离、纯化和鉴定 |
| 1.2.2 海因酶工程菌构建 |
| 1.2.3 海因酶的表达与动力学参数测定 |
| 1.2.4 基于 16S rRNA的同源分析 |
| 1.2.5 海因酶催化通道的分子模拟分析 |
| 1.2.6 海因酶突变库的构建及筛选 |
| 1.2.7 突变酶活力的测定 |
| 1.2.8 海因酶的酶学性质测定 |
| 1.2.9 固定化全细胞的各项参数优化 |
| 1.2.10 固定化全细胞小球批次实验测定 |
| 1.3 讨论 |
| 1.4 结论 |
| 参考文献 |
| 第2章 综述 |
| 2.1 海因酶产生菌的筛选方法 |
| 2.1.1 唯一氮源法 |
| 2.1.2 双层琼脂法 |
| 2.1.3 微孔快速筛选法 |
| 2.1.4 分子生物学筛选法 |
| 2.2 海因酶的定向进化 |
| 2.2.1 易错PCR |
| 2.2.2 DNA shuffling |
| 2.2.3 随机引物体外重组法 |
| 2.3 酶的固定化研究 |
| 2.3.1 酶的固定化技术 |
| 2.3.2 细胞的固定化技术 |
| 2.4 结论和展望 |
| 参考文献 |
| 结论 |
| 致谢 |
| 导师简介 |
| 作者简介 |
| 学位论文数据集 |
（9）海洋来源的D-海因酶产生菌的分离及酶催化通道模拟分析（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 样品采集 |
| 1.3 培养基的配置 |
| 1.4 海洋样品预处理 |
| 1.5 菌种的特殊筛选方法 |
| 1.5.1 菌种的分离、纯化和保藏 |
| 1.5.2 双层琼脂法 |
| 1.5.3 微孔快速筛选法 |
| 1.5.4 分子生物学筛选法 |
| 1.6 工程菌的构建 |
| 1.7 16S r RNA的扩增及分析 |
| 1.8 酶的表达与动力学参数测定 |
| 1.9 海因酶结构同源模建及催化通道模拟分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 菌种的分离、纯化和鉴定 |
| 2.2 海因酶工程菌构建 |
| 2.3 海因酶的表达与动力学参数测定 |
| 2.4 基于16 S rRNA的同源分析 |
| 2.5 海因酶催化通道的分子模拟分析 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
（10）芽孢杆菌MV0658海因氧化酶基因B的克隆及表达研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 文献综述 |
| 1.1 海因酶的历史 |
| 1.2 海因酶的分类 |
| 1.2.1 根据海因酶转化产物光学活性的不同进行分类 |
| 1.2.2 根据其作用底物的不同分类 |
| 1.3 海因酶的分布 |
| 1.4 海因酶的性质 |
| 1.4.1 酶的底物选择性 |
| 1.4.2 酶的立体选择性 |
| 1.4.3 酶的热稳定性 |
| 1.4.4 酶的诱导性 |
| 1.4.5 辅助因子和亚基组成 |
| 1.5 海因酶基因的分离和克隆表达 |
| 1.5.1 D-和L-海因酶基因的分离及表达 |
| 1.5.2 大肠杆菌中海因酶基因的分离及表达 |
| 1.6 海因酶在氨基酸生产中的应用 |
| 1.7 海因酶研究的前景展望 |
| 1.8 本研究的目的和意义 |
| 2 实验内容 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 菌株 |
| 2.1.2 载体 |
| 2.1.3 培养基 |
| 2.1.4 溶液和缓冲液 |
| 2.1.5 分子克隆工具酶及重要生化试剂 |
| 2.1.6 主要仪器 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 细菌总DNA 的分离提取 |
| 2.2.2 质粒（pUC19）DNA 的提取 |
| 2.2.3 海因氧化酶目的基因片段的扩增 |
| 2.2.4 目的片段的回收及纯化 |
| 2.2.5 酶切反应 |
| 2.2.6 DNA 凝胶电泳 |
| 2.2.7 载体与目的片段连接 |
| 2.2.8 大肠杆菌 JM109 感受态细胞的制备-CaCl_2 法 |
| 2.2.9 连接产物的转化及α互补的筛选 |
| 2.2.10 鉴定重组子 |
| 2.2.11 海因氧化酶基因序列测定、同源性比较 |
| 2.2.12 海因氧化酶基因B 的诱导表达 |
| 2.2.13 SDS-PAGE 电泳 |
| 2.2.14 重组子的酶切及回收 |
| 2.2.15 质粒（pET28a）DNA 的提取 |
| 2.2.16 pET28a 的酶切及去磷酸化反应 |
| 2.2.17 载体pET28a 与目的片段连接 |
| 2.2.18 连接产物的转化 |
| 2.2.19 鉴定重组子 |
| 2.2.20 大肠杆菌BL21 感受态细胞的制备 |
| 2.2.21 大肠杆菌Rostta 感受态细胞的制备 |
| 2.2.22 海因氧化酶基因B 的诱导表达 |
| 2.2.23 SDS-PAGE 电泳 |
| 3 结果 |
| 3.1 海因氧化酶基因的扩增 |
| 3.2 目的片段的回收及载体、目的片段的限制性酶切 |
| 3.3 PCR 产物的克隆 |
| 3.3.1 重组质粒的构建 |
| 3.3.2 重组质粒对大肠杆菌的转化 |
| 3.3.3 重组质粒基因的鉴定 |
| 3.3.4 海因氧化酶表达的SDS-PAGE 检测 |
| 3.3.5 海因氧化酶基因的分析及功能预测结果 |
| 4 讨论 |
| 4.1 PCR 反应条件的筛选，优化 |
| 4.2 重组质粒的构建和克隆的筛选 |
| 4.3 重组菌株的鉴定 |
| 4.3.1 pUC19 为载体的重组菌株的鉴定 |
| 4.3.2 pET28a 为载体的重组菌株的鉴定 |
| 4.4 重组菌株在大肠杆菌中的表达 |
| 4.5 利用生物信息学对海因氧化酶基本性质的预测 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
四、L-海因酶与D-海因酶的序列及结构比较研究（论文参考文献）
- [1]利用Tag-Catcher构建自组装双酶复合物高效制备D-氨基酸[D]. 谢露露. 山西大学, 2021(12)
- [2]D-氨甲酰水解酶的挖掘改造，结构解析及催化机制研究[D]. 刘亚菲. 江南大学, 2020(03)
- [3]多酶级联催化L-氨基酸立体异构反转合成D-氨基酸[D]. 张丹平. 江南大学, 2020(04)
- [4]两种D-氨基酸的酶法制备工艺研究[D]. 马师师. 山西大学, 2019(02)
- [5]构建重组枯草芽孢杆菌催化制备D-对羟基苯甘氨酸[J]. 李法彬,刘露,杜燕,班睿. 中国生物工程杂志, 2019(03)
- [6]构建重组枯草芽孢杆菌催化合成D-对羟基苯甘氨酸[D]. 李法彬. 天津大学, 2018(06)
- [7]异源D-海因酶和N-氨甲酰水解酶共表达重组枯草芽孢杆菌的构建[D]. 王亚盟. 天津大学, 2016(03)
- [8]D-对羟基苯甘氨酸生物合成酶的优化及固定化研究[D]. 李亚东. 华北理工大学, 2016(04)
- [9]海洋来源的D-海因酶产生菌的分离及酶催化通道模拟分析[J]. 李亚东,汪康游,樊帅,杨兆勇,田喜凤,许乐幸,金媛媛. 农业生物技术学报, 2016(05)
- [10]芽孢杆菌MV0658海因氧化酶基因B的克隆及表达研究[D]. 佘雪莲. 四川师范大学, 2009(02)