一、植物病毒载体的研究进展及其应用（论文文献综述）
郝梦媛,杭琦,师恭曜[1]（2022）在《VIGS基因沉默技术在作物基因功能研究中的应用与展望》文中研究表明随着作物基因组测序工作的陆续完成,大量影响作物重要农艺性状的基因功能等待挖掘。由于缺少高效的遗传转化方法,多种作物的基因功能研究进展缓慢。病毒诱导的基因沉默（virus-induced gene silencing,VIGS）技术不依赖遗传转化,通过病毒载体接种即可在当代植物体内实现对靶向基因的沉默。VIGS技术因其起效时间快、沉默效率高、操作成本低、便于高通量和应用植物范围广等特点,被越来越多地应用于不同作物基因功能和代谢通路解析的反向遗传学研究中。介绍了VIGS的技术原理及其发展过程,系统归纳了VIGS在不同作物中的应用,总结和讨论了现有VIGS应用的局限性以及影响其沉默效率的几个关键因素,并对VIGS技术在未来植物生物学研究中的应用进行了展望,以期为VIGS技术的进一步应用和发展提供参考。
李光照,陈锐,贾洪林,任利玲[2]（2022）在《组织工程血管化基因治疗的研究进展》文中研究指明背景:在大块工程化移植物内部迅速形成功能性血管系统,是其在宿主体内成功存活的基本前提。利用基因工程技术实现工程组织血管化具有治疗效果好、费用低、安全性高等优点,开展工程组织血管化基因治疗的相关研究对实现长期有效的组织修复有着重大意义。目的:综述目前组织工程血管化基因治疗的种子细胞、目的基因和基因载体的研究现状及存在的主要问题,以期进一步探讨基因治疗在组织工程血管化中的应用前景。方法:在Pub Med、Web of Science、CNKI上进行了文献检索,并以"Tissue engineering;Vascularization;Gene therapy;Seed cells;Target genes;Vectors"作为英文检索词,以"组织工程;血管化;基因治疗;种子细胞;目的基因;载体"作为中文检索词,对最终纳入的61篇文献进行了归纳总结。结果与结论:间充质干细胞、血管内皮细胞及内皮祖细胞是组织工程血管化基因治疗中最具潜力的种子细胞,不仅具有良好的血管诱导性,而且有利于多种病毒和非病毒载体的导入及血管化目的基因的表达。血管内皮生长因子、血管生成素1、碱性成纤维细胞生长因子、骨形态发生蛋白2、缺氧诱导因子1α等血管化目的基因,主要通过双/多基因联合、成骨与成血管耦合及上游基因调控等方式在工程化移植物内部构建出高效、稳定的血管网络。由于不同的病毒和非病毒载体具有各自的优缺点,因此在应用时主要根据基因转染效率、生物安全性、成本等方面来选择合适的载体。目前,尽管基因治疗在组织工程血管化中的应用研究已取得很大进展,但是要真正应用于临床实践,还需要突破众多技术瓶颈,例如如何提高目的因子的释放靶向性和降低安全风险等,这也是未来组织工程血管化基因治疗的研究方向和热点。
张鑫[3]（2021）在《CRISPR介导的基因激活系统的开发及应用》文中认为基因编辑系统通常依赖于诱导DNA双链断裂（DSBs）,然而由DSBs引起的脱靶位点的突变可能会产生有害的影响,从而限制其在临床治疗中的应用。最近CRISPR/Cas9系统被重新编辑并应用于基因的激活,它可以在天然染色体环境内对特定靶点进行基因激活而不产生DSBs,是一种很有潜力的治疗策略。目前,基于SpCas9已经开发多种基因激活系统,但是由于其原间隔子相邻基序（PAM）的限制、较高的脱靶效应、大体积、免疫原性等,使其在体内外的应用存在一些局限性。因此,我们仍需要构建不同类型的CRISPR激活系统,为在体内体外实现高效的基因激活提供新的可选择的方式。LbCpf1是一种2类V型CRISPR系统,不同于SpCas9识别5’-NGG的PAM序列,它可以识别5’-TTTV（V代表A,C或G）的PAM序列,并具有高特异性。我们将LbCpf1的核酸酶结构域的关键氨基酸进行突变,并结合组蛋白乙酰转移酶p300,构建dLbCpf1-p300激活系统。在gRNA的引导下,融合蛋白dLbCpf1-p300会与靶位点结合,并通过促进启动子和增强子区域组蛋白的乙酰化,使染色质发生重构,从而增强基因表达。同时,我们也将dLbCpf1突变体与SunTag系统结合,利用SunTag系统的中重复多肽GCN4和相应单链可变区抗体（scFv）特异性的结合,将融合蛋白ScFv-VP64招募到靶位点,使转录激活因子VP64在启动子区域富集,从而增强转录。通过这两种方式,我们基于LbCpf1构建了高特异性的转录激活系统,成功在多种细胞中诱导靶基因高效的表达,拓展了 CRISPR激活系统的应用范围。CjCas9是目前发现的最小Cas9同源体,与SpCas9相比,它具有不同的PAM识别序列,以及较小体积（984个氨基酸,而SpCas9为1,368个氨基酸）。因此我们将CjCas9与强效转录激活因子VPR结合,构建一系列转录激活系统。其中,dCjCas9-SunTag-VPR系统可以强效的激活基因的表达;CjCas9-VPR系统可以正交性诱导基因的编辑和激活;而基于VPR-dCjCas9系统进一步缩减和优化后形成的小型高效的激活体系（命名为miniCAFE）,在基因插入细胞系中,单个拷贝miniCAFE即可在单条gRNA的引导下有效的激活靶基因的表达。同时,由于其小体积的优势,我们可以将miniCAFE和gRNA包装在一个AAV载体中进行体内传递,并成功激活肝脏中Fgf21的表达,调节成年小鼠的能量代谢。因此,miniCAFE为体内诱导基因的表达提供了一种新的方法。综合而言,我们基于LbCpf1和CjCas9构建了多种转录激活系统,并由于PAM的不同、LbCpf1的高特异性、CjCas9的小体积以及免疫原性,这些系统各有优势,为基因激活系统在体内外的应用提供了有力的补充,对人类疾病的治疗具有巨大的潜力。
王鑫仪[4]（2021）在《茄二十八星瓢虫NPC1a基因鉴定、功能分析和防治应用研究》文中认为NPC1基因在胆固醇运输和吸收方面发挥重要作用。对于昆虫来说,胆固醇是其必须从食物中获取的重要营养物质。目前还没有关于鞘翅目昆虫NPC1基因的报道。本研究首先对两种二十八星瓢虫进行了鉴别,然后以茄二十八星瓢虫为研究对象,克隆得到茄二十八星瓢虫NPC1a基因并进行了生物信息学及表达模式分析;在此基础上,利用RNAi技术对NPC1a基因的功能进行了初步研究,并通过VIGS（Virus-induced gene silencing）技术分析了NPC1a基因用于茄二十八星瓢虫防控的潜力。主要研究结果如下:1、茄二十八星瓢虫NPC1a基因的克隆与时空表达首先根据幼虫形态和DNA分子鉴定方法对茄二十八星瓢虫进行了鉴别,以确保实验材料的正确性。然后,在转录组中比对获得一条NPC1基因的核苷酸序列。该基因的开放阅读框长度为4020bp,编码1340个氨基酸。预测编码的蛋白大小为150274.83Da,具有NPC家族蛋白的三个保守结构域。在系统发育树上显示该基因与鞘翅目昆虫的NPC1a聚成一支。最后采用荧光定量PCR技术,对NPC1a基因在茄二十八星瓢虫不同的发育阶段和不同组织中的表达量进行分析。结果表明,NPC1a基因在茄二十八星瓢虫整个发育阶段和不同组织均有表达,其中在虫体发育前期（卵、1龄、2龄、3龄）表达量较高,在3龄达到最高,随后在4龄、蛹期、成虫中的表达量逐渐降低;肠道的表达量显着高于表皮和头部,是表皮的12.8倍,是头部的5.6倍。2、RNA干扰效果评估本研究采用了两种表达dsRNA的方法,首先是利用试剂盒合成dsRNA,发现饲喂浓度为50ng/μL和500ng/μl的ds NPC1a处理组的NPC1a转录水平分别下降了43%和58%左右;幼虫的表型没有显着变化。后续实验采用了50ng/μl的浓度,从1龄开始连续饲喂幼虫4天和7天dsRNA,发现仅在连续饲喂了7天ds NPC1a的幼虫上有发育历期显着延长的表型。然后,利用VIGS技术表达dsRNA。本研究以沉默了番茄的PDS基因后产生的白化表型作为指示和参照,建立瞬时表达靶标基因的dsRNA体系。以此作为参照推断,在侵染第20天后,ds NPC1a在新叶的表达较高。此时,将1龄幼虫转接到表达ds NPC1a的叶片上并在10天后取样分析发现,NPC1a基因的表达量显着下降了54%左右;但是幼虫体重变化和发育历期与对照没有显着差异。通过两种表达dsRNA的方法进行RNAi饲喂实验发现,尽管茄二十八星瓢虫NPC1a的表达量显着下降,但是对其生长发育的影响并不显着。这可能是因为固醇为微量营养,而NPC1a基因表达的抑制程度还不够（仅有50%多）导致未抑制的部分能够翻译产生足够的NPC1a蛋白并基本满足其功能需求。此外,茄二十八星瓢虫等昆虫体内也可能存在一条独立于NPC1a基因的胆固醇吸收转运机制,能够有效补充该基因表达抑制的功能缺陷。将来的研究应通过提高干扰效率或通过基因编辑的方法获得NPC1a功能完全缺失的昆虫个体,以进一步验证NPC1a基因作为靶标进行害虫防治的可行性。
赵光远[5]（2020）在《番木瓜畸形花叶病毒在寄主基因功能鉴定及交叉保护中的应用》文中提出番木瓜（Carica papaya L.）是一种广受人们喜爱的水果和重要的热带经济作物,但番木瓜果树自身抗病毒力较弱,很容易受到病毒的侵害,其中番木瓜畸形花叶病毒（Papaya leaf distortion mosaic virus,PLDMV）是一种新的威胁番木瓜种植业的病毒病害,近年来发病率逐年递增,已成为继木瓜环斑病毒（Papaya ringspot virus,PRSV）为害最严重的病毒病害。目前,PLDMV在栽培技术上如PRSV一样也很难通过化学防治的方法予以防控。所以,急需寻找到一种更为安全且广谱的抗病毒新策略。而这种抗病毒新策略的获得需要在PLDMV致病机理、PLDMV弱毒株“植物疫苗”及基因功能鉴定等方面取得一定的工作积累。本研究就是基于这些关键技术环节开展了系列的研究,以期为开辟安全广谱的抗PLDMV新策略奠定良好的理论和技术基础。开展上述这些研究工作,都会涉及植物病毒表达载体构建的关键环节,这是研究植物病毒的基础,也是最为关键的内容之一。由于许多植物病毒基因组较大,且会在大肠杆菌体内产生毒性,所以带有病毒全长表达载体的构建一直是研究工作的难点。本研究通过将病毒全长分段扩增,然后利用在体外进行Gibson拼接后直接转化农杆菌的方法,能快速、高效、稳定的构建病毒侵染性克隆,相对于传统的体外转录或者酵母同源重组的方法成功率更高、时间更节省而且成本相对较低,本研究获得的植物病毒表达载体构建方法有利于有效开展后续的科研工作。因此,本研究利用这种新方法构建了多种PLDMV病毒表达载体,并开展了如下科研工作:一.构建含有荧光标签的PLDMV表达载体并初步探索了番木瓜的基因沉默系统。本研究对感染了PLDMV-GFP的番木瓜植株进行病毒来源的Small RNA高通量测序分析。综合Vsi RNAs丰度、分布热点、类别、长度和碱基偏好性等特性方面的差异,分析所获得的数据和结果,从RNA沉默的角度初步探究番木瓜RNA沉默系统及病毒侵染机制,预测了Vsi RNAs靶基因序列,并对沉默系统中的关键基因进行了验证,所获得的结果为深入研究病毒的致病机理和制定抗病毒新策略的奠定了理论基础,同时为抗病毒病害育种技术的发展提供参考和指导。二.利用点突变技术构建突变体弱毒株并验证了其交叉保护效果及原理。使用弱毒株“植物疫苗”对番木瓜植株进行交叉保护是一种较为高效广谱的绿色病毒防控技术。本研究基于交叉保护的原理,利用点突变技术对PLDMV的致病关键区域HC-Pro中的两个保守区域KITC和FRNK进行了突变,构建了三种突变体弱毒株PLDMV-E、PLDMV-I、PLDMV-EI,并通过攻毒实验对所构建的弱毒株进行了验证,其中双位点突变弱毒株PLDMV-EI能在进行交叉保护的60天内未产生明显症状且对强毒株系保护效果明显,有望成为一种温和有效且对环境友好的交叉保护突变体弱毒株疫苗。通过大田试验进一步验证其在自然界中对PLDMV病毒的保护效果,经统计分析PLDMV-EI突变体弱毒株的相对防控效率达到70.94%。PLDMV突变体弱毒株的构建为获得番木瓜病毒防控新方法和新策略奠定了良好的基础。三.建立了番木瓜VIGS基因功能鉴定平台并测定其CYP83B1基因功能。一种对寄主温和不产生明显症状的弱毒株是构建VIGS（Virus Induced Gene Silencing,病毒诱导的基因沉默）基因功能鉴定载体的良好材料。本研究利用PLDMV-E突变体弱毒株构建了PLDMV-VIGS载体,很大程度上避免了植物病症对沉默表型的干扰。通过对NIb蛋白与CP蛋白之间插入指示基因PDS和Chl H的PLDMV-VIGS载体进行实验,验证了不同插入片段长度与环境温度对VIGS载体沉默效率的影响,建立了PLDMV-VIGS番木瓜基因功能鉴定平台。并以此平台测定番木瓜CYP83B1基因功能,利用表征判断、q RT-PCR以及高效液相色谱等方法,成功分析番木瓜CYP83B1基因是苄基葡萄糖硫苷生成途径中的关键基因。PLDMV-VIGS作为一种拥有操作程序简单、运行成本低、分析周期短、同时不需要遗传转化等优势的基因功能鉴定手段,为开展番木瓜功能基因组学研究提供了重要的技术支持,同时更为我国生物学领域占领功能基因组学的制高点提供了一个颇具战略意义的工具。已完成的番木瓜基因组的分析表明,番木瓜基因组是已发现的基因数目最小的显花植物基因组（372 Mb）,且拥有良好的基因转化系统（为全球第一种商业化转基因果树）和较短的生长周期,所以番木瓜具有作为“模式植物”的重大潜力。因此,对番木瓜基因沉默体系的解析具有重要的科学意义。而PLDMV还可侵染葫芦科作物,所以PLDMV弱毒株的构建和PLDMV-VIGS载体沉默平台的建立也为其他葫芦科经济作物的研究打下了坚实的基础。可见,本课题从植物病毒与植物寄主间相关性方面开展了系列研究,这对推动果树学的抗病育种研究具有重要科学意义。
郭依[6]（2020）在《双链RNA介导的烟草抗病毒病（TMV,CMV,PVY）和靶斑病（Rhizoctonia solani）的研究》文中认为随着分子生物学技术的发展,RNA干扰（RNA interference,RNAi）成为了有效防治植物病害的新方法。本研究通过病毒诱导的基因沉默（virus-induced gene silencing,VIGS）体系分别筛选出抑制烟草花叶病毒（tobacco mosaic virus,TMV）、黄瓜花叶病毒（cucumber mosaic virus,CMV）、马铃薯Y病毒（potato virus Y,PVY）和烟草靶斑病菌最有效的靶点,然后体外转录同时靶向这三种病毒最有效靶点的双链RNA（double-stranded RNA,dsRNA）,以及靶向烟草靶斑病菌（Rhizoctonia solani）有效靶点的dsRNA,并将它们应用到烟草植株上,通过RT-qPCR（Real time quantitative RT-PCR）分别检测它们对这三种烟草病毒病和靶斑病的抑制效果,主要研究成果如下:1.以TMV、CMV、PVY多个核酸序列作为沉默靶点,分别构建了VIGS载体并检测了其沉默效果。本研究以烟草脆裂病毒（TRV）为载体,选取TMV的p126、p183、MP、CP、3’UTR的核酸序列;CMV的1a、2a、3’UTR的核酸序列和PVY的HC-pro、NIb、CI、CP作为沉默靶点,分别构建重组表达载体。通过农杆菌浸润的方法将重组表达载体导入4-6叶期的烟草中,诱导烟草VIGS,分别接种病毒TMV、CMV、PVY,接种病毒10 d后,通过RT-qPCR检测TMV、CMV、PVY三种病毒RNA的积累量。试验结果表明抑制TMV、CMV、PVY最有效的靶点分别是p126、2a、HC-pro。将TMV、CMV、PVY最有效靶点的核酸片段同时融合构建到了VIGS载体上,沉默效果检测表明对三种病毒都有抑制作用。利用同源重组的方式将此三种病毒最有效靶点p126（140bp）、2a（125bp）和HC-pro（133bp）三个片段同时连接到TRV载体上,得到了重组表达载体pTRV-3FF。TRV-3FF通过农杆菌介导烟草植株,利用RT-qPCR检测了TMV、CMV、PVY三种病毒RNA的积累量。结果表明TRV-3FF能同时对TMV、CMV和PVY产生抑制作用,通过计算得出对三种病毒的抑制率分别为38.11%、28.85%、37.86%。2.构建了烟草靶斑病菌VIGS载体并进行了沉默效果检测,TRV-endoPGs对烟草靶斑病菌抑制效果最优。选取烟草靶斑病菌的两个致病性相关基因RPMK1和endoPGs作为靶标,构建了VIGS沉默表达载体pTRV-RPMK1和pTRV-endoPGs,通过农杆菌介导烟草植株,利用RT-qPCR检测烟草靶斑病菌的相对表达量,结果表明,TRV-RPMK1和TRV-endoPGs对烟草靶斑病菌的抑制率分别为44.95%和51.38%,TRV-endoPGs对烟草靶斑病菌的抑制率高于TRV-RPMK1。3.进行了双链RNA的表达与抗病性分析。本研究利用T7 RNAi Transcription Kit体外转录靶向烟草病毒TMV-p126、CMV-2a、PVY-HC-pro的dsRNA-3FF,靶向烟草靶斑病菌RPMK1基因和endoPGs基因的dsRNA-RPMK1和dsRNA-endoPGs。外源dsRNA-3FF应用于烟草植株上,结果表明dsRNA-3FF能同时降低TMV、CMV、PVY的积累量,其中对TMV的抑制效果最好,抑制率为37.5%;dsRNA-RPMK1和dsRNA-endoPGs在24 h、48 h和72 h三个时间点均对烟草靶斑病菌菌丝生长有一定的抑制作用,其中dsRNA-RPMK1和dsRNA-endoPGs在48 h时对烟草靶斑病菌菌丝生长的抑制作用最好,抑制率分别为44.03%和50.49%。将外源dsRNA-RPMK1和dsRNA-endoPGs介导到烟草离体叶叶片上,结果发现,外源dsRNA-RPMK1和dsRNA-endoPGs处理的烟草叶片上病斑直径与对照组相比明显减小。通过RT-qPCR检测,结果发现,dsRNA-RPMK1和dsRNA-endoPGs均对烟草靶斑病菌有抑制作用,抑制率分别为33.94%和43.75%。dsRNA-endoPGs对烟草靶斑病菌的抑制作用强于dsRNA-RPMK1。本研究为病毒的复合侵染和烟草靶斑病的防治,提供了一种新的解决办法。
郭炎[7]（2019）在《大豆花叶病毒介导的大豆生物反应器构建及抗除草剂蛋白表达的研究》文中认为植物生物反应器是最经济的生物反应器,能够为外源蛋白的表达提供安全的生产体系和完整的真核蛋白质修饰场所;然而,该系统却存在实验周期较长,外源蛋白的表达水平较低等问题;通过利用病毒载体来介导植物生物反应器,可以缩短实验周期,提高外源蛋白的表达量。大豆花叶病毒（Soybean Mosaic Virus,SMV）广泛分布于世界各地,由于对该病毒的研究主要集中在基因功能分析及抗病育种方面,在以SMV为载体介导植物生物反应器的方面,相关研究却相对较少。本实验室前期对大豆花叶病毒东北3号株系进行了全基因测序,并构建了该毒株的侵染性克隆,在此基础上,我们对大豆花叶病毒东北3号株系的全基因组侵染性克隆（SMV3）进行了改造,减弱其致病性而又不影响其侵染力的同时为了便于目的基因的插入和相应融合蛋白的表达,又利用融合PCR在SMV3基因组中插入限制性酶切位点AvrⅡ和大豆花叶病毒蛋白酶切位点ESVSLQ/S,从而构建了本试验中所用的介导大豆植物生物反应器的重组载体SMV3-2;此外,由于Bar基因（Bialaphos Resistance Gene,Bar）是常用的选择标记基因之一,由该基因编码的PAT蛋白具有良好的除草剂抗性,可用于后续试验的检测,所以本试验利用构建的SMV3-2载体携带Bar基因,形成SMV3-2-bar重组病毒,并将其转化至大豆植株体内。通过RT-PCR、ELISA及Western-blot检测方法,分别对目的基因及相应蛋白的表达进行检测,结果表明SMV3-2-bar重组病毒已成功转入大豆植株体内,并表达了PAT蛋白;通过对PAT蛋白表达趋势进行分析发现,在转化后的第六周,表达量最高;对其进行的生物学测定试验结果表明,PAT蛋白可以较好的发挥抗除草剂特性;同时,稳定性相对较好综上所述,本试验通过构建大豆花叶病毒载体并对其介导的大豆植物生物反应器进行了初步的探索,对其功能进行验证并分析其稳定性。结果表明,该系统可以完整的表达目的蛋白,且稳定性较好。本试验结果也将为基因功能研究和新型植物生物反应器的研究奠定基础。
徐丽[8]（2019）在《Ⅰ型启动子及其终止序列对植物病毒载体系统表达效率的影响分析》文中研究表明植物RNA病毒载体表达系统是一种有潜力的外源基因瞬时表达平台,生物安全性是阻碍其应用的瓶颈问题之一。Ⅰ型启动子具有的种属间特异性,理论上可以缩小重组病毒的宿主范围降低病毒载体潜在的生物危害性。Ⅰ型启动子已被广泛应用于动物病毒载体的研究中,但在植物中却鲜有报道。植物Ⅰ型启动子能否像哺乳动物Ⅰ型启动子一样,高效地提高病毒载体的生物安全性仍有待验证。鉴于此,本论文以番茄丛矮病毒（Tomato bushy stunt virus,TBSV）为实验材料,构建本氏烟Ⅰ型启动子介导转录的TBSV病毒表达载体,通过分析接种叶片中重组GFP表达情况,探索本氏烟Ⅰ型启动子顺式调控序列、转录特性和Ⅰ型终止子对病毒载体的影响,初步明确Ⅰ型启动子介导转录的植物病毒载体表达系统的有效性和主要特征。研究发现,①本氏烟Ⅰ型启动子长度对启动子转录频率和病毒载体的表达水平无显着影响;长度仅为77 nt的启动子就可以起始病毒基因组RNA的转录;并且其启动子结构中不存在类似于动物Ⅰ型启动子的上游控制元件（Upstream control element,UCE）;②启动子转录起始位点上游T串序列以及转录起始位点核苷酸A/G互换也对启动子转录频率和病毒载体的表达效率无显着的影响;③转录起始位点下游延伸序列（延伸至+42位）对启动子转录强度具有显着的正调控作用,能够通过增强启动子转录频率提高病毒载体表达水平,效果增幅约为2倍;④源于35S启动子的ELS序列（Enhancer-like sequence）能够增强启动子转录频率和提高病毒载体表达水平3-5倍;修改后的本氏烟Ⅰ型启动子具有与35S启动子相似的转录强度;⑤本氏烟Ⅰ型启动子具有转录的非专一性,这一转录特征与转录起始位点下游延伸序列和ELS序列无关,是其自身固有的特性。受体本氏烟中的Pol Ⅱ对Ⅰ型启动子的非特异性识别是其非特异性转录产生的可能原因;⑥对本氏烟Ⅰ型启动子TATA框中的单碱基进行突变,可以在不影响Ⅰ型启动子转录效率的情况下,一定程度上提高了其转录的专一性。但是,依然不能完全杜绝受体细胞PolⅡ对Ⅰ型启动子的非特异性识别和转录;⑦Ⅰ型终止子既不能提高病毒载体的表达水平,也不能提高本氏烟Ⅰ型启动子的转录专一性,且其存在与否不会影响病毒载体的表达效率。推测TBSV病毒对其3’末端的高水平修复是产生这一结果的可能原因。相关研究初步建立起以RNA聚合酶Ⅰ介导转录植物病毒表达系统,为进一步探索Ⅰ型启动子介导的植物病毒表达系统在生物安全性上的潜力以及其在实际应用中的潜能和应用前景等奠定了基础。
包文龙[9]（2018）在《以类水滑石纳米片材料作为生物分子细胞导入载体的方法研究》文中指出植物细胞膜外围由致密的细胞壁包裹,在为细胞提供机械支撑的同时,也阻碍了外源物质进入植物细胞。在植物分子和细胞生物学研究中,导入生物活性分子的过程也会受到植物细胞壁的阻碍。为此,研究者们开发了多种外源生物分子导入植物细胞的技术。但这些技术难以做到广谱、高效、低毒、经济,因而难以得到广泛应用。本研究利用材料科学的方法合成了两种类水滑石纳米片（Layered Double Hydroxide Nanosheets,LDH-NS）,即乳酸根插层的 LDH-NS（LDH-Lactate-NS）和醋酸根插层的LDH-NS（LDH-Acetate-NS）。通过原子力显微镜成像和扫描电子显微镜成像等一系列表征分析了 LDH-NS的结构尺寸、表面形貌等特征。通过X射线衍射、分光光度计和凝胶电泳成像等方法探究了 LDH-NS吸附DNA分子的能力。结果表明LDH-Lactate-NS纳米片的吸附能力高于LDH-Acetate-NS纳米片,并且吸附DNA分子后仍可以保持很好的剥离状态。此外,本研究分析和比较了吸附时间影响LDH-NS吸附DNA分子的能力。结果表明LDH-Lactate-NS的吸附速率大于LDH-Acetate-NS。用含不同浓度LDH-NS的细胞培养基处理293T细胞后,通过流式细胞仪分选Hoechst33342/PI 双染细胞发现 LDH-Lactate-NS 和 LDH-Acetate-NS 纳米片均不产生严重的细胞毒性,并且LDH-Lactate-NS纳米片的细胞毒性更低。以上述实验数据为指导,本研究探究了 LDH-Lactate-NS纳米片作为生物分子载体运输DNA分子进入靶细胞的能力。首先通过共孵育的方法获得了 LDH-Lactate-NS@ssDNA-FITC复合物,然后利用该复合物处理细胞后使用激光共聚焦显微镜检测了胞内信号。结果表明LDH-Lactate-NS纳米片具有高效运输DNA分子进入293T细胞的能力。本研究以模式植物烟草细胞和拟南芥为研究对象,探究了 LDH-Lactate-NS纳米片对植物细胞产生的毒性。通过用含不同浓度纳米片的植物细胞培养基分别对烟草细胞和拟南芥进行处理后发现LDH-Lactate-NS纳米片的工作浓度低于100 μg/mL时对植物细胞产生的细胞毒性并不显着。基于以上实验数据,用不同生物分子偶联的LDH-Lactate-NS纳米片处理烟草细胞和拟南芥后用激光共聚焦显微镜检测胞内信号。结果表明LDH-Lactate-NS纳米片能有效负载不同生物分子导入完整的植物细胞。最后,通过植物细胞生物学实验手段结合耗散粒子动力学模拟技术揭示了 LDH@DNA复合物可以通过直接穿膜的方式进入靶细胞的跨膜机制,并发现了该复合物的有效穿膜结构为DNA-LDH-DNA。综上所述,本研究通过结合材料科学、植物细胞学和计算机科学的手段证实了LDH-Lactate-NS能作为生物分子载体应用于植物分子与细胞学研究中,并为进一步提高LDH-Lactate-NS运输生物分子进入完整植物细胞的能力提供了理论基础。
李瑞雪[10]（2018）在《红苞凤梨VIGS基因沉默体系的建立及POR基因的克隆与功能验证》文中研究指明红苞凤梨（Ananas comosus var.bracteatus）由于其叶片嵌合形状多样且明显,成为一种重要的新型观赏植物。嵌合性状在组织培养过程中很不稳定,再生植株中嵌合型植株数量稀少。探究叶色镶嵌的形成机理,对提高繁育过程中嵌合性状的稳定性有着重要的意义。本文通过组织培养得到嵌合性状分离的全白植株和全绿植株,通过分析两种植株光合色素合成相关生理指标和基因表达的差异,筛选出导致叶片白化的关键基因为POR基因。通过建立VIGS基因沉默体系,得到一种快速获得转基因植株鉴定基因功能方法。并对POR基因进行了克隆、表达分析和功能验证,探究其对红苞凤梨叶片白化的影响,为深入分析红苞凤梨白化细胞失绿突变的分子机理提供理论依据,对提高红苞凤梨嵌合性状的稳定性,促进红苞凤梨的工厂化育苗具有重要的实践意义。获得的主要研究结果如下:1通过对EF1、UBQ、ACT、GADPH、Histone、TUA、TUB、18S、elf-5A、α-tubulin10个候选基因在红苞凤梨不同生长阶段、全绿和全白叶样品中进行RT-q PCR表达模式分析,筛选出红苞凤梨不同生长发育时期最适内参基因是Histone和α-tubulin,18s、EF1和α-tubulin的内参组合在全绿苗和全白苗的对比分析时最理想。采用Pet F基因验证筛选结果,证明所选的内参基因合适。2以红苞凤梨全绿植株和全白植株叶片为材料,通过RNA-seq测序,经COG、GO和KEGG功能注释分析,发现DEGs主要在叶绿体发育、叶绿素合成和光合作用途径富集。而叶绿素合成代谢过程中有13个差异表达基因,RNA-seq和Real time q PCR分析表明,13个DEGs中仅2个POR基因在全白植株中下调表达。POR基因可能是红苞凤梨叶片白化细胞失绿突变的关键基因。3测定了红苞凤梨组培全白和全绿植株的叶绿素合成中间代谢产物及叶绿素的含量。全绿叶片中Pchlide的含量是全白叶片的4倍,经原叶绿素酸酯氧化还原酶（POR）的催化,全绿叶片中Chla的含量是全白叶片的30倍。结合转录组测序结果进行分析,推测POR基因可能是关键基因,POR基因编码的原叶绿素酸酯氧化还原酶抑制可能是导致是细胞失绿白化的关键原因。4克隆得到2个POR基因的c DNA序列,分别命名为POR1和POR2,两个基因的ORF序列长度分别为1167bp和1218bp,分别编码388和405个氨基酸。导入NCBI进行Blast比对,确定两个基因均是POR基因,属于短链脱氢酶（c-like SDR）家族。这两条核苷酸序列的同源性为73.81%,由碱基推导的氨基酸序列同源性为74.08%。将氨基酸序列与39个不同植物的不同类型POR基因的氨基酸序列进行比对,并建立系统进化树,推测POR1可能为红苞凤梨的PORB基因,POR2为红苞凤梨的PORA基因。5选取PDS基因作为指示基因,使用烟草脆裂病毒为载体,在红苞凤梨中建立VIGS基因沉默体系。构建基因沉默载体PDS-TRV2,利用农杆菌GV3101介导将沉默载体PDS-TRV2和TRV2空载注射红苞凤梨全绿苗。经PCR检测确定病毒在植物内复制并转移,对沉默后的红苞凤梨叶色进行比对,发现转沉默载体的红苞凤梨（Si）和转沉默载体的隔叶（Si-Ge）叶色轻微偏黄,对基因沉默的红苞凤梨类胡萝卜素含量分析表明,Si组和Si-Ge组红苞凤梨类胡萝卜素含量低于阴性对照组（CK）和阳性对照组（P）,说明成功构建红苞凤梨VIGS体系。6使用构建成功的VIGS体系,分别选取POR1、POR2中各230bp和298bp保守序列,分别构建沉默载体POR1-TRV2和POR2-TRV2,利用农杆菌GV3101介导将两个POR基因沉默载体和TRV2空载注射红苞凤梨全绿苗。RT-q PCR检测发现转沉默载体的红苞凤梨（Ti）POR基因表达量低于阴性对照组（CK）和阳性对照组（P）。对沉默后的红苞凤梨叶色进行比对,Ti1组和Ti1-Ge组红苞凤梨叶色总体偏黄,且Ti1组和Ti1-Ge组叶绿素含量相较两个对照组下降30%,说明Ti1组叶绿素合成受阻;Ti2组和Ti2-Ge组红苞凤梨叶色与两个对照组相近,且Ti2组和Ti2-Ge组叶绿素含量与两个对照组差异不显着,说明Ti2组叶绿素合成未受太大影响。推测POR1基因可能在叶片叶绿素合成过程中发挥较重要的作用。
二、植物病毒载体的研究进展及其应用（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、植物病毒载体的研究进展及其应用（论文提纲范文）
（1）VIGS基因沉默技术在作物基因功能研究中的应用与展望（论文提纲范文）
| 1 VIGS技术原理 |
| 2 VIGS的发展 |
| 2.1 病毒沉默载体的发展 |
| 2.2 VIGS技术的拓展 |
| 2.2.1 小RNA介导的VIGS |
| 2.2.2 寄主诱导的基因沉默 |
| 2.3 VIGS接种方式的发展 |
| 3 VIGS在作物中的应用 |
| 3.1 VIGS在单子叶作物中的应用 |
| 3.2 VIGS在棉花中的应用 |
| 3.3 VIGS在蔬菜中的应用 |
| 3.4 VIGS在果树中的应用 |
| 3.5 VIGS在药用植物中的应用 |
| 4 影响VIGS效率的因素 |
| 4.1 环境因素 |
| 4.2 病毒载体 |
| 4.3 插入基因片段 |
| 4.4 侵染方式 |
| 5 VIGS的检测 |
| 6 VIGS存在的问题及解决方法 |
| 7 展望 |
（2）组织工程血管化基因治疗的研究进展（论文提纲范文）
| 文章快速阅读： |
| 文题释义： |
| 0引言Introduction |
| 1 资料和方法Data and methods |
| 1.1 资料来源 |
| 1.2 筛选标准 |
| 1.3 文献的提取 |
| 2 结果Results |
| 2.1 基因治疗中的成血管种子细胞 |
| 2.2 基因治疗中的促血管化目的基因 |
| 2.3 基因治疗中的载体 |
| 3 总结与展望Summary and prospects |
（3）CRISPR介导的基因激活系统的开发及应用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 第一章 利用CRISPR/LbCpf1构建高特异性的激活系统 |
| 前言 |
| 1.1 材料与方法 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.3 统计学分析 |
| 1.4 实验结果 |
| 1.5 讨论 |
| 1.6 本章小结 |
| 第二章 利用CRISPR/CjCas9构建小而高效的激活系统及其应用 |
| 前言 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.3 统计学分析 |
| 2.4 实验结果 |
| 2.5 讨论 |
| 2.6 本章小结 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间成果 |
| 致谢 |
（4）茄二十八星瓢虫NPC1a基因鉴定、功能分析和防治应用研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 茄二十八星瓢虫概述 |
| 1.2 昆虫NPC1 基因的研究进展 |
| 1.3 RNAi及其应用概述 |
| 1.4 VIGS技术在昆虫基因功能中的研究进展 |
| 1.4.1 VIGS技术介导昆虫RNAi的应用研究 |
| 1.4.2 VIGS技术介导昆虫RNAi效率的影响因素 |
| 1.4.3 VIGS技术介导昆虫RNAi的优缺点 |
| 1.5 研究的目的意义和内容 |
| 第二章 茄二十八星瓢虫NPC1a基因的克隆及时空表达 |
| 2.1 材料和方法 |
| 2.1.1 供试虫源 |
| 2.1.2 主要仪器和试剂 |
| 2.1.3 常用溶液和培养基 |
| 2.1.4 试验方法 |
| 2.2 结果与分析 |
| 2.2.1 茄二十八星瓢虫与马铃薯瓢虫鉴别 |
| 2.2.2 茄二十八星瓢虫NPC1a基因序列分析与鉴定 |
| 2.2.3 NPC1a基因在茄二十八星瓢虫不同发育阶段和不同组织相对表达量分析 |
| 2.3 讨论 |
| 第三章 干扰NPC1a基因的效果评估 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 供试虫源与植物 |
| 3.1.2 主要试剂和仪器 |
| 3.1.3 常用溶液和培养基 |
| 3.1.4 试验方法 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.2.1 试剂盒合成dsRNA |
| 3.2.2 VIGS技术诱导番茄表达dsRNA |
| 3.3 讨论 |
| 第四章 结论与研究展望 |
| 4.1 总结 |
| 4.2 创新点 |
| 4.3 问题与展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（5）番木瓜畸形花叶病毒在寄主基因功能鉴定及交叉保护中的应用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 一.引言 |
| 1.1 番木瓜畸形花叶病毒 |
| 1.1.1 PLDMV的特点、病征与基因结构 |
| 1.1.2 PLDMV的检测方法 |
| 1.1.3 Potyvirus侵染性克隆的构建及其在大肠杆菌中的不稳定性 |
| 1.2 植物病毒表达载体 |
| 1.2.1 用于外源基因表达 |
| 1.2.2 用于构建弱毒株进行交叉保护 |
| 1.2.3 用于病毒诱导的基因沉默(VIGS)对宿主基因功能鉴定 |
| 1.3 本研究的目的、意义、创新点及主要内容 |
| 1.3.1 本研究的目的及意义 |
| 1.3.2 本研究的主要内容及创新点 |
| 1.3.3 本研究的技术路线 |
| 二.材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 植物材料及病毒株 |
| 2.1.2 菌株及载体 |
| 2.1.3 主要试剂及培养基配方 |
| 2.1.4 主要仪器设备 |
| 2.1.5 引物 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 植物总RNA的提取 |
| 2.2.2 RNA纯度及完整性检测 |
| 2.2.3 反转录cDNA第一链的合成 |
| 2.2.4 聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction,PCR) |
| 2.2.5 琼脂糖凝胶电泳及回收 |
| 2.2.6 DNA测序与数据分析 |
| 2.2.7 Gibson assembly |
| 2.2.8 农杆菌的转化 |
| 2.2.9 转化子阳性克隆鉴定PCR反应 |
| 2.2.10 农杆菌接种液的配置及接种方法 |
| 2.2.11 快速核酸提取方法 |
| 2.2.12 RT-LAMP可视化检测 |
| 2.2.13 q RT-PCR荧光实时定量检测 |
| 2.2.14 叶绿素的提取及含量测定 |
| 2.2.15 苄基硫代葡萄糖苷的提取 |
| 2.2.16 高效液相色谱 |
| 2.3 插入外源报告基因的PLDMV病毒表达载体的构建及应用 |
| 2.3.1 两种含有外源报告基因的PLDMV病毒表达载体的构建 |
| 2.3.2 PLDMV-GFP的接种、侵染效率测定及NGS样品制备 |
| 2.3.3 感病番木瓜植株Vsi RNA的测定及其靶基因的预测分析 |
| 2.3.4 番木瓜基因沉默系统中三种关键基因相对表达量分析 |
| 2.4 三种PLDMV-HC-Pro突变体弱毒株表达载体的构建及应用 |
| 2.4.1 三种PLDMV-HC-Pro突变体弱毒株病毒表达载体的构建 |
| 2.4.2 三种PLDMV-HC-Pro突变体弱毒株交叉保护及攻毒实验 |
| 2.4.3 交叉保护机制验证实验 |
| 2.4.4 PLDMV-EI突变体弱毒株在大田中的相对防效测定 |
| 2.5 PLDMV-VIGS病毒表达载体的构建及应用 |
| 2.5.1 多种PLDMV-VIGS基因功能鉴定载体的构建 |
| 2.5.2 插入片段长度对PLDMV-VIGS基因沉默效果的影响 |
| 2.5.3 不同环境温度对PLDMV-VIGS基因沉默效果的影响 |
| 2.5.4 番木瓜CYP83B1基因功能的鉴定 |
| 三.结果与分析 |
| 3.1 插入外源报告基因的PLDMV病毒表达载体的构建及应用结果 |
| 3.1.1 两种含有外源报告基因的PLDMV病毒表达载体的构建结果 |
| 3.1.2 PLDMV-GFP的侵染效率测定结果 |
| 3.1.3 感病番木瓜病毒来源的siRNA测序结果分析 |
| 3.1.4 番木瓜基因沉默系统中三种关键基因相对表达量分析结果 |
| 3.2 三种PLDMV-HC-Pro突变体弱毒株表达载体的构建及应用结果 |
| 3.2.1 三种PLDMV突变体弱毒株的表达载体构建结果 |
| 3.2.2 三种PLDMV-HC-Pro突变体弱毒株交叉保护及攻毒实验结果 |
| 3.2.3 交叉保护机制验证实验结果 |
| 3.2.4 PLDMV-EI突变体弱毒株在大田中的相对防效测定结果 |
| 3.3 PLDMV-VIGS病毒表达载体的构建及应用结果 |
| 3.3.1 多种PLDMV-VIGS基因功能鉴定载体的构建结果 |
| 3.3.2 插入片段长度对PLDMV-VIGS基因沉默效果的影响分析 |
| 3.3.3 不同环境温度对PLDMV-VIGS基因沉默效果的影响分析 |
| 3.3.4 番木瓜CYP83B1基因功能鉴定结果 |
| 四.讨论 |
| 4.1 一种E.coli-Free快速稳定构建Potyvirus病毒表达载体的新方法 |
| 4.2 一种适用于大田间感病植株可视化检测技术的建立 |
| 4.3 番木瓜基因沉默与防御系统分析 |
| 4.4 多位点突变弱毒株PLDMV致病力的影响及交叉保护效果分析 |
| 4.5 VIGS沉默效果的影响因素 |
| 五.结论 |
| 参考文献 |
| 缩略语表 |
| 附录 |
| 致谢 |
（6）双链RNA介导的烟草抗病毒病（TMV,CMV,PVY）和靶斑病（Rhizoctonia solani）的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 双链RNA和 RNA干扰的研究进展 |
| 1.1.1 双链RNA的形成与RNA干扰的发现 |
| 1.1.2 RNA干扰的作用机制与特点 |
| 1.1.3 RNA干扰在植物抗病研究方面的应用 |
| 1.1.4 植物病毒载体在RNA干扰方面的应用 |
| 1.2 三种重要烟草病毒病的研究进展 |
| 1.2.1 烟草花叶病毒(TMV)的研究进展 |
| 1.2.2 黄瓜花叶病毒(CMV)的研究进展 |
| 1.2.3 马铃薯Y病毒(PVY)的研究进展 |
| 1.2.4 烟草病毒病的防治现状 |
| 1.3 烟草靶斑病的研究进展 |
| 1.3.1 病害发生情况 |
| 1.3.2 危害症状 |
| 1.3.3 病原菌 |
| 1.3.4 重要致病基因 |
| 1.3.5 烟草靶斑病的防治现状 |
| 第二章 三种病毒靶标序列的获得及VIGS载体的构建 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 试验材料 |
| 2.1.2 TMV,CMV和 PVY诱导的VIGS体系的建立及沉默检测 |
| 2.1.3 TMV-p126,CMV-2a和 PVY-HC-pro核酸片段融合VIGS载体的构建及基因沉默效果检测 |
| 2.2 结果与分析 |
| 2.2.1 TMV,CMV和 PVY诱导的VIGS体系的建立及沉默效果分析 |
| 2.2.2 核酸序列融合的VIGS沉默效果及分析 |
| 2.3 小结 |
| 第三章 烟草靶斑病菌靶标序列的获得及VIGS体系的建立 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 试验材料 |
| 3.1.2 试验方法 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.2.1 RPMK1 基因和endoPGs基因的获得 |
| 3.2.2 pTRV-RPMK1和pTRV-endoPGs重组表达载体转入大肠杆菌 |
| 3.2.3 TRV-RPMK1和TRV-endoPGs诱导的VIGS体系的沉默效果及分析 |
| 3.3 小结 |
| 第四章 双链RNA的表达及抗病性的初步分析 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 试验材料 |
| 4.1.2 三种病毒序列和烟草靶斑病菌基因序列的dsRNA的表达 |
| 4.1.3 外源dsRNA的应用 |
| 4.2 结果与分析 |
| 4.2.1 载体pT-3FF的菌落PCR鉴定 |
| 4.2.2 表达dsRNA-3FF,dsRNA-RPMK1,dsRNA-endoPGs和 dsRNA-GFP的模板制备 |
| 4.2.3 dsRNA-3FF,dsRNA-RPMK1,dsRNA-endoPGs和 dsRNA-GFP的表达 |
| 4.2.4 外源dsRNA-3FF对三种病毒的抑制效果分析 |
| 4.2.5 外源dsRNA-RPMK1和dsRNA-endoPGs对靶斑病菌的抑制效果分析 |
| 4.3 小结 |
| 第五章 结论与讨论 |
| 5.1 病毒诱导的基因沉默(VIGS)对 TMV,CMV和 PVY的抑制效果 |
| 5.2 病毒诱导的基因沉默(VIGS)对烟草靶斑病的抑制效果 |
| 5.3 外源dsRNA抗三种烟草病毒(TMV,CMV和 PVY)和烟草靶斑病菌 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读硕士期间发表论文情况 |
（7）大豆花叶病毒介导的大豆生物反应器构建及抗除草剂蛋白表达的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略词表 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 植物生物反应器概况 |
| 1.1.1 植物生物反应器 |
| 1.1.2 植物生物反应器的构建流程 |
| 1.2 病毒介导的植物生物反应器 |
| 1.2.1 植物病毒载体用于表达外源蛋白的研究 |
| 1.2.2 植物病毒重组载体的构建策略 |
| 1.3 大豆花叶病毒 |
| 1.3.1 大豆花叶病毒的性质 |
| 1.3.2 大豆花叶病毒的基因组结构 |
| 1.4 抗除草剂蛋白概况 |
| 1.4.1 抗除草剂蛋白作用机理 |
| 1.4.2 Bar基因调控PAT蛋白的表达研究 |
| 1.5 本研究的目的和意义 |
| 第二章 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 主要试剂 |
| 2.1.2 主要仪器 |
| 2.1.3 毒源、菌株和植物材料 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 大豆花叶病毒侵染性克隆SMV3 的改造 |
| 2.2.2 目的基因的克隆 |
| 2.2.3 SMV3-2 载体的构建 |
| 2.2.4 SMV3-2-bar重组病毒的构建 |
| 2.2.5 重组载体转化大豆植株 |
| 2.2.6 SMV3-2-bar的表达分析 |
| 2.2.7 PAT蛋白在大豆叶片上的积累趋势 |
| 2.2.8 PAT蛋白的纯化 |
| 2.2.9 PAT蛋白的生物学测定 |
| 2.2.10 遗传稳定性分析 |
| 第三章 结果与分析 |
| 3.1 侵染性克隆改造 |
| 3.2 目的基因的克隆 |
| 3.3 SMV3-2 载体的构建 |
| 3.4 SMV3-2-bar重组病毒的构建 |
| 3.5 SMV3-2-bar重组病毒的表达 |
| 3.6 转化植株RT-PCR检测结果 |
| 3.7 转化植株ELISA检测 |
| 3.8 转化植株Western-Blot检测结果 |
| 3.9 PAT蛋白在大豆叶片上的积累趋势 |
| 3.10 生物学测定结果 |
| 3.11 纯化的PAT蛋白Western-blot分析结果 |
| 3.12 遗传稳定性分析结果 |
| 第四章 讨论 |
| 4.1 SMV3-2 介导的大豆植物生物反应器 |
| 4.2 外源蛋白PAT的积累趋势 |
| 4.3 验证PAT蛋白的生物活性 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 发表论文与参加科研情况说明 |
| 致谢 |
（8）Ⅰ型启动子及其终止序列对植物病毒载体系统表达效率的影响分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 1 绪论 |
| 1.1 植物RNA病毒载体表达系统 |
| 1.2 启动子、终止子与RNA病毒表达载体 |
| 1.3 TBSV病毒表达载体 |
| 1.4 研究的目的及意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料与试剂 |
| 2.2 实验中病毒表达载体的构建 |
| 2.2.1 Ⅰ型启动子顺式调控序列系列病毒表达载体的构建 |
| 2.2.2 Ⅰ型启动子转录特性系列病毒表达载体的构建 |
| 2.2.3 Ⅰ型终止子系列病毒表达载体的构建 |
| 2.3 重组质粒的农杆菌转化(冻融法)及筛选鉴定 |
| 2.4 农杆菌渗滤(Agro-infiltration)接种本氏烟 |
| 2.5 本氏烟叶片接种部位GFP荧光检测 |
| 2.6 叶片可溶性总蛋白(Total soluble proteins,TSPs)的提取 |
| 2.7 SDS-PAGE凝胶电泳 |
| 2.8 Western Blots检测 |
| 2.9 本氏烟叶片中GFP表达量测定 |
| 2.10 本氏烟叶片总RNA提取和RT-PCR检测 |
| 2.11 统计学分析 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 Ⅰ型启动子顺式调控序列对病毒载体的影响研究 |
| 3.1.1 启动子长度对病毒载体的影响 |
| 3.1.2 T串及转录起始位点核苷酸种类对病毒载体的影响 |
| 3.1.3 转录起始位点下游延伸序列对病毒载体的影响 |
| 3.1.4 ELS序列(Enhancer-like sequence)对病毒载体的影响 |
| 3.2 Ⅰ型启动子转录特性对病毒载体的影响研究 |
| 3.2.1 Ⅰ型启动子转录专一性及转录强度比较 |
| 3.2.2 ELS和转录起始位点下游序列对Ⅰ型启动子转录专一性影响 |
| 3.2.3 突变Ⅰ型启动子核心序列对其转录专一性的影响 |
| 3.3 Ⅰ型终止子对病毒载体的影响 |
| 3.3.1 不同来源Ⅰ型终止子对病毒载体的影响 |
| 3.3.2 Ⅰ型终止子对Ⅰ型启动子转录专一性的影响 |
| 3.3.3 载体3'末端旁侧序列对病毒载体表达的影响 |
| 4 讨论 |
| 4.1 植物RNA病毒载体表达系统的生物安全性问题 |
| 4.2 植物Ⅰ型启动子结构特点与转录特性 |
| 4.3 病毒3'末端的自我修复与病毒表达载体的构建 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简介 |
（9）以类水滑石纳米片材料作为生物分子细胞导入载体的方法研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 1 引言 |
| 1.1 外源生物分子导入细胞技术的概述 |
| 1.1.1 外源生物分子导入细胞技术的概念与种类 |
| 1.1.2 外源生物分子导入细胞技术的应用与进展 |
| 1.2 类水滑石作为生物分子载体的概述 |
| 1.2.1 类水滑石载体的概念与种类 |
| 1.2.2 类水滑石载体的应用与进展 |
| 1.3 本论文选题目的意义和研究内容 |
| 1.3.1 研究目的 |
| 1.3.2 研究意义 |
| 1.3.3 研究内容 |
| 1.4 技术路线 |
| 2 类水滑石纳米片的合成与表征 |
| 2.1 实验试剂与实验设备 |
| 2.1.1 实验试剂 |
| 2.1.2 实验设备 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 合成乳酸根插层的类水滑石 |
| 2.2.2 剥离乳酸根插层的类水滑石 |
| 2.2.3 合成醋酸根插层的类水滑石 |
| 2.2.4 剥离醋酸根插层的类水滑石 |
| 2.2.5 表征实验样品 |
| 2.3 结果与讨论 |
| 2.3.1 X-射线衍射分析 |
| 2.3.2 扫描电子显微镜分析 |
| 2.3.3 透射电子显微镜分析 |
| 2.3.4 原子力显微镜分析 |
| 2.4 本章小结 |
| 3 探究类水滑石纳米片负载生物分子导入动物细胞的能力 |
| 3.1 实验试剂与实验设备 |
| 3.1.1 实验试剂 |
| 3.1.2 实验设备 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 类水滑石纳米片吸附生物分子 |
| 3.2.2 类水滑石纳米片对动物细胞的毒性 |
| 3.2.3 类水滑石纳米片负载生物分子导入动物细胞 |
| 3.3 结果与讨论 |
| 3.3.1 类水滑石纳米片吸附生物分子 |
| 3.3.2 类水滑石纳米片对动物细胞的毒性 |
| 3.3.3 类水滑石纳米片负载生物分子导入动物细胞 |
| 3.4 本章小结 |
| 4 探究类水滑石纳米片负载生物分子导入植物细胞的能力 |
| 4.1 实验试剂与实验设备 |
| 4.1.1 实验试剂 |
| 4.1.2 实验设备 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 类水滑石纳米片对植物细胞的毒性 |
| 4.2.2 类水滑石纳米片负载生物分子导入植物细胞 |
| 4.3 结果与讨论 |
| 4.3.1 类水滑石纳米片对植物细胞的毒性 |
| 4.3.2 类水滑石纳米片负载生物分子导入植物细胞 |
| 4.4 本章小结 |
| 5 探究类水滑石纳米片负载生物分子导入细胞的跨膜机制 |
| 5.1 实验试剂与实验设备 |
| 5.1.1 实验试剂 |
| 5.1.2 实验设备 |
| 5.2 实验方法 |
| 5.2.1 通过细胞生物学手段探究类水滑石纳米片的跨膜机制 |
| 5.2.2 通过计算机模拟技术探究类水滑石纳米片的跨膜机制 |
| 5.3 结果与讨论 |
| 5.3.1 通过细胞生物学手段探究类水滑石纳米片的跨膜机制 |
| 5.3.2 通过计算机模拟技术探究类水滑石纳米片的跨膜机制 |
| 5.4 本章小结 |
| 6 结论与展望 |
| 6.1 结论 |
| 6.2 创新点 |
| 6.3 展望 |
| 参考文献 |
| 个人简介 |
| 导师简介 |
| 攻读博士期间获得成果目录清单 |
| 致谢 |
（10）红苞凤梨VIGS基因沉默体系的建立及POR基因的克隆与功能验证（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 前言 |
| 1.文献综述 |
| 1.1 凤梨科植物研究进展 |
| 1.1.1 凤梨科植物发展现状 |
| 1.1.2 凤梨科植物转基因技术研究 |
| 1.2 植物嵌合体机理研究 |
| 1.2.1 植物嵌合体的类型及产生 |
| 1.2.2 嵌合体发生的分子机制 |
| 1.3 VIGS基因沉默技术及其应用 |
| 1.3.1 病毒诱导的基因沉默(VIGS)的作用机理 |
| 1.3.2 影响VIGS的因素 |
| 1.3.3 VIGS技术的应用 |
| 1.4 POR基因的研究进展 |
| 1.4.1 POR基因的功能 |
| 1.4.2 POR基因在各种植物中的研究进展 |
| 1.5 本研究的目的与意义 |
| 2.红苞凤梨实时荧光定量PCR分析中内参基因的筛选 |
| 2.1 试验材料 |
| 2.2 试验仪器及试剂 |
| 2.2.1 主要试验仪器 |
| 2.2.2 试验试剂 |
| 2.3 试验方法 |
| 2.3.1 引物的设计 |
| 2.3.2 总RNA的提取和cDNA第一链的合成 |
| 2.3.3 实时荧光定量PCR(Real-timeqPCR) |
| 2.3.4 数据分析 |
| 2.4 结果分析 |
| 2.4.1 荧光定量PCR引物的特异性及扩增效率 |
| 2.4.2 内参基因的筛选 |
| 3.红苞凤梨全白、全绿植株表达谱测序分析及关键基因的筛选 |
| 3.1 试验材料 |
| 3.2 试验仪器及试剂 |
| 3.2.1 主要仪器 |
| 3.2.2 主要试剂 |
| 3.3 试验方法 |
| 3.3.1 全白、全绿植株RNA的提取与质量检测 |
| 3.3.2 表达谱测序 |
| 3.3.3 表达谱测序信息分析 |
| 3.3.4 叶绿素合成关键基因的荧光定量表达 |
| 3.4 结果分析 |
| 3.4.1 全绿、全白植株细胞间的差异表达基因分析 |
| 3.4.2 GO和KEGG途径对DEGs的富集分析 |
| 3.4.3 全绿、全白植株光合色素生物合成相关DEGs功能注释分析 |
| 3.4.4 全绿、全白植株叶绿素合成相关基因表达差异分析 |
| 3.4.5 叶绿素生物合成相关基因RealtimeqPCR表达分析 |
| 4.红苞凤梨叶片叶绿素含量及其合成代谢相关指标的测定 |
| 4.1 试验材料 |
| 4.2 主要试验试剂及仪器 |
| 4.2.1 主要仪器 |
| 4.2.2 主要试剂 |
| 4.3 测定项目与方法 |
| 4.3.1 叶绿素和类胡萝卜素含量测定 |
| 4.3.2 叶绿素合成前体物质含量测定 |
| 4.3.3 原叶绿素酸酯氧化还原酶(POR)活性的测定 |
| 4.4 结果分析 |
| 4.4.1 叶绿素和类胡萝卜素含量分析 |
| 4.4.2 叶绿素生物合成前体的评估 |
| 4.4.3 全绿、全白植株POR酶活性比较 |
| 5.红苞凤梨POR基因的克隆及POR序列分析 |
| 5.1 试验材料 |
| 5.2 试验仪器及试剂 |
| 5.2.1 主要仪器 |
| 5.2.2 主要试剂及配方 |
| 5.3 试验方法 |
| 5.3.1 红苞凤梨总RNA的提取 |
| 5.3.2 cDNA第一链合成 |
| 5.3.3 POR基因全长的扩增和测序 |
| 5.4 结果分析 |
| 5.4.1 红苞凤梨总RNA质量的检测 |
| 5.4.2 POR基因全长的克隆 |
| 5.4.3 POR基因的生物信息学分析 |
| 6.红苞凤梨VIGS体系的建立 |
| 6.1 试验材料 |
| 6.2 试验仪器及试剂 |
| 6.2.1 主要仪器 |
| 6.2.2 主要试剂及配方 |
| 6.3 试验方法 |
| 6.3.1 红苞凤梨PDS干扰载体的构建 |
| 6.3.2 沉默载体质粒冻融法转化农杆菌感受态 |
| 6.3.3 农杆菌介导的病毒感染 |
| 6.3.4 红苞凤梨PDS基因沉默的鉴定 |
| 6.4 结果分析 |
| 6.4.1 PDS沉默载体的构建 |
| 6.4.2 冻融法转化沉默载体质粒 |
| 6.4.3 红苞凤梨PDS基因沉默的表型分析 |
| 6.4.4 红苞凤梨PDS基因沉默及类胡萝卜素含量 |
| 6.4.5 PDS基因沉默的病毒分子检验及PCR鉴定 |
| 7.POR基因的功能验证 |
| 7.1 试验材料 |
| 7.2 试验仪器及试剂 |
| 7.2.1 主要仪器 |
| 7.2.2 主要试剂及配方 |
| 7.3 试验方法 |
| 7.3.1 红苞凤梨POR沉默载体的构建 |
| 7.3.2 沉默载体质粒冻融法转化农杆菌感受态 |
| 7.3.3 农杆菌介导的病毒感染 |
| 7.3.4 红苞凤梨POR基因沉默的鉴定 |
| 7.4 结果分析 |
| 7.4.1 POR沉默载体的构建 |
| 7.4.2 冻融法转化沉默载体质粒 |
| 7.4.3 红苞凤梨POR基因沉默及叶绿素含量 |
| 7.4.4 红苞凤梨POR基因沉默后的POR酶活性 |
| 7.4.5 POR基因沉默的病毒分子检验 |
| 7.4.6 红苞凤梨POR基因荧光定量表达分析 |
| 8.结论与讨论 |
| 8.1 红苞凤梨内参基因的筛选 |
| 8.2 红苞凤梨叶片白化关键基因的筛选 |
| 8.3 POR基因的序列特征及所编码的蛋白质基本性质 |
| 8.4 红苞凤梨VIGS体系的建立 |
| 8.5 POR基因的功能分析 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
四、植物病毒载体的研究进展及其应用（论文参考文献）
- [1]VIGS基因沉默技术在作物基因功能研究中的应用与展望[J]. 郝梦媛,杭琦,师恭曜. 中国农业科技导报, 2022(01)
- [2]组织工程血管化基因治疗的研究进展[J]. 李光照,陈锐,贾洪林,任利玲. 中国组织工程研究, 2022(28)
- [3]CRISPR介导的基因激活系统的开发及应用[D]. 张鑫. 南方医科大学, 2021
- [4]茄二十八星瓢虫NPC1a基因鉴定、功能分析和防治应用研究[D]. 王鑫仪. 西北农林科技大学, 2021(01)
- [5]番木瓜畸形花叶病毒在寄主基因功能鉴定及交叉保护中的应用[D]. 赵光远. 海南大学, 2020(02)
- [6]双链RNA介导的烟草抗病毒病（TMV,CMV,PVY）和靶斑病（Rhizoctonia solani）的研究[D]. 郭依. 沈阳农业大学, 2020(08)
- [7]大豆花叶病毒介导的大豆生物反应器构建及抗除草剂蛋白表达的研究[D]. 郭炎. 吉林师范大学, 2019(06)
- [8]Ⅰ型启动子及其终止序列对植物病毒载体系统表达效率的影响分析[D]. 徐丽. 宁夏大学, 2019(02)
- [9]以类水滑石纳米片材料作为生物分子细胞导入载体的方法研究[D]. 包文龙. 北京林业大学, 2018(04)
- [10]红苞凤梨VIGS基因沉默体系的建立及POR基因的克隆与功能验证[D]. 李瑞雪. 四川农业大学, 2018(02)