一、L-乳酸脱氢酶催化反应机理的理论研究进展（论文文献综述）
彭斌[1]（2021）在《新型类母乳OMO型结构酯的酶法合成、动力学模拟及对肝细胞脂质代谢的影响》文中研究指明中长链甘油三酯（MLCTs）是指甘油骨架上同时含有长链脂肪酸和中链脂肪酸的结构甘三酯,因其在人体中独特的代谢途径和在免疫系统中所起的积极作用等成为油脂领域研究的热点。到目前为止,MLCTs已被合成主要有四种,及MLL、MML、LML、MLM,大多数在结构上是脂肪酸链长和位置的差别。有研究表明MLCTs在降低体重预防肥胖方面扮演着重要角色,影响体内脂质代谢;同时MLCTs在提供人体必需脂肪酸方面发挥着重要作用。因此MLCTs具有较高的潜在营养价值,或可用作植物油替代品。1,3-二油酸-2-中链脂肪酸（OMO）型结构酯是一类具有类似母乳结构酯1,3-二油酸-2-棕榈酸（OPO）的新型甘油三酯,由两个油酸分布在甘油骨架的sn-1,3位,一个中链脂肪酸分布在甘油骨架的sn-2位组成,是一种LML型的MLCTs。理论上,这种结构酯既可能有MLCTs的功能,也可能有母乳结构酯的部分功能。然而,目前关于类母乳OMO型结构酯及其功能的研究未见报道。为深入了解OMO型结构酯的酶法合成性质和功能,提升工业上OMO型结构酯在功能食品领域的开发应用,本研究采用香樟籽油与油酸（甘油三酯与脂肪酸）、椰子油与高油酸菜籽油（甘油三酯与甘油三酯）二种方式酶法合成高OMO型结构酯含量的MLCTs,GC/HPLC-APCI-MS技术检测分析结构酯上脂肪酸的组成含量和位置分布;研究微量水分油体系中常见四种脂肪酶（Lipozyme RM IM、Lipozyme TL IM、Novozym 435和AO IM）催化合成OMO型结构酯过程中,酶催化性能和结构变化规律;分子动力学和量子化学从分子水平上深入探讨外界因素如何影响脂肪酶结构和OMO型结构酯合成过程中过渡态四面体的形成及反应能垒等催化机制;最后研究探讨OMO型结构酯对油酸诱导的人肝细胞LO2脂质沉积的影响及其机制。本研究可为二种方式酶法合成结构酯提供普适性的理论依据。主要研究结果如下:1、以樟树籽油和油酸为原料,采用脂肪酶Lipozyme RM IM合成了高OMO含量的MLCTs,并对其酰基迁移速率（RAM）进行了研究。在底物樟树籽油与油酸的摩尔比为1:4、酶用量为10%、反应温度为60 oC、反应时间为24 h的最佳条件下,OMO结构酯的产率（YST）最大可达64.45%,同时RAM为28.66%。在底物摩尔比（r2=0.999,P<0.01）、酶用量（r2=0.988,P<0.01）、温度60 oC以下（r2=0.923,P<0.05）和反应时间24 h内（r2=0.940,P<0.05）,YST与RAM呈显着正相关。而在温度60 oC以上（r2=-0.682,P>0.05）或反应时间24 h以上（r2=-0.594,P>0.05）时,YST与RAM呈负相关。分子动力学模拟验证了温度对脂肪酶Lipozyme RM IM结构的影响,随着温度的升高,酶活性位点盖子的打开程度增加,有助于底物侵入酶活性中心催化三元体。当温度高于333 K（60 oC）时,促进了活性中心催化三联体的重排,导致酶催化活性降低和引发酰基迁移。这项研究有助于理解甘油三酯与脂肪酸酸解合成结构酯在高温下酰基迁移的触发机制,发现在无溶剂反应体系中,反应温度是平衡YST和RAM的关键因素。2、在脂肪酶Lipozyme RM IM催化的椰子油与高油酸菜籽油酯酯交换反应中,通过促进酰基迁移,合成了高OMO含量的结构酯。正交试验L25（55）结果表明,在椰子油与高油酸菜籽油摩尔比为50:50、酶用量为12%、反应温度为60 oC、反应时间为2 h、水活度为0.07的条件下,OMO结构酯的最大产率为45.65%。低水活度下,酰基迁移率较高（10.86%vs 5.07%无水体系）,由于中链脂肪酸向甘油骨架上sn-2位置迁移,促进了OMO型结构酯的合成。分子动力学模拟发现,在低含水量（5%）下,水分子通过氢键稳定Lipozyme RM IM的整体结构,有助于固定脂肪酶催化的活性中心,使底物更容易插入活性位点,从而提高酶的活性。3、以椰子油和菜籽油为原料,在微量水分油体系中,通过不同脂肪酶催化反应合成了OMO型结构酯,通过实验分析和计算机模拟,比较了Lipozyme RM IM、Lipozyme TL IM、Novozym 435和米曲霉固定化脂肪酶（AO IM）四种脂肪酶的稳定性,阐明了Novozym 435在OMO型结构酯合成过程中的催化机理。傅立叶变换红外光谱（FTIR）和分子动力学模拟（MD）结果表明,有序结构（α-螺旋和β-折叠）的减少导致酶活性的降低。与Lipozyme RM IM和Novozym 435相比,Lipozyme TL IM和AO IM表现出更好的稳定性,可能是由于Lipozyme TL IM的短链覆盖了活性位点,AO IM的活性中心与水之间形成氢键。在四种脂肪酶中,AO IM表现出最佳的催化性能:3 h时OMO型结构酯产率为30.7%,48 h内具有良好的催化稳定性。密度泛函理论结果表明,在OMO型结构酯的合成过程中,添加Novozym 435（来源于南极假丝酵母脂肪酶B,CALB）显着降低了反应能垒（有脂肪酶CALB时反应能垒为64.4 KJ/mol,无脂肪酶时为332.7KJ/mol）,由于过渡态四面体中间体的形成,有助于生成OMO型结构酯。微量水分油体系可能是脂肪酶催化合成OMO型结构酯的一种绿色高效的替代反应环境,研究对脂肪酶在甘油三酯酯交换合成结构酯过程中的稳定性/不稳定性及催化机理提供了重要的认识。4、反应环境对脂肪酶的结构稳定性和催化活性起着至关重要的作用。采用MD模拟和FTIR研究了正己烷、甲醇、超临界CO2（sc CO2）、1-丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐离子液体（[BMIM][BF4]）以及三油酸甘油三酯（作为无溶剂体系处理）等五种非水相体系和水相体系,对南极假丝酵母脂肪酶B（CALB）结构性质的影响。均方根偏差（RMSD）分析表明,脂肪酶CALB在正己烷（0.239nm）和三油酸甘油三酯（0.188 nm）中的结构变化均小于在水溶液（0.275 nm）中的结构变化,说明脂肪酶CALB在正己烷和三油酸甘油三酯中具有良好的结构稳定性。此外,回旋半径（Rg）分析表明,在甲醇中,脂肪酶CALB结构的致密性显着降低（P<0.05）,导致脂肪酶稳定性下降。二级结构分析表明,在非水相体系中,脂肪酶的β-折叠和γ-转角的含量减少,α-螺旋和无规卷曲的含量增加。基于残基接触图谱的三级结构分析,非水相体系中脂肪酶的一级结构比水相体系中脂肪酶的一级结构保留得更多。FTIR结果表明,正己烷和三油酸甘油三酯是适宜的反应环境,有利于脂肪酶CALB各化学键的稳定。这项研究有助于更好地理解反应环境与脂肪酶CALB结构之间的关系,确定适合脂肪酶CALB稳定的反应环境。5、研究探讨了不同甘油三酯对油酸诱导的人肝LO2细胞脂质堆积的影响及其机制。用油酸（OA）、OA+椰子油（CO）、OA+菜籽油（RO）、OA+CO和RO的物理混合油（CROM）、OA+CO和RO的酯交换油（CROI,富含MLCTs）、OA+OMO（MLCTs中的一种）和OA+OPO,与OA组对比,OA+CROI和OA+OMO培养肝细胞LO2显着降低细胞内总甘油三酯和总胆固醇的含量（P<0.05）。此外,CROI和OMO下调二酰甘油酰基转移酶（DGAT1）蛋白的表达,上调过氧化物酶体增殖物激活受体α（PPARα）蛋白的表达。实验结果表明,富含MLCTs的CROI和OMO型结构酯能改善油酸诱导的LO2细胞脂质积聚,调节脂质代谢相关蛋白的表达。
倪玉芳[2]（2021）在《四种啮齿动物Ldha基因的克隆、原核表达与酶学性质研究》文中研究指明目的:乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase,LDH）是生物体内催化丙酮酸和乳酸之间相互转变的酶,它在正常细胞中主要参与糖的无氧氧化和糖异生两大代谢途径,而在癌细胞中则参与糖的有氧酵解代谢,因此LDH被认为是癌症治疗的理想靶点之一。除病毒外,几乎所有生物体均表达乳酸脱氢酶同工酶（LDHs）,哺乳动物的LDHs是由LDHA、LDHB、LDHC和LDHD四个基因编码蛋白亚基形成的四聚体酶,其中LDHC基因主要在睾丸组织中特异表达,而LDHD基因编码的LDH仅催化D型乳酸的代谢。因此,在哺乳动物组织细胞中最主要存在的是由LDHA和LDHB基因分别编码的M和H蛋白亚基组合形成的LDH1（H4）,LDH2（H3M1）,LDH3（H2M2）,LDH4（H1M3）,LDH5（M4）五种LDH同工酶。啮齿动物作为哺乳动物的一大类,其LDH在组织细胞的物质代谢中同样具有重要的作用,但是关于啮齿动物LDH的研究并不多。目前在Gen Bank数据库中有大鼠、小鼠Ldha和Ldhb基因的参考序列,而豚鼠仅有该基因的预报告序列,作为主要家栖鼠的黄胸鼠尚无LDH的核苷酸和氨基酸序列记录。本研究希望通过克隆大鼠、小鼠、黄胸鼠和豚鼠Ldha基因的编码序列并分别构建重组原核表达质粒,再将重组表达质粒导入大肠杆菌进行诱导表达,纯化表达蛋白后研究其酶学性质,可为进一步研究LDH的结构特征、关键氨基酸的确定和抑制剂的筛选等奠定基础。方法:本研究通过提取四种啮齿动物大腿肌肉组织的总RNA,利用特异引物扩增Ldha基因的编码序列,将其克隆至p GM-T载体,经酶切和测序确认克隆成功后再亚克隆至原核表达载体p ET系列中;同时利用生物信息学在线网站和软件对克隆的四种啮齿动物Ldha编码序列进行生物信息学分析;然后将构建好的原核表达载体导入E.coil BL21（DE3）大肠杆菌后用IPTG进行诱导表达,通过镍亲和柱对表达蛋白进行纯化后利用SDS-PAGE和Western Blot进行鉴定;最后采用琼脂糖凝胶电泳LDH同工酶谱法检测纯化蛋白的酶活性,以及应用连续监测法检测纯化蛋白的酶比活性、最适pH、pH稳定性、温度稳定性和对不同底物的Km、Vmax等。结果:1.四种啮齿动物Ldha基因的克隆与原核表达载体构建克隆并测序确认四种啮齿动物Ldha基因的编码序列,其序列长度均为999 bp,再将克隆序列亚克隆至p ET系列原核表达载体上分别构建四种啮齿动物Ldha基因重组原核表达质粒。2.四种啮齿动物Ldha基因的生物信息学分析生物信息学分析结果显示克隆的四种啮齿动物Ldha基因编码序列均编码332个氨基酸,理论分子量约为36.5 k D,碱性氨基酸数量稍多于酸性氨基酸,为轻微疏水性热稳定性蛋白;四种LDHA的氨基酸序列高度相似,仅有23个氨基酸位点存在不同程度差异,其中豚鼠有11个氨基酸位点与其它三种鼠不同,还有黄胸鼠在属于底物结合区域的第229位氨基酸为非极性的甘氨酸,而大鼠为酸性的天冬氨酸,小鼠和豚鼠为酸性的谷氨酸,这些氨基酸的差别可能导致了它们在酶学性质上的差异。3.四种啮齿动物Ldha基因的诱导表达及条件优化四种啮齿动物Ldha基因重组表达质粒均可被IPTG诱导表达,为获得更多可溶性的表达蛋白,优化诱导表达条件为在温度30℃,100μmol/L的IPTG浓度下诱导6 h,结果显示在此条件下四种表达蛋白不仅量多而且可溶性蛋白占总表达蛋白的30%以上。4.四种啮齿动物LDHA蛋白的纯化与鉴定四种啮齿动物LDHA蛋白通过镍亲和柱纯化,经SDS-PAGE电泳鉴定为纯化蛋白且分子量大小与目标蛋白一致,再经Western Blot鉴定这些纯化蛋白均为LDHA蛋白。5.四种啮齿动物LDHA蛋白的酶比活性测定和酶谱分析在pH=7.3,25℃条件下,分别检测黄胸鼠、大鼠、小鼠和豚鼠LDHA纯化蛋白催化丙酮酸生成乳酸的酶比活性为113.76±1.463U/mg、575.89±5.426 U/mg、311.25±33.420 U/mg和365.32±48.892U/mg,而催化乳酸生成丙酮酸的酶比活性分别为2.18±0.125 U/mg、4.78±1.375 U/mg、1.93±0.788 U/mg和1.88±0.379 U/mg。上述结果可见四种啮齿动物的LDHA表达蛋白符合Ldha编码的LDH同工酶更易催化丙酮酸生成乳酸这一特征。此外,琼脂糖凝胶电泳LDH同工酶谱分析显示四种纯化蛋白均具有催化活性且仅有一条同工酶带,并且由于这四种纯化蛋白的p I值不同,导致这四种同工酶电泳的迁移率不同。6.四种啮齿动物LDHA蛋白的酶学性质分析从pH 5.0-10.0范围内每增加0.5选取一个pH值,应用三种缓冲液共配制11种不同pH值的缓冲液以分别检测在不同pH值条件下纯化蛋白的酶活性,结果显示黄胸鼠、大鼠和小鼠LDHA纯化蛋白的最适pH为7.0,而豚鼠LDHA纯化蛋白的最适pH为6.0。将四种LDHA纯化蛋白分别与上述11种pH值的缓冲溶液按照1:4比例混合后,于25℃放置1 h后再在最适pH条件下检测酶活性。结果显示四种纯化蛋白与pH 7.0的缓冲溶液混合后放置对酶活性影响最小,并且黄胸鼠LDHA纯化蛋白与pH 5.0-9.0、大鼠LDHA纯化蛋白与pH5.0-10.0、小鼠LDHA纯化蛋白与pH 5.0-10.0、豚鼠LDHA纯化蛋白与pH 5.5-7.5范围内的缓冲溶液混合放置1 h后还可保留80%以上的酶比活性。将四种纯化蛋白分别在4℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃和50℃的不同温度下放置1 h后,黄胸鼠、大鼠和小鼠在温度为4℃-40℃均可保留90%以上的酶比活性,而豚鼠仅在温度为4℃-30℃范围内才能保留90%以上的酶比活性。在温度为25℃和最适pH条件下,分别测得黄胸鼠、大鼠、小鼠和豚鼠以丙酮酸作底物的Km值为0.17±0.193 mmol/L、0.247±0.033 mmol/L、0.195±0.158mmol/L和0.224±0.028 mmol/L;以NADH作底物的Km值为0.088±0.008 mmol/L、0.136±0.028 mmol/L、0.058±0.0006 mmol/L和0.094±0.016 mmol/L;以乳酸作底物的Km值为22.54±0.007 mmol/L、27.042±4.095 mmol/L、21.21±1.961 mmol/L和51.57±15.58 mmol/L;以NAD+作底物的Km值为0.413±0.069 mmol/L、0.193±0.028 mmol/L、0.39±0.064 mmol/L和0.711±0.298 mmol/L。结论:1.克隆并表达了黄胸鼠、大鼠、小鼠和豚鼠的Ldha基因,检测到四种Ldha原核表达纯化蛋白均具有LDH的酶活性,并且催化丙酮酸转变为乳酸的活性远高于催化乳酸转变为丙酮酸的活性。2.首次克隆了黄胸鼠的Ldha基因,提交到NCBI的Gen Bank数据库登录号为MW201965。生物信息学分析显示黄胸鼠Ldha基因编码序列与大鼠的编码序列相似性很高,生物进化分析表明它们之间的亲缘关系也最近,但是它们在第229位氨基酸的差异可能是导致其酶学性质差异的主要原因。豚鼠与其它三种鼠类的亲缘关系最远,氨基酸序列差异性最大,可能导致了其在最适pH值、pH稳定性和温度稳定性等酶学性质上存在较大差异。
杨重[3]（2021）在《硫酸盐废水的资源化回收及功能菌群解析》文中研究说明随着冶金、造纸、制革等行业的发展,大量高浓度硫酸盐废水被排放到环境中,导致水生生态失衡、土壤板结、大气污染等严重后果。目前对硫酸盐废水的处理主要依赖硫酸盐还原菌（sulfate reduction bacteria,SRB）的生物作用,在厌氧条件下将硫酸根离子(SO42-)还原为硫离子(S2-)。但是在高浓度硫酸盐废水的处理过程中,微生物群落和功能基因的变化过程尚不明确,无法从基因层面对废水处理过程进行分析和调控。同时,S2-的大量产生和积累又会导致新的环境问题,例如腐蚀反应设备、产生H2S污染大气等。针对SO42-还原过程中的菌群结构和功能基因进行分析将有助于优化和改善反应条件,而对废水处理过程中产生的反应副产物S2-进行回收和再利用,将有效地解决硫酸盐废水处理过程中的资源化问题。本研究针对硫酸盐废水处理过程中普遍存在的问题,构筑了缺氧反应器用于探究不同碳硫比（C/S）、氮硫比（N/S）条件下的SO42-还原性能。该反应器能高效去除废水中的SO42-,对初始浓度为1 g/L的Na2SO4能达到97%的去除效率。当进水中的Na2SO4浓度从1 g/L逐渐升高到2 g/L导致C/S下降时,会降低SRB菌群对SO42-的还原效率,使其SO42-去除效率从96.9%降为51%。当进水中的氯化铵（NH4Cl）浓度从1 g/L逐渐升高到8g/L导致N/S升高时,SRB菌群对SO42-的还原效率没有明显变化,仍然保持97%的去除效率。同时,本研究利用宏基因组技术对不同条件下微生物的群落结构和功能基因丰度变化进行分析发现,菌群中的优势菌为变形菌（Proteobacteria）、拟杆菌（Bacteroidetes）、绿弯菌（Chloroflexi）,当条件改变时优势菌群会发生变化,进水NH4Cl浓度增加会导致放线菌（Actinobacteria）的相对丰度增加,进水COD浓度增加会导致厚壁菌（Firmicutes）的相对丰度增加。在功能基因层面,和S代谢相关的基因包括SO42-还原相关基因tc.sulp、sat、apr AB以及S2-氧化相关基因sqr、dsr EFH、soe ABC等,证实反应器内同时存在SO42-还原过程和S2-氧化过程。随后对反应副产物S2-进行回收处理,通过金属硫化物回收方法,即向出水中添加与S2-摩尔比为1:1的Cu2+、Fe2+、Zn2+、Co2+等金属离子,能有效收集金属硫化物沉淀,去除废水中的S2-。通过生物硫回收方法,即将废水静置在空气中,可以通过硫氧化菌（sulfur oxidation bacteria,SOB）将S2-氧化为乳白色胶体硫,加入Al Cl3可得到絮状生物硫沉淀,实现废水中S2-的去除。对金属硫化物回收方法得到的纳米CuS材料的潜在应用进行探索,将其用于Cr（VI）吸附和光催化还原时,对Cr（VI）的去除效果较差,只能在3 h移除8%初始浓度为0.5mmol/L的Cr（VI）。而将其用于催化活化过硫酸盐（persulfate,PS）氧化降解磺胺甲基嘧啶（sulfamerazine,SMR）时,能实现SMR的有效去除,可以在4 h氧化降解97.46%初始浓度为25 mg/L的SMR。最后,通过分析CuS在反应前后的结构变化,PS在反应过程中产生的活性物种,SMR降解后产生的中间产物,对CuS/PS体系去除SMR的反应机理进行了研究。在CuS活化PS降解SMR的过程中,CuS会催化活化PS产生硫酸盐自由基（SO4·-）、羟基自由基（·OH）和单线态氧（1O2）,其中SO4·-为降解SMR的主要活性物种,SMR会在降解过程中被逐步分解为分子质量更小的中间产物例如甲基嘧啶和苯胺等,最终再被彻底降解为CO2和H2O。CuS材料在反应后会向溶液中释放Cu2+,同时材料表面的Cu+和S2-等低价态物质会被氧化为Cu2+和S0,材料的溶解浸出和氧化腐蚀会导致CuS对PS的非均相活化性能下降,使其循环利用效果变差。本研究对硫酸盐废水处理过程中的菌群结构变化和功能基因进行了分析,同时还对反应副产物S2-的回收再利用进行了系统研究,为废水中SO42-的完全去除及资源化回收提出了理论指导。
张婷[4]（2020）在《L-乳酸脱氢酶偶联葡萄糖脱氢酶高效制备L-苯乳酸》文中进行了进一步梳理L-苯乳酸（L-phenyllactic acid,L-PLA）是一种高附加值的天然有机酸,对食源性致病菌和腐败菌具有广谱抑菌性,易被人体代谢吸收,可代替防腐剂应用于食品和饲料中。L-PLA作为许多药物和材料的合成前体,在医药和材料领域的重要作用备受关注。目前,报道的关于生物合成L-PLA的产量和生产效率较低,限制了L-PLA的大规模制备。本研究以干酪乳杆菌Lactobacillus casei L-乳酸脱氢酶突变体L-LcLDH1Q88A/I229A为研究对象,通过与葡萄糖脱氢酶共同构建体内和体外辅酶循环体系,并利用体外双酶偶联不对称还原苯丙酮酸（Phenylpyruvate,PPA）,为实现L-PLA的工业化生产奠定基础。利用L-LcLDH1Q88A/I229A和嗜酸热源体Thermoplasma aciddophilium葡萄糖脱氢酶SyGDH,构建体内辅酶循环体系和体外辅酶循环体系。成功构建了共表达重组菌E.coli/pET-22b-Lcldh1Q88A/I229A/pET-28a-Sygdh,利用其不对称还原PPA,反应生成L-PLA的产量明显高于E.coli/pET-22b-Lcldh1Q88A/I229A。对共表达重组菌的表达条件进行优化,在最佳诱导表达条件下（温度15℃、IPTG 0.6 mM、诱导时间12 h）,L-LcLDH1Q88A/I229A的酶活性为158.7 U·g-1（湿菌体）,SyGDH酶活性为44.6 U·g-1（湿菌体）,分别较未优化前提高了17.1%和39.5%。将E.coli/pET-22b-Lcldh1Q88A/I229A、E.coli/pET-28a-Sygdh诱导表达后进行细胞破碎,得到粗酶液,经纯化得到纯酶液。分别将L-LcLDH1Q88A/I229A和SyGDH的粗酶、纯酶偶联,构建体外辅酶循环体系。利用共表达重组菌全细胞、粗酶体系和纯酶体系分别催化10 mM PPA,所得L-PLA的产率分别为86.9%、91.3%、99.6%,只有纯酶体系无副产物生成,因此纯酶体系最适合用于不对称还原PPA制备PLA。为降低酶的制备成本,尝试将L-LcLDH1Q88A/I229A在毕赤酵母Pichia pastoris GS115中分泌表达以及对SyGDH的粗酶液进行热处理。SDS-PAGE分析显示,毕赤酵母重组酶L-LcLDH1Q88A/I229A（Pp）的表观分子量为36.8 kDa,发酵液中杂蛋白少,比活性为270.5U·mg-1。经纯化后,测定动力学参数,Vmax为627.0 U·mg-1,催化效率kcat/Km为94.3mM-1·s-1,分别是大肠杆菌重组酶L-LcLDH1Q88A/I229A（Ec）的26.1和25.5倍。SyGDH粗酶液经50℃、1 h的热处理,残余酶活性为93.1%,与毕赤酵母发酵液reLcLDH1Q88A/I229A偶联不对称还原10 mM PPA,产率可达99.6%,未产生副产物。优化其催化条件,在40℃、pH 5.0,reLcLDH1Q88A/I229A添加量10 U·mL-1,热处理过的SyGDH添加量1 U·mL-1,NAD+浓度2.0 mM、葡萄糖浓度120 mM的体系中,可在2 h内催化100 mM PPA生成L-PLA的产率为99.2%,辅酶循环数TTN为49.6。为实现辅酶高效循环再生,通过筛选比较,选择亲和NAD+、耐热、耐酸的球形赖氨酸芽孢杆菌Lysinibacillus sphaericus G10来源的葡萄糖脱氢酶突变体LsGDHD255C,代替SyGDH用于体外辅酶循环体系,当NAD+浓度为0.1 mM时,其可在2 h内催化100 mM PPA生成L-PLA的产率为99.5%,辅酶循环数TTN为995,提高了19.1倍。优化LsGDHD255C的添加量,其添加量为4 U·mL-1时,反应时间可缩短至30 min。最后,利用reLcLDH1Q88A/I229A偶联LsGDHD255C的体外辅酶循环体系,在催化反应过程中,通过三次补加PPA,反应最终积累的L-PLA浓度高达359.8 mM,eep>99%,时空产率为10.0g·L-1·h-1,平均转化率为269.3 g·g-1·L-1。分离纯化样品,高手性纯的L-PLA得率为70.6%。
李国四[5]（2020）在《生物催化级联反应制备丙酮酸及L-酪氨酸衍生物》文中研究指明丙酮酸作为重要的原料和中间体,广泛应用于化工、医药、农业等领域。传统的酒石酸脱水脱羧法生产工艺操作简单,但存在污染严重、产率低、原料消耗大等问题,导致丙酮酸及其衍生产品价格较高。近年来,丙酮酸的生物法制造技术由于原料成本低、反应条件温和、产品安全可靠等优点,引起产业界的广泛关注。生物法包括糖质原料发酵法和乳酸的酶催化氧化法两类。由于细胞内与丙酮酸相关的代谢途径活跃,限制了丙酮酸发酵水平的提高,而且由于丙酮酸在水溶液中溶解度大,从成分复杂的发酵液中分离丙酮酸成本较高,发酵法生产丙酮酸一直难以大规模工业化。以短链L-2-羟基酸氧化酶为基础的生物催化法由于无需添加昂贵的辅酶、催化体系简单且产品分离纯化方便,具有较好的工业应用前景。但是,催化的过程中产生的副产物过氧化氢容易将丙酮酸氧化成乙酸和二氧化碳,导致产率的降低。光学纯L-酪氨酸及其衍生物常被用于合成一些重要的药物,例如帕金森药L-多巴和抗肿瘤药物沙弗拉霉素A等。化学从头合成酪氨酸衍生物需要多个步骤,最终产物也是外消旋体,需要进行后期的拆分。酪氨酸酚裂解酶可直接催化丙酮酸、苯酚衍生物和氨生成L-酪氨酸衍生物,是一种极具前景的L-酪氨酸衍生物绿色合成途径。但是由于供体底物丙酮酸成本较高且不稳定,该方法和化学法相比竞争性仍不显着。生物催化级联反应因为具有克服中间产物的毒性和不稳定性、降低中间底物和产物分离纯化成本以及提高催化效率等优点,已经被广泛应用于高附加值化学品的合成。针对上述问题,本论文开发了两种催化级联反应体系:1)将短链L-2-羟基酸氧化酶催化的乳酸氧化脱氢反应和过氧化氢酶催化的过氧化氢分解反应相偶联,构建了能够将廉价的生物基原料L-乳酸氧化成丙酮酸的大肠杆菌全细胞催化剂。2)将上述体系进一步与酪氨酸酚裂解酶催化的C-C耦合反应相偶联,构建了一种包含L-2-羟基酸氧化酶、过氧化氢酶以及酪氨酸酚裂解酶的三酶级联反应体系,以L-乳酸和苯酚衍生物为出发底物,一锅法制备L-酪氨酸衍生物。首先,通过文献调研以及基因挖掘克隆了6种短链L-2-羟基酸氧化酶以及10种单功能过氧化氢酶,并分别从中筛选出催化活力高且稳定性好的来源于Aerococcus viridans 的乳酸氧化酶 AvLOX 以及来源于 Ureibacillus thermospAhaericus的过氧化氢酶UtCAT。其中,AvLOX在大肠杆菌中表达时包涵体比例较高,为了提高酶活,采用降低表达温度和诱导剂浓度、RBS序列定向进化和共表达分子伴侣的策略增强其可溶性表达。通过降低表达温度和诱导剂浓度,可溶性提高了3.4倍,酶活提高了48.9%;通过对RBS序列定向进化,成功获得了有利于AvLOX可溶性表达的RBS突变序列GGGGGC,携有该突变序列的重组菌E coli-pET28a-T7rbsAvLOX中目标酶的可溶性提高了 1.7倍,酶活提高了62.7%;在此基础上,进一步共表达分子伴侣GroES-GroEL,可溶性提高了 1.8倍,酶活提高了43.1%,最终AvLOX可溶性由8.5%提高到89.2%,酶活由4.5 U/mL提高到15.6 U/mL。然后,采用UtCAT与AvLOX粗酶液构建了胞外的双酶级联反应体系,确定了 UtCAT与AvLOX的酶活最优配比为300:1,以500 mM L-乳酸为底物收率能够达到92.3%,是不添加过氧化氢酶时（7.3%）时的12.6倍。为了简化工艺、提高偶联效率和降低成本,将AvLOX与UtCAT在E.coli BL21（DE3）内进行共表达,以pET28a-T7rbsAvLOX为质粒骨架构建了胞内双酶级联的全细胞催化剂。采用三种不同的单质粒共表达策略,其中共表达菌株五.coli-pET28a-T7rbsAvLOX-rbsUtCAT双酶表达效果最好。为了进一步提高过氧化氢酶酶活,利用RBS计算软件对UtCAT基因前的RBS序列进行重新设计,获得了翻译起始速率显着增强的序列RBS3,可使UtCAT酶活提高了 1.8倍,最终共表达菌株E.coli-pET-28a-T7rbsAvLOX-rbsUtCAT 中 UtCAT 和 AvLOX 的酶活分别达到4127.3 U/mL 和 12.6 U/ml（酶活比 328:1）。对 E.coli-pET-28a-T7rbsAvLOX-rbs3UtCAT的催化工艺进行了优化,获得的最佳的工艺条件为:反应温度37℃C,体系pH7.0,菌体添加量20 g/L以及0.7 Mpa氧气压力,其中氧气浓度是L-乳酸氧化反应的限制因素。在该条件下,500mML-乳酸仅需要1.5h即可被转化,收率达到92.2%。同时,考虑到维持氧气压力对设备有一定要求,在常压条件下建立了底物分批补料催化工艺,在L-乳酸总浓度为600 mM的反应中丙酮酸收率能够达到90.8%。然后,表达了来源于Symbiobacterium toebii的热稳定型酪氨酸酚裂解酶（Thermophilic tyrosine-phenol lyase,TTPL）并分析了 底物谱,发现 TTPL 可以催化苯酚、以及邻位时OH和F的2-羟基苯酚和2-氟-苯酚,但是将邻位取代基换成Cl、Br、CH3以及OCH3后TTPL就丧失了对底物的催化能力。为增强TTPL对不同底物的适应性,对其进行理性设计改造。基于同源建模与分子对接模拟分析,通过定点突变将TTPL中对底物特异性起决定作用的口袋进行扩大,构建了10个突变株,从中成功筛选出3个对2-甲基苯酚有较高催化活力的突变株F37V、T126S和M380V。底物特异性研究表明,突变株F37V和M380V表现出更宽的底物谱以及不错的催化活力。最后,以2-氟-苯酚为模式底物,构建了基于AvLOX、UtCAT以及TTPL M380V的三酶级联反应体系,其最佳的工艺条件为:反应温度40℃,体系pH 8.0,E.coli-pET28a-T7rbsAvLOX-rbs3UtCAT 与E.coli-pET28a-TTPLM380V 菌体添加比为1:2,湿菌添加总量为25g/L,底物浓度为46mM,该条件下3-氟-L-酪氨酸的收率由83.1%提高到97.1%,ee值>99%。以此为基础,通过改变热稳定性酪氨酸酚裂解酶突变子种类,还可以催化合成5种其它L-酪氨酸衍生物,收率达到81.1-96.3%,ee值均大于99%。采用底物流加补料催化工艺,在0.5 L规模反应中,上述反应的底物酚转化率分别达到77.4～94.3%,产物浓度达到48.0～60.4g/L,成功解决了底物抑制、催化剂不稳定和收率低等问题,展示出良好的工业应用前景。
熊慧[6]（2020）在《基于碳代谢改造构建高菌体量乳酸乳球菌菌株及其生产应用》文中研究表明乳酸乳球菌是在厌氧条件下可发酵碳水化合物转化成以乳酸为主的代谢产物的一种革兰氏阳性细菌。乳酸乳球菌不仅在食品行业中应用广泛,其在作为细胞工厂用于生物基化学品的大规模生产方面也表现出巨大的潜力。作为兼性厌氧菌,乳酸乳球菌主要通过糖酵解途径获得能量用于生长和生产,其生物合成能力通常有限。随着发酵的进行,乳酸积累引起的反馈抑制和环境酸化严重抑制了细胞活性,难以实现细胞的高密度生长。本研究通过对碳代谢途径进行改造以解除代谢物积累对菌株生长的抑制作用,并探究高菌体量菌株的生产能力。本研究以一株nisin生产菌株乳酸乳球菌F44为出发菌株,首先通过引入外源途径、强化内源途径、调整氧化还原状态和抑制乳酸途径几种策略初步探究碳代谢改造对乳酸乳球菌菌体量的影响。其中引入外源磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶PCKA、过表达NADH氧化酶NOXE、敲除乳酸脱氢酶LDH分别使菌体量提高了4.4%、8.6%、18.4%。其它几种改造策略未对菌体量产生可见的影响。其次,在乳酸乳球菌ΔLDH的基础上敲除ldh B进一步抑制乳酸合成。ldh和ldh B基因缺失菌株菌体量和nisin产量分别为7.32和4209 IU/m L,分别较原始菌株提高了46.1%和117.5%。发酵液中乳酸浓度由22.83 g/L减少至2.48 g/L,而甲酸、乙酸、乙偶姻和乙醇的浓度增加。为了缓解因ldh和ldh B基因缺失引起的甲酸积累对细胞的毒害作用,通过敲除pfl基因和表达来自博伊丁假丝酵母的fdh基因两种策略降低甲酸水平。pfl基因的敲除限制了菌株的生长能力,菌株菌体量急剧减少,这可能和pfl敲除后菌株乙酰辅酶A生产能力下降有关。表达fdh使菌体量和nisin产量分别增加至7.64和4763 IU/m L,较对照菌株分别增加了6.56%和13.16%。最后,通过异源表达苯乳酸合成途径,探究高菌体量菌株的生产能力。苯乳酸（PLA）作为一种天然有机酸,不仅对多种革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌具有显着的抑制作用,还可以抑制酵母和霉菌的生长,被认为是化学合成防腐剂的潜在替代品。通过抑菌实验和食品保鲜实验发现nisin和PLA的联合使用具有协同效果。为进一步提高乳酸乳球菌发酵产品的保鲜效果,在高菌体量菌株中构建了联产nisin和PLA的发酵体系,菌株的PLA产量达1.67 g/L,苯丙酮酸转化率为55.7%。我们预期本研究所构建的高菌体量菌株有潜力拓展到其他高附加值生物基产品（异源蛋白、维生素、疫苗及发酵菌剂）的生产。
王金鹏[7]（2020）在《L-乳酸脱氢酶介导木糖葡萄球菌多重耐药机制的研究》文中提出在凝固酶阴性葡萄球菌引起的奶牛乳房炎中,木糖葡萄球菌是主要的分离菌并因其较高的分离率和严重的多重耐药现象引起广泛关注。细菌耐药性问题是全球关注的热点,目前的研究表明,细菌的耐药机制受其代谢途径的调控。L-乳酸脱氢酶（L-lactate dehydrogenase,ldh）是一种与代谢密切相关的蛋白,本实验室前期研究表明其与木糖葡萄球菌对泰乐菌素的耐药性相关,然而其是否与木糖葡萄球菌多重耐药性相关及其潜在耐药机制尚不明确。针对以上背景,本研究以绿色荧光蛋白（green fluorescent protein,gfp）为筛选标记对实验室前期诱导的泰乐菌素耐药木糖葡萄球菌进行ldh基因的敲除与回补;以耐药株、耐药敲除株和耐药回补株为受试菌株,通过药敏试验检测其对大环内酯类、酰胺醇类、林可胺类、四环素类及氨基糖苷类兽医临床常用抗菌药物的耐药表型,阐明L-乳酸脱氢酶是否影响木糖葡萄球菌的多重耐药性;通过测定三羧酸循环（TCA循环）及硫氧还蛋白系统中的关键基因、酶活性和代谢物含量的变化来阐明L-乳酸脱氢酶是否通过调控以上途径而影响木糖葡萄球菌的多重耐药性,从而为开发针对代谢途径的新型药物提供理论基础。具体研究结果如下:（1）以gfp为筛选标记,通过基因敲除及基因回补技术成功构建了ldh基因缺失株及ldh基因回补株。（2）敲除ldh基因后,细菌对五类抗菌药物的耐药性均上升,其中细菌对泰乐菌素的最小抑菌浓度（MIC）上升了10倍;对红霉素的MIC上升了32倍;对林可霉素的MIC上升了512倍;对氟苯尼考的MIC上升了160倍;对金霉素、土霉素的MIC均上升8倍;对链霉素的MIC上升了1024倍,对庆大霉素的MIC上升了2倍。而回补ldh基因后,与敲除株相比,细菌对泰乐菌素、红霉素、氟苯尼考、金霉素及土霉素的MIC均下降2倍;对林可霉素、链霉素及庆大霉素的MIC均下降了4倍。（3）敲除ldh基因后,细菌中乳酸含量显着上升,丙酮酸和NADH含量显着下降,异柠檬酸脱氢酶和苹果酸脱氢酶在酶活性及m RNA水平均显着下调。而回补ldh基因后,以上指标均恢复至敲除前水平。（4）敲除ldh基因后,细菌中硫氧还蛋白还原酶活性显着上升、硫氧还蛋白在m RNA水平显着上调、活性氧含量显着下降。而回补ldh基因后,硫氧还蛋白还原酶活性和硫氧还蛋白的m RNA水平均恢复至敲除前水平。综上所述,L-乳酸脱氢酶是木糖葡萄球菌多重耐药的相关蛋白;敲除L-乳酸脱氢酶后,木糖葡萄球菌通过抑制TCA循环,调节细菌中硫氧还蛋白系统而促进多重耐药性的产生。
汪保卫[8]（2020）在《代谢工程改造大肠杆菌细胞工厂生产D-乳酸及衍生物》文中指出D-乳酸及衍生物3-羟基丙酸（3HP）、丙烯酸含有羧基、羟基或乙烯基等活性基团,可参与多种合成反应,也可通过形成聚合物、参与分子嫁接及表面改性等方式用于材料开发,具有广阔的应用市场。当前,D-乳酸、3HP、丙烯酸的生产面临进一步提高产量、得率、生产速率以及开发基于可再生资源的合成路线等问题;利用代谢工程方法开发这三种产品的高效合成细胞工厂具有重要意义。本研究通过实验室适应性进化获得了一株厌氧快速生长的大肠杆菌平台菌株;利用全基因组突变分析揭示了其快速生长的原因;开发了一株D-乳酸高产菌;实现了基于D-乳酸中间体的3HP和丙烯酸的厌氧发酵生产;为大肠杆菌细胞工厂生产这三种产品提供了新的方法。首先,通过实验室适应性进化获得了一株大肠杆菌快速生长平台菌株WE269并研究了快速生长的遗传机制。所获平台菌株在测试条件下稳定期生物量及比生长速率(μmax)比出发菌株提高了约20%及72%。进一步研究发现sucD（M245I）和ilv G（Δ1 bp）突变为平台菌株厌氧快速生长的主要原因;在平台菌株中PPP途径、应激反应DNA复制机器及部分外排泵基因转录上调,RNA转录机器、脂肪酸合成酶等基因转录下调。其次,通过代谢改造所获平台菌株构建了一株D-乳酸高产菌。通过发酵测试与工艺优化,乳酸产量为98.3 g/L,生产速率为2.05 g/（L·h）,得率为0.97 g/g,D-乳酸光学纯度大于95%。利用葡萄糖厌氧生产D-乳酸综合性能极具竞争力,具备工业应用潜力。接下来,通过代谢改造大肠杆菌平台菌株构建了一株3HP生产菌株。通过合成途径分析设计、关键酶挖掘、密码子优化、组合调控优化、强化能量供应、关键基因替换等代谢工程策略,构建和优化了基于D-乳酸中间体的3HP合成途径。通过对整合高效合成途径的3HP生产菌株的发酵测试,在5 L罐发酵条件下菌株W3110（p3HP1.0）的3HP产量在排除甲酸干扰物情况下达到2.0 g/L。最后,通过代谢改造大肠杆菌平台菌株构建了一株丙烯酸生产菌株。构建了基于D-乳酸中间体的丙烯酸合成途径,通过与前期获得的D-乳酸生产工程菌株整合获得了丙烯酸生产菌株。摇瓶厌氧发酵产量为74 mg/L,证实该菌株可成功合成丙烯酸。
鹿承建[9]（2020）在《重组毕赤酵母全细胞转化L-乳酸合成丙酮酸钠的工艺研究》文中进行了进一步梳理丙酮酸是生物体系中重要的有机小分子物质,是细胞进行氧化功能过程中起关键作用的中间产物,在三大营养物质的代谢联系中起着重要的枢纽作用,广泛应用于医药化工、食品工业、农用化学品和日用工业品等行业,对其商业需求不断增长。目前工业生产丙酮酸主要采用化学合成法和发酵法,但由于化学合成法和发酵法存在转化率低、副产物多、不易分离提取等问题,限制了丙酮酸的工业化生产。因此,开发新型全细胞转化法生产丙酮酸钠的工艺,实现产业化生产,具有重要的经济和社会意义。本课题以高产乙醇酸氧化酶的重组毕赤酵母GS115-GO为出发菌株,在5L发酵罐发酵过程中通过对接种量、p H、培养温度、甲醇诱导时间、甲醇浓度、甲醇开始诱导时间等工艺进行优化,提高重组毕赤酵母GS115-GO发酵液的菌体浓度和乙醇酸氧化酶的活力。在接种量15%、p H控制在4.5-5.0、发酵温度30℃、培养25h进行0.3-1.5g/L浓度的甲醇诱导,诱导30h条件下,重组毕赤酵母GS115-GO在5L发酵罐上发酵60h菌体湿重达到241.47g/L,提高了33.8%,乙醇酸氧化酶的活力可达8.9U/g,提高了59.3%。为了进一步研究该菌株的工业化应用价值,我们对重组毕赤酵母GS115-GO种子罐培养基进行优化、种子扩大培养和多级发酵工艺验证,再按照溶氧一致性原则,进行5T发酵罐重组毕赤酵母GS115-GO中试放大发酵60h,重组毕赤酵母GS115-GO的最大菌体湿重可达273.83g/L,比5L发酵水平提高13.4%,乙醇酸氧化酶活力为9.16U/g,比5L发酵水平提高2.92%。在重组毕赤酵母GS115-GO转化L-乳酸制备丙酮酸钠的过程中,首先对重组毕赤酵母GS115-GO的细胞透性化处理工艺进行优化,提高细胞的转化效率。最佳透性化处理工艺采用0.06%的苯扎氯铵处理60min。在此基础上对转化体系的底物L-乳酸浓度、细胞浓度、p H、转化温度等转化条件进行优化提高丙酮酸钠产率和L-乳酸转化率。在底物L-乳酸浓度为90g/L、重组毕赤酵母细胞浓度80g/L、p H值7.5-8.0,转化温度15℃条件下,丙酮酸钠的浓度达187.9g/L,L-乳酸转化率达91.15%,反应速率达到2.93g/L/h。针对全细胞生物催化法副产物少、分离纯化简单以及丙酮酸离子不稳定的特点,建立丙酮酸钠的提取纯化工艺,并对提取过程中脱色工艺、浓缩冷却结晶工艺和醇结晶工艺进行优化,制备的丙酮酸钠晶体,含量达99.8%,纯度达99.7%,收率达72%。本课题采用全细胞生物催化制备丙酮酸钠,副产物少,转化率高,对环境的污染小,符合绿色发展的观念。采用醇结晶的方式来提取纯化丙酮酸钠,工艺操作简单,节约生产成本。同时为丙酮酸钠的工业化应用奠定了基础,进一步满足国内外市场对丙酮酸钠产品的需求。
梁珊,宗敏华,娄文勇[10]（2019）在《酶法催化二氧化碳制备高附加值化学品研究进展》文中研究表明现代工业的发展不断消耗煤、石油、天然气等碳化石燃料,并产生了大量的温室气体CO2,使人类面临能源和环境的双重挑战,开发绿色能源、控制CO2对环境的影响迫在眉睫. CO2是一种廉价的碳源,可通过化学法、光化学法、电化学法或酶法等转化为高附加值含碳化学品,实现CO2的资源化循环利用,是解决全球碳排放所带来的能源和环境危机的双赢策略.受CO2胞内天然生物转化的启发,酶法为CO2的循环利用带来了新的机遇,相比于传统的化学及光、电化学法,可表现出绿色、高效、温和、高选择性等优点,有望为CO2高值化利用带来新的契机.有鉴于此,本文从胞内CO2生物转化机理出发,综述了国内外近年来多种单酶及多酶级联催化CO2高值化利用的最新研究进展,并交叉论述了固定化酶催化体系的构建、酶定向进化和改造、酶催化过程调控等内容,总结了酶法转化目前存在的缺陷和不足,并提出了展望,以期为酶法催化CO2高值化利用提供一定的参考和借鉴.
二、L-乳酸脱氢酶催化反应机理的理论研究进展（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、L-乳酸脱氢酶催化反应机理的理论研究进展（论文提纲范文）
（1）新型类母乳OMO型结构酯的酶法合成、动力学模拟及对肝细胞脂质代谢的影响（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略语表 |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 结构酯的主要特征 |
| 1.2 结构酯的合成技术 |
| 1.2.1 化学法合成技术 |
| 1.2.2 酶法合成技术 |
| 1.2.3 基因工程合成技术 |
| 1.2.4 几种合成技术的比较 |
| 1.3 结构酯的功能研究 |
| 1.4 类母乳结构酯的酶法合成 |
| 1.5 分子动力学和量子化学技术在酶催化反应中的应用 |
| 1.6 结构酯脂肪酸在肝细胞中的代谢 |
| 1.7 选题意义与研究内容 |
| 1.7.1 课题来源 |
| 1.7.2 选题意义 |
| 1.7.3 主要研究内容 |
| 第2章 非水相中樟树籽油和油酸酸水解酶法合成OMO型结构酯 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 材料、试剂与设备 |
| 2.2.1 实验材料 |
| 2.2.2 实验试剂 |
| 2.2.3 主要仪器与设备 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 OMO结构酯的小规模酶促合成 |
| 2.3.2 MLCT的分离与纯化 |
| 2.3.3 甘油三酯种类的分离与鉴定 |
| 2.3.4 总脂肪酸组成测定 |
| 2.3.5 二位脂肪酸组成测定 |
| 2.3.6 酰基迁移率的分析与测定 |
| 2.3.7 OMO型结构酯的扩大规模试验 |
| 2.3.8 统计分析 |
| 2.4 结果与分析 |
| 2.4.1 合成产物MLCTs的甘油三酯组成 |
| 2.4.2 反应条件对产物甘油酯脂肪酸分布和OMO型结构酯得率的影响 |
| 2.4.3 反应条件对酰基迁移率的影响 |
| 2.4.4 OMO型结构酯的得率与酰基迁移率的关系 |
| 2.4.5 扩大实验中产物MLCTs的理化性质 |
| 2.5 讨论 |
| 2.6 本章小结 |
| 第3章 非水相中椰子油和高油酸菜籽油酶法酯酯交换合成OMO型结构酯 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 材料、试剂与设备 |
| 3.2.1 实验材料 |
| 3.2.2 实验试剂 |
| 3.2.3 主要仪器与设备 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 椰子油和菜籽油酶法酯酯交换 |
| 3.3.2 甘油三酯的分离和鉴定 |
| 3.3.3 总脂肪酸组成测定 |
| 3.3.4 二位脂肪酸组成测定 |
| 3.3.5 酰基迁移率的测定 |
| 3.3.6 正交实验设计 |
| 3.3.7 MCTs和LCTs酯化反应中的酰基转移 |
| 3.3.8 统计分析 |
| 3.4 结果与分析 |
| 3.4.1 椰子油和菜籽油的脂肪酸组成 |
| 3.4.2 合成产物中长链甘油三酯组成 |
| 3.4.3 正交试验法优化合成OMO型结构酯结果 |
| 3.4.4 酰基迁移对OMO型结构酯合成的影响 |
| 3.5 讨论 |
| 3.6 本章小结 |
| 第4章 四种脂肪酶催化合成OMO型结构酯空间构象和活性变化 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 材料、试剂与设备 |
| 4.2.1 实验材料 |
| 4.2.2 实验试剂 |
| 4.2.3 主要仪器与设备 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 不同脂肪酶催化酯酯交换 |
| 4.3.2 甘油三酯的分离和鉴定 |
| 4.3.3 脂肪酶水解活性测定 |
| 4.3.4 傅里叶红外光谱FTIR测量脂肪酶结构 |
| 4.3.5 统计分析 |
| 4.4 结果与分析 |
| 4.4.1 脂肪酶类型对OMO型结构酯产率的影响 |
| 4.4.2 不同反应时间脂肪酶水解活性的变化 |
| 4.4.3 不同反应时间脂肪酶FTIR光谱的变化 |
| 4.4.4 脂肪酶CALB在水相和非水相体系中FTIR光谱的变化 |
| 4.5 讨论 |
| 4.6 本章小结 |
| 第5章 分子动力学模拟外界因素对脂肪酶结构的影响 |
| 5.1 前言 |
| 5.2 材料、试剂与设备 |
| 5.2.1 主要仪器与设备 |
| 5.3 实验方法 |
| 5.3.1 不同温度对脂肪酶结构影响模型的建立 |
| 5.3.2 不同含水量对脂肪酶结构影响模型的建立 |
| 5.3.3 不同脂肪酶在微量水分油体系中结构模型的建立 |
| 5.3.4 水相和非水相环境对脂肪酶结构影响模型建立 |
| 5.4 结果与分析 |
| 5.4.1 温度对脂肪酶Lipozyme RM IM结构的影响 |
| 5.4.2 含水量对脂肪酶Lipozyme RM IM结构的影响 |
| 5.4.3 微量水分油体系中不同脂肪酶结构稳定性 |
| 5.4.4 水相和非水相环境对脂肪酶CALB结构的影响 |
| 5.5 讨论 |
| 5.5.1 反应条件参数对脂肪酶结构的影响 |
| 5.5.2 脂肪酶在不同反应体系中结构的变化 |
| 5.6 本章小结 |
| 第6章 量子化学计算OMO型结构酯合成中各阶段过渡态及能垒 |
| 6.1 前言 |
| 6.2 材料、试剂与设备 |
| 6.2.1 主要仪器与设备 |
| 6.3 实验方法 |
| 6.3.1 反应路径的建立 |
| 6.3.2 反应过渡态搜寻 |
| 6.3.3 反应能垒计算 |
| 6.4 结果与分析 |
| 6.4.1 OMO型结构酯过渡态及能垒 |
| 6.5 讨论 |
| 6.6 本章小结 |
| 第7章 新型类母乳OMO型结构酯在人肝细胞中对脂质代谢的影响 |
| 7.1 前言 |
| 7.2 材料、试剂与设备 |
| 7.2.1 实验材料 |
| 7.2.2 实验试剂 |
| 7.2.3 主要仪器与设备 |
| 7.3 实验方法 |
| 7.3.1 肝细胞LO2培养 |
| 7.3.2 不同甘油三酯孵育肝细胞LO2的MTT试验 |
| 7.3.3 试剂盒测试LO2细胞中t-TG和t-Chol含量 |
| 7.3.4 油酸诱导的肝细胞LO2脂质堆积模型 |
| 7.3.5 统计分析 |
| 7.4 结果与分析 |
| 7.4.1 不同甘油三酯对LO2细胞脂质积聚的影响 |
| 7.4.2 油酸诱导LO2细胞脂质堆积 |
| 7.4.3 OMO型结构酯减轻油酸引起的肝细胞脂质堆积 |
| 7.4.4 OMO型结构酯调节脂质合成和代谢相关酶的表达,预防油酸诱导的肝细胞脂质堆积 |
| 7.5 讨论 |
| 7.5.1 椰子油和菜籽油对油酸诱导的肝细胞脂质堆积的影响 |
| 7.5.2 MCTs和LCTs的物理混合物和酯交换产物对油酸诱导的细胞脂质堆积的影响 |
| 7.5.3 OMO和OPO对油酸诱导细胞脂质堆积的影响 |
| 7.6 本章小结 |
| 第8章 结论与展望 |
| 8.1 主要结论 |
| 8.1.1 温度通过影响脂肪酶活性位点催化三联体关键残基间的距离来影响酶活性 |
| 8.1.2 微量水活度可通过促进脂肪酶RM IM催化的酯交换作用中的酰基迁移来提高OMO型结构酯的形成 |
| 8.1.3 并非所有非水相溶剂都显示出比水溶剂更高的脂肪酶CALB结构稳定 |
| 8.1.4 底物结合脂肪酶活性位点通过形成瞬时过渡态四面体结构生成OMO型结构酯 |
| 8.1.5 新型OMO型结构酯可以通过调节脂质代谢相关酶蛋白的表达来改善油酸在肝细胞LO2中引起的脂肪堆积 |
| 8.2 主要创新点 |
| 8.3 进一步研究方向 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间的研究成果 |
（2）四种啮齿动物Ldha基因的克隆、原核表达与酶学性质研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 英汉缩略词对照表 |
| 乳酸脱氢酶的酶学性质研究进展 综述 |
| 参考文献 |
| 攻读硕士学位期间发表论文情况 |
| 致谢 |
（3）硫酸盐废水的资源化回收及功能菌群解析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 绪论 |
| 1.1 微生物驱动的硫元素生物地球化学循环 |
| 1.1.1 硫元素主要的价态变化 |
| 1.1.2 硫元素循环过程中的功能微生物 |
| 1.1.3 硫元素循环过程中主要的功能基因及催化过程 |
| 1.1.4 硫元素循环过程中的微生物群落研究 |
| 1.2 高浓度硫酸盐废水的危害及处理方法 |
| 1.2.1 硫酸盐废水的来源与危害 |
| 1.2.2 硫酸盐废水的主要处理方式 |
| 1.2.3 生物法处理硫酸盐废水的研究进展 |
| 1.3 研究目的和研究内容 |
| 1.3.1 研究目的 |
| 1.3.2 研究内容 |
| 1.3.3 技术路线图 |
| 2 实验材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 实验试剂和仪器 |
| 2.1.2 实验装置 |
| 2.1.3 接种污泥与配水 |
| 2.2 分析检测方法 |
| 2.2.1 污泥指标的检测方法 |
| 2.2.2 常规水质分析项目的检测方法 |
| 2.2.3 微生物群落结构和功能分析 |
| 2.2.4 材料表征方法 |
| 3 兼氧反应器对硫酸盐废水的去除 |
| 3.1 兼氧反应器的处理过程 |
| 3.1.1 反应器驯化阶段 |
| 3.1.2 反应器SO_4~(2-)负荷提高阶段 |
| 3.1.3 反应器氨氮负荷提高阶段 |
| 3.1.4 反应器高氨氮负荷稳定阶段 |
| 3.1.5 反应器COD负荷提高阶段 |
| 3.2 兼氧反应器运行效果 |
| 3.2.1 反应器对SO_4~(2-)的去除效果 |
| 3.2.2 反应器对氨氮的去除效果 |
| 3.2.3 反应器对COD的去除效果 |
| 3.2.4 反应器的进出水pH变化 |
| 3.2.5 反应器生成S~(2-)的效率 |
| 3.3 反应器群落结构和功能基因的生物信息学分析 |
| 3.3.1 微生物的群落结构变化分析 |
| 3.3.2 菌群的基因种类和丰度变化分析 |
| 3.3.3 菌群的硫、碳、氮代谢途径分析 |
| 3.3.4 单菌的硫、碳、氮代谢途径分析 |
| 3.4 本章小结 |
| 4 反应器处理含硫废水的副产物S~(2-)的回收再利用 |
| 4.1 S~(2-)的回收 |
| 4.1.1 金属硫化物回收方法 |
| 4.1.2 生物硫回收方法 |
| 4.2 金属硫化物纳米材料的应用性能 |
| 4.2.1 金属硫化物还原Cr(VI)的相关特性研究方法 |
| 4.2.2 金属S~(2-)活化PS降解SMR的特性研究方法 |
| 4.2.3 金属硫化物活化PS降解SMR的机理研究方法 |
| 4.3 实验结果与讨论 |
| 4.3.1 金属硫化物鉴定结果分析 |
| 4.3.2 生物硫鉴定结果分析 |
| 4.3.3 金属硫化物还原Cr(VI)的相关特性研究结果分析 |
| 4.3.4 金属硫化物活化PS降解SMR的特性研究结果分析 |
| 4.3.5 金属硫化物活化PS降解SMR的机理研究结果分析 |
| 4.4 本章小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 攻读硕士学位期间发表学术论文情况 |
| 致谢 |
（4）L-乳酸脱氢酶偶联葡萄糖脱氢酶高效制备L-苯乳酸（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略词注释表 |
| 1 绪论 |
| 1.1 苯乳酸的概述 |
| 1.1.1 苯乳酸的结构和理化性质 |
| 1.1.2 苯乳酸的抑菌作用 |
| 1.1.3 苯乳酸的应用价值 |
| 1.2 苯乳酸的生物制备 |
| 1.2.1 微生物发酵法 |
| 1.2.2 生物酶催化法 |
| 1.3 乳酸脱氢酶 |
| 1.3.1 催化机理 |
| 1.3.2 来源和性质 |
| 1.4 辅酶再生系统 |
| 1.4.1 葡萄糖脱氢酶 |
| 1.4.2 辅酶循环策略 |
| 1.5 大肠杆菌和毕赤酵母表达系统 |
| 1.5.1 大肠杆菌表达系统 |
| 1.5.2 毕赤酵母表达系统 |
| 1.6 本课题的立题依据和主要研究内容 |
| 1.6.1 立题依据 |
| 1.6.2 主要研究内容 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 菌株、质粒和工具酶 |
| 2.1.2 主要仪器设备 |
| 2.1.3 试剂、溶液和培养基 |
| 2.1.4 主要软件和网站 |
| 2.1.5 引物 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 共表达重组菌的构建及其不对称还原PPA |
| 2.2.2 L-LcLDH1~(Q88A/I229A)与SyGDH酶液的制备及酶活性测定 |
| 2.2.3 辅酶NADH循环体系的验证和比较 |
| 2.2.4 L-LcLDH1~(Q88A/I229A)在毕赤酵母中表达及其酶学性质分析 |
| 2.2.5 SyGDH(Ec)粗酶的热处理 |
| 2.2.6 体外双酶偶联不对称还原苯丙酮酸催化条件的优化 |
| 2.2.7 NAD~+偏好性GDH在大肠杆菌中的表达以及稳定性分析 |
| 2.2.8 体外双酶偶联高效制备L-PLA的应用研究 |
| 3 结果与讨论 |
| 3.1 体内辅酶循环体系的构建 |
| 3.1.1 共表达重组菌的构建 |
| 3.1.2 L-LcLDH1~(Q88A/I229A)与SyGDH的诱导表达 |
| 3.1.3 重组E.coli全细胞不对称还原PPA能力比较 |
| 3.1.4 共表达重组菌的诱导表达条件优化 |
| 3.2 体外辅酶循环体系的构建 |
| 3.2.1 游离酶的制备 |
| 3.2.2 辅酶NADH循环体系的构建和验证 |
| 3.3 L-LcLDH1~(Q88A/I229A)在毕赤酵母中表达 |
| 3.3.1 重组表达质粒的构建 |
| 3.3.2 重组毕赤酵母转化子的构建 |
| 3.3.3 重组毕赤酵母的诱导表达 |
| 3.3.4 重组酶的酶学性质测定 |
| 3.3.5 小结 |
| 3.4 体外双酶偶联不对称还原苯丙酮酸的催化条件优化 |
| 3.4.1 GDH的热处理 |
| 3.4.2 温度和pH对催化反应的影响 |
| 3.4.3 PPA浓度对催化反应的影响 |
| 3.4.4 reLcLDH1~(Q88A/I229A)添加量对催化反应的影响 |
| 3.4.5 NAD~+浓度对催化反应的影响 |
| 3.4.6 葡萄糖浓度对催化反应的影响 |
| 3.4.7 小结 |
| 3.5 NAD~+偏好性GDH在 E.coli中的表达及其稳定性分析 |
| 3.5.1 辅酶再生GDH的选择拟定 |
| 3.5.2 BsGDH~(E170K/Q252L)和LsGDH~(D255C)表达载体的构建 |
| 3.5.3 BsGDH~(E170K/Q252L)和LsGDH~(D255C)的诱导表达和酶活性的测定 |
| 3.5.4 BsGDH~(E170K/Q252L)和LsGDH~(D255C)的稳定性分析 |
| 3.6 体外双酶偶联制备L-PLA的应用研究 |
| 3.6.1 NAD~+浓度的优化 |
| 3.6.2 LsGDH~(D225C)(ht)添加量的优化 |
| 3.6.3 体外双酶偶联不对称还原PPA的反应进程 |
| 3.6.4 分批添加PPA高效制备L-PLA |
| 主要结论与展望 |
| 主要结论 |
| 展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录 :作者在攻读硕士学位期间发表的论文 |
（5）生物催化级联反应制备丙酮酸及L-酪氨酸衍生物（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 主要缩略符号说明 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 丙酮酸 |
| 1.1.1 丙酮酸及其应用 |
| 1.1.2 丙酮酸的制备 |
| 1.1.2.1 化学合成法 |
| 1.1.2.2 生物法 |
| 1.1.3 丙酮酸的稳定性 |
| 1.2 L-酪氨酸及其衍生物 |
| 1.2.1 L-酪氨酸及其衍生物概论 |
| 1.2.2 L-酪氨酸及其衍生物的制备 |
| 1.2.2.1 化学合成法 |
| 1.2.2.2 酶催化法 |
| 1.3 短链L-2-羟基酸氧化酶 |
| 1.3.1 短链L-2-羟基酸氧化酶简介 |
| 1.3.2 短链L-2-羟基酸氧化酶结构特征与反应机制 |
| 1.4 过氧化氢酶 |
| 1.4.1 过氧化氢酶概述 |
| 1.4.2 过氧化氢酶的分类及结构特征 |
| 1.4.3 过氧化氢酶的催化机理 |
| 1.4.4 过氧化氢酶的来源 |
| 1.4.5 过氧化氢酶的应用 |
| 1.5 酪氨酸酚裂解酶 |
| 1.5.1 酪氨酸酚裂解酶概述 |
| 1.5.2 酪氨酸酚裂解酶的结构特征 |
| 1.5.3 酪氨酸分裂解酶催化机理 |
| 1.5.4 酪氨酸酚裂解酶的改造 |
| 1.5.5 酪氨酸酚裂解酶的应用 |
| 1.6 大肠杆菌表达优化 |
| 1.6.1 表达条件 |
| 1.6.2 宿主的选择 |
| 1.6.3 RBS (Ribosome binding site)序列 |
| 1.6.4 分子伴侣 |
| 1.7 生物催化级联反应 |
| 1.7.1 生物催化级联反应简介 |
| 1.7.2 级联反应在生物催化中的应用 |
| 1.7.2.1 辅酶再生 |
| 1.7.2.2 促进反应平衡 |
| 1.7.2.3 去除有毒副产物 |
| 1.8 本课题的研究思路与主要内容 |
| 第二章 短链L-2-羟基酸氧化酶的筛选及可溶性表达研究 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 实验仪器 |
| 2.2.2 主要试剂 |
| 2.2.3 培养基与试剂配置 |
| 2.2.4 菌种和质粒 |
| 2.2.5 基因的扩增 |
| 2.2.6 表达载体与工程菌构建 |
| 2.2.7 重组大肠杆菌诱导产酶 |
| 2.2.8 大肠杆菌超声破碎及SDS-PAGE检测 |
| 2.2.9 蛋白质浓度的测定 |
| 2.2.10 蛋白纯化(重力柱法) |
| 2.2.11 酶活测定 |
| 2.2.12 酶学性质研究 |
| 2.2.13 RBS高通量筛选方法 |
| 2.2.14 分子伴侣与AvLOX共表达 |
| 2.3 结果与讨论 |
| 2.3.1 短链L-2-羟基酸氧化酶的筛选 |
| 2.3.2 短链L-2-羟基酸氧化酶的热稳定性比较 |
| 2.3.4 乳酸氧化酶AvLOX酶学性质分析 |
| 2.3.4.1 最适温度与温度稳定性 |
| 2.3.4.2 最适pH与pH稳定性 |
| 2.3.5 增强AvLOX可溶性表达 |
| 2.3.5.1 宿主对AvLOX可溶性表达的影响 |
| 2.3.5.2 诱导温度对AvLOX可溶性表达的影响 |
| 2.3.5.3 异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)对AvLOX可溶性表达的影响 |
| 2.3.5.4 核糖体结合位点(RBS)对表达的影响 |
| 2.3.5.5 分子伴侣对表达的影响 |
| 2.3.5.6 乳酸氧化酶AvLOX可溶性表达前后对比 |
| 2.4 本章小结 |
| 第三章 过氧化氢酶的筛选及体外双酶级联体系的构建 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 实验仪器 |
| 3.2.2 实验药品与试剂 |
| 3.2.3 培养基与试剂配制 |
| 3.2.4 菌株和质粒 |
| 3.2.5 过氧化氢酶的克隆 |
| 3.2.6 表达载体与工程菌构建 |
| 3.2.7 重组大肠杆菌诱导产酶 |
| 3.2.8 大肠杆菌超声破碎及SDS-PAGE检测 |
| 3.2.9 蛋白纯化(重力柱法) |
| 3.2.10 酶活测定 |
| 3.2.11 半衰期测定 |
| 3.2.12 酶学性质研究 |
| 3.2.13 丙酮酸稳定性测试 |
| 3.2.14 双酶偶联体系的构建 |
| 3.2.15 分析方法 |
| (1) 液相检测方法 |
| (2) 反应收率计算 |
| 3.3 结果与讨论 |
| 3.3.1 过氧化氢酶酶库的建立 |
| 3.3.2 过氧化氢酶的筛选 |
| 3.3.3 过氧化氢酶UtCAT的酶学性质分析 |
| 3.3.3.1 过氧化氢酶UtCAT的纯化 |
| 3.3.3.2 最适温度和温度稳定性 |
| 3.3.3.3 最适pH与pH稳定性 |
| 3.3.3.4 过氧化氢浓度对UtCAT酶活的影响 |
| 3.3.4 丙酮酸的稳定性 |
| 3.3.4.1 丙酮酸在过氧化氢溶液中的稳定性 |
| 3.3.4.2 丙酮酸在粗酶液中的稳定性 |
| 3.3.5 体外双酶偶联体系的构建 |
| 3.4 本章小结 |
| 第四章 全细胞催化剂的构建及在丙酮酸制备中的应用 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 实验仪器 |
| 4.2.2 实验药品与试剂 |
| 4.2.3 培养基与试剂配制 |
| 4.2.4 菌种和质粒 |
| 4.2.5 乳酸氧化酶和过氧化氢酶酶活测定 |
| 4.2.6 液相检测 |
| 4.2.7 共表达重组质粒的构建 |
| 4.2.8 RBS序列设计 |
| 4.2.9 不同共表达菌株的催化效率对比 |
| 4.2.10 全细胞催化制备丙酮酸的优化 |
| 4.2.11 1L规模底物分批补料制备丙酮酸 |
| 4.2.12 丙酮钠的分离纯化 |
| 4.3 结果与讨论 |
| 4.3.1 AvLOX和UtCAT共表达策略 |
| 4.3.2 不同共表达策略下蛋白表达分析和活力测定 |
| 4.3.3 RBS序列优化后蛋白表达分析和活力测定 |
| 4.3.4 共表达菌株催化效率评估 |
| 4.3.5 全细胞催化制备丙酮酸工艺优化 |
| 4.3.5.5 底物浓度对催化的影响 |
| 4.3.5.6 常压下底物分批补料反应 |
| 4.3.6 丙酮酸的分离提纯 |
| 4.4 本章小结 |
| 第五章 酪氨酸酚裂解酶克隆表达及理性改造 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 材料与方法 |
| 5.2.1 实验仪器 |
| 5.2.2 实验药品与试剂 |
| 5.2.3 培养基与试剂配制 |
| 5.2.4 菌种和质粒 |
| 5.2.5 重组表达质粒的构建 |
| 5.2.6 定点突变 |
| 5.2.7 重组大肠杆菌诱导产酶 |
| 5.2.8 多序列比对 |
| 5.2.9 同源建模与分子对接 |
| 5.2.10 标准品Rac-4b和d-g化学酶法合成 |
| 5.2.11 底物特异性研究 |
| 5.2.12 HPLC检测方法 |
| 5.3 结果与讨论 |
| 5.3.1 酪氨酸酚裂解酶的克隆表达 |
| 5.3.2 酪氨酸酚裂解酶酶学特性研究 |
| 5.3.2.1 最适反应温度和温度稳定性 |
| 5.3.2.2 最适反应pH和pH稳定性 |
| 5.3.2.3 不同铵盐对酶活的影响 |
| 5.3.2.4 丙酮酸浓度对TTPL酶活的影响 |
| 5.3.2.5 酪氨酸酚裂解酶TTPL底物谱 |
| 5.3.3 基于结构-功能关系的TTPL理性设计 |
| 5.3.4 定点突变与活力测定 |
| 5.3.5 不同突变子的底物谱分析 |
| 5.4 本章小结 |
| 第六章 三酶级联反应合成L-酪氨酸衍生物的工艺研究 |
| 6.1 引言 |
| 6.2 材料与方法 |
| 6.2.1 实验仪器 |
| 6.2.2 实验药品与试剂 |
| 6.2.3 培养基与试剂配制 |
| 6.2.4 菌种和质粒 |
| 6.2.5 大肠杆菌诱导产酶 |
| 6.2.6 多酶体系的反应条件优化 |
| 6.2.7 离子交换色谱法纯化L4a-g |
| 6.2.8 L-4a-g光学纯度测定 |
| 6.2.9 酪氨酸衍生物L-4a-g产品鉴定 |
| 6.2.10 乳酸氧化酶、过氧化氢酶和酪氨酸酚裂解酶在苯酚中的稳定性 |
| 6.2.11 0.5 L规模底物流加补料反应制备酪氨酸 |
| 6.2.12 L-酪氨酸衍生物的纯化 |
| 6.2.13 HPLC检测方法 |
| 6.3 结果与讨论 |
| 6.3.1 多酶级联反应催化合成3-氟-L-酪氨酸L4f |
| 6.3.2 AvLOX和TTTLM380V双酶配比对多酶催化3f的影响 |
| 6.3.3 菌体添加量对催化效率的影响 |
| 6.3.4 提高底物3f浓度的研究 |
| 6.3.5 优化前后工艺参数及指标对比 |
| 6.3.6 两步级联反应与一步C-C偶联的比较 |
| 6.3.7 一釜式两步级联反应合成酪氨酸衍生物L-4a-g |
| 6.3.8 0.5 L规模底物流加补料反应 |
| 6.3.9 L-酪氨酸衍生物产品的分离纯化 |
| 6.4 小结 |
| 第七章 结论与展望 |
| 7.1 结论 |
| 7.2 论文的创新点 |
| 7.3 展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 作者简历 |
（6）基于碳代谢改造构建高菌体量乳酸乳球菌菌株及其生产应用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第1章 文献综述 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 乳酸乳球菌碳代谢改造及其应用 |
| 1.2.1 乳酸乳球菌碳代谢改造用于通用化学品的生产 |
| 1.2.2 乳酸乳球菌碳代谢改造用于食品添加剂的生产 |
| 1.2.3 乳酸乳球菌碳代谢用于高价值产品的生产 |
| 1.3 乳酸链球菌素研究进展 |
| 1.3.1 Nisin的分子结构及应用 |
| 1.3.2 Nisin的生物合成及作用机制 |
| 1.3.3 提高nisin合成研究进展 |
| 1.4 PLA的研究进展 |
| 1.4.1 PLA结构及应用 |
| 1.4.2 PLA生物合成及作用机制 |
| 1.4.3 菌株改造用于生产PLA的研究进展 |
| 1.5 本文的主要研究内容与实验设计 |
| 第2章 碳代谢分流对乳酸乳球菌菌体量影响的探究 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验材料 |
| 2.2.1 菌株和质粒 |
| 2.2.2 设备与仪器 |
| 2.2.3 实验试剂与药品 |
| 2.2.4 培养基与主要溶液 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 基因序列的获取 |
| 2.3.2 引物设计 |
| 2.3.3 基因组的提取 |
| 2.3.4 目的基因片段的扩增与回收 |
| 2.3.5 大肠杆菌质粒的提取 |
| 2.3.6 载体及目标片段的酶切和回收 |
| 2.3.7 载体和目标片段的连接 |
| 2.3.8 大肠杆菌TG1 化学感受态的制备及转化 |
| 2.3.9 转化子的筛选和验证 |
| 2.3.10 乳酸乳球菌F44 电转化感受态的制备和转化 |
| 2.3.11 乳酸乳球菌重组菌的筛选与验证 |
| 2.3.12 乳酸乳球菌重组菌株菌体量和发酵液p H的测定 |
| 2.3.13 代谢物检测 |
| 2.4 结果与讨论 |
| 2.4.1 乳酸乳球菌F44 代谢物抑制强度测定结果 |
| 2.4.2 碳代谢流再分配对乳酸乳球菌菌体量的影响 |
| 2.4.3 碳代谢流再分配对乳酸乳球菌发酵液p H的影响 |
| 2.4.4 碳代谢途径改造对乳酸乳球菌F44 代谢产物的影响 |
| 2.5 本章小结 |
| 第3章 乳酸合成途径对乳酸乳球菌菌体量影响的探究 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验材料 |
| 3.2.1 菌株和质粒 |
| 3.2.2 仪器和设备 |
| 3.2.3 实验试剂与药品 |
| 3.2.4 培养基和主要溶液 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 乳酸乳球菌基因序列的获取和基因组的提取 |
| 3.3.2 引物设计 |
| 3.3.3 目的基因上下游同源臂的扩增和回收 |
| 3.3.4 质粒p CS1966 的提取 |
| 3.3.5 质粒的酶切和回收 |
| 3.3.6 基因片段与载体的连接 |
| 3.3.7 大肠杆菌TG1 化学感受态的制备及转化 |
| 3.3.8 转化子的筛选和验证 |
| 3.3.9 乳酸乳球菌电转化感受态的制备和转化 |
| 3.3.10 乳酸乳球菌基因缺失菌株的筛选 |
| 3.3.11 乳酸脱氢酶基因缺失菌株的发酵实验 |
| 3.3.12 代谢物检测 |
| 3.4 结果与讨论 |
| 3.4.1 乳酸脱氢酶基因缺失对乳酸乳球菌F44 菌体量的影响 |
| 3.4.2 乳酸脱氢酶基因缺失对乳酸乳球菌F44 发酵液p H的影响 |
| 3.4.3 乳酸脱氢酶基因缺失对乳酸乳球菌F44 nisin产量的影响 |
| 3.4.4 乳酸脱氢酶基因缺失对乳酸乳球菌F44 代谢物的影响 |
| 3.4.5 ldh和 ldhB基因缺失对乳酸乳球菌丙酮酸含量的影响 |
| 3.4.6 分流策略对乳酸乳球菌ΔLDHΔLDHB的影响 |
| 3.5 本章小结 |
| 第4章 甲酸合成途径对乳酸乳球菌菌体量影响的探究 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验材料 |
| 4.2.1 菌株和质粒 |
| 4.2.2 仪器和设备 |
| 4.2.3 试剂与药品 |
| 4.2.4 培养基和主要溶液的配置 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 基因序列的获取和基因组的提取 |
| 4.3.2 引物设计 |
| 4.3.3 目标基因片段的扩增和回收 |
| 4.3.4 大肠杆菌质粒的提取 |
| 4.3.5 质粒的酶切及回收 |
| 4.3.6 载体和目标片段的连接 |
| 4.3.7 大肠杆菌TG1 化学感受态的制备及转化 |
| 4.3.8 转化子的筛选和验证 |
| 4.3.9 乳酸乳球菌电转化感受态的制备及转化 |
| 4.3.10 乳酸乳球菌重组菌株的筛选和验证 |
| 4.3.11 乳酸乳球菌的发酵实验 |
| 4.4 结果与讨论 |
| 4.4.1 甲酸对乳酸乳球菌生长的影响 |
| 4.4.2 抑制甲酸合成途径对乳酸乳球菌ΔLDHΔLDHB的影响 |
| 4.4.3 fdh的表达对乳酸乳球菌ΔLDHΔLDHB菌体量的影响 |
| 4.4.4 fdh的表达对乳酸乳球菌ΔLDHΔLDHB发酵液p H的影响 |
| 4.4.5 fdh的表达对乳酸乳球菌ΔLDHΔLDHB nisin产量的影响 |
| 4.4.6 fdh的表达对乳酸乳球菌ΔLDHΔLDHB代谢产物的影响 |
| 4.4.7 fdh的表达对乳酸乳球菌F44 的影响 |
| 4.5 本章小结 |
| 第5章 利用高菌体量菌株联产nisin和 PLA |
| 5.1 引言 |
| 5.2 实验材料 |
| 5.2.1 菌株和质粒 |
| 5.2.2 仪器和设备 |
| 5.2.3 实验试剂与药品 |
| 5.2.4 培养基和试剂溶液 |
| 5.3 实验方法 |
| 5.3.1 基因序列的获取和基因组提取 |
| 5.3.2 引物设计 |
| 5.3.3 表达载体的构建 |
| 5.3.4 乳酸乳球菌重组菌株的构建 |
| 5.3.5 乳酸乳球菌的发酵实验 |
| 5.3.6 PLA的检测方法 |
| 5.3.7 PLA和 nisin联合抑菌强度测定 |
| 5.4 结果与讨论 |
| 5.4.1 PLA和 nisin联合抑菌强度 |
| 5.4.2 PLA和 nisin在食品保鲜方面的应用 |
| 5.4.3 联产nisin和 PLA菌株的构建 |
| 5.5 本章小结 |
| 第6章 结论与展望 |
| 6.1 结论 |
| 6.2 论文创新点 |
| 6.3 展望 |
| 参考文献 |
| 发表论文和参加科研情况说明 |
| 致谢 |
（7）L-乳酸脱氢酶介导木糖葡萄球菌多重耐药机制的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 引言 |
| 1.1 奶牛乳房炎 |
| 1.1.1 奶牛乳房炎的危害 |
| 1.1.2 凝固酶阴性葡萄球菌引起奶牛乳房炎的发病率 |
| 1.1.3 木糖葡萄球菌引起的奶牛乳房炎与耐药现状 |
| 1.2 细菌耐药性的研究进展 |
| 1.2.1 抗菌药物的发展与细菌耐药性的危害 |
| 1.2.2 部分抗菌药物耐药机制的研究进展 |
| 1.2.3 细菌的生理代谢与细菌耐药性 |
| 1.3 TCA循环的研究进展 |
| 1.3.1 TCA循环简介 |
| 1.3.2 TCA循环与细菌耐药性 |
| 1.3.3 L-乳酸脱氢酶与细菌耐药性 |
| 1.4 硫氧还蛋白系统的研究进展 |
| 1.4.1 硫氧还蛋白系统 |
| 1.4.2 硫氧还蛋白系统与细菌耐药性 |
| 1.5 研究目的与意义 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 菌株及质粒 |
| 2.1.2 药品 |
| 2.1.3 主要试剂 |
| 2.1.4 仪器设备 |
| 2.1.5 PCR引物 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 泰乐菌素耐药木糖葡萄球菌ldh基因缺失株的构建 |
| 2.2.2 泰乐菌素耐药木糖葡萄球菌ldh基因回补株的构建 |
| 2.2.3 细菌对药物敏感性的检测 |
| 2.2.4 细菌中关键代谢物含量的检测 |
| 2.2.5 细菌中TCA循环活性的检测 |
| 2.2.6 细菌中硫氧还蛋白系统的测定 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 泰乐菌素耐药木糖葡萄球菌ldh基因缺失株的构建 |
| 3.1.1 ldh基因缺失株克隆载体的构建 |
| 3.1.2 ldh基因缺失株自杀质粒的构建 |
| 3.1.3 ldh缺失菌株的筛选 |
| 3.1.4 ldh缺失菌株的的鉴定 |
| 3.2 泰乐菌素耐药木糖葡萄球菌ldh基因回补株的构建 |
| 3.2.1 ldh基因回补株克隆载体的构建 |
| 3.2.2 ldh基因回补质粒的构建 |
| 3.2.3 ldh回补菌株的筛选及鉴定 |
| 3.3 细菌对药物敏感性的检测 |
| 3.4 细菌中关键代谢物含量的测定 |
| 3.4.1 乳酸含量的测定 |
| 3.4.2 丙酮酸含量的测定 |
| 3.5 细菌中TCA循环活性的测定 |
| 3.5.1 NADH含量的测定 |
| 3.5.2 异柠檬酸脱氢酶活性的测定 |
| 3.5.3 苹果酸脱氢酶活性的测定 |
| 3.5.4 异柠檬酸脱氢酶、苹果酸脱氢酶mRNA水平检测 |
| 3.6 细菌中硫氧还蛋白系统关键指标的测定 |
| 3.6.1 硫氧还蛋白还原酶活性的测定 |
| 3.6.2 硫氧还蛋白mRNA水平的检测 |
| 3.6.3 ROS含量的测定 |
| 4 讨论 |
| 4.1 L-乳酸脱氢酶与木糖葡萄球菌多重耐药相关 |
| 4.1.1 L-乳酸脱氢酶是耐药相关蛋白 |
| 4.1.2 L-乳酸脱氢酶对木糖葡萄球菌多重耐药性的影响 |
| 4.2 L-乳酸脱氢酶通过TCA循环介导木糖葡萄球菌的多重耐药性 |
| 4.2.1 乳酸、丙酮酸对木糖葡萄球菌多重耐药性的影响 |
| 4.2.2 NADH、异柠檬酸脱氢酶、苹果酸脱氢酶对木糖葡萄球菌多重耐药性的影响 |
| 4.3 硫氧还蛋白系统是TCA循环调控木糖葡萄球菌中多重耐药性的潜在机制 |
| 4.3.1 硫氧还蛋白对木糖葡萄球菌多重耐药性的影响 |
| 4.3.2 ROS对木糖葡萄球菌多重耐药性的影响 |
| 4.4 L-乳酸脱氢酶及TCA循环对研发抗耐药菌药物的启示 |
| 4.4.1 从代谢途径中寻找抗菌药物靶点 |
| 4.4.2 调节代谢途径底物以辅助抗菌药物治疗 |
| 5 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 攻读硕士学位期间发表的学术论文 |
（8）代谢工程改造大肠杆菌细胞工厂生产D-乳酸及衍生物（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第1章 文献综述 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 代谢工程的概述 |
| 1.2.1 微生物代谢的多层次调控特征 |
| 1.2.2 代谢工程研究的总体路线 |
| 1.2.3 实验室适应性进化与新型生物反应器的运用 |
| 1.3 大肠杆菌细胞工厂的概述 |
| 1.3.1 大肠杆菌细胞工厂的优良特质 |
| 1.3.2 大肠杆菌细胞工厂生产本源产物案例 |
| 1.3.3 大肠杆菌细胞工厂生产外源产物案例 |
| 1.4 D-乳酸及衍生物的概述 |
| 1.4.1 D-乳酸及衍生物3HP、丙烯酸的理化性质、应用及市场需求 |
| 1.4.2 D-乳酸及衍生物3HP、丙烯酸化学合成法的研究概况 |
| 1.4.3 D-乳酸及衍生物3HP、丙烯酸生物合成法的研究进展 |
| 1.5 选题背景与研究内容 |
| 1.5.1 选题背景 |
| 1.5.2 研究内容与技术路线 |
| 第2章 实验室适应性进化选育大肠杆菌快速生长平台菌株及机制研究 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 菌种和质粒 |
| 2.1.2 实验仪器 |
| 2.1.3 实验主要试剂 |
| 2.1.4 培养基 |
| 2.1.5 溶液 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 大肠杆菌生长情况评价 |
| 2.2.2 大肠杆菌出发菌株的实验室适应性进化 |
| 2.2.3 厌氧快速生长平台菌株的筛选 |
| 2.2.4 平台菌株的表型评价 |
| 2.2.5 平台菌株基因组尺度突变分析 |
| 2.2.6 平台菌株突变基因的反向代谢重构 |
| 2.2.7 平台菌株相关基因转录水平分析 |
| 2.2.8 平台菌株胞内ATP水平分析 |
| 2.2.9 生物量及主要代谢产物测定方法 |
| 2.2.10 常规分子生物学操作及主要实验方法 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 大肠杆菌出发菌株生长评价 |
| 2.3.2 大肠杆菌出发菌株的实验室适应性进化 |
| 2.3.3 厌氧快速生长平台菌株的筛选与表型评价 |
| 2.3.4 平台菌株基因组尺度突变分析 |
| 2.3.5 平台菌株突变基因的反向代谢重构 |
| 2.3.6 平台菌株相关基因转录水平分析 |
| 2.3.7 平台菌株胞内ATP水平分析 |
| 2.4 本章小结 |
| 第3章 代谢改造大肠杆菌平台菌株生产D-乳酸 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 菌种和质粒 |
| 3.1.2 实验仪器 |
| 3.1.3 实验试剂 |
| 3.1.4 培养基 |
| 3.1.5 溶液 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 以野生菌株W3110 为出发菌株的代谢工程改造设计与构建 |
| 3.2.2 以平台菌株WE269 为出发菌株的代谢工程改造设计与构建 |
| 3.2.3 大肠杆菌工程菌株D-乳酸生产测试与发酵优化 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 以野生菌株W3110 为出发菌株的代谢工程改造设计、构建与测试 |
| 3.3.2 大肠杆菌平台菌株WE269 的D-乳酸生产测试 |
| 3.3.3 以平台菌株WE269 为出发菌株的代谢工程改造设计、构建与测试 |
| 3.3.4 大肠杆菌工程菌株D-乳酸生产测试与发酵优化 |
| 3.4 本章小结 |
| 第4章 代谢改造大肠杆菌平台菌株生产3-羟基丙酸 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.1.1 菌种和质粒 |
| 4.1.2 实验仪器 |
| 4.1.3 实验试剂 |
| 4.1.4 培养基 |
| 4.1.5 溶液 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 基于Gibson DNA组装技术的质粒构建 |
| 4.2.2 3HP生产菌株的发酵测试 |
| 4.2.3 发酵液3HP含量的测定 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 3HP合成代谢途径设计与关键酶挖掘 |
| 4.3.2 初始3HP合成途径质粒及菌株的构建与发酵测试 |
| 4.3.3 3HP合成途径基因的密码子优化及生产菌株发酵测试 |
| 4.3.4 3HP合成途径基因的组合调控优化 |
| 4.3.5 强化3HP合成途径的能量供应 |
| 4.3.6 3HP合成途径的关键基因替换 |
| 4.3.7 整合高效合成途径的3HP生产菌株发酵测试 |
| 4.4 本章小结 |
| 第5章 代谢改造大肠杆菌平台菌株生产丙烯酸 |
| 5.1 实验材料 |
| 5.1.1 菌种和质粒 |
| 5.1.2 实验仪器 |
| 5.1.3 实验试剂 |
| 5.1.4 培养基 |
| 5.1.5 溶液 |
| 5.2 实验方法 |
| 5.2.1 基于Gibson DNA组装技术的质粒构建 |
| 5.2.2 丙烯酸生产菌株的发酵测试 |
| 5.2.3 丙烯酸含量的测定 |
| 5.3 结果与分析 |
| 5.3.1 丙烯酸合成代谢途径设计与关键酶挖掘 |
| 5.3.2 丙烯酸合成途径质粒及生产菌株的构建 |
| 5.3.3 丙烯酸生产菌株的发酵测试 |
| 5.4 本章小结 |
| 第6章 结论与展望 |
| 6.1 主要结论 |
| 6.2 创新点 |
| 6.3 展望 |
| 参考文献 |
| 发表论文和参加科研情况说明 |
| 附录 |
| 致谢 |
（9）重组毕赤酵母全细胞转化L-乳酸合成丙酮酸钠的工艺研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 绪论 |
| 第一节 丙酮酸 |
| 1.1 丙酮酸的结构和理化性质 |
| 1.2 丙酮酸(盐)的用途 |
| 第二节 丙酮酸的生产方法及生产概况 |
| 2.1 化学合成法 |
| 2.2 直接发酵法 |
| 2.3 酶转化法 |
| 第三节 丙酮酸的提取方法 |
| 3.1 减压蒸馏法 |
| 3.2 有机溶剂提取法 |
| 3.3 反渗透膜分离法 |
| 3.4 离子交换法 |
| 第四节 重组毕赤酵母发酵的关键控制 |
| 4.1 毕赤酵母碳源的影响 |
| 4.2 诱导时间的影响 |
| 4.3 发酵培养中pH的影响 |
| 第五节 细胞透性化技术研究进展 |
| 5.1 细胞透性化技术 |
| 5.2 细胞透性化方法 |
| 5.3 透性化细胞的应用 |
| 第六节 课题的研究内容及意义 |
| 6.1 课题研究意义 |
| 6.2 课题研究内容 |
| 第一章 重组毕赤酵母5L发酵罐发酵工艺优化 |
| 第一节 引言 |
| 第二节 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.2 分析方法 |
| 2.3 实验方法 |
| 第三节 结果与分析 |
| 3.1 接种量对重组毕赤酵母生长及乙醇酸氧化酶活力影响 |
| 3.2 pH对重组毕赤酵母生长及乙醇酸氧化酶活力的影响 |
| 3.3 培养温度对重组毕赤酵母生长及乙醇酸氧化酶活力的影响 |
| 3.4 诱导时间对重组毕赤酵母生长及乙醇酸氧化酶活力的影响 |
| 3.5 甲醇浓度对重组毕赤酵母生长及乙醇酸氧化酶活力的影响 |
| 3.6 开始诱导的时间对重组毕赤酵母生长及乙醇酸氧化酶活力的影响 |
| 3.7 重组毕赤酵母5L发酵罐菌体生长和发酵参数分析 |
| 第四节 小结与讨论 |
| 第二章 重组毕赤酵母5T发酵罐中试放大工艺研究 |
| 第一节 引言 |
| 第二节 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.2 分析方法 |
| 2.3 实验方法 |
| 第三节 结果与分析 |
| 3.1 三级种子发酵培养基的优化 |
| 3.2 三级发酵工艺对重组毕赤酵母生长和乙醇酸氧化酶活力的影响 |
| 3.3 重组毕赤酵母5T发酵罐菌体生长和发酵参数分析 |
| 第四节 小结与讨论 |
| 第三章 重组毕赤酵母催化L-乳酸合成丙酮酸钠的转化工艺优化 |
| 第一节 引言 |
| 第二节 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.2 分析方法 |
| 2.3 实验方法 |
| 第三节 结果与分析 |
| 3.1 细胞的透性化处理 |
| 3.2 重组毕赤酵母的重复使用次数对转化过程的影响 |
| 3.3 底物L-乳酸浓度对转化过程的影响 |
| 3.4 细胞浓度对转化过程的影响 |
| 3.5 pH对转化过程的影响 |
| 3.6 反应温度对转化过程的影响 |
| 3.7 重组毕赤酵母转化L-乳酸生成丙酮酸钠转化过程分析 |
| 第四节 小结与讨论 |
| 第四章 丙酮酸钠提取纯化工艺的优化 |
| 第一节 引言 |
| 第二节 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.2 分析方法 |
| 2.3 实验方法 |
| 第三节 结果与分析 |
| 3.1 丙酮酸钠溶解度的研究 |
| 3.2 丙酮酸钠发酵液的脱色工艺研究 |
| 3.3 丙酮酸钠转化液浓缩冷却结晶工艺的研究 |
| 3.4 丙酮酸钠结晶工艺的研究 |
| 3.5 丙酮酸钠分离纯化工艺流程 |
| 第四节 小结与讨论 |
| 第五章 结论与展望 |
| 5.1 结论 |
| 5.2 创新点 |
| 5.3 展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
四、L-乳酸脱氢酶催化反应机理的理论研究进展（论文参考文献）
- [1]新型类母乳OMO型结构酯的酶法合成、动力学模拟及对肝细胞脂质代谢的影响[D]. 彭斌. 南昌大学, 2021(02)
- [2]四种啮齿动物Ldha基因的克隆、原核表达与酶学性质研究[D]. 倪玉芳. 西南医科大学, 2021(01)
- [3]硫酸盐废水的资源化回收及功能菌群解析[D]. 杨重. 大连理工大学, 2021
- [4]L-乳酸脱氢酶偶联葡萄糖脱氢酶高效制备L-苯乳酸[D]. 张婷. 江南大学, 2020(12)
- [5]生物催化级联反应制备丙酮酸及L-酪氨酸衍生物[D]. 李国四. 浙江大学, 2020(05)
- [6]基于碳代谢改造构建高菌体量乳酸乳球菌菌株及其生产应用[D]. 熊慧. 天津大学, 2020(02)
- [7]L-乳酸脱氢酶介导木糖葡萄球菌多重耐药机制的研究[D]. 王金鹏. 东北农业大学, 2020(04)
- [8]代谢工程改造大肠杆菌细胞工厂生产D-乳酸及衍生物[D]. 汪保卫. 天津大学, 2020(01)
- [9]重组毕赤酵母全细胞转化L-乳酸合成丙酮酸钠的工艺研究[D]. 鹿承建. 福建师范大学, 2020(12)
- [10]酶法催化二氧化碳制备高附加值化学品研究进展[J]. 梁珊,宗敏华,娄文勇. 化学学报, 2019(11)