一、RNAi研究进展（论文文献综述）
张秋朗,刘建宏,徐进,叶辉[1]（2021）在《RNA干扰在鳞翅目昆虫中的应用研究进展》文中研究指明鳞翅目（Lepidoptera）是昆虫纲中的第二大目,现已经记载的鳞翅目昆虫多达18万个种。鳞翅目昆虫中的许多成员是重要的全球性农业害虫。多数鳞翅目害虫具有繁殖快、危害重、抗药性强及长距离迁飞等特性,对农业生产构成巨大威胁。RNA干扰（RNAi）技术是指通过将目的基因特异性同源双链RNA（dsRNA）导入到细胞内,引起与其同源的mRNA特异性降解,从而达成目标基因表达沉默的一种分子技术。目前该技术已被广泛应用于鳞翅目昆虫的基因功能研究和绿色害虫防治策略探索,并在近年来取得了显着成效和进展。基于此,对RNAi在昆虫中的作用机理进行了归纳和概括,并重点总结和探讨了近年来RNAi技术在鳞翅目昆虫基因功能研究以及鳞翅目害虫防治新方法探索方面取得的新进展,以期为鳞翅目昆虫相关科学研究和生产实践提供参考。
卢枫[2]（2021）在《甲维盐对松材线虫作用机理初探》文中认为甲维盐（emamectin benzoate,EB）是一种常用的十六元大环内酯化合物（16-membered macrolide lactones）,它由阿维菌素衍生合成,杀虫活性比阿维菌素高出数个数量级,且对哺乳动物的毒性低,是目前应用最广泛的高效低毒广谱杀虫剂,也是树干注药防治松材线虫的主要药剂之一,但尚未有研究验证其对松材线虫作用机理。本论文克隆出编码松材线虫谷氨酸门控氯离子通道（glutamate-gated chloride channel,GluCl）和γ-氨基丁酸门控氯离子通道（γ-aminobutyric acid-gated chloride channel,GABACl）的基因,验证了这两个作用靶标与甲维盐及几种十六元大环内酯化合物的亲和作用。主要结果如下:1.通过生物测定明确了低剂量甲维盐对松材线虫的毒力作用。浓度为0.1 mg/L的甲维盐处理能够显着降低松材线虫雌虫平均产卵量（F=145.25,P＜0.001）、抖动频率（F=141.97,P＜0.001）,且能抑制其发育进度（F=175.75,P＜0.001）,对后代性别比例则无显着影响（F=1.412,P=0.281）,表明低剂量甲维盐对松材线虫的繁殖、发育、运动均有影响。2.通过转录组测序筛选0.1 mg/L甲维盐胁迫下松材线虫的差异表达基因（differentially expressed genes,DEGs）。处理12 h,各RNA-seq库间只有7个DEGs;处理24 h,共筛选出5741个DEGs,其中甲维盐与助剂对照处理24 h样品（EB24与ON24）对比结果中,共有758个基因上调表达,562个基因下调表达,它们的生物学功能分别与生活史、神经与运动系统、外源性物质代谢及致病性相关。通过qPCR验证转录组测序结果,果胶裂解酶（F=151.9,P＜0.001）和β-1,4-内切葡聚糖酶（F=735.2,P＜0.001）基因经甲维盐处理显着下调表达,谷氨酸门控氯离子通道（F=35.0,P＜0.001）、γ-氨基丁酸β受体（F=15.8,P＜0.001）、UDP葡萄糖醛酸转移酶（F=17.0,P＜0.001）和ABC转运蛋白（F=23.1,P＜0.001）基因则显着上调,相对表达水平变化趋势与转录组测序结果相符,证明了转录组数据准确可靠。生物信息学分析结果表明,筛选出的BxGluCl和BxGABACl基因均具备半胱氨酸环配体门控离子通道（cysteine-loop ligand-gated ion channel super family,cys-loop LGICs）超家族的典型结构特征;系统发育树构建结果表明,BxGluCl和BxGABACl与其他线虫的氯离子通道基因具备高度同源性。推断BxGluCl和BxGABACl具备氯离子通道蛋白功能,且能够完整表达。3.使用PCR扩增和重组质粒构建技术克隆目的基因,并通过qPCR分析松材线虫BxGluCl和BxGABACl在不同龄期的表达水平及化合物处理后的表达模式。PCR扩增得到电泳结果符合预期大小的目的条带,使用pGEM-T Easy载体构建重组质粒并导入大肠杆菌,提取得到质粒测序,序列与预期相符,克隆出的BxGluCl和BxGABACl片段长度分别为1386 bp和1446 bp。BxGluCl和BxGABACl均在卵期表达量较低,二龄至四龄（J2-J4）幼虫表达量较高,成虫期则达到最高表达水平。甲维盐处理12 h内,成虫体内BxGluCl（F=2.308,P=0.203）和BxGABACl（F=4.654,P=0.097）表达量均未发生显着变化,24 h后则均显着上升（F=8.248,P=0.019;F=8.436,P=0.018）;对照药剂噻虫啉处理后48 h内BxGluCl和BxGABACl表达水平均不发生显着变化。4.使用RNAi技术明确了十六元大环内酯化合物对松材线虫的作用靶标。松材线虫成虫经合成的BxGluCl和BxGABACl的dsRNA（dsBxGluCl和dsBxGABACl）浸泡干扰24 h后,BxGluCl和BxGABACl沉默效率分别达54.93%和38.53%,RNAi沉默效率较高。使用不同剂量的甲维盐、天维菌素A、天维菌素B、阿维菌素B1a和噻虫啉进行生物测定,松材线虫经RNAi后,对4种十六元大环内酯化合物的敏感性均显着下降,对新型氯代烟碱杀虫剂噻虫啉的敏感性则无显着变化;松材线虫经BxGluCl和BxGABACl的混合dsRNA（dsMix）沉默后抖动频率亦显着降低（F=6.310,P=0.036）。说明甲维盐等十六元大环内酯化合物作用靶标为松材线虫的BxGluCl和BxGABACl蛋白。
李慧咏[3]（2021）在《飞蝗Loquacious在小RNA通路中的功能研究》文中指出飞蝗（Locusta migratoria）是重要的作物害虫,蝗灾导致了农作物产量减少,降低了农业生产效益。飞蝗的繁殖率高、飞行能力强,这是造成种群数量大、危害严重的重要原因,对飞蝗的有效控制是农业植保领域的重要课题。RNA干扰（RNAi）通过传递基因特异性双链RNA（dsRNA）,成为各种生物基因功能研究的有力工具,作为新的害虫防治策略,具有重要的理论与实践意义。本文以飞蝗为研究对象,对飞蝗RNAi通路关键基因Loquacious（Loqs）进行分子特性及表达研究,并基于RNAi技术结合双荧光素酶报告实验、Pull Down实验及S2细胞过表达实验,对飞蝗Loqs在飞蝗RNAi通路中的功能进行了探究,为飞蝗RNAi通路作用机制的深入研究提供了新的依据,完善了飞蝗RNAi机制的部分研究内容,推动了RNAi技术在害虫防治中的应用。主要研究内容如下:一、飞蝗Loqs分子特性及表达分析基于飞蝗的全基因组进行搜索,采用生物信息学的方法获得3条Loqs序列,经基因结构分析,显示这几条序列均含有双链结合域—DSRM结构域,分别命名为LmLoqs-A、LmLoqs-B和LmLoqs-C。LmLoqs-A的核酸序列长度为834 bp,编码277个氨基酸;LmLoqs-B的核苷酸序列长度为987 bp,编码328个氨基酸;LmLoqs-C的核苷酸序列长度为861 bp,编码286个氨基酸。采用RT-q PCR技术进行研究,发现LmLoqs在飞蝗精巢和卵巢高表达,其他组织部位恒定表达,LmLoqs在飞蝗3龄整个龄期均有较高的表达水平。二、LmLoqs在飞蝗外源siRNA（exo-siRNA）通路中的功能分析为了揭示LmLoqs在飞蝗exo-siRNA通路中的功能,首先,在飞蝗体内通过RNAi ofRNAi实验,初步证明LmLoqs可以参与飞蝗exo-siRNA通路。随后,在S2细胞中分别将LmLoqs-A、LmLoqs-B和LmLoqs-C过表达,采用双荧光素酶实验,进一步发现LmLoqs-A和LmLoqs-B能够增强外源小RNA通路的RNA干扰;最后又通过体外结合实验,证明LmLoqs-A和LmLoqs-B能够与外源dsRNA相结合。研究结果表明,LmLoqs-A和LmLoqs-B均参与了飞蝗exo-siRNA通路。三、LmLoqs在飞蝗内源siRNA（endo-siRNA）通路中的功能分析为了探索LmLoqs在飞蝗endo-siRNA通路中的功能,将LmLoqs基因沉默后,发现飞蝗体内部分endo-siRNAs的表达与对照组相比下调。为了进一步探究LmLoqs在endo-siRNA通路中的功能,构建psi CHECK-2-esi2.1内源性质粒,转染至S2细胞中表达,随后,分别将LmLoqs-A、LmLoqs-B、LmLoqs-C和Lm Tubulin（对照）在S2细胞中过表达,研究发现,与对照组相比,LmLoqs-B和LmLoqs-C的过表达显着提高了由endo-siRNA通路引起的RNAi效率,研究结果表明,LmLoqs-B和LmLoqs-C参与了飞蝗endo-siRNA通路。四、LmLoqs在飞蝗miRNA通路中的功能分析为了研究LmLoqs在飞蝗miRNA通路中的功能,将飞蝗体内的LmLoqs基因沉默,与对照组相比飞蝗体内部分miRNAs的表达下调。此外,分别将LmLoqs-A、LmLoqs-B、LmLoqs-C和Lm Tubulin（对照）在S2细胞中过表达,结果发现,与对照组相比,LmLoqs-B的过表达可显着提高miRNA的表达量。研究结果表明,LmLoqs-B参与了飞蝗miRNA通路。综上所述,本文对飞蝗RNAi通路关键基因Loquacious的三种剪切体LmLoqs-A、LmLoqs-B和LmLoqs-C在飞蝗小RNA通路中的功能进行了系统性的研究,指在为飞蝗的防治提供新的科学靶标。
尹红琴[4]（2021）在《粘虫CYP4G199基因在表皮发育中的功能研究》文中指出粘虫被列入一类农作物病虫害名录,大发生时造成严重损失,在防治方面不容松懈,而随着杀虫剂的使用,其抗药性日益严重,因此粘虫的抗药性治理及绿色防控成为研究热点。细胞色素P450（cytochrome P450,CYP）与昆虫的生长发育、内外源物质代谢密切相关,越来越多的研究发现P450家族的基因参与表皮碳氢化合物的合成,导致害虫抗药性增强。本研究基于P450基因在表皮发育中的重要功能,通过转录组测序获得粘虫表皮转录组数据,筛选鉴定得出CYP4G199基因在表皮中特异性高表达,探索了该基因在粘虫中的时空表达模式;并成功建立粘虫RNAi技术体系,验证CYP4G199在粘虫表皮发育中的功能。研究结果为研发P450抑制剂或杀虫剂,寻求粘虫绿色防控方法提供理论基础。主要研究结果如下:1.粘虫表皮转录组测序及P450基因的鉴定通过转录组测序,从4龄幼虫表皮共鉴定出166个P450基因转录本和4个细胞色素P450还原酶（Cytochrome P450 Reductase,CPR）基因转录本,其中66个P450基因和1个CPR基因拥有完整开放阅读框（Open Reading Frame,ORF）,这些基因包括四个集团（CYP2、CYP3、CYP4和Mitochondrial）,主要分布在CYP4、CYP6、CYP9和CYP340家族,均含有Helix C、Helix I、Helix K和Heme-binding domain等保守结构域。2.筛选粘虫表皮中特异性高表达的P450基因基于转录组数据中的FPKM（Fragments Per Kilobase per Million mapped fragments）值,鉴定出了10个在表皮高表达的P450基因,其中包括CPR基因;进一步验证这10个基因在表皮中的相对表达水平,结果与转录组测序数据一致,其中CYP4G199基因的表达水平明显高于其他基因。利用RT-qPCR检测这10个基因在幼虫不同组织中的表达水平发现,CYP4G199等五个基因在幼虫表皮特异性表达。因此CYP4G199基因在表皮中特异性高表达。3.CYP4G199基因的克隆与序列分析克隆获得CYP4G199基因的cDNA序列,含有1695 bp的ORF,编码564个氨基酸,包括保守区域Helix C、Helix I、Helix K以及Heme-binding domain的P450蛋白特征序列;基于基因组DNA,扩增获得CYP4G199 DNA序列长度为6985 bp,包括9个内含子,长度介于331-1538 bp,外显子长度介于70-238 bp,且每段内含子与外显子的交界处都符合GT-AG原则。比对发现CYP4G199与甜菜夜蛾的CYP4G74基因序列同源性最高,相似性达到92.32%。4.利用RT-qPCR技术解析CYP4G199基因的时空表达模式通过RT-qPCR检测CYP4G199在粘虫不同发育阶段表达量发现,1龄幼虫中表达量相对最高,随着幼虫龄期的增长,CYP4G199基因的表达量有逐步降低的趋势,成虫时期,雌虫的表达量略高于雄虫。通过比较CYP4G199在不同龄期幼虫表皮中表达量发现,该基因在各个龄期幼虫表皮中均有表达,1龄幼虫表皮中表达量相对较高,6龄幼虫表皮中的表达量较低,2龄至5龄阶段幼虫表皮中基因表达量差异则不显着。在幼虫蜕皮过程中,进入蜕皮阶段6 h,CYP4G199基因在表皮中的表达量最低,后期随着蜕皮逐步结束,基因表达量也逐渐升高,至4龄初期表皮中CYP4G199基因的表达量与蜕皮前期无显着差异,说明在旧表皮消化和新表皮形成这一过程中,CYP4G199表达水平有明显增减变化。5.RNAi研究CYP4G199基因在粘虫表皮发育中的功能建立粘虫RNAi技术体系,通过体外合成ds RNA,显微注射法对4龄幼虫进行RNAi,结果表明CYP4G199基因的表达被抑制,其表达量显着下调65%,并且4龄幼虫蜕皮至5龄幼虫阶段表皮发育异常,6龄幼虫出现无法正常化蛹的现象,这表明CYP4G199与昆虫表皮发育相关,很可能参与表皮合成过程。
时苏[5]（2021）在《杂拟谷盗热激蛋白基因应答4-松油醇及柠檬烯胁迫的表达及功能分析》文中提出植物精油因其广谱、安全、在环境中低残留及昆虫不易产生抗药性等优点,成为储粮害虫防治领域的研究热点。课题组前期分别从茶树精油与中山杉中分离鉴定出对杂拟谷盗具有杀虫活性的4-松油醇与柠檬烯,并发现其提高温度会增加其敏感性。在此基础上,本研究利用熏蒸法测定不同温度下4-松油醇、柠檬烯对杂拟谷盗的生物活性,基于转录组数据与生物信息学分析,筛选出杂拟谷盗应答4-松油醇后表达量上调的热激蛋白（TcfHSP）基因,探讨TcfHSP应答4-松油醇、柠檬烯胁迫后的响应模式,利用RNAi方法验证目的基因在4-松油醇、柠檬烯胁迫杂拟谷盗的过程中的功能。本研究的结果为阐明热激蛋白（Heat shock protein,HSP）在杂拟谷盗体内的功能,及4-松油醇与柠檬烯应用于储粮害虫防治方面提供理论依据。主要研究结果如下:1、40℃条件下可增强4-松油醇、柠檬烯对杂拟谷盗的毒性通过三角瓶熏蒸法,初步生测发现,4-松油醇、柠檬烯在28℃与10℃条件下熏蒸杂拟谷盗成虫,其LC50基本一致;然而,在40℃条件下,以上述致死中浓度熏蒸试虫,处理组与对照组的死亡率具有显着性差异。说明杂拟谷盗在高温条件下对两种化合物更加敏感,具有叠加的效果。进一步实验发现两种化合物在40℃条件下的LC50均小于28℃的,其中,4-松油醇在28℃条件下LC50（3.80mg/L）是40℃条件下（1.01 mg/L）的3.74倍,柠檬烯在28℃条件下LC50（8.93mg/L）是40℃条件下（4.93 mg/L）的1.29倍。综上所述,在40℃条件下可以增强4-松油醇、柠檬烯对杂拟谷盗的毒性,其中4-松油醇的效果更为突出。2、基于杂拟谷盗应答4-松油醇转录组数据鉴定热激蛋白基因基于杂拟谷盗应答4-松油醇转录组数据从中筛选出68个TcfHSPs转录本,进一步比对筛选出22个具有完整ORF的TcfHSPs基因。其中有9个属于上调关系,通过NCBI比对进一步确认后得到4个转录本,并成功克隆它们的全长序列,分别是s HSP家族的TcfHSP13.8、TcfHSP16.8和TcfHSP19.0以及HSP70家族的TcfHSP70.9。3、TcfHSPs在不同虫态与不同体段表达量最高分别在成虫与腹部利用RT-qPCR检测杂拟谷盗不同虫态的4个TcfHSPs基因的表达量,表达水平最高的虫态主要集中于幼虫末期与成虫,TcfHSP参与了杂拟谷盗整个发育生长时期。通过比较4个TcfHSPs基因在不同体段的表达量发现,4个TcfHSPs基因在腹部的表达水平均显着高于头部与胸部（p<0.05）。4、TcfHSPs在高温条件下的表达量高于对照组通过RT-qPCR方法,检测发现杂拟谷盗成虫在40℃时4个TcfHSPs基因的表达量均显着高于28℃与10℃的处理（p<0.05）,28℃与10℃处理之间并无显着性差异。28℃条件下受4-松油醇LC50浓度诱导后4个TcfHSPs基因表达量均高于对照组,与转录组测序结果一致,且TcfHSP13.8、TcfHSP16.8与对照组有显着性差异;受柠檬烯LC50浓度诱导后TcfHSP16.8、TcfHSP19.0、TcfHSP70.9与对照组均有显着性差异（p<0.05）。40℃条件下受4-松油醇LC10与LC50浓度诱导后4个TcfHSP与对照组相比均具有显着性差异;受柠檬烯LC10与LC50浓度诱导后TcfHSP16.8、TcfHSP19.0、TcfHSP70.9均与对照组有显着性差异（p<0.05）。由此可见,在高温环境中TcfHSP调控4-松油醇、柠檬烯对杂拟谷盗的毒性中具有重要意义。5、高温条件下TcfHSP介导了杂拟谷盗对4-松油醇和柠檬烯的敏感性基于28℃条件下TcfHSP应答4-松油醇LC50浓度的表达模式分析结果选择TcfHSP16.8与TcfHSP19.0进行RNAi研究,通过RT-q PCR检测2个基因的沉默效率高达83%以上。28℃与40℃条件下杂拟谷盗的羽化率并无差异,对RNAi后的成虫进行4-松油醇、柠檬烯的敏感性测试,发现在40℃条件下的死亡率明显高于28℃,4-松油醇熏蒸后的响应提高17%以上（p<0.05）,柠檬烯熏蒸后的响应提高29%以上（p<0.05）,结果表明沉默TcfHSP16.8与TcfHSP19.0后在40℃条件下增加了杂拟谷盗对两种化合物的敏感性且柠檬烯效果更加明显。综上所述,在高温条件下TcfHSP介导并增加了杂拟谷盗对4-松油醇和柠檬烯的敏感性。
刘春艳[6]（2021）在《棉花GhCEN基因调控根系发育的功能初步研究》文中指出棉花是世界范围内天然纤维的主要来源之一,亦是我国重要的大田经济作物,其种植遍及全国多个省、市、自治区,其中最重要的棉花产区是新疆地区。为了降低生产成本提高植棉效益,新疆地区大面积推广机械化采收,在此背景下对利用遗传手段改良棉花株型的重要性的认识日益加深。但是,优良的株型结构需要健壮的根系来保证。CEN（CENTRORADIALIS）基因是棉花株型的关键调控基因,迄今为止,对CEN基因的研究主要集中于其在植物地上部分的功能解析,对其调控根系发育的相关报道鲜有所见。本研究从CEN这一关键基因入手,利用已创制完成的RNAi转基因材料与受体棉花HM-1号组成CEN近等基因系,将地上部分与地下部分结合,通过形态学、转录组比较分析,系统解析CEN基因在棉花根系发育中的调控功能。本项目着眼于解决棉花株型育种中的关键问题,聚焦解析CEN基因在棉花根系发育中的调控功能,为棉花株型育种提供理论支持和技术支撑。主要结果如下:1.观察田间6个RNAi转基因株系表型,发现与对照相比株高显着降低,茎顶端由无限生长变为有限生长,表明CEN基因可调控植株株型;纤维品质检测结果显示GhCEN基因经RNAi后会对衡量品质的4项指标产生影响,即断裂比强度和马克隆值变小,而纤维上半部平均长度和整齐度指数的变化规律与RNA干扰程度有关。2.室内棉花表型鉴定结果显示,与对照HM-1相比,生长32天（6叶龄）的RNAi转基因棉株不在产生新的茎节,现蕾提前,铃柄直接着生在主茎顶端形成顶花,由无限生长变为有限生长。3.对根系的形态学指标测定结果进行分析,发现GhCEN基因经RNA干扰后能使棉花的侧根总长、侧根长变短,GhCEN基因对棉花根系的侧根长起正调控作用。根系表型鉴定结果和地下生物量统计结果显示,GhCEN基因RNA干扰后会对根系发育产生影响,表现为侧根的数目减少、侧根长度变短,地下物质积累变少。4.对RNAi-GhCEN转基因株系RNAi-3和对照HM-1的根和茎组织进行转录组测序,测序共产生了77.11Gb高质量碱基（Clean Data）,每个样品的Clean Data不低于5.81Gb,碱基质量值大于或等于Q30的占93.36%～94.28%。将测序数据与指定的参考基因组（TM-1）进行序列比对的比对效率在94.22%～96.66%之间。在RNAi-3和HM-1的根和茎中筛选出3153个差异表达基因（Differentially expressed genes,DEG）,其中98.7%得到了功能注释。5.对HM-1和RNAi-3根和茎中都表达的DEGs进行分析。GO富集分析结果显示这些DEGs主要富集了氧的结合与运输,氧化还原酶、双加氧酶、2-烯烃还原酶的催化活性,膜（类囊体）和肽酶复合物（线粒体）的组成,固氮作用等;通过KEGG富集分析发现根和茎中都表达的DEGS主要参与了萜类化合物和脂肪酸的生物合成,植物与病原体的互作,内质网中蛋白质的加工,氨基糖、核苷酸糖、氮素等的代谢,RNA的转运与降解,核苷酸剪切修护等过程。6.GhCEN基因（GH＿D07G1075）参与以DNA为模板的转录调控过程,与NAC014、ERF017、ERF1A基因拥有同样的注释功能,编码产物为SCR-like蛋白,可能是通过调节根分生组织细胞的不对称分裂来调控棉花侧根的形成。
裴培[7]（2021）在《花绒寄甲P450参与氯氰菊酯胁迫响应分子机制研究》文中进行了进一步梳理花绒寄甲（Dastarcus helophoroides）属鞘翅目寄甲科昆虫,作为一种重要的天敌生物,已被广泛应用于天牛类害虫的生物防治。细胞色素P450是昆虫三大解毒酶之一,在昆虫对多种化学杀虫剂的解毒代谢过程中发挥重要作用。随着化学农药的大量使用,药剂在杀死害虫的同时,对天敌昆虫也有较大影响。关于农药对害虫的影响、害虫对农药的解毒代谢机制有较多的相关报道,但关于蛀干害虫的天敌——花绒寄甲对农药胁迫的响应机制未见相关报道。本文首先探究了常用杀虫剂氯氰菊酯对花绒寄甲的毒力;其次利用转录组测序技术筛选出花绒寄甲在氯氰菊酯药剂处理下高表达的P450基因,再同时借助实时荧光定量技术检测不同浓度氯氰菊酯处理后花绒寄甲相关P450基因表达差异,最后使用RNAi技术验证相关P450基因的功能,为后续探究花绒寄甲对氯氰菊酯的解毒代谢过程奠定基础。主要试验结果如下:1、利用浸渍法,获得氯氰菊酯对花绒寄甲的击倒中浓度KC50为0.19 mg/L,KC30为0.08mg/L。被击倒后的花绒寄甲胸足抽搐,无法正常爬行和取食。花绒寄甲对氯氰菊酯的耐受性较好,只有在较高浓度的氯氰菊酯处理下才会出现死亡。2、利用氯氰菊酯KC30药剂浓度和丙酮浸渍处理花绒寄甲成虫,提取处理后24h的总RNA,构建cDNA文库,利用Illumina技术进行测序,获得相应转录组数据。以|log2（Fold Change）|>0为标准,共筛选出90条差异表达的P450基因,其中有57条基因表达量升高,最高的差异倍数为39.4倍;有33条基因的表达量下降,最高下降了7.5倍。3、从转录组数据中筛选出差异表达的12条P450基因,利用实时荧光定量技术检测花绒寄甲在氯氰菊酯KC10、KC30浓度处理下,1h、4h、8h、12h、24h、48h时基因的表达差异,结果表明:花绒寄甲在受到药剂胁迫后,这12条基因的表达量在各时段内均有上升,在8h-24h内,基因表达量上升最明显的分别是:农药处理8h时,基因Dh 1216的表达量是对照组的9倍,处理12h时,基因Dh 775的表达量是对照组的9倍,处理24h时,基因Dh 1094的表达量是对照组的5倍。4、利用RNAi技术,向花绒寄甲体内注射不同注射量、不同P450基因的dsRNA,结果发现:对花绒寄甲的P450基因进行单一干扰时,基因Dh 775的表达量下降最明显,下降了77.0%;基因Dh 1094的表达量下降最小,下降了47.3%;当两条基因或三条基因混合干扰时,在一定注射量范围内,基因表达量会随dsRNA注射量的增加而降低。干扰基因Dh 1094后,花绒寄甲对氯氰菊酯的敏感性变化最为明显,用KC50浓度处理24h时,击倒率上升至96.7%。单一干扰基因Dh 775、Dh 1216后,击倒率分别上升至68.2%、73.7%。混合干扰中,干扰基因相同的情况下,花绒寄甲对氯氰菊酯的敏感性会随着注射量的增多而升高。因此推测花绒寄甲的三条P450基因:Dh 1216、Dh775、Dh 1094与其对氯氰菊酯的解毒代谢功能相关。
王芹[8]（2020）在《BmSlit和受体BmRobo以及BmTbx20在家蚕丝腺中的表达研究》文中研究表明提高家蚕的产丝量是蚕丝业几千年来一直追求的目标。家蚕的丝腺是合成和分泌蚕丝蛋白的器官,是整个蚕丝业的生物学基础。因此,探明家蚕丝腺形成和发育的分子调控机制具有重要的理论意义和实践意义。Slit是一类在进化上高度保守的分泌型糖蛋白,它与受体Roundabout（Robo）在神经轴突导向、神经元的迁移、血管生成、癌细胞转移、白细胞趋化等多种生理病理过程中具有调节作用。家蚕丝腺被认为是果蝇唾液腺的进化同源器官。现有研究发现,Slit及其受体Robo在果蝇唾液腺发育中发挥着重要作用,但是在家蚕丝腺中的功能研究还未有相关报道。Tbx20是一种进化上高度保守的转录因子,是T-box转录因子家族成员之一,在调控心脏发生、控制细胞迁移、促进细胞增殖等过程中扮演着重要角色。在果蝇胚胎发育过程中,Tbx20的同源基因midline能够调控唾液腺的导向迁移,也可以同时调控神经系统中slit和robo基因的表达,但对于Tbx20在家蚕中的功能目前还不清楚。本研究基于前期在家蚕中已鉴定并克隆的Bmslit和Bmrobo（Bmrobo1a、Bmrobo1b、Bmrobo2/3）以及Bmtbx20基因,通过qPCR和免疫荧光染色确定Bmslit、Bmrobo及Bmtbx20基因在丝腺中的时空表达模式,探讨它们在丝腺发育中的功能,并在胚胎期采用RNAi技术,分析BmTbx20对Bmslit和Bmrobo基因的表达调控作用及对丝腺发育的影响,以期为揭示家蚕丝腺发生和发育的基因调控网络提供新的资料。主要研究结果如下:1.利用qPCR技术,系统检测了家蚕幼虫丝腺不同功能区及不同发育时期Bmslit和Bmrobo1a、Bmrobo1b、Bmrobo2/3基因的表达变化。结果表明,Bmslit和3个Bmrobo基因在家蚕前、中、后部丝腺中均有表达,而且在不同发育时期存在很大差异,但Bmslit和Bmrobo的表达特征具有较高的相似性和关联性。2.通过免疫荧光染色对BmSlit和BmRobo蛋白进行双染,发现BmRobo1a、BmRobo1b、BmRobo2/3与BmSlit在家蚕胚胎以及幼虫不同发育时期、不同功能区的丝腺细胞质中均有合成,而且在幼虫丝腺细胞膜处都存在共定位。说明BmSlit可能通过与BmRobo结合而在家蚕丝腺中发挥作用。3.分别将Bmslit和Bmrobo1a、Bmrobo1b、Bmrobo2/3基因的siRNA注射到丝腺发生前的蚕卵中进行RNA干涉。qPCR检测发现,注射48 h后的蚕卵中以上4种基因的表达均被不同程度抑制,相对表达量都比对照组极显着下调。4.取家蚕不同发育时期的丝腺组织,通过qPCR和免疫荧光染色分别从转录水平和蛋白水平上分析了Bmtbx20基因在丝腺中的时空表达模式。结果表明,Bmtbx20在家蚕丝腺不同功能区及不同发育时期均有表达,转录因子BmTbx20与BmSlit在家蚕胚胎期和幼虫期丝腺中均有合成。5.对家蚕17-18期胚胎中的Bmtbx20基因进行RNAi,qPCR测定显示,蚕卵注射后48 h,不仅Bmtbx20的相对表达量与对照组NC相比极显着下降,而且Bmslit和Bmrobo1a、Bmrobo1b、Bmrobo2/3基因的相对表达量也都存在不同程度的下调。这些结果表明,转录因子BmTbx20可能通过调控Bmslit和Bmrobo基因的表达从而调控丝腺的发育过程。6.在家蚕胚胎期对Bmslit、Bmrobo以及Bmtbx20基因进行RNAi,与对照组NC相比,Bmslit和Bmrobo基因RNAi后,丝腺的发生位置及丝腺发育情况均未见明显差异。但Bmtbx20基因RNAi后会导致胚胎发育加快,丝腺发育也相应提前,故在同一催青时间,丝腺较对照组延伸的较长。关于这些基因在丝腺发育中的详细作用机理还有待利用基因敲除等手段做进一步研究。
梁思佳[9]（2020）在《利用植物介导的RNAi技术创造棉花抗盲蝽新种质》文中认为棉花害虫种类繁多,而且在整个生育时期均易遭受各种害虫危害。Bt抗虫棉的广泛种植有效的控制了棉铃虫的爆发,但由于杀虫剂使用量的大幅度减少,导致Bt非靶标害虫盲蝽象为害日益加重,并由次要害虫上升为主要害虫。盲蝽寄住范围广、飞行扩散能力强、爆发频率高,给盲蝽的防治带来了巨大的困难。目前喷洒化学杀虫剂是防治盲蝽的主要方法,但化学杀虫剂不但容易诱发盲蝽抗性的产生,而且给人类健康和环境安全带来威胁。因此迫切需要高效安全的盲蝽防治新策略。近年来,植物介导的RNAi技术由于其高效、特异,对环境无污染等特性被广泛应用于害虫的防治研究。本研究利用植物介导的RNAi技术创造了棉花抗盲蝽新种质,为盲蝽的防治提供了新的策略。主要研究内容如下:1.棉花抗中黑盲蝽新种质的创造本研究利用植物介导的RNAi技术,以影响中黑盲蝽（Adelphocoris suturalis）生殖能力的As FAR基因为靶标,创造了能够高量表达As FAR基因ds RNA的转基因棉花。当中黑盲蝽取食该转基因棉花后,可以成功诱发其体内的RNAi效应,导致其内源As FAR基因的表达水平显着下降。田间抗虫鉴定结果显示,As FAR转基因棉花受中黑盲蝽危害较轻,平均每株棉花仅捕获中黑盲蝽12-14头。然而对照组棉花受中黑盲蝽危害非常严重,平均每株棉花捕获中黑盲蝽数量大于20头。以上结果表明As FAR转基因棉花可以成功抑制中黑盲蝽的生殖能力,导致其种群数量显着下降,有效减少中黑盲蝽的危害。非靶标害虫的抗性鉴定结果显示As FAR转基因棉花只对中黑盲蝽有抗性效果,对棉铃虫（Helicoverpa armigera）的体重以及蚜虫（Aphis gossypii）的种群数量均无不良影响。连续两年的田间农艺性状调查结果显示,As FAR转基因棉花与野生型对照棉花之间的农艺性状没有显着差异（P>0.05）,且不同世代间农艺性状表现稳定。此外,外源基因的表达对棉花纤维品质没有不利影响。以上结果表明,As FAR转基因棉花对中黑盲蝽有较高的抗性,对非靶标害虫无不良影响,农艺性状良好且稳定,可以作为防治中黑盲蝽的理想种质资源。该研究为中黑盲蝽的防治提供了新的可替换策略策略。2.棉花抗绿盲蝽新种质的创造本研究选择绿盲蝽（Apolygus lucorum）Al LIM基因作为靶标基因,序列分析表明Al LIM基因具有高度特异性。随后将该基因转入棉花,成功创造了能够高量表达绿盲蝽Al LIM基因ds RNA的转基因棉花材料。室内饲喂结果显示,取食Al LIM转基因棉花后,绿盲蝽内源Al LIM基因的相对表达水平显着下降。在幼虫向成虫转化过程中蜕皮发生严重缺陷,最终因蜕皮失败,变态发育被阻断而死亡,死亡率高达33%-41%。此外有少量绿盲蝽可以羽化为成虫,但其翅膀、后腿出现畸形。对分别注射ds RNA-Al LIM（ds Al LIM）和ds RNA-GFP（ds GFP）的绿盲蝽样品进行转录组测序。数据分析结果显示,总共鉴定到4923个差异表达基因,其中有2484个基因在ds Al LIM处理后上调表达,2439个基因在ds Al LIM处理后下调表达。差异基因KEGG通路分析结果显示,与肌肉生长发育相关的信号通路被显着富集。根据KEGG通路分析结果鉴定到一些参与肌肉生长发育且在ds Al LIM处理后发生显着变化的差异基因。以上结果表明,Al LIM基因在绿盲蝽肌肉发育过程中发挥重要作用。肌肉结构和功能的完整性是昆虫变态发育的关键,因此推测绿盲蝽Al LIM基因的缺失会导致绿盲蝽羽化过程中蜕皮所需肌肉发育缺陷,最终导致蜕皮失败,羽化被阻断,死亡率增加。田间抗虫鉴定结果显示,转基因棉花受绿盲蝽危害较轻,每株转基因棉花平均捕获绿盲蝽8.1-10.1头。然而野生型对照组棉花受绿盲蝽危害却非常严重,每株平均捕获绿盲蝽高达21.5-24.1头。取食转基因棉花导致绿盲蝽死亡率增加,种群数量显着下降。此外,在田间依然观察到少量后腿及翅膀缺陷的绿盲蝽成虫。以上结果表明该转基因棉花对绿盲蝽具有较高的抗性水平。非靶标昆虫的生物测结果显示,Al LIM转基因棉对棉铃和蚜虫的生长发育没有负面影响,对有益昆虫瓢虫（Menochilus sexmaculatus）的生长发育没不良影响。连续两年的田间农艺性状调查结果显示,转基因棉花与野生型对照棉花之间的农艺性状没有显着差异（P>0.05）,且不同世代间农艺性状表现稳定。此外,外源基因的表达对棉花纤维品质没有不良影响。以上结果充分表明Al LIM转基因棉花目标抗虫性状效果良好,对非靶标害虫、有益昆虫以及人类安全,农艺性状以及纤维品质良好,可以作为防治绿盲蝽的理想种质资源。
于鹏成[10]（2020）在《应用dsRNA对旋毛虫Kazal型丝氨酸蛋白酶抑制剂基因功能的初步研究》文中指出旋毛虫病是世界范围内一种重要的食源性寄生虫病。旋毛虫分泌的丝氨酸蛋白酶抑制剂在幼虫发育过程中发挥着关键的作用。丝氨酸蛋白酶抑制剂也是早期宿主免疫反应的靶分子抗原,可以作为新的抗原用于旋毛虫感染的早期诊断。本研究应用dsRNA干扰技术沉默旋毛虫Kazal型丝氨酸蛋白酶抑制剂基因的表达,进一步从体外存活、侵入肠上皮细胞情况、体内发育情况、雌虫生殖力以及对宿主免疫的影响几个方面进行分析,从而为研究Kazal型丝氨酸蛋白酶抑制剂基因功能奠定基础。本研究通过浸泡和电转两种方法将特异性dsRNA-TsKaSPI导入旋毛虫肌幼虫和成虫体内,而后应用实时荧光定量PCR检测肌幼虫和成虫TsKaSPI基因转录水平,Western-blot检测肌幼虫TsKaSPI基因蛋白水平。结果表明,肌幼虫和成虫该基因转录水平与对照组相比,浸泡法降低了59.36%、67.80%（P<0.001）,电转法降低了63.36%,68.91%（P<0.001）;肌幼虫该蛋白表达水平与对照组相比,浸泡法和电转法分别降低70.67%、69.24%（P<0.001）;电转法沉默效率优于浸泡法,dsRNA-TsKaSPI最优干扰浓度为30μg/ml。同时设计一条Tsp03044基因实时荧光引物,用来验证dsRNA干扰的特异性。结果表明,TsKaSPI基因转录水平与对照基因Tsp03044相比明显降低,即dsRNA-TsKaSPI只能引起与它同源基因的沉默。随后研究dsRNA-TsKaSPI经浸泡和电转两种方法处理后,体外连续培养6d观察每1d转录水平的变化。结果表明,浸泡法在培养第1d转录水平有所降低,随后在第3d转录水平与对照组相比显着降低了63.21%（P<0.001）,达到最好的沉默效果,随着天数增加,转录水平逐渐恢复,而电转法在培养第1d转录水平与对照组相比显着降低了69.31%（P<0.001）,沉默效果最佳,第2d和第3d仍处于较低的水平,随后几天逐渐恢复,由此推出电转法转染效率优于浸泡法。体外培养观察TsKaSPI基因沉默对肌幼虫体外存活、体外侵入肠上皮细胞影响。结果表明,浸泡法与电转法分别处理肌幼虫后体外连续培养6d,浸泡法存活率为96%、91%、87%、67%、55%、46%（P>0.05）,电转法存活率为96%、91%、82%、67%、61%、52%（P>0.05）,与对照组相比无显着性差异,推测,TsKaSPI基因对旋毛虫体外存活方面未产生影响。体外侵染肠上皮细胞结果表明,TsKaSPI处理组与对照组相比,作用5h时浸泡法与电转法侵入率分别为41%、43%,明显低于对照组,同时随着培养时间增加,侵入肌幼虫的数量逐渐增多,在第5h时入侵率达到最佳。推测,TsKaSPI基因沉默后对肌幼虫体外侵入肠上皮细胞有一定的抑制作用。将dsRNA导入后的肌幼虫经口接种小鼠,观察TsKaSPI基因沉默对肌幼虫体内发育的影响。结果表明,6d肠道成虫和35d肌幼虫的减虫率与对照组相比分别为36.22%和31.87%,同时发现雌虫PBS组、e GFP对照组和TsKaSPI的处理组新生幼虫量分别为49.20±5.93、49.40±4.62、50.80±4.32（P>0.05）,处理组与对照组相比雌虫新生幼虫数没有明显的差异,推测,TsKaSPI基因与肌幼虫在宿主体内发育方面有重要的影响,而与雌虫生殖力关系不大。本研究通过检测小鼠脾淋巴细胞CD4+CD8+细胞数以及血清中抗体水平,进一步分析了TsKaSPI基因沉默后对宿主免疫方面的影响。流式细胞术（FCM）检测结果显示,TsKaSPI处理组CD3+CD4+、CD3+CD8+细胞数与PBS对照组相比明显增加,CD4+/CD8+比值也明显上升。同时,ELISA检测结果显示,TsKaSPI处理组IgG1、IgG2a、IgM抗体水平与对照组相比明显降低,IgG1/IgG2a比值也显着降低。因此,我们初步认为TsKaSPI基因的沉默诱导宿主Th1型细胞免疫反应增强,引起Th2型体液免疫减弱。综上所述,本研究证实dsRNA可明显抑制Kazal型丝氨酸蛋白酶抑制剂基因的转录和表达、肌幼虫对肠上皮细胞的侵入及幼虫在小鼠体内发育,同时促进Th1型细胞免疫应答,使Th2型体液免疫效应减弱。说明Kazal型丝氨酸蛋白酶抑制剂不仅在旋毛虫侵入宿主肠粘膜及发育过程中起着非常重要的作用,而且在与宿主免疫的相互作用中也发挥着非常重要的作用,为进一步研究旋毛虫基因功能打下了坚实基础。
二、RNAi研究进展（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、RNAi研究进展（论文提纲范文）
（2）甲维盐对松材线虫作用机理初探（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 引言 |
| 1 文献综述 |
| 1.1 甲维盐研发与应用进展 |
| 1.1.1 甲维盐的研发进程 |
| 1.1.2 甲维盐在害虫防治中的应用 |
| 1.2 甲维盐及同类化合物作用机理研究进展 |
| 1.2.1 十六元大环内酯化合物对氯离子通道作用 |
| 1.2.2 十六元大环内酯化合物对其他基因作用 |
| 1.3 松材线虫及线虫氯离子通道研究进展 |
| 1.3.1 松材线虫研究进展 |
| 1.3.1.1 松材线虫病的危害与防治 |
| 1.3.1.2 松材线虫基础生物学研究进展 |
| 1.3.2 线虫氯离子通道研究进展 |
| 1.3.2.1 氯离子通道的结构特征与生理功能 |
| 1.3.2.2 谷氨酸门控氯离子通道研究进展 |
| 1.3.2.3 γ-氨基丁酸门控氯离子通道研究进展 |
| 1.4 甲维盐对线虫作用研究方法概述 |
| 1.4.1 转录组测序技术 |
| 1.4.2 RNA干扰技术 |
| 1.5 论文研究思路与框架 |
| 2 低剂量甲维盐对松材线虫毒力作用研究 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 供试松材线虫 |
| 2.1.2 供试试剂 |
| 2.1.3 主要仪器与设备 |
| 2.1.4 培养基与溶液配制 |
| 2.1.5 各龄期松材线虫的培养与分离 |
| 2.1.6 生物测定方法 |
| 2.1.6.1 雌虫产卵量的测定 |
| 2.1.6.2 发育进度的测定 |
| 2.1.6.3 线虫抖动频率的测定 |
| 2.1.6.4 后代性别比例的测定 |
| 2.1.7 数据处理与分析 |
| 2.2 结果与分析 |
| 2.2.1 雌虫产卵量变化 |
| 2.2.2 发育进度变化 |
| 2.2.3 线虫抖动频率变化 |
| 2.2.4 后代性别比例变化 |
| 2.3 小结 |
| 3 甲维盐胁迫下松材线虫差异表达基因筛选 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 供试松材线虫 |
| 3.1.2 供试试剂 |
| 3.1.3 主要仪器与设备 |
| 3.1.4 培养基与溶液配制 |
| 3.1.5 各龄期松材线虫的培养与分离 |
| 3.1.6 药物处理 |
| 3.1.7 松材线虫总RNA提取 |
| 3.1.8 松材线虫转录组测序 |
| 3.1.9 转录组测序结果分析 |
| 3.1.9.1 转录组测序质量分析 |
| 3.1.9.2 差异表达基因定义与筛选 |
| 3.1.9.3 差异表达基因功能分类 |
| 3.1.10 转录组数据qPCR验证 |
| 3.1.10.1 差异表达基因选择 |
| 3.1.10.2 引物设计 |
| 3.1.10.3 药剂处理 |
| 3.1.10.4 cDNA第一链合成 |
| 3.1.10.5 qPCR扩增体系与反应 |
| 3.1.11 数据处理与分析 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.2.1 松材线虫总RNA提取结果 |
| 3.2.2 转录组测序质量分析 |
| 3.2.3 甲维盐胁迫差异表达基因分析 |
| 3.2.4 差异表达基因定量验证 |
| 3.3 小结 |
| 4 BxGluCl与BxGABACl的克隆与序列分析 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 供试松材线虫 |
| 4.1.2 供试质粒与菌株 |
| 4.1.3 供试试剂 |
| 4.1.4 主要仪器与设备 |
| 4.1.5 培养基与溶液配制 |
| 4.1.6 目的基因的筛选 |
| 4.1.7 目的基因的克隆 |
| 4.1.7.1 第一链cDNA反转录 |
| 4.1.7.2 引物设计 |
| 4.1.7.3 PCR扩增目的片段 |
| 4.1.7.4 凝胶回收目的片段 |
| 4.1.7.5 重组质粒的构建 |
| 4.1.7.6 重组质粒导入大肠杆菌 |
| 4.1.7.7 质粒提取与测序分析 |
| 4.1.8 目的基因序列生物信息学分析 |
| 4.1.9 氨基酸序列比对和系统发育树构建 |
| 4.2 结果与分析 |
| 4.2.1 目的基因克隆结果 |
| 4.2.1.1 目的基因筛选与全长PCR扩增结果 |
| 4.2.1.2 重组质粒菌液PCR扩增结果 |
| 4.2.2 目的基因序列分析 |
| 4.2.2.1 BxGluCl基因序列分析 |
| 4.2.3.2 BxGABACl基因序列分析 |
| 4.2.3 目的基因生物信息学分析 |
| 4.2.3.1 信号肽 |
| 4.2.3.2 跨膜域 |
| 4.2.3.3 二级结构 |
| 4.2.3.4 三维模型 |
| 4.2.4 序列比对和系统发育树构建结果 |
| 4.3 小结 |
| 5 BxGluCl与BxGABACl的功能验证 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.1 供试松材线虫 |
| 5.1.2 供试试剂 |
| 5.1.3 主要仪器与设备 |
| 5.1.4 主要溶液与储备液配制 |
| 5.1.5 目的片段扩增 |
| 5.1.5.1 引物设计 |
| 5.1.5.2 PCR扩增目的片段 |
| 5.1.6 RNA干扰 |
| 5.1.6.1 dsRNA合成 |
| 5.1.6.2 RNAi浸泡试验 |
| 5.1.7 不同化合物对松材线虫毒力测定 |
| 5.1.8 qPCR试验 |
| 5.1.8.1 各龄期目的基因表达水平验证 |
| 5.1.8.2 化合物处理后目的基因表达模式分析 |
| 5.1.8.3 沉默效率qPCR测定 |
| 5.1.9 目的基因功能验证 |
| 5.1.10 数据处理与分析 |
| 5.2 结果与分析 |
| 5.2.1 PCR扩增结果 |
| 5.2.2 dsRNA合成结果 |
| 5.2.3 各龄期BxGluCl和BxGABACl表达水平比较 |
| 5.2.4 化合物处理后BxGluCl和BxGABACl表达模式 |
| 5.2.5 RNAi沉默效率 |
| 5.2.6 生物测定结果 |
| 5.2.6.1 不同化合物LC_(50)与LC_(80)的测定结果 |
| 5.2.6.2 沉默后对化合物敏感性变化结果 |
| 5.2.6.3 沉默后抖动频率变化结果 |
| 5.3 小结 |
| 6 讨论 |
| 6.1 低剂量甲维盐可抑制松材线虫繁殖、发育、运动功能 |
| 6.2 BxGluCl和BxGABACl为十六元大环内酯化合物作用靶标 |
| 6.3 甲维盐与松材线虫氯离子通道存在最佳结合时间 |
| 7 结论与展望 |
| 7.1 结论 |
| 7.2 展望 |
| 参考文献 |
| 个人简介 |
| 致谢 |
（3）飞蝗Loquacious在小RNA通路中的功能研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 昆虫RNA干扰通路的介绍 |
| 1.1.1 小干扰RNA(small interference,siRNA)通路 |
| 1.1.2 微小RNA(microRNA,miRNA)通路 |
| 1.1.3 piRNA(Piwi-interacting,RNA)通路 |
| 1.1.4 昆虫Loquacious(Loqs)蛋白的研究现状 |
| 1.2 飞蝗体内RNAi的研究进展 |
| 1.2.1 飞蝗防治现状及其RNAi研究进展 |
| 1.2.2 研究意义及技术路线 |
| 第二章 飞蝗Loqs分子特性与表达分析 |
| 2.1 实验材料及试剂 |
| 2.1.1 供试昆虫 |
| 2.1.2 实验试剂 |
| 2.1.3 主要仪器设备 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 PCR引物设计 |
| 2.2.2 cDNA模板的合成 |
| 2.2.3 飞蝗Loqs的扩增、检测及纯化 |
| 2.2.4 阳性克隆菌株的筛选 |
| 2.2.5 飞蝗Loqs结构功能域及系统进化分析 |
| 2.2.6 飞蝗Loqs基因不同组织部位的表达特性 |
| 2.2.7 飞蝗Loqs基因在3 龄不同天数的表达特性 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 飞蝗Loqs基因序列分析 |
| 2.3.2 飞蝗Loqs的聚树分析 |
| 2.3.3 飞蝗Loqs基因不同组织部位和不同时期的表达分析 |
| 2.4 讨论 |
| 第三章 LmLoqs在飞蝗exo-siRNA通路中的功能分析 |
| 3.1 实验材料及试剂 |
| 3.1.1 实验材料 |
| 3.1.2 主要试剂和缓冲液的配制 |
| 3.1.3 所用仪器和设备 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 体外合成dsRNA |
| 3.2.2 dsRNA注射及沉默效率检测 |
| 3.2.3 重组质粒p Ac5.1-LmLoqs-A/B/C的构建及转染 |
| 3.2.4 重组质粒p ET32a-LmLoqs-A/B/C的构建及检测 |
| 3.2.5 LmLoqs-A LmLoqs-B和 LmLoqs-C的表达及收集 |
| 3.2.6 目的蛋白LmLoqs-A LmLoqs-B和 LmLoqs-C的纯化及检测 |
| 3.2.7 体外结合(RNA pull down)实验及检测 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1RNAi ofRNAi实验结果分析 |
| 3.3.2 双荧光素酶实验结果及重组质粒的表达检测 |
| 3.3.3 重组质粒p ET32a-LmLoqs-A/B/C的构建与检测 |
| 3.3.4 LmLoqs-A LmLoqs-B和 LmLoqs-C的原核表达及纯化 |
| 3.3.5 体外结合(RNA pull down)实验结果分析 |
| 3.4 讨论 |
| 第四章 LmLoqs在飞蝗endo-siRNA通路中的功能分析 |
| 4.1 实验材料及试剂 |
| 4.1.1 供试昆虫及细胞系 |
| 4.1.2 主要试剂 |
| 4.1.3 实验设备 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 体外合成dsRNA及注射 |
| 4.2.2 RT-qPCR检测飞蝗endo-siRNAs的表达量 |
| 4.2.3 内源性质粒psi CHECK-2-esi2.1 的构建和检测 |
| 4.2.4 重组质粒的构建及转染 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.3.1 LmLoqs对飞蝗endo-siRNAs的表达量影响 |
| 4.3.2 荧光素酶实验结果分析 |
| 4.4 讨论 |
| 第五章 LmLoqs在飞蝗miRNAs通路中的功能分析 |
| 5.1 实验材料及试剂 |
| 5.1.1 实验材料 |
| 5.1.2 主要设备及仪器 |
| 5.2 实验方法 |
| 5.2.1 dsRNA体内注射及沉默效率检测 |
| 5.2.2 重组质粒的构建及转染 |
| 5.2.3 RT-q PCR结果验证 |
| 5.3 实验结果 |
| 5.3.1 LmLoqs对飞蝗miRNAs的表达量影响 |
| 5.3.2 过表达重组质粒对果蝇S2 细胞miRNAs的表达量影响 |
| 5.4 讨论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
| 个人简介及联系方式 |
（4）粘虫CYP4G199基因在表皮发育中的功能研究（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 1 文献综述 |
| 1.1 粘虫概述 |
| 1.2 昆虫表皮发育研究进展 |
| 1.2.1 昆虫表皮结构及功能 |
| 1.2.2 昆虫表皮几丁质 |
| 1.2.3 昆虫表皮蛋白 |
| 1.2.4 昆虫表皮碳氢化合物 |
| 1.3 昆虫细胞色素P450 研究进展 |
| 1.3.1 昆虫细胞色素P450 概述 |
| 1.3.2 CYP4G亚家族研究现状 |
| 1.4 RNA干扰技术在鳞翅目昆虫中的应用 |
| 2 前言 |
| 2.1 研究目的与意义 |
| 2.2 研究内容 |
| 3 材料与方法 |
| 3.1 试验材料 |
| 3.1.1 供试昆虫 |
| 3.1.2 试验试剂及耗材 |
| 3.1.3 主要仪器设备 |
| 3.2 试验方法 |
| 3.2.1 粘虫表皮转录组数据分析 |
| 3.2.2 P450 基因在表皮中表达水平验证 |
| 3.2.3 CYP4G199 基因内含子扩增 |
| 3.2.4 CYP4G199 基因全长克隆及序列分析 |
| 3.2.5 CYP4G199 基因时空表达分布 |
| 3.2.6 CYP4G199 基因的RNAi功能研究 |
| 4 结果分析 |
| 4.1 粘虫表皮转录组数据分析及P450 基因鉴定 |
| 4.1.1 De novo组装信息 |
| 4.1.2 转录组功能注释 |
| 4.1.3 转录组P450 基因的鉴定 |
| 4.1.4 粘虫P450 基因的系统发育树构建 |
| 4.2 粘虫表皮特异性高表达P450 基因筛选 |
| 4.2.1 P450 基因在幼虫表皮中的相对表达水平验证 |
| 4.2.2 P450 基因在幼虫不同组织中的表达 |
| 4.3 CYP4G199 基因生物信息学分析 |
| 4.3.1 CYP4G199 基因克隆 |
| 4.3.2 CYP4G199 基因的序列分析 |
| 4.4 CYP4G199 基因表达模式分析 |
| 4.4.1 CYP4G199 基因在不同发育阶段的表达 |
| 4.4.2 CYP4G199 基因在不同发育阶段幼虫表皮中的表达 |
| 4.4.3 CYP4G199 基因在3 龄至4 龄幼虫蜕皮过程中表皮的表达 |
| 4.5 粘虫CYP4G199 基因的RNAi功能研究 |
| 4.5.1 粘虫CYP4G199 基因沉默效率分析 |
| 4.5.2 粘虫CYP4G199 基因的RNAi功能研究 |
| 5 讨论 |
| 5.1 粘虫表皮转录组数据库的建立 |
| 5.2 粘虫表皮P450 基因的鉴定与筛选 |
| 5.3 CYP4G199 基因的生物学信息分析 |
| 5.4 CYP4G199 基因的时空表达分布 |
| 5.5 CYP4G199 基因在粘虫表皮发育中的功能研究 |
| 6 结论 |
| 6.1 完成粘虫表皮转录组测序及P450 基因的鉴定 |
| 6.2 筛选出粘虫表皮中特异性高表达的P450 基因 |
| 6.3 完成CYP4G199 基因的克隆与序列分析 |
| 6.4 利用RT-q PCR技术探究CYP4G199 基因的时空表达模式 |
| 6.5 RNAi研究CYP4G199 基因在粘虫表皮发育中的功能 |
| 参考文献 |
| 作者简介 |
（5）杂拟谷盗热激蛋白基因应答4-松油醇及柠檬烯胁迫的表达及功能分析（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 术语及缩略语表 |
| 1 文献综述 |
| 1.1 4-松油醇与柠檬烯在储粮害虫方面的研究进展 |
| 1.1.1 杂拟谷盗的为害现状及防治技术 |
| 1.1.2 4-松油醇与柠檬烯的应用研究 |
| 1.2 昆虫热激蛋白的功能与应用 |
| 1.2.1 热激蛋白的简介 |
| 1.2.2 昆虫HSP的分类 |
| 1.2.3 热激蛋白的功能 |
| 1.2.4 外界环境与昆虫热激蛋白基因之间的研究进展 |
| 1.3 RNAi技术在储粮害虫中的应用 |
| 2 引言 |
| 2.1 研究目的及意义 |
| 2.2 研究内容 |
| 2.3 技术路线图 |
| 3 材料与方法 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 供试虫源 |
| 3.1.2 供试试剂 |
| 3.1.3 主要仪器设备 |
| 3.1.4 常用试剂配制 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 不同温度下4-松油醇及柠檬烯对杂拟谷盗的生物测定 |
| 3.2.2 杂拟谷盗HSP应答4-松油醇及柠檬烯表达模式解析 |
| 3.2.3 基于转录组对杂拟谷盗热激蛋白基因的克隆及序列分析 |
| 3.2.4 杂拟谷盗TcfHSP基因RNAi功能研究 |
| 4 结果与分析 |
| 4.1 不同温度下4-松油醇、柠檬烯对杂拟谷盗成虫生物测定 |
| 4.1.1 28℃下两种化合物的LC_(10)与LC_(50)对杂拟谷盗在不同温度下的生测结果 |
| 4.1.2 4-松油醇对杂拟谷盗的室内生物测定 |
| 4.1.3 柠檬烯对杂拟谷盗的室内生物测定 |
| 4.2 杂拟谷盗热激蛋白基因的鉴定与序列分析 |
| 4.2.1 基于转录组数据筛选杂拟谷盗TcfHSP基因 |
| 4.2.2 杂拟谷盗HSP基因全长序列克隆 |
| 4.2.3 杂拟谷盗热激蛋白基因全长序列信息分析 |
| 4.2.4 杂拟谷盗HSP基因的系统发育分析 |
| 4.3 杂拟谷盗热激蛋白的时空表达及分析 |
| 4.3.1 热激蛋白基因在杂拟谷盗不同发育阶段的表达 |
| 4.3.2 热激蛋白基因在杂拟谷盗不同体段的表达 |
| 4.4 杂拟谷盗热激蛋白应答4-松油醇、柠檬烯诱导后的表达模式分析 |
| 4.4.1 不同温度下热激蛋白基因在杂拟谷盗成虫体内表达水平的变化 |
| 4.4.2 28℃条件下TcfHSP应答4-松油醇及柠檬烯表达模式分析 |
| 4.4.3 40℃条件下TcfHSP应答4-松油醇、柠檬烯表达模式分析 |
| 4.5 杂拟谷盗热激蛋白基因沉默与功能分析 |
| 4.5.1 杂拟谷盗HSP基因RNAi沉默效率检测 |
| 4.5.2 杂拟谷盗HSP基因RNAi后对成虫羽化率的影响 |
| 4.5.3 RNAi处理后杂拟谷盗对4-松油醇及柠檬烯的敏感性变化 |
| 5 讨论 |
| 5.1 不同温度下4-松油醇及柠檬烯对杂拟谷盗生物测定结果的影响 |
| 5.2 基于转录组筛选杂拟谷盗热激蛋白基因的鉴定与序列分析 |
| 5.3 杂拟谷盗热激蛋白基因的时空表达 |
| 5.4 热激蛋白基因应答4-松油醇、柠檬烯的相应表达模式分析 |
| 5.5 利用RNAi技术研究杂拟谷盗热激蛋白基因的功能 |
| 6 结论 |
| 6.1 不同温度条件下4-松油醇及柠檬烯对杂拟谷盗的杀虫活性测定 |
| 6.2 基于转录组测序数据筛选鉴定了与4-松油醇、柠檬烯胁迫相关的TcfHSP基因 |
| 6.3 杂拟谷盗热激蛋白基因的时空表达 |
| 6.4 解析杂拟谷盗热激蛋白基因对温度与4-松油醇、柠檬烯处理的响应模式 |
| 6.5 杂拟谷盗热激蛋白基因的功能验证 |
| 参考文献 |
| 作者简介 |
（6）棉花GhCEN基因调控根系发育的功能初步研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 植物根系 |
| 1.2 常见植物根系发育相关基因研究进展 |
| 1.2.1 水稻根系发育基因 |
| 1.2.2 油菜根系发育调基因 |
| 1.2.3 拟南芥根系发育基因 |
| 1.2.4 棉花根系发育基因 |
| 1.3 植物CENTRORADIALIS基因研究进展 |
| 1.3.1 PEBP基因家族 |
| 1.3.2 CEN/CEN-like基因研究进展 |
| 1.4 棉花CEN同源基因研究进展 |
| 1.5 研究目的和意义 |
| 第2章 试验材料与方法 |
| 2.1 试验材料 |
| 2.1.1 植物材料 |
| 2.1.2 试验药品 |
| 2.1.3 试剂的配制 |
| 2.1.4 试验主要仪器设备 |
| 2.1.5 试验使用引物 |
| 2.2 测定项目与方法 |
| 2.2.1 田间表型鉴定与纤维品质测定 |
| 2.2.2 根系形态观察及指标测量 |
| 2.2.3 室内表型鉴定 |
| 2.2.4 数据处理与分析 |
| 2.3 试验方法 |
| 2.3.1 基因组DNA的提取与检测 |
| 2.3.2 基因组RNA的提取与检测 |
| 2.3.3 cDNA合成 |
| 2.4 转基因株鉴定 |
| 2.5 CEN基因表达量测定 |
| 2.5.1 材料处理 |
| 2.5.2 qRT-PCR反应体系 |
| 2.5.3 qRT-PCR数据处理 |
| 2.6 转录组测序 |
| 2.6.1 材料处理 |
| 2.6.2 样品检测 |
| 2.6.3 测序文库构建 |
| 2.6.4 聚类和测序 |
| 2.6.5 数据分析 |
| 第3章 结果与分析 |
| 3.1 田间试验 |
| 3.1.1 田间RNAi-GhCEN转基因株鉴定 |
| 3.1.2 RNA干扰转基因材料田间表现 |
| 3.1.3 CEN基因对纤维品质的影响 |
| 3.1.4 CEN基因在主茎尖的表达量分析 |
| 3.2 室内试验 |
| 3.2.1 RNAi-GhCEN转基因株鉴定 |
| 3.2.2 幼苗根系形态指标结果分析 |
| 3.2.3 蕾期表型性状指标调查 |
| 3.2.4 GhCEN基因表达模式分析 |
| 3.3 转录组分析 |
| 3.3.1 测序数据和比对效率统计 |
| 3.3.2 样品重复相关性评估和表达量PCA分析 |
| 3.3.3 差异表达基因数目统计 |
| 3.3.4 DEGs功能注释 |
| 3.3.5 根、茎中都表达的 DEGs的 GO分析 |
| 3.3.6 根、茎中都表达的 DEGs的 KEGG富集分析 |
| 3.3.7 GhCEN基因的功能 |
| 第4章 结论与讨论 |
| 4.1 全文结论 |
| 4.1.1 表型性状鉴定 |
| 4.1.2 品质性状分析 |
| 4.1.3 转录组分析 |
| 4.2 讨论分析 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 附表1 农业农村部棉花品质监督检验测试中心检验报告 |
| 附表2 根、茎中都表达的 DEGS的 GO富集分析结果 |
| 附表3 根、茎中都表达的 DEGS的 KEGG富集分析结果 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（7）花绒寄甲P450参与氯氰菊酯胁迫响应分子机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 花绒寄甲及其生物防治研究概述 |
| 1.1.1 花绒寄甲的分类地位及分布 |
| 1.1.2 花绒寄甲的形态学特征 |
| 1.1.3 花绒寄甲生活史 |
| 1.1.4 花绒寄甲生物学特征 |
| 1.1.5 花绒寄甲的室内扩繁技术 |
| 1.1.6 花绒寄甲的生物防治效果 |
| 1.2 菊酯类农药研究概述 |
| 1.2.1 拟除虫菊酯类杀虫剂使用现状 |
| 1.2.2 昆虫对氯氰菊酯的抗性机理 |
| 1.3 昆虫细胞色素P450 研究现状 |
| 1.3.1 昆虫细胞色素P450 |
| 1.3.2 细胞色素P450 的研究进展 |
| 1.4 农药对天敌的影响研究 |
| 1.5 转录组测序技术、实时荧光定量技术与RNAi技术概述 |
| 1.5.1 转录组测序技术 |
| 1.5.2 实时荧光定量PCR技术 |
| 1.5.3 RNA干扰技术 |
| 1.6 研究的目的与意义 |
| 1.7 研究技术路线 |
| 第二章 花绒寄甲在氯氰菊酯处理下的转录组测序及分析 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 主要试剂与仪器 |
| 2.1.2 供试昆虫的饲养 |
| 2.1.3 氯氰菊酯对花绒寄甲的毒力测定方法 |
| 2.1.4 转录组测序实验样品的准备 |
| 2.1.4.1 供试昆虫的处理 |
| 2.1.4.2 总RNA提取 |
| 2.1.5 cDNA文库构建及Illumina测序 |
| 2.1.6 花绒寄甲在氯氰菊酯处理下的转录组测序 |
| 2.1.6.1 转录组数据质量评估 |
| 2.1.6.2 参考基因组比对 |
| 2.1.6.3 基因预测 |
| 2.1.6.4 定量分析 |
| 2.1.6.5 差异分析 |
| 2.1.6.6 富集分析 |
| 2.2 结果与分析 |
| 2.2.1 氯氰菊酯对花绒寄甲的毒力测定结果 |
| 2.2.2 转录组数据质量评估结果 |
| 2.2.3 参考基因组比对结果 |
| 2.2.4 定量分析结果 |
| 2.2.5 差异基因分析 |
| 2.2.6 富集分析结果 |
| 2.3 分析与讨论 |
| 第三章 氯氰菊酯处理下花绒寄甲P450 相关基因表达变化 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 主要试剂与仪器 |
| 3.1.2 供试昆虫与处理 |
| 3.1.3 各处理昆虫总RNA提取及第一链cDNA的合成 |
| 3.1.3.1 总RNA提取 |
| 3.1.3.2 第一链cDNA的合成 |
| 3.1.4 转录组数据中花绒寄甲P450 表达差异基因的确定 |
| 3.1.4.1 花绒寄甲转录组数据中P450 候选基因的筛选与确定 |
| 3.1.4.2 花绒寄甲转录组数据中P450 表达差异基因的筛选 |
| 3.1.5 相关P450 基因特异性引物的设计与合成 |
| 3.1.6 相关P450 基因特异性引物的验证 |
| 3.1.7 实时荧光定量绘制P450 相关基因的标准曲线并建立回归方程 |
| 3.1.8 实时荧光定量检测P450 基因差异表达 |
| 3.1.9 实时荧光定量数据的处理 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.2.1 P450 候选基因的确定 |
| 3.2.2 基因标准曲线回归方程 |
| 3.2.3 实时荧光定量结果 |
| 3.3 分析与讨论 |
| 第四章 花绒寄甲P450 相关基因的RNAi研究 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 主要试剂与仪器 |
| 4.1.2 花绒寄甲RNAi基因的确定 |
| 4.1.3 花绒寄甲3 条候选基因RNAi引物的设计、合成与验证 |
| 4.1.4 dsRNA的合成与纯化 |
| 4.1.4.1 含T7 启动子模板的制备 |
| 4.1.4.2 GFP质粒模板的制备 |
| 4.1.4.3 dsRNA的合成 |
| 4.1.5 注射dsRNA方法 |
| 4.1.6 单一基因干扰 |
| 4.1.6.1 dsRNA最佳注射量与最佳干扰时间的确定 |
| 4.1.6.2 分别注射3 条基因的dsRNA后基因的表达 |
| 4.1.6.3RNAi后花绒寄甲对氯氰菊酯的敏感性检测 |
| 4.1.7 两条基因混合干扰 |
| 4.1.7.1 dsRNA最佳注射量与最佳干扰时间的确定 |
| 4.1.7.2 两两混合干扰后基因的表达 |
| 4.1.7.3 两条基因混合干扰后花绒寄甲对氯氰菊酯的敏感性检测 |
| 4.1.8 三条基因混合干扰 |
| 4.1.8.1 三条基因混合干扰后基因的表达 |
| 4.1.8.2 三条基因混合花绒寄甲对氯氰菊酯的敏感性检测 |
| 4.2 结果与分析 |
| 4.2.1 单一基因干扰后相关实验结果 |
| 4.2.2 两条基因混合干扰后相关实验结果 |
| 4.2.3 三条基因混合干扰后相关实验结果 |
| 4.3 分析与讨论 |
| 第五章 总结与展望 |
| 5.1 研究总结 |
| 5.2 创新点 |
| 5.3 问题与展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（8）BmSlit和受体BmRobo以及BmTbx20在家蚕丝腺中的表达研究（论文提纲范文）
| 符号说明 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 1 前言 |
| 1.1 家蚕丝腺研究进展 |
| 1.1.1 家蚕丝腺的结构及功能 |
| 1.1.2 家蚕丝腺的发生和发育 |
| 1.1.3 家蚕丝腺发育的调控机理 |
| 1.2 Slit-Robo信号通路的研究进展 |
| 1.2.1 Slit-Robo家族简介 |
| 1.2.2 Slit-Robo信号通路基本结构 |
| 1.2.2.1 Slit基本结构 |
| 1.2.2.2 Robo基本结构 |
| 1.2.3 Slit-Robo信号通路的主要功能 |
| 1.2.3.1 对神经轴突的导向作用 |
| 1.2.3.2 调节细胞迁移 |
| 1.2.3.3 参与器官形成 |
| 1.3 Tbx20的研究进展 |
| 1.3.1 T-box家族简介 |
| 1.3.2 tbx20基因的鉴定 |
| 1.3.3 转录因子Tbx20的功能研究 |
| 1.3.3.1 调控心脏的发育 |
| 1.3.3.2 控制细胞的迁移 |
| 1.3.3.3 促进心肌细胞的增殖 |
| 1.3.4 tbx20的表达调控机制 |
| 1.4 本研究的目的与意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 试验材料 |
| 2.1.1 试验动物 |
| 2.1.2 试剂及配制 |
| 2.1.2.1 试剂及试剂盒 |
| 2.1.2.2 相关试剂的配制 |
| 2.1.3 主要仪器设备 |
| 2.1.4 生物信息学分析工具及数据处理软件 |
| 2.2 试验方法 |
| 2.2.1 Bmslit、Bmrobo和 Bmtbx20 基因在家蚕丝腺中的表达测定 |
| 2.2.1.1 取材 |
| 2.2.1.2 家蚕丝腺总RNA的提取 |
| 2.2.1.3 RNA反转录合成c DNA |
| 2.2.1.4 qPCR引物设计 |
| 2.2.1.5 qPCR反应体系及程序 |
| 2.2.1.6 数据处理与分析 |
| 2.2.2 BmSlit、BmRobo和 BmTbx20 蛋白在家蚕丝腺中的表达定位 |
| 2.2.2.1 抗体稀释 |
| 2.2.2.2 家蚕丝腺解剖与染色前处理 |
| 2.2.2.3 免疫荧光染色 |
| 2.2.3 Bmslit、Bmrobo和 Bmtbx20 基因RNAi对家蚕胚胎期丝腺发育的影响分析 |
| 2.2.3.1 siRNA的设计与注射液的配制 |
| 2.2.3.2 显微注射前准备工作 |
| 2.2.3.3 注射卵的制备 |
| 2.2.3.4 蚕卵的显微注射 |
| 2.2.3.5 RNAi对家蚕胚胎期Bmslit、Bmrobo和 Bmtbx20 基因表达水平影响测定 |
| 2.2.3.6 RNAi对家蚕胚胎发育和丝腺发生的影响观察 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 Bmslit和 Bmrobo在家蚕幼虫丝腺不同功能区及不同发育时期的表达模式 |
| 3.1.1 Bmslit和 Bmrobo在家蚕幼虫前部丝腺中的表达变化 |
| 3.1.2 Bmslit和 Bmrobo在家蚕幼虫中部丝腺中的表达变化 |
| 3.1.3 Bmslit和 Bmrobo在家蚕幼虫后部丝腺中的表达变化 |
| 3.2 BmSlit和 BmRobo在家蚕丝腺不同功能区及不同发育时期的组织定位 |
| 3.2.1 BmSlit和 BmRobo在家蚕胚胎期丝腺中定位 |
| 3.2.2 BmSlit和 BmRobo在家蚕幼虫期前部丝腺中共定位 |
| 3.2.3 BmSlit和 BmRobo在家蚕幼虫期中部丝腺中共定位 |
| 3.2.4 BmSlit和 BmRobo在家蚕幼虫期后部丝腺中共定位 |
| 3.3 Bmslit和 Bmrobo基因RNAi对家蚕胚胎期相关基因表达的影响 |
| 3.3.1 RNAi对家蚕胚胎期Bmslit基因表达水平的影响 |
| 3.3.2 RNAi对家蚕胚胎期Bmrobo1a基因表达水平的影响 |
| 3.3.3 RNAi对家蚕胚胎期Bmrobo1b基因表达水平的影响 |
| 3.3.4 RNAi对家蚕胚胎期Bmrobo2/3 基因表达水平的影响 |
| 3.4 转录因子BmTbx20 在家蚕丝腺中的表达定位及其对Bmslit和 Bmrobo的表达调控 |
| 3.4.1 Bmtbx20在家蚕幼虫丝腺不同功能区及不同发育时期的表达模式 |
| 3.4.2 BmTbx20和BmSlit在家蚕丝腺不同功能区及不同发育时期的组织定位 |
| 3.4.3 BmTbx20 调控Bmslit和 Bmrobo的表达 |
| 3.5 Bmslit、Bmrobo及 Bmtbx20 基因RNAi对家蚕胚胎发育和丝腺发生的影响 |
| 3.5.1 Bmslit、Bmrobo及 Bmtbx20 基因RNAi对家蚕胚胎发育的影响 |
| 3.5.2 Bmslit、Bmrobo及 Bmtbx20 基因RNAi对家蚕丝腺发生的影响 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读硕士学位期间发表论文情况 |
（9）利用植物介导的RNAi技术创造棉花抗盲蝽新种质（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 棉花抗虫育种研究进展 |
| 1.1.1 形态抗虫育种 |
| 1.1.2 生化抗虫育种 |
| 1.1.3 分子标记辅助选择抗虫育种 |
| 1.1.4 转外源抗虫基因抗虫育种 |
| 1.1.5 利用RNAi技术沉默昆虫靶标基因抗虫育种 |
| 1.2 盲蝽的危害特点及抗盲蝽研究的必要性 |
| 1.2.1 盲蝽的种类及形态特征 |
| 1.2.2 盲蝽的生活习性以及危害特点 |
| 1.2.3 开展棉花抗盲蝽研究的重要性和必要性 |
| 1.3 RNAi的研究进展及在作物抗虫育种中的应用 |
| 1.3.1 RNAi现象的发现及定义 |
| 1.3.2 RNAi的作用机理及特点 |
| 1.3.3 RNAi的种类 |
| 1.3.4 昆虫摄取dsRNA的方式 |
| 1.3.5 植物介导的RNAi技术在作物抗虫育种中的应用 |
| 1.4 FAR基因研究进展 |
| 1.5 LIM基因研究进展 |
| 1.6 本研究的目的意义与技术路线 |
| 1.6.1 本研究的目的与意义 |
| 1.6.2 本研究的技术路线 |
| 第二章 实验材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 植物材料,载体和菌株 |
| 2.1.2 植物表达载体 |
| 2.1.3 基因的来源 |
| 2.1.4 供试的昆虫材料 |
| 2.1.5 主要试剂 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 载体构建 |
| 2.2.2 棉花遗传转化 |
| 2.2.3 棉花DNA提取与Southern杂交 |
| 2.2.4 棉花RNA提取,表达量分析以及Northern杂交 |
| 2.2.5 盲蝽RNA提取,反转录以及RT-qPCR基因表达量分析 |
| 2.2.6 盲蝽的田间抗虫鉴定 |
| 2.2.7 转基因棉花大田农艺性状评价 |
| 2.2.8 非靶标昆虫的室内抗性鉴定 |
| 2.2.9 绿盲蝽的室内抗性鉴定 |
| 2.2.10 dsAl LIM和 dsGFP处理后绿盲蝽的转录组分析 |
| 第三章 利用植物介导的RNAi技术创造棉花抗中黑盲蝽新种质 |
| 3.1 结果与分析 |
| 3.1.1 AsFAR转基因棉花的获得与分子检测 |
| 3.1.2 AsFAR转基因棉花的表达量检测 |
| 3.1.3 AsFAR转基因棉花对中黑盲蝽种群数量的影响 |
| 3.1.4 AsFAR转基因棉花对中黑盲蝽内源靶标基因表达水平的影响 |
| 3.1.5 AsFAR转基因棉花对中黑盲蝽的抗性显着增强 |
| 3.1.6 AsFAR转基因棉花对非靶标害虫的影响 |
| 3.1.7 不同世代AsFAR转基因棉花大田农艺性状及纤维品质调查分析 |
| 3.2 讨论 |
| 第四章 利用植物介导的RNAi技术创造棉花抗绿盲蝽新种质 |
| 4.1 结果与分析 |
| 4.1.1 基因序列分析及载体构建 |
| 4.1.2 AlLIM转基因棉花的获得 |
| 4.1.3 AlLIM转基因棉花的阳性检测及拷贝数分析 |
| 4.1.4 AlLIM转基因棉花的表达量检测 |
| 4.1.5 AlLIM转基因棉花对绿盲蝽内源靶标基因表达水平的影响 |
| 4.1.6 AlLIM转基因棉花的室内饲喂效果检测 |
| 4.1.7 ds Al LIM处理后绿盲蝽转录组分析 |
| 4.1.8 AlLIM转基因棉花的田间抗绿盲蝽效果检测 |
| 4.1.9 不同世代AlLIM转基因棉花大田农艺性状及纤维品质调查分析 |
| 4.1.10 AlLIM转基因棉花对非靶标昆虫的影响 |
| 4.2 讨论 |
| 4.2.1 AlLIM转基因棉花的抗虫性研究 |
| 4.2.2 绿盲蝽AlLIM基因的功能研究 |
| 4.2.3 AlLIM转基因棉花的环境安全性评价 |
| 4.2.4 RNAi转基因作物与Bt转基因作物的叠加是未来抗虫育种发展的新方向 |
| 4.2.5 植物介导的RNAi技术面临的挑战 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 附录1 载体构建 |
| 附录2 棉花的遗传转化 |
| 附录3 棉花DNA提取(天根试剂盒法DP305) |
| 附录4 Sourthern杂交(地高辛标记法) |
| 附录5 棉花RNA提取 |
| 附录6 Northern杂交(地高辛标记法) |
| 附录7 AsFARDNA序列 |
| 附录8 AlLIMDNA序列 |
| 附表 |
| 附表1 本研究所用的引物序列 |
| 已发表和待发表论文 |
| 已申请专利 |
| 致谢 |
（10）应用dsRNA对旋毛虫Kazal型丝氨酸蛋白酶抑制剂基因功能的初步研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| 英文摘要 |
| 1 前言 |
| 1.1 旋毛虫和旋毛虫病 |
| 1.2 丝氨酸蛋白酶抑制剂概况 |
| 1.2.1 丝氨酸蛋白酶抑制剂的分类 |
| 1.2.2 丝氨酸蛋白酶抑制剂的功能和作用机制 |
| 1.3 Kazal型丝氨酸蛋白酶抑制剂概况 |
| 1.3.1 Kazal型丝氨酸蛋白酶抑制剂结构特征 |
| 1.3.2 Kazal型丝氨酸蛋白酶抑制剂的功能 |
| 1.3.3 Kazal型丝氨酸蛋白酶抑制剂作用机制 |
| 1.4 RNA干扰概述 |
| 1.4.1 dsRNA干扰的机理 |
| 1.5 旋毛虫肌幼虫体外侵染肠上皮细胞的研究进展 |
| 1.6 寄生虫RNAi的研究进展 |
| 1.6.1 吸虫RNAi的研究进展 |
| 1.6.2 线虫RNAi的研究进展 |
| 1.6.3 原虫RNAi的研究进展 |
| 1.7 研究目的及意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 实验虫种、菌株与细胞系 |
| 2.1.2 实验动物及试剂 |
| 2.1.3 主要仪器设备 |
| 2.1.4 主要溶液的配制 |
| 2.1.5 qPCR引物与dsRNA引物片段序列 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 旋毛虫的收集 |
| 2.2.2 TsKaSPI基因dsRNA合成 |
| 2.2.3 旋毛虫肌幼虫和成虫dsRNA的导入 |
| 2.2.4 转染浓度与时间的优化 |
| 2.2.5 dsRNA的特异性 |
| 2.2.6 dsRNA对TsKaSPI转录水平的影响 |
| 2.2.7 dsRNA对TsKaSPI蛋白表达水平的影响 |
| 2.2.8 TsKaSPI基因沉默对旋毛虫幼虫体外存活及侵入肠上皮细胞的影响 |
| 2.2.9 TsKaSPI基因沉默对旋毛虫体内发育及雌虫生殖力的影响 |
| 2.2.10 TsKaSPI基因沉默后肌幼虫对宿主T细胞增值及抗体水平的影响 |
| 2.2.11 实验数据分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 dsRNA体外转录模板(含T7启动子) |
| 3.2 dsRNA体外合成 |
| 3.3 dsRNA对TsKaSPI转录水平的影响 |
| 3.3.1 浸泡法导入dsRNA TsKaSPI转录水平变化 |
| 3.3.2 电转法导入dsRNA TsKaSPI转录水平变化 |
| 3.4 dsRNA的特异性 |
| 3.5 dsRNA对TsKaSPI蛋白表达水平的影响 |
| 3.5.1 浸泡法导入dsRNA TsKaSPI蛋白表达水平变化 |
| 3.5.2 电转法导入dsRNA TsKaSPI蛋白表达水平变化 |
| 3.6 TsKaSPI基因沉默对旋毛虫幼虫体外存活及侵入肠上皮细胞的影响 |
| 3.6.1 TsKaSPI基因沉默对旋毛虫肌幼虫体外存活的影响 |
| 3.6.2 TsKaSPI基因沉默对旋毛虫肌幼虫侵入肠上皮细胞的影响 |
| 3.7 TsKaSPI基因沉默对肌幼虫体内发育及雌虫生殖力的影响 |
| 3.8 TsKaSPI基因沉默对肌幼虫感染小鼠后流式细胞检测CD4~+、CD8~+细胞水平 |
| 3.9 TsKaSPI基因沉默对肌幼虫感染小鼠后IgG1、IgG2a、IgM抗体水平的检测 |
| 4 讨论 |
| 4.1 dsRNA干扰对旋毛虫TsKaSPI基因表达的影响 |
| 4.2 TsKaSPI在旋毛虫入侵宿主过程中的作用 |
| 4.3 TsKaSPI基因沉默对宿主免疫保护的影响 |
| 5 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 攻读硕士学位期间发表的学术论文 |
四、RNAi研究进展（论文参考文献）
- [1]RNA干扰在鳞翅目昆虫中的应用研究进展[J]. 张秋朗,刘建宏,徐进,叶辉. 生物灾害科学, 2021(04)
- [2]甲维盐对松材线虫作用机理初探[D]. 卢枫. 浙江农林大学, 2021(02)
- [3]飞蝗Loquacious在小RNA通路中的功能研究[D]. 李慧咏. 山西大学, 2021(12)
- [4]粘虫CYP4G199基因在表皮发育中的功能研究[D]. 尹红琴. 安徽农业大学, 2021
- [5]杂拟谷盗热激蛋白基因应答4-松油醇及柠檬烯胁迫的表达及功能分析[D]. 时苏. 安徽农业大学, 2021
- [6]棉花GhCEN基因调控根系发育的功能初步研究[D]. 刘春艳. 塔里木大学, 2021
- [7]花绒寄甲P450参与氯氰菊酯胁迫响应分子机制研究[D]. 裴培. 西北农林科技大学, 2021
- [8]BmSlit和受体BmRobo以及BmTbx20在家蚕丝腺中的表达研究[D]. 王芹. 山东农业大学, 2020(01)
- [9]利用植物介导的RNAi技术创造棉花抗盲蝽新种质[D]. 梁思佳. 华中农业大学, 2020(01)
- [10]应用dsRNA对旋毛虫Kazal型丝氨酸蛋白酶抑制剂基因功能的初步研究[D]. 于鹏成. 东北农业大学, 2020